قسمت 1 اثرات آنتی اکسیدانی و ضد انعقادی گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید جدا شده از گل جارویی (Orobanche Caryophyllacea، Phelipanche Arenaria، و P. Ramosa)

بارتوش اسکالسکی الف، سیلویا پاولک ب، داریوش جدریک ب، آگاتا رولنیک، روستیسلاو پیتوخوف،

رناتا پیووارچیک سی، آنا استوچمال بی، بیاتا اولاس آ،*

دانشگاه Ło'd´z، گروه بیوشیمی عمومی، دانشکده زیست شناسی و حفاظت از محیط زیست، 90-236 Ł´od´z، لهستان

b گروه بیوشیمی و کیفیت محصول، موسسه علوم خاک و کشت گیاهان، موسسه تحقیقات دولتی، 24-100 Puławy، لهستان

مرکز تحقیقات و حفاظت از تنوع زیستی، گروه زیست شناسی محیطی، موسسه زیست شناسی، دانشگاه یان کوچانوفسکی، 25-406 کیلچه، لهستان

خلاصه

گیاهان هولوپارازیت Orobanchaceae از جملهسیستانچ، Orobanche و Phelipanche spp، به دلیل غنی بودن از گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید (PPGs) شناخته شده اند. بسیاری از ترکیبات PPG دارای طیف گسترده ای از فعالیت ها مانند ضد میکروبی، ضد التهابی، آنتی اکسیدانی و تقویت کننده حافظه هستند. برای بررسی بهتر پتانسیل زیست فعالی گونه های جارویی اروپایی (O. Caryophyllaceae - OC، P. Arenaria - PA، P. ramosa - PR) و ده ترکیب فنیل پروپانوئید منفرد جدا شده، عملکرد ضد رادیکال آنها، اثر محافظتی در برابر اکسیداسیون در پلاسما در سیستم آزمایشگاهی را بررسی کردیم. و تأثیر بر پارامترهای انعقادی. عصاره‌های آزمایش‌شده فعالیت مهاری 50 تا 70 درصد از قدرت Trolox را نشان دادند. عصاره OC، غنی ازاکتئوزید، بیش از 20 درصد پتانسیل ضد رادیکالی بهتری نسبت به عصاره PR داشت که تنها عصاره حاوی PPG بود که بخش کاتکول B-ring در واحد آسیل نداشت. علاوه بر این، مشخص شد که تنها هشت PPG آزمایش شده پتانسیل آنتی اکسیدانی را در پلاسمای انسانی تیمار شده با H2O2/Fe نشان دادند. با این حال، سه PPG آزمایش شده علاوه بر خواص آنتی اکسیدانی دارای پتانسیل ضد انعقادی نیز بودند. به نظر می رسد که ساختار PPG ها، به ویژه وجود قطعات آسیل و کاتکول، عمدتاً به خواص آنتی اکسیدانی آنها مربوط می شود. پتانسیل ضد انعقاد این ترکیبات به ساختار شیمیایی آنها نیز مرتبط است. PPG های انتخاب شده پتانسیل درمان بیماری های قلبی عروقی مرتبط با استرس اکسیداتیو را نشان می دهند.

