PART 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide Inhibits OVX-induced Bone Loss in Mice And RANKL-induced Osteoclastogenesis
Mar 02, 2022
مقدمه
پوکی استخوان-بیماری که مشخصه آن کاهش توده استخوانی است، ریز ساختار غیرطبیعی بافت استخوان، افزایش شکنندگی استخوان، و شکستگی (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006)— در حال حاضر بیش از 200 میلیون نفر را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار می دهد و بار پزشکی و اقتصادی اجتماعی قابل توجهی را بر جامعه مدرن ارائه می دهد (استروم و همکاران، 2011). درمان بالینی پوکی استخوان عمدتاً بر جایگزینی هورمون، بیس فسفونات، یا درمان دنوسوماب تمرکز دارد. این روش ها موثر هستند اما عوارض جانبی طولانی مدت مانند خطر بالقوه سرطان پستان و شکستگی استخوان ران غیرpical (سیاه و سفید, باور, شوارتز, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof- Bauer, 2011). از این رو نیاز فوری به کشف داروهایی وجود دارد که نه تنها می توانند مهار کنندپوکی استخواناما همچنین دارای عوارض جانبی نامطلوب کمتر.
سیستانچه بیابانیکولا(CD)، یک غذای مقوی و دارویی که به طور گسترده ای در چین استفاده می شود، معروف به "جینسنگ بیابانی"، ساقه خشک شده با برگ مقیاس ازسی کویرکولاYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) و دارای تنوع و موثر استداروییفعالیت، مانند تنظیم ایمنی بدن، ضد اکسیداسیون، و ضد-پوکی استخوانخواص (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). مطالعات قبلی در مورد مواد فعال سی دی در درمان پوکی استخوان عمدتا بر روی متمرکزفنایلتانوئیدگلیکوسایدها(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). با این حال، سی دی همچنین شامل اجزای موثر دیگر مانند iridoids، lignans،پلی ساکریدها(Wang, Zhang, & Xie, 2012). کاربرد بالینی طب سنتی چینی (TCM) عمدتاً آب زدایی است.پلی ساکریدهااجزای محلول در آب هستند و به احتمال زیاد اجزای اصلی فارماکودینامیک TCM هستند. پلی ساکریدهای استخراج شده از TCM به طور وحشی گزارش شد که ضد-پوکی استخواناثر و چند عوارض جانبی نامطلوب، که به طور کلی در کلینیک ها استفاده شده است (به عنوان مانند، پلی ساکرید استخراج شده از Epimedium brevicornum (ژنگ، او، وو، Cai، & Wei، 2020)، Achyranthes bidentata (ژانگ، وانگ، & یان، 2018)، و موریندا officinalis (یان و همکاران، 2019)). بنابراین ما این فرضیه را مطرح کرده بودیم کهسیستانچه بیابانیکولاپلی ساکرید(CDP) استخراج شده از سی دی ممکن است یک داروی بالقوه امن برای درمان پوکی استخوان باشد.
