قسمت 1 تشخیص محصولات دارویی Cistanches Herba (Rou Cong Rong) با استفاده از امضاهای نوکلئوتیدی خاص

برای اطلاعات بیشتر لطفا تماس بگیرید:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-Ping Han 1*, Zheng Zhang 1* and Shi-lin Chen 3

1 آزمایشگاه کلیدی مواد فعال زیست فعال و منابع استفاده از داروهای گیاهی چینی، وزارت آموزش، موسسه توسعه گیاهان دارویی، آکادمی علوم پزشکی چین و کالج پزشکی اتحادیه پکن، پکن، چین، 2 اتحاد تحقیقاتی NHP، موسسه تنوع زیستی انتاریو (BIO) )، دانشگاه گوئلف، گوئلف، ON، کانادا،

3 آزمایشگاه کلیدی پکن برای شناسایی و ارزیابی ایمنی طب چینی، موسسه چینی مواد مدیکا، آکادمی علوم پزشکی چین، پکن، چین

Cistanche deserticola اثرات زیادی دارد، برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

Cistanches Herbaگیاهی دارویی است که خاصیت سم زدایی دارد و معمولا در آسیا استفاده می شود. به دلیل عدم تعادل بین عرضه و تقاضا، متخلفان اغلب برای سود اضافه می شوند. با این حال، هیچ نظارت نظارتی وجود ندارد زیرا ابزارهای کنترل کیفیت برای شناسایی محصولات به شدت فرآوری شده کافی نیستند. بنابراین، یک ابزار مولکولی جدید بر اساس امضاهای نوکلئوتیدی و پرایمرهای خاص گونه توسعه یافت. مناطق ITS2 از 251Cistanches Herbaو نمونه های تقلبی توالی یابی شدند. بر اساس سایت های SNP، چهار امضای نوکلئوتیدی در 30 تا 37 جفت باز و شش آغازگر مخصوص گونه توسعه یافتند، و آنها توسط مخلوط های تجربی مصنوعی متشکل از شش گونه مختلف و نسبت های مختلف تایید شدند. این روش همچنین برای شناسایی 66 مورد استفاده قرار گرفتCistanches Herbaمحصولات موجود در بازار، از جمله عصاره ها و داروهای ثبت اختراع چینی. نتایج نشان‌دهنده کاربرد امضاهای نوکلئوتیدی در شناسایی مواد تقلبی در مخلوط‌ها بود. مطالعه بازار 36.4 درصد تقلب را نشان داد: 19.7 درصد تقلب با Cynomorium songaricum یاسیستانچSinensis، و 16.7 درصد شامل تعویض با Cy. آهنگریکوم، سی. سیننسیس یا بوشنیاکیا روسیکا. نتایج همچنین نشان داد که Cy. songaricum رایج ترین خیانتکار در بازار بود. بنابراین، ما استفاده از امضاهای نوکلئوتیدی خاص گونه را برای تنظیم تقلب و تأیید تضمین کیفیت زنجیره تامین محصولات دارویی، به ویژه برای محصولات فرآوری شده که DNA آنها تخریب شده است، توصیه می کنیم.

کلید واژه ها: Cistanches Herba، پزشکی ثبت اختراع چینی، امضای نوکلئوتیدی، DNA تخریب شده، کنترل کیفیت دارو

