قسمت 1: Echinacoside از طریق تنظیم مسیر ROS/ATF3/CHOP در برابر آپوپتوز عصبی ناشی از MPP پلاس محافظت می کند

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید

گونه ها (ROS) نیز به توسعه آن کمک می کنند [3]. ویژگی های مشابه PD را می توان توسط چندین سموم محیطی، از جمله 1-متیل-4-فنیل{3}}، 2،3،6-تتراهیدروپیریدین (MPTP)، سیانید، دی سولفید کربن، و تولوئن MPTP به طور گسترده ای برای القای مدل های حیوانی PD استفاده می شود و متابولیت فعال آن، 1-متیل-4- یون فنیل پیریدینیم (MPP?)، در مدل های سلولی PD استفاده می شود [4، 5]. MPP؟ به طور انتخابی زنجیره انتقال الکترون را مهار می کند و منجر به تولید بیش از حد ROS می شود و در نتیجه باعث مرگ نورون ها و سندرمی شبیه PD می شود [6]. مطالعات اخیر نشان داده است که MPP? مسیرهای متعددی را در یک مدل PD in vitro القا می‌کند، از جمله افزایش فسفوریلاسیون GSK3B (pY206) و تجمع a-synuclein [5]، تنظیم مثبت هم اکسیژناز{16}}/نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید فسفات اکسیداز اکسیداز/ROS محور [7، ROS]. 8]، افزایش بیان فاکتور رونویسی فعال 3 (ATF3) و توقف رشد از طریق 153 (GADD153)/C/EBP-پروتئین همولوگ (CHOP) القایی با آسیب DNA [9]. در درمان بالینی، سرکوب محصولات ROS یکی از مهم ترین استراتژی ها برای بقای نورون ها و درمان PD است [1].

اکیناکوزید(ECH، شکل 1A)، طبیعی استفنیل اتانوئیدکه در بسیاری از گیاهان دارویی یافت می شود، جزء اصلی آن استفنیل اتانوئیدگلیکوزیدهاجدا شده از گیاه سنتی چینی،سیستانچسالسا [10]. جالب است که مطالعات اخیر نشان داده استECHدارای اثرات محافظتی در مدل موشی PD ناشی از MPTP است [10، 11].ECHهمچنین آپوپتوز سلول نوروبلاستوما ناشی از فاکتور نکروز تومور-a یا {1}هیدروکسی دوپامین را در شرایط آزمایشگاهی کاهش می دهد [12، 13]. با این حال، مکانیسم هایی که توسط آنECHبقای نورون‌ها را در مدل سلولی PD ناشی از MPP؟ نامشخص باقی می‌ماند.

ما این را نشان دادیمECHبه طور قابل توجهی محصولات ROS ناشی از MPP را کاهش داد؟ در سلول های SH-SY5Y.ECHهمچنین بیان ATF3، CHOP و a-synuclein ناشی از MPP را مهار کرد و همچنین فعال‌سازی پروتئین‌های پرو آپوپتوز کاسپاز{4}} و پلی (ADP-ribose) پلیمراز (PARP) را مهار کرد.

سیستانچاکیناکوزیدداردمحافظ عصبیاثرات

مواد و روش ها

معرف ها

حداقل محیط ضروری Dulbecco (DMEM)، سرم جنین گاو، 0.25 درصد تریپسین، 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین، و معرف TRIZol از Life Technologies (Grand Island، NY) بود. رنگ کروماتین بیس بنزیمید (Hoechst 33342)، پلی ال-لیزین، MPP؟ یدید و MPTP از سیگما (سنت لوئیس، MO) بودند. کیت سنجش پراکسیداسیون لیپیدی مالون دی آلدئید (MDA) و دی کلروفلورسئین دی استات (DCFH-DA) از Beyotime Biotech (هایمن، چین) بود. ECH با خلوص C98 از Push Biotechnology (چنگدو، چین) بود.