به طور معمول، جذب استخوان و تشکیل استخوان تعادل پویایی را در حین بازسازی استخوان در هماهنگی با چندین نوع سلول از جمله استئوکلاست ها، استئوبلاست ها، سلول های پوشش استخوانی، و استئووسیت ها حفظ می کند (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). استراحت در این تعادل می تواند منجر به انواع بیماری های متابولیک استخوان، مانندپوکی استخوان(Zhu et al., 2018) and osteosclerosis (Ihde et al., 2011). استئوکلاست ها، به عنوان سلول های پایانی- مشتق شده از خط خطی تک هسته ای/ماکروفاژی، تنها سلول هایی هستند که عملکرد جذب استخوان دارند (Teitelbaum, 2000). دو سیتوکین کلیدی وجود دارد که در تمایس و بلوغ استئوکلاست شرکت می کنند (کوگا و همکاران، ۲۰۰۴): عامل تحریک کننده کلونی ماکروفاژ (M-CSF) و فعال کننده گیرنده لیگاند فاکتور هسته ای κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF میانجی گری از تفکیک سلول های بنیادی خون ساز به تولید کننده های استئوکلاست و ترویج تفکیک استئوکلاست ها با تنظیم بیان گیرنده RANK (تاکایاناگی، 2007). اتصال RANKL و RANK بر سطح سلول استئوکلاست منجر به موارد زیر می شود: (1) جذب مولکول های آداپتور سیگنالینگ مانند فاکتور 6 مرتبط با گیرنده TNF (TRAF6)؛ (2) فعال سازی اهداف پایین دست متعدد، از جمله NF- κB و کینازهای پروتئین فعال میتوگن (MAPKs)؛ and (3) upregulation of the expression levels of nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). فعال شدن این مسیرهای سیگنالینگ به طور مستقیم بیان ژن های استئوکلاست را تنظیم می کند، از جمله اسید فسفاتاز ۵ (Acp5) [encoding tartrate-resistant acid phosphatase (TRAcP)], matrix metalloproteinase 9 (MMP9), and cathepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). بنابراین مهار مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با استئوکلاست ناشی از RANKL یک روش درمانی بالقوه برای پوکی استخوان است.
در اين مطالعه با هدف تعيين اثرات درمان CDP بر اواريککتومی شده (OVX) القا شدهپوکی استخوانمدل موش در زنده و بر روی فعالیت استئوکلاست ناشی از RANKL در شرایط آزمایشگاهی، با تمرکز بر بیان ژن های خاص استئوکاست و فعال سازی NFATc1 و مسیرهای سیگنالینگ NF-κB و MAPKs. یافته های ما ممکن است بینش های جدیدی را در مورد پتانسیل CDP به عنوان یک داروی امن و موثر برای درمان پوکی استخوان فراهم کند.
برای کسب اطلاعات بیشتر با ما تماس بگیرید:Joanna.jia@wecistanche.com
2. مواد و روش ها
2.1. مواد شیمیایی و جمع آوری نمونه
سی دی (شماره 180801) از شرکت طب سنتی چینی آنهویی جیشون، با مسئولیت محدود (آنهویی، چین) خریداری شد و توسط پروفسور هایبو هوانگ از دانشکده علوم دارویی، دانشگاه پزشکی چین گوانگ ژو، گوانگ ژو، چین شناسایی شد. قرص های والرات استردیول از بایر (لورکوزن، نوردراین وستفالن، آلمان) خریداری شد. آلفا اصلاح شده حداقل محیط ضروری
(α-MEM) و سرم گاو جنین (FBS) از گیبکو (ترمو فیشر علمی، والتام، MA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. پنی سیلین/استرپتوومایسین و کیت رنگ آمیزی TRAcP از سولاربیو (پکن، چین) به دست آمد. M-CSF موش ترکابی و RANKL موشک ترکابی طرفدار درمان سیستم های R&D (مینیاپولیس، MN، ایالات متحده آمریکا) بودند. صفحات پوشیده از هیدروکسی آپاتیت از علوم زندگی کورنینگ (سنت لوول، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. آنتی بادی های اولیه برای NFATc1 و CTSK (سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)؛ IκB-α, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK, and P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan- vers, MA, USA); و β (CWBIO، پکن، چین) نیز به دست آمد. سایر ریجنت های مورد استفاده در این مطالعه از درجه تحلیلی بودند و آب توسط سیستم تصفیه آب میلی کیو (میلی پور، بدفورد، MA، ایالات متحده آمریکا) تصفیه شد.
2.2. استخراج CDP
سی دی زمین به پودر خوب بود و مخلوط با تریس اتر نفت آن را شکست. باقی مانده جامد توسط تصفیه جمع آوری شد و سپس در دمای اتاق خشک شد. Theپلی ساکریدهااز نمونه های از قبل درمان شده سه برابر با آب به مدت 2 ساعت، متمرکز، با اضافه شدن اتانول انیدرو به غلظت نهایی 80 درصد (v/ v) استخراج و در 4 پوند C به مدت 24 ساعت ذخیره شدند. بارش ها با استفاده از سنتریفوژ در 3000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه جمع آوری شد، در آب تقارن حل شد، و تصفیه (حذف پروتئین های آزاد) با استفاده از روش Sevag (ژائو و همکاران، 2019). بهبود یافتهپلی ساکریدهادیالیز شده بودند، خشک، و ذخیره می شدند تا استفاده بیشتر. علاوه بر این، نتایج ترکیب شیمیایی نشان داد که کل قند، اسید اورونیک، سولفات و پروتئین CDP 67.63 0.98٪ ، 21.05 0.49٪، 1.90 0.24٪، و 81/8 0.36٪.
