PART 1: Cistanche Extracts Ameliorates The Neurotoxicity Induced By Hydrogen Peroxide in New Mutant DJ‐1‐transfected Neuroblastoma Cellular Models

تماس:joanna.jia@wecistanche.com

1. مقدمه

بیماری های اصلی نورودژنراتیو شاملآلزایمربیماری، بیماری پارکینسون (PD)، بیماری هانتینگتون، و دیگران. در میان این اختلالات، میزان بروز PD(بیماری پارکینسون) در جهان دوم است و در افراد بالاتر از ۶۰ سال به ۱٪–۲٪ دست می یابد (Burke & O'Malley, 2013; ملارد، ۱۳۹۶؛ Shen & Ji, 2013). به عنوان ویژگی عصبی عمده PD، نورون های دوپامینرجی در سوبستانتیا نیگرا پارس کومپاکتا دژنراتیو پیشرونده هستند (Glizer & MacDonald, 2016) که با ظاهر α‐ شمولات سینوکلین به نام بدن های لوی (ژانگ، آن، ژانگ، & پو، ۲۰۱۰) همراه است. در بیماری زا شدن PD، لرزش استراحت، سفتی، برادی کینزی، و ناهنجاری های وضعیتی به عنوان علائم اصلی PD در کلینیک تشخیص داده می شوند. اگرچه مکانیسم های دژنراتیو پیشرونده دقیق نورون های دوپامینرژی قابل درک نیستند، یا علل محیطی از جمله قرار گرفتن در معرض حشره کش ها، عوامل سم زدایی عصبی، و فلزات سنگین، و یا علل ژنتیکی مانند جهش پارکین (کیتادا و همکاران، 1998)، α‐سینوکلین (پلیمروپولوس و همکاران، 1997)، و دی جی‐1 (بیوسا و همکاران، 2017؛ اعتقاد بر این است که بونیفاتی و همکارانش، ۲۰۰۳) منجر به وقوع PD می شود. تا به امروز، تعداد جهش های missense، جهش های تغییر شکل فریم، و حذف قطعه بزرگ ناشی از جهش ژن DJ‐1 بیش از 10 (آندرس‐ماتوس و همکاران، 2007؛ Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003). در داخل ‐1 دی جی، جایگزینی Leucine166Proline (L166P) می ایستد به عنوان مهم است. علاوه بر این، همچنین نشان داده شده است که استرس اکسیداتیو در PD رخ می دهد (Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, & Sontakke, 2009) and is involved in its pathogenesis (Hague et al., 2003).

دی جی‐۱ ژن حاوی هشت اکسون توزیع شده بیش از ۲۴ کیلو بایت، بر روی کروموزوم ۱p۳۶ در انسان قرار دارد (بونیفاتی و همکارانش، ۲۰۰۳)، و یک پروتئین بسیار محفوظ حاوی ۱۸۹ اسید آمینه را کدگذاری می کند. پروتئین متعلق به خانواده ThiJ/PfpI بود، به صورت همودیمر وجود دارد. سلول های گلیال درون قشر و زیرستانتیا نیگرا و استریاتوم اصلی ترین سلول هایی هستند که در مناطقی از پروتئین DJ‐1 یافت می شوند (Olzmann et al., 2007). در این سلول ها دی جی‐۱ نقش های زیر را ایفا می کند، مانند اونکوژن (ناگاکوبو و همکاران، ۱۹۹۷)، تنظیم رونویسی (کیم و همکاران، ۲۰۰۵؛ ۲۰۰۵) Niki, Takahashi‐ Niki, Taira, Iguchi‐Ariga, & Agria, 2003), antioxidative stress (Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), chaperone (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete, & Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko, & Fink, 2006), and protease (Abou‐Sleiman, Healy, Quinn, Lees, & Wood, 2003).

درمان بیماری های نورودژنراتیو: عصاره سیستانچه

سیستانچهطب سنتی چینی است و عمدتا مورد استفاده قرار گرفته است برای درمان بیماری آندرولوژی پایین سنین. مواد تشکیل دهنده عمده فعالسیستانچهاز جمله ۳۴ ترکیب، مانند اکتئوسید، اکیناکوساید و غیره، فنل گلیکوساید هستند. اثرات فارماکولوژیکعصاره های سیستانچهشامل بهبود عملکرد جنسی، ضد پیری، افزایش توانایی یادگیری و حافظه، محافظت عصبی، ایمنی، آنتی فاتیگ، آنتی ایسکمیک، و حفاظت از کبد (Tu et al., 2011). کافئیک اسید یکی از متابولیت های عمده سیستانچه است (یان، ۲۰۱۸).