مقدمه

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) یک داروی شناخته شده ثبت شده در فارماکوپه در آسیا است (کمیسیون فارماکوپه چین، 2015؛ کنوانسیون دارویی ژاپن، 2016). این دارو از ساقه های ساکولنت خشک شده به دست می آیدCistanche deserticolaYC Ma یاCistanche tubulosaتونیک، زیرا سمی نیست و می توان آن را برای مدت طولانی مصرف کرد (لی و همکاران، 2016). علاوه بر این،سیستانچهربا افتخار نامگذاری "جین سینگ صحرا" را به دلیل ارزش دارویی زیادی که دارد، به ویژه در تقویت عملکرد جنسی مردان دریافت کرد (ژانگ و سو، 2014؛ گو و همکاران، 2016). بیش از 100 داروی ثبت اختراع چینی در کمیسیون فارماکوپه چین (2015) و سایر استانداردهای رسمی اعلام شده محلی ثبت شده است (وانگ و همکاران، 2012). با افزایش جمعیت افراد مسن، تقاضای قابل توجهی برای این افراد وجود داردCistanches Herbaو فرآورده های دارویی آن با این حال، منابع مواد خام به طور فزاینده ای کمیاب می شوند. در واقع، دو گونه اصلی ازCistanches Herbaبه عنوان گیاهان وحشی محافظت شده توسط دولت (رده دوم) به کتاب داده قرمز گیاهان چین اضافه شده است (فو، 1991). مواد دارویی موجود در بازار عمدتاً در شمال غربی چین کشت می شود.

به دلیل عدم تعادل قابل توجه بین عرضه و تقاضاسیستانچهربا، بسیاری از خیانتکاران وارد بازار شده اند. این تقلب ها با استانداردها ناسازگار هستند و می توانند امنیت مواد مخدر را تهدید کنند. مواد تقلبی شناخته شده شامل ساقه های ساکولنت خشک Cynomorium songaricum Rupr است. (Cynomorii Herba، Suo Yang در چینی)،سیستانچsinensis Beck، Orobanche coerulescens Stephan، و Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (سان و همکاران، 2012). این مواد تقلبی دارای ویژگی‌های مورفولوژیکی مشابهی هستندسیستانچHerba، شناسایی طبقه بندی سنتی را دشوار می کند، به ویژه پس از پردازش مواد به محصولات دارویی. شناسایی میکروسکوپی در دسترس نیست زیراسیستانچهرباهیچ ویژگی میکروسکوپی قطعی یا منحصر به فردی ندارد. ابزارهای شیمی تحلیلی کنونی برای تشخیص تقلب Cistanches Herba کافی نیستند زیرا ترکیبات مشابهی نیز در مواد تقلبی شناخته شده Ci وجود دارد. سالسا (لی و همکاران، 2001؛ چن و همکاران، 2007) و سی. sinensis (لیو و همکاران، 2013). بنابراین، توسعه یک روش مولکولی سریع برای احراز هویت Cistanches Herba و محصولات آن برای سیستم های کنترل کیفیت مناسب در پزشکی ثبت اختراع چین و سایر صنایع فرآورده های دارویی به فوریت مورد نیاز است.

چن و همکاران برای اولین بار فاصله رونویسی داخلی 2 (ITS2) را به عنوان بارکد جهانی برای گیاهان دارویی پیشنهاد کرد (چن و همکاران، 2010). سان و همکاران ناحیه ITS2 را به عنوان بارکد DNA ترجیحی برای شناسایی تأیید کردسیستانچهربا و تقلب های آن (سان و همکاران، 2012). با این حال، ITS2 نمی تواند برای تشخیص پزشکی ثبت اختراع چینی از DNA تخریب شده استفاده شود. اخیراً، تعداد فزاینده‌ای از مطالعات نشان داده‌اند که «بارکد کوچک» روشی مفید برای تقویت DNA تخریب‌شده است (حاجی‌بابایی و همکاران، 2006؛ میسنیر و همکاران، 2008؛ دوبی و همکاران، 2011؛ ​​لو و همکاران، 2015). با این حال، امضاهای نوکلئوتیدی مناسب‌تر از بارکدهای کوچک هستند، زیرا شکل‌دهنده‌ها به یک یا چند نوکلئوتید اشاره می‌کنند که منحصر به یک گونه هستند و می‌توانند به طور موثر توسط بسیاری از تکنیک‌های مولکولی مانند پروب‌های DNA، میکروسیال‌ها و تقویت همدما با واسطه حلقه مورد استفاده قرار گیرند. دی بوئر و همکاران، 2015). هان و همکاران امضاهای نوکلئوتیدی را برای Panax ginseng، Angelica Sinensis و Lonicera japonica توسعه داد و با موفقیت داروهای ثبت اختراع چینی مرتبط را شناسایی کرد (لیو و همکاران، 2016؛ وانگ و همکاران، 2016a؛ گائو و همکاران، 2017).