ترکیب مونوساخارید و تجزیه و تحلیل مادون قرمز تبدیل فوریه CDP در شکل مکمل 1 و 2 نشان داده شد.
2.3. مدل موش پوکی استخوان ناشی از OVX
تمام آزمایش های حیوانی توسط کمیته اخلاق حیوانات دانشگاه پزشکی چین گوانگ ژو (مصوب SYXK 2019-0202) تأیید شد. سی موش ماده 6 هفته ای C57BL/6 توسط مرکز حیوانات آزمایشی دانشگاه پزشکی چین گوانگ ژو تأمین شد. پس از تحسين به مدت يک هفته به يک گروه از موش ها يک عمل شام (گروه شام) داده شد، در حالی که موش های باقی مانده تحت عمل اواريککتومی (گروه OVX) قرار داشتند. پس از عمل جراحی به موش ها اجازه داده شد تا به مدت ۱ هفته بهبود یابند. سپس موش ها با موفقیت مدل سازی شدند و به طور تصادفی به 5 گروه تقسیم شدند که 6 موش در هر گروه بودند:
(1) گروه شام: تحت درمان با آب تطرح شده، (2) گروه OVX: درمان با آب تطرح شده، (3) OVX E2 گروه (E2): درمان با 0.13 میلی گرم در کیلوگرم قرص والرات استردیول، (4) OVX CDP گروه دوز پایین (CDP-L): درمان با 300 میلی گرم در کیلوگرم CDP، (5) OVX CDP گروه دوز بالا (CDP- H): درمان با 600 میلی گرم در کیلوگرم CDP. آب تغز شده، E2، یا CDP روزانه یک بار توسط وحشی تجویز می شد. تمام موش ها پس از 12 هفته درمان قربانی شدند (شماره 1A). ادرار ها جمع آوری و وزن شدند و دریاس چپ برای معاینات بعدی جمع آوری شد. نمونه خون کامل جمع آوری و در 5000 rpm برای
15 دقیقه در 4 دلار آمریکا. سوپرناتانت های سرم مشتاق بودند و در ذخیره می شدند
—80 دلار C تا تجزیه و تحلیل بیشتر.
2.4. میکرو محاسبات توموگرافی (میکرو سی تی) تجزیه و تحلیل و استخوان histomorphometry
تیبیاهای چپ با پارافورمالدهید ۴٪ به مدت ۴۸ ساعت ثابت شدند و متعاقباً در لوله های سانترریفیوژ حاوی سالین طبیعی قرار گرفتند. نمونه های ثابت با استفاده از تنظیمات زیر اسکن شدند: ولتاژ، 80 کیلو ولت؛ منبع جریان, 100 μA; فیلتر Al, 0.5 میلی متر; پیکسل
اندازه, 9.76 میکرومتر; و مرحله چرخش، 0.6 پارامترهای متعددی از
استخوان ترابکولار شامل تراکم معدنی استخوان (BMD)، کسر حجم استخوان (BV/TV)، سطح استخوان در حجم کل (BS/TV)، تعداد ترابکولار (Tb. N)، و فاصله ترابکولار (Tb. Sp) با استفاده از نرم افزار CT-Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan) اندازه گیری شد. تصاویر سه بعدی با استفاده از نرم افزار CTVol (Bruker micro-CT) تولید شدند. Skyscan).