مدل های سلولی که معمولاً مورد استفاده قرار می گیرند شامل سلول های PD ۱‐متیل‐۴‐ فنیل pyridinium ion‐عوا شده PC12 سلول ها (Abou‐Sleiman et al., 2003) and hydrogen peroxide (H2O2)‐induced neuroblastoma (SH‐SY5Y) cells (Zhang et al., 2009). با این حال، ویژگی های پاتولوژیک معمولی PD در این مدل ها وجود ندارد. برای توسعه یک مدل سلولی مرتبط با فیزیولوژیکی PD، در این مطالعه سلول های L166P و C106S دی جی‐1‐ترانسفکت شده SH‐SY5Y H2O2 را ایجاد و اثرات سلول های SH‐Y5Y را مورد بررسی قرار داد.عصاره های سیستانچهو ترکیبات کلیدی زیست فعال، از جمله اکتیوساید، اکیناکوساید، اسید کافئیک، وسیستانچه کل گلیکوسایدهاروی این دو مدل، برای اولین بار.

عصاره سیستانچه بیماری های ضد نورودژنراتیو

2. مواد و روش ها

2.1 | پلاسمیدها، داروها، مواد شیمیایی، و سلول ها

FLAG‐L166P DJ‐1, FLAG‐C106S DJ‐1 plasmids, and anti‐DJ‐1 poly‐ clonal antibodies were kindly supplied by Dr. Hiroyoshi Ariga, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University. حداقل محیط ضروری کم آب شده (MEM) و محیط f‐12 از گیبکو خریداری شد. لیپوفکتین اهل اینویتروژن بود. FastDigest Xho I and FastDigest EcoR I were from Fermentas. کیت آماده سازی پلاسمید بدون اندوتوکسین از بیوتک بود. سلول SH‐SY5Y از بانک سلولی آکادمی علوم پزشکی چین بود. کیت نایب السلطنه پروتئین BCA از پیرس بود. غشاهای PVDF از میلی پور بودند. آنتی ‐FLAG از GeneTex بود.عصاره های سیستانچه, including acteoside, echinacoside, caffeic acid, and Cistanche total glycosides, were supplied by the Department of Natural Medicines, School of Pharmaceutical Sciences, Beijing University.

2.2 | تقویت پلاسمیدها، استخراج، و تصفیه

پس از پرورش سلول های اشریشیا کلی JM109 در محیط مایع LB تا OD600 = 0.5، سلول های صالح با استفاده از روش کلرید کلسیم تهیه شدند. سپس اشریکلی صالح با استفاده از روش شوک گرمایی با DNA پلاسمید تبدیل شد و پس از آن تبدیل کننده ها بر روی صفحات LB حاوی آمبی سیلین به مدت 16 تا 24 ساعت در 37 درجه سانتی گراد کشت داده شدند. سپس یک کلونی مونوکلونی با موفقیت دگرگون شده در محیط مایع LB حاوی 50 میکروگرم بر میلی آمپری سیلین برای 12 ساعت اضافی در 37 درجه سانتی گراد انتخاب و کشت شد. پلاسمیدها با استفاده از کیت آماده سازی پلاسمید بدون ‐ با توجه به دستورالعمل تولیدکننده استخراج و تصفیه شدند.

2.3 | شناسایی پلاسمید

پلاسمیدهای استخراج شده تحت هضم آنزیمی قرار گرفتند و پس از آن پلاسمیدها و قطعات هضم شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد مورد بررسی قرار گرفتند. ژل حاصل در محلول EB به مدت 20–25 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شد و عکس برداری شد.

2.4 | انتقال پلاسمید به سلول های SH‐SY5Y

DNA پلاسمید خالص شده به سلول های SH‐SY5Y کشت شده در محیط MEM/F‐12 حاوی 10 درصد سرم گاو جنین منتقل شد. سپس سلول های ترانسفکت شده در محیط حاوی 400 میکروگرم بر میلی گرم G418 انتخاب شدند و پس از آن از 200 میکروگرم بر میلی میلی گرم G418 برای حفظ خط سلولی قابل انتقال استفاده شد.

2.5 | شناسايی سلول های ترانسفکت شده توسط بلات غربی

سلول های انتقال یافته SH‐SY5Y در بافر RIPA lysed شدند. پس از سنتریفوژ شدن lysate، غلظت پروتئین کل در سوپرناتانت با استفاده از یک کیت کمک کننده پروتئین BCA تعیین شد. سپس مقادیر مساوی عصاره پروتئین تحت الکتروفورز ژل sDS‐polyacrylamide 12.5 درصد قرار گرفت و بر روی یک غشای PVDF منتقل شد. غشای PVDF با 5 درصد شیر خشک غیر چرب در محلول TBST مسدود شد و برای ایمنی دهی فرآوری شد. آنتی ‐FLAG و ضد دی ‐J‐1 به عنوان آنتی بادی اولیه مورد استفاده قرار گرفت، و IgG ‐تشعل شده HRP آنتی بادی ثانویه بود. یک سیستم تشخیص شیمی لومینسانس افزایش یافته برای تشخیص پروتئین های هدف به کار گرفته شد.