برای اطلاعات بیشتر لطفا تماس بگیرید:Joanna.jia@wecistanche.com

سیستانچتوبولوزا اثرات زیادی دارد

1. مقدمه

استرس اکسیداتیو به دلیل تأثیر منفی آن بر سلامت موجودات زنده از جمله تسریع پیری و برخی سرطان ها به طور گسترده ای شناخته شده است. وقوع استرس اکسیداتیو با اختلال در تعادل بین مکانیسم های اکسیداتیو و آنتی اکسیداتیو (از جمله دفاع آنزیمی (کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز) و غیر آنزیمی (گلوتاتیون) در سلول های بدن همراه است [1]. تولید بیش از حد گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، از جمله رادیکال‌های اکسیدکننده و گونه‌های پوسته بسته، یکی از مکانیسم‌های اصلی تشکیل استرس اکسیداتیو است. با این حال، اثر بیولوژیکی ناشی از ROS تا حد زیادی به غلظت، زمان قرار گرفتن در معرض و مکان بستگی دارد. در شرایط عادی (غلظت کم)، رادیکال‌های اکسیژن/نیتروژن می‌توانند نقش پیام‌رسان‌های ثانویه را بازی کنند، اما در سطح بالاتر، ممکن است با ساختارهای بیولوژیکی مانند غشای سلولی واکنش نشان دهند [2]. در میان همه گونه‌های ROS، یک رادیکال هیدروکسیل (HO.) یکی از بزرگترین آسیب‌ها را به ماکرومولکول‌های زیستی ایجاد می‌کند: پروتئین‌ها، لیپیدها و DNA. استرس اکسیداتیو نقش مهمی در طیف وسیعی از بیماری ها از جمله بیماری های قلبی عروقی دارد. اختلالات سیستم خونی با تغییرات در پارامترهای مختلف هموستاز و بیومارکرهای پلاسما مرتبط و/یا مقدم بر آن بوده است [1،3].

از سوی دیگر، بسیاری از مواد طبیعی، مانند پلی فنل ها و اسیدهای چرب غیراشباع، به عنوان آنتی اکسیدان های قوی شناسایی شده اند که قادر به جلوگیری از تشکیل و/یا کاهش گونه های فعال اکسیژن هستند. ترکیباتی با چنین خواصی در بسیاری از محصولات غذایی و فرآورده های دارویی با منشاء گیاهی یافت می شود. بنابراین رژیم غذایی غنی شده با سبزیجات و میوه های تازه و درمان های آنتی اکسیدانی مبتنی بر آنتی اکسیدان های طبیعی به طور گسترده ای توصیه می شود زیرا می توانند سطح استرس اکسیداتیو را کاهش دهند و از فرآیندهای پاتوفیزیولوژیکی مختلف جلوگیری کنند [4،5]. پلی فنل‌های گیاهی گروه متنوعی از متابولیت‌های ثانویه هستند که در میان آنها اسیدهای فنولیک جایگاه مهمی را به خود اختصاص می‌دهند، زیرا به طور گسترده توزیع می‌شوند و اثرات بیولوژیکی مختلفی مانند ضد میکروبی، آنتی‌اکسیدانی و ضد التهابی از خود نشان می‌دهند. گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید (PPGs) از استری‌های اسید هیدروکسی سینامیک هستند و تنها کلاس متابولیت‌های ثانویه موجود در گیاهان هولوپارازیتی Orobanchaceae هستند.سیستانچ، Orobanche و Phelipanche spp. چندین گونه از این خانواده آفات جدی محصولات هستند که کشاورزان می خواهند در مزارع از شر آنها خلاص شوند (به عنوان مثال Phelipanche ramosa)، تعداد کمی از آنها در فارماکولوژی استفاده می شوند، در حالی که بیشتر آنها برای انسان اهمیت کمی دارند. هرباسیستانچبه طور گسترده در طب سنتی آسیایی در درمان کمبود کلیه و به عنوان یک عامل تقویت کننده ایمنی و حافظه، ضد پیری و ضد خستگی استفاده می شود [6]. آنالیزهای فیتوشیمیایی گروه‌های تحقیقاتی مختلف نشان داده‌اند که گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید، مانند استونید، اکیناکوزید، و ساید پودیوم، یکی از اجزای اصلی فعال هربا سیستانش هستند [7]. مطالعه اخیر بر روی چندین گونه جاروک که در لهستان یافت شده توسط Jedrejek و همکارانش انجام شده است. [8] نشان داده است که این ماده گیاهی دارای ترکیب کیفی مشابه (غلبه PPG) است، علاوه بر این، برابر یا حتی فراتر از آن است.سیستانچspp از نظر محتوای مواد فعال [8].