محصولات کاربردی حاویسیستانچهربا به طور خاص، ما (1) چهار امضای نوکلئوتیدی و شش جفت آغازگر خاص را برای تمایز واقعی ایجاد کردیم.سیستانچهربا و مواد تقلبی شناخته شده، (2) چهار امضای نوکلئوتیدی را در آزمایش‌ها از جمله مخلوطی از کوپن‌های طبقه‌بندی شناخته‌شده مورد استفاده برای تهیه محصولات Cistanches Herba که حاوی مواد اصلی و تقلبی هستند، تأیید کرد، و (3) یک بررسی بازار از 66 مورد انجام داد.سیستانچمحصولات هربا از طریق امضای نوکلئوتیدی خود.

سیستانچاثرات زیادی دارد و می تواند عملکرد کلیه را بهبود بخشد

مواد و روش ها

جمع آوری و آماده سازی نمونه

در مجموع، 251 نمونه از مغولستان داخلی، سین کیانگ، و نینگشیا، در میان مناطق دیگر جمع آوری شد. این نمونه ها شامل 214 نمونه بودندCistanches Herbaو 37 تقلبی و در جدول تکمیلی S1 به تفصیل آمده است. نمونه‌های کوپن مربوطه توسط تاکسونومیست‌ها تأیید شد و در هرباریوم مؤسسه توسعه گیاهان دارویی، آکادمی علوم پزشکی چین، پکن، چین سپرده شد. در مجموع 35 دسته پودر، ادویه و عصارهسیستانچهربا از فروشگاه های آنلاین و داروخانه های آجر و ملات در پکن و چنگدو خریداری شد (جدول 1). در مجموع، 31 دسته از پزشکی ثبت اختراع چینی حاویسیستانچHerba از داروخانه های مختلف خریداری شد (جدول 2)، و ترکیبات اعلام شده داروهای ثبت اختراع مختلف چینی در جدول تکمیلی S3 نشان داده شده است. خصوصیات مورفولوژیکی مختلف اشکال دوزهای مختلف در شکل 1 نشان داده شده است.

نمونه های مخلوط: پودرهای Ci.دسرتیکولا، سی.توبولوزا، Cy. آهنگریکوم، سی. sinensis، B. rossica، و O. coerulescens به طور مصنوعی در ترکیبات مختلف (به نسبت 1:1) قبل از استخراج مخلوط شدند. جزئیات این نمونه های مخلوط در افسانه شکل 3 نشان داده شده است. deserticola در نسبت های وزنی مختلف: 10:1، 50:1، 100:1، 200:1، 500:1، 1000:1،

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1، 50000:1 و 60000:1 (جدول 3). و دو محصول اصلی به یک نسبت مخلوط می شوند.

جوشانده: برش های Ci. deserticola و Cy. برای تهیه جوشانده از songaricum استفاده می شد. برش ها (10 گرم) در 300 میلی لیتر آب دوبار تقطیر به مدت 30، 60، 90، 120، 150، 180، 210 و 240 دقیقه جوشانده شدند و سپس برای استخراج DNA استفاده شدند.

استخراج DNA، واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تقویت و تعیین توالی

نمونه ها، جوشانده و نمونه های مخلوط: نمونه ها (40 تا 50 میلی گرم) از طریق آسیاب مخلوط کن آزمایشگاهی Retsch MM400 (Retsch Co.، آلمان) با فرکانس 30 هرتز به پودرهای ریز تبدیل شدند. DNA ژنومی متعاقباً با یک کیت DNA ژنومیک جهانی گیاهی (شرکت Tiangen Biotech Beijing، چین) طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. ITS2 توسط پرایمرهای جهانی 2F/3R تقویت شد (چن و همکاران، 2010).