2.6 | شناسايی ايمونوسيتوشيميايی سلول های ترانسفکت شده

سلول های SH‐SY5Y ترانسفکت شده با محلول پارافورمالدهید 4 درصد ثابت شدند و با محلول تریتون ایکس‐100 3/0 درصد بی اثر شدند و با سرم بز 10 درصد مسدود شدند. سپس سلول های مسدود شده ابتدا با آنتی بادی ضد ‐FLAG و آنتی بادی پلی کلنال ‐DJ‐1 و سپس با آنتی بادی ثانویه آنتی رابیت بز FITC‐مجواب شده انکوبه شدند. هسته های سلولی با هوچست ۳۴۲ رنگ آمیزی شدند و سلول ها تحت میکروسکوپ فلورسانس وارونه (IX‐71، Olympus) تجسم شدند.

2.7| سلول زنده ماندن assay

سلول های SH‐SY5Y ترجمه نشده و منتقل نشده به 96‐ اندود شدند، از جمله اکی ائوساید، اکتیناکوساید، کافئیک اسید، و سیستانچه کل گلیکوسایدها (به ترتیب 10، 20 و 40 میکروگرم بر میلی لتر)، اضافه شدند و سلول ها به مدت 6 ساعت قبل از درمان با 0.2 میلی متر H2O2 برای 1 ساعت اضافی انکوبه شدند. محیط دور انداخته شد، و زنده ماندن سلول با استفاده از MTT به عنوان در بالا شرح داده شد.

2.8 | تأثير عصاره سيستانچه بر زنده ماندن سلول ها

عصاره ها شامل اکتئوسايد، اکيناکوزيد، اسيد کافيک، و گليکوايدهای کل سيستانچه (به ترتیب 10، 20 و 40 ميکروگرم در ميکروليتر) اضافه شدند و سلول ها به مدت 6 ساعت قبل از درمان با 2/0 ميکرومتر H2O2 برای 1 ساعت اضافی انکوبه شدند. محیط دور انداخته شد، و زنده ماندن سلول با استفاده از MTT به عنوان در بالا شرح داده شد.

2.9 | تجزیه و تحلیل آماری

داده ها به عنوان میانگین sD ± آزمایش مستقل بیان می شوند. تفاوت بین گروه ها با استفاده از روش ‐ 22.0 SPSS و روش LSD مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقادیر p< 0.05="" were="" considered="">

سیستانچهگیاه

3 | نتیجه

3.1 | پلاسمیدها با موفقیت دگرگون و تصفیه شدند. پس از بیان جداگانه در E. coli JM109، پلاسمیدها با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد پس از هضم با آنزیم محدودیت استخراج و مورد بررسی قرار گرفتند (شکل 1). پلاسمیدهای 6.2‐kb به قطعات DNA خطی 5.4‐ و 0.8‐kb کلاف شدند که تأیید کرد پلاسمیدهای L166P و C106S DJ‐1 هر دو با موفقیت بیان و تصفیه شده اند.

3.2 | شناسایی سلول های ترانسفکت شده توسط بلاتینگ غربی. همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، ما شناسایی FLAG‐L166P دی جی‐1 و FLAG‐C106S دی جی‐1 باند در حدود 70 کیلودایی. سطوح بالای پروتئین FLAG‐tagged در سلول های SH‐SY5Y ترانسفکت شده نشان می دهد که جهش یافته های L166P و C106S DJ‐1 به شدت در ترانسفکتانت های مربوطه خود بیان شده اند.

3.3 | شناسایی ایمونوسیتوشیمیایی سلول های ترانسفکت شده. این نشان می دهد سیگنال های فلورسنت قوی از سلول های SH‐ SY5Y ترانسفکت شده پس از انکوباسیون با آنتی بادی های ضد ‐DJ‐1 یا ضدFLAG ‐ است. این امر سطوح بالای L166P و C106S DJ‐1 بیان شده در ترانسفکتانت ها را تأیید می کند.

3.4 | سلول های ترانسفکت شده نسبت به سلول های ترجمه نشده نسبت به H2O2 حساس تر بودند. پس از انکوباسیون به مدت 1 ساعت در حضور غلظت های درجه بندی شده H2O2 (0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0.5، و 1 میلی متر به ترتیب)، زنده بودن سلول های SH‐SY5Y منتقل شده با L166P یا C106S DJ‐1 وابسته به دوز در مقایسه با سلول های ترجمه نشده کاهش یافته است.

3.5 | عصاره سیستانچه مهار کاهش H2O2 ‐ القا شده SH‐SY5Y دوز زنده ماندن سلول‐به طور وابسته توسط درمان با مهارعصاره های سیستانچه، شامل اکی ائوساید، اکیناکوساید، اسید کافئیک، و گلیکوسایدهای کل سیستانچه (به ترتیب 10، 20، و 40 میکروگرم در میلی میلی تال).

سیستانچه