Cistanche deserticola اثرات زیادی دارد، برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

مطالعه حاضر با هدف ارزیابی پتانسیل ضد رادیکال و آنتی اکسیدانی و همچنین تأثیر بر پارامترهای هموستاز سه عصاره گل جارویی (Orobanche Caryophyllaceae - OC، Pheli-panache Arenaria - PA و P. ramosa - PR) غنی از فنیل های مختلف انجام شد. -

پروستانوئیدها و همچنین ترکیبات تک PPG آنها. ظرفیت ضد رادیکال با استفاده از 2،2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid/Trolox Equivalent (ABTS/TE) و 2،2-diphenyl-1-picrylhybrazil (DPPH) اندازه گیری شد. ) آزمایشات استرس اکسیداتیو در سیستم آزمایش پلاسما با استفاده از یک رادیکال هیدروکسیل (H2O2/Fe)، سپس پراکسیداسیون لیپیدی (آزمایش گونه‌های واکنش‌دهنده اسید تیوباربیتوریک (TBARS))، و سطح پروتئین کربونیل و گروه‌های تیول اندازه‌گیری شد. از جمله پارامترهای تعیین شده هموستاز عبارتند از: زمان ترومبوپلاستین جزئی فعال (APTT)، زمان پروترومبین (PT) و زمان ترومبین (TT).

2. مواد و روشها

2.1. مواد شیمیایی

2،2-دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل رادیکال (DPPH)، 2،2'-آزینوبیس-3-اتیل بنزتیازولین-6-اسید سولفونیک (ABTS)، پرسولفات پتاسیم، {{9 }}هیدروکسی-2، 5،7،8-تترا متیل کرومان-2-اسید کربوکسیلیک (Trolox)، دی متیل سولفوکسید (DMSO)، اسید تیوباربیتوریک (TBA)، اسید فرمیک (گرید LC-MS)، و H2O2 از Sigma-Aldrich (سنت لوئیس، MO.، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. متانول (گرید گرادیان HPLC) و استونیتریل (گرید LC-MS) از مرک (دارمشتات، آلمان) به دست آمد. ده فنیل

ترکیبات پروپانیک آزمایش شده در این کار، از جمله 2'-O-استیلاکتئوزید (97 درصد)، 2'-O-استیل پلیوموزید (98 درصد)، 3-O-متیل پلیوموزید (96 درصد)، استونید (99 درصد)، آرنا داخل (97 درصد)، کرناتوزید (98 درصد)، تنیپوزید (99 درصد)، پولیوموزید (99 درصد)، توبولوزید A (96 درصد)، و ویدمانیوزید D (96 درصد) قبلاً توسط ما از مواد گیاهی زیر جدا شده بودند. 8]. خلوص ترکیبات با استفاده از آنالیز UHPLC-PDA-MS ارزیابی شد. آب فوق خالص با استفاده از سیستم تصفیه آب Milli-Q (شرکت Millipore) در داخل خانه تهیه شد. سایر معرف ها از درجه تحلیلی بودند و توسط تامین کنندگان تجاری داخلی تهیه می شدند.

2.2. ماده ی گیاهی

گیاهان گلدار از سه گونه گل جارو شامل Orobanche Caryophyllaceae Sm.، Phelipanche Arenaria Pomel و P. Ramos (L.) Pomel توسط پروفسور شناسایی شد. Renata Piwowarczyk (دانشگاه Jan Kochanowski، Kielce، لهستان) و از منبع طبیعی در لهستان جمع آوری شده است.

نمونه‌های کوپن (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E)، علفزار گرماگیر، انگلی Galium boreale، می 2014؛ P. Arenaria – Zwierzyniec (50.38-N,02◦) آیش، انگلی Artemisia campestris، ژوئن 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E)، مزرعه، انگلی Solanum Lycopersicum، سپتامبر 2014) در هرباریوم دانشگاه یان کوچانوفسکی در کیلچه (KTC) نهشته شده است. مواد گیاهی قبل از استخراج لیوفیلیزه و ریز آسیاب شد.