به صورت موازی در هر دسته پودر پزشکی ثبت اختراع چینی با 7{4}}0 میکرولیتر بافر پیش شستشو [100 میلی مولار Tris-HCl، pH 8.0 شسته شد. 20 میلی مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA)، pH 8.0.

7{3}}0 میلی مولار NaCl; 2 درصد پلی وینیل پیرولیدون (PVP)-40; و 0.4 درصد - مرکاپتواتانول] چندین بار تا زمانی که مایع رویی شفاف و بی رنگ شد، پس از آن مخلوط در 7500 × گرم به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. رسوب متعاقباً برای استخراج DNA ژنومی از طریق کیت DNA ژنومیک جهانی گیاهی (شرکت Tiangen Biotech Beijing) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. در پایان، DNA هر دسته در یک لوله متمرکز شد. شش جفت آغازگر مخصوص گونه-SYF1/SYR1، HMRCF/HMRCR، GHRCF/GHRCR، CCRF/CCRR،

SCRF/SCRR و LDF/LDR—از طریق Primer Premier طراحی شده‌اند

6. 0 نرم افزار (Premier Co., Canada) برای تقویت Cistanches Herba و عوامل تقلبی آن (جزئیات در جدول 4 نشان داده شده است). PCR در یک واکنش حجمی 50 میکرولیتری حاوی 1 میکرولیتر انجام شد

KOD FX (تویوبو، ژاپن)، 25 میکرولیتر بافر 2× PCR، 10 میکرولیتر dNTPs (2 میلی‌مولار)، 1.5 میکرولیتر از هر پرایمر (10 میکرومولار)، و 4 میکرولیتر (50 نانوگرم) الگوی DNA. حجم باقی مانده از آب دوبار تقطیر تشکیل شده است. واکنش ها توسط

چرخاننده حرارتی (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., USA)؛ برنامه های حرارتی در جدول 4 آمده است. محصولات PCR از طریق الکتروفورز ژل آگارز 3 درصد مورد بررسی قرار گرفت و برای توالی یابی دو جهته با یک توالی سنجی ABI 3730XL (شرکت Applied Biosystems) مطابق با روش توالی یابی Sanger خالص شد. سپس، حساسیت شش پرایمر از طریق روش کمی PCR (qRT-PCR) با سیستم Real-time CFX96 (آزمایشگاه Bio-rad، ایالات متحده آمریکا) مورد آزمایش قرار گرفت. آستانه چرخه به طور خودکار توسط سیستم از طریق مدل "PCR Baseline Subtracted Curve Fit" محاسبه شد. qRT-PCR در یک واکنش حجمی 15 میکرولیتری حاوی 7.5 میکرولیتر SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus) انجام شد.

(Takara Bio Co.، ژاپن)، 1.0 µL از هر آغازگر (10 میکرومولار)، و 1.0 µL الگوی DNA با حجم باقی‌مانده شامل آب دوبار تقطیر شده است. qRT-PCR با سه تکرار فنی انجام شد که بر اساس آن خطای استاندارد محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل توالی: توالی ها ویرایش و به صورت دستی از طریق CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA) مونتاژ شدند.

توالی های ITS از GenBank از طریق مدل Hidden Markov (HMM) برای به دست آوردن توالی های ITS2 حاشیه نویسی شدند (Keller et al., 2{3}}09). سپس توالی ها توسط نرم افزار MEGA 5.0 از طریق روش هم ترازی "Muscle" تراز شدند (ادگار، 2004؛ تامورا و همکاران، 2011).