پس از تجزیه و تحلیل میکرو سی تی، تیبیاهای چپ در محلول EDTA 14 درصد decalcified شدند و برای بخش بندی در پارافین تعبیه شدند. نمونه ها با استفاده از ميکروتوم قبل از آزمايش های رنگ آمیزی هماتوکسیلين و يوزين (H&E) و TRAcP به بخش های 5 ميکرومتری تکه تکه شدند. بخش های رنگی با استفاده از دامنه خرد المپوس CX 31 (شرکت نوری المپوس، با مسئولیت محدود، توکیو، ژاپن) مورد بررسی و مستند سازی قرار گرفتند.
سیستانچهمی تواند تراکم استخوان را افزایش دهد و پوکی استخوان را تسکین دهد
2.5. تجزیه و تحلیل سرم
غلظت کلسیم (Ca) و فسفر (P) بر اساس دستورالعمل کیت طراحی شده توسط موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ (نانجینگ، چین) تعیین شد. سطح TRAcP-5b و RANKL در سرم به ترتیب با استفاده از کیت TRAcP-5b ELISA (CUSABIO، ووهان، چین) و کیت RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., ووهان چین) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
2.6. در آزمایشگاهی استئوکلاستوژنز assay
BMMها از استخوان درنگ و استخوان 6 هفته ای موش های C57BL/6 ماده جدا شدند. سلول های جدا شده در محیط α-MEM حاوی 25 ng/mL M-CSF، 10 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین/استرپتوومایسین کشت داده شدند. پس از رسیدن به تلاقی، BMMs (1 104 سلول در چاه) در صفحات 96 چاه بذرپاشی و با CDP در حضور 50 ng/mL RANKL درمان شد. متوسط و CDP هر 2 روز یک بار جایگزین شدند. پس از 7 روز، سلول ها با پارافورمالدهید 4 درصد ثابت شدند و برای حضور TRAcP رنگ آمیزی شدند. تعداد استئوکلاست ها که به عنوان سلول های مثبت TRAcP با سه یا چند هسته تعریف می شوند، با استفاده از میکروسکوپ سبک شمارش و مستند شدند.
2.7. سلول های تکثیر
BMMs (1 × 104 سلول / چاه) در یک بشقاب 96 چاه بذر و جوجه کشی یک شبه. پس از این، سلول ها با غلظت های مختلف CDP (0، 0.625، 1.25، 2.5، 5، 10، 20، و 40 میکروگرم در میلی میلی یل) به مدت 48 ساعت درمان شدند. تلاقی سلول با استفاده از زوم IncuCyte® (Essen BioScience، Ann Arbor، MI، ایالات متحده آمریکا)، یک سیستم تصویربرداری سلول زنده پویای بلند مدت و بی درنگ شناسایی و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
2.8. بررسی جذب هیدروکسی آپاتیت
BMMs (1 104 سلول در چاه) در یک صفحه پوشیده از هیدروکسی آپاتیت بذر، درمان با CDP در غلظت های نشان داده شده (0، 5، و 10 میکروگرم در میلی متر در میلی گرم) ، و کشت به طور کامل α- MEM حاوی 25 ng/mL M-CSF و 50 ng/mL RANKL. پس از 7 روز، سلول ها با محلول سفید کننده 10 درصد شسته شدند تا اجزای سلول حذف شوند. تصاویر مناطق جذب هیدروکسی آپاتیت با استفاده از زوم IncuCyte® ضبط و با استفاده از نرم افزار ImageJ (NIH، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) (Abramoff، Magelhaes، & Ram، 2003) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
2.9. جداسازی RNA و زمان واقعی معکوس رونویسی کمی PCR (RT-qPCR) تجزیه و تحلیل
BMMs (1 105 سلول در چاه) در یک صفحه 6 چاهی بذرپاشی شد و با RANKL و M-CSF در حضور CDP در غلظت های مختلف (0، 5، و 10 میکروگرم در میلی میلی گرم) به مدت 5 روز تحریک شد. RNA کل از سلول ها یا بافت استخوانی موش ها با استفاده از ریجنت TRIzol (سیگما آلدریچ) جدا شد. DNA مکمل از 2 میکروگرم کل RNA با استفاده از کیت رونویسی معکوس (TransGen Biotech، پکن، چین) سنتز شد. واکنش های RT-qPCR با استفاده از SuperMix QPCR سبز PerfectStart™ (TransGen Biotech) تهیه و توسط سیستم ABI 7500 (کاربردی) شناسایی شد
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). پارامترهای دوچرخه سواری برای PCR به این صورت تنظیم شد: 95 به مدت 5 دقیقه و به دنبال آن 40 چرخه 95 برای 15 s، و 60 دلار C برای 30 s. آغازگرهای خاص مورد استفاده در جدول 1 نشان داده شده اند، و کمیت هر ژن هدف به GAPDH (کنترل داخلی) طبیعی شد.