2.3. تهیه عصاره گل جارویی

مواد گیاهی پودر شده (O. Caryophyllaceae (OC) - 2 گرم، P. Arenaria (PA) - 3 گرم و P. ramosa (PR) - 3 گرم) با 80 درصد MeOH در دمای 40 درجه سانتی گراد و 1500 psi (فشار حلال) استخراج شد. ) با استفاده از ASE 200 شتاب

استخراج کننده حلال (Dionex، Sunnyvale، CA، USA). عصاره ها تبخیر و یخ خشک شدند (Gamma 2-16 LSC freeze dryer، Christ، آلمان). راندمان استخراج برای OC، PA و PR به ترتیب 55 درصد، 37 درصد و 43 درصد وزنی مواد گیاهی بود. با توجه به محتوای بالای کربوهیدرات (داده‌ها نشان داده نشده است)، عصاره‌های خام بیشتر با استخراج فاز جامد (SPE) بر روی میکرو ستون Oasis HLB (500 میلی‌گرم؛ واترز، میلفورد، MA، ایالات متحده آمریکا) خالص‌سازی شدند. قندها با 1 درصد MeOH حذف شدند، سپس ترکیبات مورد نظر با 80 درصد MeOH شستشو داده شدند. پس از حذف حلال، عصاره های OC، PA و PR لیوفیلیزه شدند (خشک کن انجمادی گاما 2-16 LSC)، و بازده خالص سازی SPE 53 درصد (OC)، 67 درصد (PA) و 51 درصد (PR) بود. .

2.4. ویژگی های فیتوشیمیایی عصاره گل جارویی

تجزیه و تحلیل کمی و کیفی عصاره گل جارو با استفاده از یک سیستم ACQUITY UPLC (Waters) متصل به آشکارساز آرایه دیود نوری (PDA) و یک طیف‌سنج جرمی چهار قطبی پشت سر هم (TQD-MS/MS) انجام شد. عصاره های OC، PA و PR یخ زده در 5{3}} درصد متانول با غلظت 0.50 میلی گرم بر میلی لیتر حل شدند و سپس

کروماتوگرافی بر روی ستون BEH C18 (100 × 2.1 میلی متر، 1.7 میکرومتر، آب). شرایط کروماتوگرافی به شرح زیر بود: دمای کوره - 25 ◦C،

گرادیان خطی 10→ 25 درصد فاز متحرک B (0.1 درصد اسید فرمیک در استونیتریل) در فاز متحرک A (0.1 درصد اسید فرمیک در H2O) بیش از 12 دقیقه، سرعت جریان - 0.4 میلی لیتر در دقیقه، حجم تزریق - 2 میکرولیتر، محدوده UV - 190-490 نانومتر (رزولوشن 3.6 نانومتر). تجزیه و تحلیل MS در حالت یون منفی با یونیزاسیون الکترواسپری (ESI)، با استفاده از تنظیمات زیر انجام شد: محدوده اسکن 100-1200 m/z. ولتاژ مویرگی 2.8 کیلو ولت؛ ولتاژ مخروط 35 ولت؛

دمای منبع 150 ◦C; دمای تخلیه 450 ◦C; نابودی

جریان گاز 900 لیتر در ساعت و جریان گاز مخروطی 100 لیتر در ساعت. جمع آوری و پردازش داده ها با استفاده از نرم افزار Waters MassLynx 4.1 انجام شد.

پیک‌های گلیکوزید فنیل پروپانوئید (PPG) با مقایسه داده‌های LC-MS به‌دست‌آمده با ترکیبات قبلاً جدا شده شناسایی شدند [8]. کمی سازی PPG ها در عصاره گل جارو بر اساس روش UPLC-UV با تشخیص در 330 نانومتر و کالیبراسیون استاندارد خارجی با استفاده ازاکتئوزید(سیگما آلدریچ، 99 درصد، HPLC) به عنوان

استاندارد گروه منحنی کالیبراسیون خطی در شش غلظت در محدوده 200-1 ug/mL تهیه شد و خطی بودن خوبی را نشان داد (R2

0.999). نتایج کمی نشان دهنده میانگین مقدار SD سه تزریق و به صورت میلی گرم بیان شداکتئوزیدمعادل (eq) در هر گرم عصاره (mgاکتئوزیدمعادله / گرم).