سیستانچاثرات زیادی دارد و می تواند تقویت شودکلیهعملکرد

نتایج

توسعه امضاهای نوکلئوتیدی و جفت‌های پرایمر خاص گونه‌ها برای Cistanches Herba و Adulterants

نرخ موفقیت آمیزی PCR و توالی یابی 251 نمونه، زمانی که از جفت پرایمر 2F/3R استفاده شد، 100 درصد بود. طول تراز شده Cy. توالی songaricum ITS2 229 جفت باز بود (شکل S1 تکمیلی). تجزیه و تحلیل توالی‌های گونه‌های هرباریوم و توالی‌های گونه‌های نزدیک به هم که از GenBank (جدول تکمیلی S2) بازیابی شده‌اند، دو مکان پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) را برای Cy نشان داد. songaricum. بر اساس SNP ها، یک Cy. Songaricum-specific 30- امضای نوکلئوتیدی bp (5'-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') توسعه داده شد (شکل 2A). نتایج ابزار جستجوی همترازی محلی پایه (BLAST) در NCBI نشان داد که این امضای نوکلئوتیدی منحصر به Cy است. songaricum (جدول 5). با تجزیه و تحلیل مشابهی از توالی از گونه های نزدیک، یک تا دو SNP از Ci کشف شد. sinensis، B. rossica، و O. coerulescens. بر اساس SNPs، امضاهای نوکلئوتیدی برای سه عامل تقلبی دیگر نیز به طور مشابه ایجاد شد، از جمله امضای 34 جفت باز (5'-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3') برای Ci. Sinensis، امضای 37 جفت باز (5'- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') برای B. rossica، و امضای 31 جفت باز (5'-gtctgtcgtg tcggatggtg tcggatggtg ttgcttgttg'{26}gtg. (شکل 2BD). تجزیه و تحلیل BLAST در NCBI همچنین نشان داد که این امضاهای نوکلئوتیدی خاص بوده و در هیچ گونه دیگری وجود ندارد (جدول 5).

Cistanches Herbaو مواد تقلبی آن می توانند به طور همزمان از مخلوط ها از طریق جفت پرایمر جهانی 2F/3R تقویت شوند. بنابراین، ما آغازگرهای گونه‌ای خاص را برای تقویت امضای نوکلئوتیدی با هم‌تراز کردن توالی‌های ITS2 طراحی کردیم. چهار جفت پرایمر خاص - SYF1/SYR1، CCRF/CCRR، SCRF/SCRR، و LDF/LDR- برای تقویت امضاهای نوکلئوتیدی Cy طراحی شدند. songaricum، B. rossica، Ci. sinensis و O. coerulescens به ترتیب (جدول 4). طول آمپلیکون ها به ترتیب 123، 72، 131 و 71 جفت باز بود.

علاوه بر این، در مجموع 214 توالی ITS2 از مواد تجربی Cistanches Herba مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. دو آغازگر اختصاصی کوتاه - HMRCF/HMRCR و GHRCF/GHRCR برای Ci. deserticola و Ci. توبولوزا به ترتیب برای تقویت نواحی کوتاه نمونه های تخریب شده طراحی شدند (جدول 4). طول آمپلیکون ها به ترتیب 132 و 134 جفت باز بود.

اعتبار سنجی روش پرایمر امضای نوکلئوتیدی و گونه خاص بر اساس مخلوط ها و جوشانده مصنوعی

راندمان تقویت جفت آغازگر جدید از مخلوط تایید شد. همانطور که نشان داده شده است، محصولات PCR از طریق هر جفت پرایمر برای هر گونه هدف به دست آمد

مقادیر cq B. rossica یا O. coerulescens را می توان به دست آورد حتی نسبت نمونه ها 30000:1 یا 40000:1 بود و نتایج تقویت Ci. sinensis، Ci.توبولوزاو Ci deserticola زمانی قابل تشخیص بود که نسبت 20000:1 بود. اما هیچ نتیجه قابل تشخیصی برای Cy بدست نیامد. songaricum زمانی که نسبت 20000:1 را تشکیل می داد.