2.10. تجزیه و تحلیل بلات غربی
BMMs (5 105 سلول / چاه) در یک صفحه 6 چاه بذر. برای آزمایش های کوتاه مدت دوره زمانی، سلول ها با غلظت های مختلف CDP (0، 5 و 10 میکروگرم بر میلیL) به مدت 1 ساعت از پیش جوجه کشی شدند و سپس با 50 ng/mL RANKL به مدت 30 دقیقه درمان شدند. برای مدت طولانی، سلول ها با 50 ng/mL RANKL در روزهای 3، 5، و 7 در حضور CDP (0، 5، و 10 میکروگرم در میلی L) تحریک شدند. پروتئین های کل با استفاده از بافر لیز RIPA (CWBIO) استخراج شدند. پروتئین ها با ۱۰٪ SDS-PAGE از هم جدا شدند و به غشاهای PVDF منتقل شدند. غشاها با 5 درصد شیر اسکیم در دمای اتاق به مدت 2 ساعت مسدود شدند که با اولیه انکوبه شدند
آنتی بادی یک شبه در 4 ، و سپس با ثانویه مربوطه
آنتی بادی برای 1.5 ساعت. غشاها با استفاده از رجنت های ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) توسعه داده شدند و تصاویر با استفاده از سیستم تصویربرداری شیمی لومینسانس تانون ۵۲۰۰ (علم و فناوری تانون، شانگهای، چین) گرفته شدند.
سیستانچهمی تواند تراکم استخوان را افزایش دهد
2.11. تشخیص انتقال NFATc1 با استفاده از آزمون ایمونوفلورسانس
BMMs بر روی پوشش های 12 چاهی بذرپاشی شد، با RANKL و M-CSF تحریک شد و به مدت 5 روز با CDP 10 میکروگرم در میلیلیتر درمان شد. سلول ها با پارافورمالدهید 4 درصد به مدت 15 دقیقه ثابت شدند، سه گانه شسته شده با PBS، و با 1/0 درصد تریتون ایکس-100 به مدت 10 دقیقه بی ثبات شدند. سلول ها با سرم بز 10 درصد (CWBIO) مخلوط شدند و به مدت 2 ساعت انکوبه شدند. پس از آن، سلول ها با آنتی بادی اولیه یک شبه در 4 دلار C و سپس با الکسا فلور 488 بز آنتی بادی ثانویه ضد موش (Abcam، کمبریج، MA، ایالات متحده آمریکا) در تاریکی به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. پوشش با PBS شسته شد, نصب شده در طولانی مدت طلا ضد فد نایب السلطنه با 4′, 6-diamidino-2-phenyl در دول (DAPI) (خورشیدی), و
بازرسی با استفاده از Zeiss LSM 800 با میکروسکوپ Confocal Airyscan (کارل Zeiss، Oberkochen، آلمان).
2.12. تجزیه و تحلیل آماری
تمام داده های تجربی با استفاده از نرم افزار آماری SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. داده های مطالعات حیوانی و سلولی به ترتیب به معنی sEM و ± SD بیان می ± معنی است. نتایج با استفاده از تجزیه و تحلیل یک طرفه واریانس یا آزمون تی دانش آموز است. مقادیر p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">
سیستانچهمی تواند کاهشآپوپتوزو استخوان را تقویت کنیدتراکم