2.5. فعالیت ضد رادیکال در شرایط آزمایشگاهی

2.5.1. روش مهار رادیکال ABTS

آزمایش ضد رادیکال ABTS با استفاده از روش توصیف شده توسط Kontek و همکاران انجام شد. [9]، با تغییرات جزئی به شرح زیر: 20 درصد MeOH برای تهیه معرف ها (7 میلی مولار ABTS و 4.9 میلی مولار پتاسیم در هر) استفاده شد.

سولفات)؛ محلول‌های عصاره‌های OC، PA و PR در چهار سطح غلظت در محدوده 100-400 ug/mL و محلول‌های Trolox در شش سطح غلظت در محدوده 10 250 میکروگرم بر میلی‌لیتر، با 50 درصد MeOH. نسبت نمونه به محلول کاری ABTS 1:25 (v/v) بود. جذب در طول موج 734 نانومتر پس از 30 دقیقه انکوباسیون اندازه گیری شد

در تاریکی با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-vis (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

مهار جذب (درصد) به صورت زیر محاسبه شد: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] × 100.

معادل Trolox (TE) عصاره گل جاروبرقی محاسبه شد

با استفاده از فرمول TE=msample/mstandard، که در آن m شیب خط مستقیم است

منحنی های خط (بازداری جذب در مقابل غلظت). مقدار TE از

نمونه فعالیت عادی خود را در برابر Trolox توصیف می کند (TEStandard =

1.0). مقادیر IC50 برای عصاره های OC، PA و PR و Trolox بود

تجربی به دست آمد، سپس از خط مستقیم آنها محاسبه شد

منحنی ها (بازداری جذب در مقابل غلظت) و در بیان می شوند

ug/ml.

سنجش در سه تکرار انجام شد و نتایج ارائه شده است

به عنوان میانگین ± انحراف استاندارد (SD).

2.5.2. روش مهار رادیکال DPPH

آزمایش ضد رادیکال DPPH با استفاده از روش توصیف شده توسط Jedrejek و همکاران انجام شد. [8] و برند-ویلیامز و همکاران. [10]، با تغییرات جزئی به شرح زیر: محلول‌های عصاره‌های OC، PA و PR، در چهار سطح غلظت در محدوده 50▽ 250 ug/mL، و محلول‌های Trolox، در شش سطح غلظت در محدوده 10▽ 250 ug/mL با 50 درصد MeOH تهیه شد. نسبت نمونه به DPPH 1:19 (v/v) بود. جذب در 517 نانومتر پس از 30 دقیقه انکوباسیون در تاریکی با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-vis (Evolution 260 Bio) اندازه‌گیری شد. مهار جذب (درصد) به صورت زیر محاسبه شد: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] × 100. مقادیر معادل Trolox (TE) و IC50 نمونه های آزمایشی به همان روشی که در آزمون ABTS (بخش 2.5.1) محاسبه شد. سنجش در سه تکرار انجام شد و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شد.

2.6. محلول‌های موجود در ترکیبات و عصاره‌های گیاهی آزمایش‌شده برای آزمایش‌هایی با پلاسمای انسانی

محلول‌های استوک ترکیبات و عصاره‌های گیاهی در 50 درصد DMSO تهیه شد. غلظت نهایی DMSO در نمونه‌های مورد آزمایش کمتر از 05/0 درصد بود و اثرات آن در تمام آزمایش‌ها مشخص شد.