برای بررسی اینکه آیا روش امضای نوکلئوتیدی با مواد فرآوری شده کار می کند یا نه، جوشانده Ci. deserticola و Cy. songaricum تهیه شد. نتایج نشان داد که بارکد کوتاه از Ci. حتی پس از جوشاندن نمونه ها به مدت 210 دقیقه، deserticola می تواند تقویت شود. علاوه بر این، امضای نوکلئوتیدی Cy. songaricum را می توان پس از جوشاندن نمونه ها به مدت 150 دقیقه تکثیر کرد، در حالی که پس از جوشاندن نمونه ها به مدت 210 یا 240 دقیقه، هیچ محصول PCR شناسایی نشد (شکل 4). نتایج توالی یابی نشان داد که امضای نوکلئوتیدی کوتاه با موفقیت از جوشانده به دست آمد.

بررسی بازار تقلب از طریق امضای نوکلئوتیدی و آغازگرهای خاص

روش فوق برای تشخیص استفاده شدسیستانچمحصولات هربا در بازار سی و پنج دسته ازسیستانچبرش‌ها، پودرها و عصاره‌های هربا با استفاده از شش آغازگر خاص طراحی‌شده تکثیر و توالی‌یابی شدند (نتایج الکتروفورز ژل آگارز در شکل تکمیلی S2 و توالی‌ها در برگه داده‌های تکمیلی 1 فهرست شده‌اند). تجزیه و تحلیل توالی ها از طریق امضای نوکلئوتیدی آنها نشان داد که پنج دسته از برش ها معتبر بودند. یک دسته برش و یک دسته پودر با Cy جایگزین شدند. songaricum و یک عصاره با Ci جایگزین شد. sinensis شش دسته دیگر از پودرها مخلوط بودند: پنج دسته با Cy تقلبی شده بودند. songaricum و Ci. sinensis و یکی با Cy تقلب شده بودند. songaricum (جدول 1). علاوه بر این، یک دسته برش با مریم گلی جایگزین شد.

Cistanches Herba در داروهای ثبت اختراع چینی تحت فرآیندهای مختلفی قرار می گیرد که احراز هویت را دشوار می کند. توانایی شش جفت آغازگر برای تقویت مناطق امضای نوکلئوتیدی خاص گونه از داروهای ثبت اختراع چینی مورد آزمایش قرار گرفت (نتایج الکتروفورز ژل آگارز در شکل تکمیلی S2 نشان داده شده است). اکثر داروهای ثبت اختراع چینی حاوی اجزای انواع مختلفی از گونه ها هستند. به عنوان مثال، قرص Shihu Yeguang (ZCY34) حاوی 25 ماده است، از جمله Cistanches Herba (Rou Cong Rong)، Dendrobii Caulis (Shi Hu) و Ginseng Radix et Rhizoma (رن شن). از این مواد، Cistanches Herba را می توان به طور خاص از طریق جفت آغازگر GHRCF/GHRCR تقویت کرد. توالی یابی مستقیم محصولات PCR آثار بسیار تمیزی را نشان داد. با این حال، یک نوار قابل مشاهده با جفت پرایمر HMRCF/HMRCR به دست نمی آید.

مثال دیگر قرص های Kangguzhi Zengsheng (ZCY44) است. علاوه بر این، هشت ماده وجود داردسیستانچHerba در این داروی ثبت اختراع چینی، اما هیچ نوار قابل مشاهده ای وجود نداشت که توسط GHRCF/GHRCR یا HMRCF/HMRCR به دست آمد، به این معنی که هیچCistanches Herbaحضور داشت. با این حال، منطقه متجاوز Cy. songaricum با موفقیت توسط جفت پرایمر خاص SYF1/SYR1 تقویت شد. نتایج توالی یابی امضای نوکلئوتیدی کوتاه Cy را نشان داد. songaricum با موفقیت به دست آمد.

سیستانچعملکردهای زیادی دارد و داردضد التهاباثرات