2.7. جداسازی پلاسمای انسانی

خون انسان یا پلاسما از شش اهداکننده منظم (زن و مرد غیر سیگاری) به بانک خون (لودز، لهستان) و یک مرکز پزشکی (لودز، لهستان) گرفته شد. خون به عنوان یک محلول CPD (سیترات/فسفات/دکستروز؛ 9:1؛ حجم خون/CPD) یا محلول CPDA (سیترات/فسفات/دکستروز/آدنین؛ 8.5:1؛ v/v؛ خون/CPDA) جمع‌آوری شد. اهداکنندگان حداقل دو هفته قبل از اهدا، هیچ دارو یا مواد اعتیادآور (از جمله تنباکو، الکل و مکمل های آنتی اکسیدانی) مصرف نکرده بودند. تجزیه و تحلیل ما از نمونه‌های خون بر اساس دستورالعمل‌های اعلامیه هلسینکی برای تحقیقات انسانی انجام شد و توسط کمیته اخلاق تحقیق در آزمایش‌های انسانی در دانشگاه لودز تأیید شد. پلاسما با سانتریفیوژ خون تازه انسان در گرم 4500 به مدت 25 دقیقه در دمای اتاق تهیه شد. غلظت پروتئین با اندازه گیری جذب نمونه های آزمایش شده در طول موج 280 نانومتر، طبق روش ویتاکر و گرانوم [11] محاسبه شد.

2.8. نشانگرهای استرس اکسیداتیو در پلاسمای انسان

2.8.1. اندازه گیری پراکسیداسیون لیپید

پراکسیداسیون لیپیدی پلاسما با اندازه گیری غلظت مواد واکنش دهنده اسید تیوباربیتوریک (TBARS) اندازه گیری شد. غلظت TBARS با استفاده از ضریب خاموشی مولی (ε=156، 000 M 1 cm 1) محاسبه شد. این روش به طور کاملتر در موارد دیگر [12،13] توضیح داده شده است. 2.8.2. اندازه‌گیری گروه کربونیل سطح گروه‌های کربونیل با استفاده از ضریب خاموشی مولی (ε=22،000 M 1 cm 1) محاسبه شد و به‌عنوان nmol گروه‌های کربونیل بر میلی‌گرم پروتئین پلاسما بیان شد. 13] و لوین و همکاران. [14]. 2.8.3. تعیین گروه تیول محتوای گروه تیول در پروتئین‌های پلاسما به روش اسپکتروفتومتری با استفاده از دستگاه SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH، آلمان) با جذب در طول موج 412 نانومتر با 5،5'-dithiol-bis-({24}} اسید نیتروبنزوئیک) اندازه‌گیری شد. این روش با جزئیات بیشتر در جای دیگری توضیح داده شده است [15-17].

2.9. پارامترهای هموستاز

2.9.1. اندازه گیری زمان پروترومبین (PT)

PT با استفاده از انعقاد نوری به روش انعقادی تعیین شد

حروف نتایج آزمون Tukey را نشان می دهد (p < 0.05)، مقادیر با همان

حرف در یک ردیف تفاوت قابل توجهی ندارد.

2.9.2. اندازه گیری زمان ترومبین (TT)

TT با استفاده از یک آنالایزر انعقادی نوری (مدل K-3002، Kselmed، Grudziadz، لهستان)، مطابق روشی که توسط Malinowska و همکارانش توضیح داده شده است، به صورت انعقادی تعیین شد. [18].

2.9.3. اندازه گیری زمان ترومبوپلاستین جزئی فعال (APTT)

طبق گفته Mali now ska و همکاران، APTT با استفاده از یک آنالایزر انعقادی نوری K{0}} (Kselmed، Grudziadz، لهستان) به صورت انعقادی تعیین شد. [18].

2.10. تجزیه و تحلیل داده ها آزمون کیو دیکسون برای حذف داده های نامشخص انجام شد.

داده ها از نظر توزیع نرمال با آزمون شاپیرو-ویلک و برابری واریانس با آزمون لوون مورد آزمون قرار گرفتند. تفاوت‌های آماری معنی‌دار با استفاده از ANOVA و به دنبال آن آزمون مقایسه‌های چندگانه توکی یا آزمون Kruskal-Wallis مشخص شد. مقایسه ها در p < 0.05="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="" شد.="" مقادیر="" به="" صورت="" میانگین="" ±="" sd/sem="" ارائه="" می="">