حیوانات و درمان

نگهداری و درمان حیوانات همانطور که قبلاً توضیح داده شد [14] بود. ما از موش‌های نر C57BL/6 (شرکت حیوانات آزمایشگاهی شانگهای، شانگهای، چین) با وزن 24 تا 26 گرم در 10 هفتگی استفاده کردیم. حیوانات تحت شرایط استاندارد (نور: 12:12 ساعت نور: چرخه تاریکی، 2±21 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 40 درصد) نگهداری شدند و اجازه دسترسی آزاد به غذا و آب را داشتند. تمام مراحل توسط کمیته اخلاق حیوانات بیمارستان Zhongshan، دانشگاه فودان تایید شد و مطابق با راهنمای موسسه ملی سلامت برای مراقبت و استفاده از

حیوانات آزمایشگاهی

موش ها به طور تصادفی به چهار گروه (10 موش/گروه) تقسیم شدند: گروه A، گروه کنترل وسیله نقلیه، با توجه به حجم مساوی (500 لیتر) نرمال سالین (NS). گروه B، گروه کنترل ECH، با 20 mg/kg ECH. گروه C، گروه مدل MPTP، پیش تیمار شده با حجم مساوی NS. و گروه D، گروه تحت درمان با ECH، پیش تیمار شده با mg/kg 20ECH. ECHدر NS حل شد و با تزریق داخل معده هر 24 ساعت به مدت 15 روز متوالی تحویل داده شد. مدل PD موش برای گروه‌های C و D با پنج تزریق متوالی داخل صفاقی 30 میلی‌گرم بر کیلوگرم MPTP هر 24 ساعت از روز 11 تا 15 تولید شد. کیلوگرم) به صورت داخل صفاقی 24 ساعت پس از درمان نهایی.

پرفیوژن و پردازش بافت همانطور که قبلاً توضیح داده شد [14] بود. پس از پرفیوژن داخل قلب، نمونه‌های مغز جمع‌آوری شد و در پارافورمالدئید 4 درصد به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد تثبیت شد، در پارافین جاسازی شد و بخش‌های تاجی که کل SNc را در بر می‌گرفت (مختصات استریوتاکسی قدامی خلفی -3}}}.64 تا {2{2{. میلی متر نسبت به برگما) در 5 میلی متر برش داده شد.

5 حیوان دیگر از هر گروه با دررفتگی دهانه رحم کشته شدند و مغز میانی شکمی به سرعت در بافر لیز SDS 1 درصد روی یخ لیز شد. سطوح پروتئین CHOP و ATF3 در lysate با وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت.

سیستانچاکیناکوزیداثر نشاط بخشی داردکلیه

کشت مغز میانی شکمی موش صحرایی (VM)

نورون های دوپامینرژیک

موش های باردار ویستار از شرکت حیوانات آزمایشگاهی شانگهای (شانگهای، چین) خریداری شدند. نورون‌های DA در VM در روز 14 جنینی جدا شدند. VM تشریح شد و برای ایجاد کشت‌های اولیه نورون VM DA همانطور که قبلاً توضیح داده شد، پردازش شد [15، 16]. به طور خلاصه، قطعات بافت در محلول نمک متعادل هنکس سرد یخی (HBSS) جمع‌آوری شدند و با سرعت 1{8}}00 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. گلوله بافت در 750 لیتر تریپسین-HBSS 0.1 درصد به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2 انکوبه شد. سرم جنین گوساله (FCS؛ 750 لیتر) برای غیرفعال کردن تریپسین استفاده شد و بافت‌ها با تریتوراسیون ملایم جدا شدند.

با استفاده از پیپت پاستور استریل شده سوسپانسیون های سلولی با سرعت 1000 دور در دقیقه به مدت 4 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند و مجدداً در محیط تمایز (محیط Eagle اصلاح شده توسط Dulbecco/F12، 33 میلی مول در لیتر D-گلوکز، 1 درصد L-گلوتامین، و 1 درصد مکمل FCS، 1 درصد) معلق شدند. B27). سلول ها روی صفحات کشت بافت چاهی پوشش داده شده با پلی دی لیزین (سیگما) در 5 9 104 سلول/چاه در محیط تمایز 500 لیتری در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2 به مدت 10 روز کاشته شدند تا تبدیل به

نورون های بالغ DA نورون های VM DA با ایمونوفلورسانس با آنتی بادی ایزوتیپ III ضد b-توبولین و آنتی بادی تیروزین هیدروکسیلاز (TH) مشخص شدند (شکل S1). سلول ها با 1 mmol/L MPP?، 40 LG/mL ECH، ترکیبی از MPP? و ECH یا PBS به تنهایی به عنوان کنترل. زنده ماندن سلولی پس از 96 ساعت درمان با معرف CCK{5}} آنالیز شد.

و به صورت میانگین ± SD (n {{0}}؛ **P \0 ارائه می‌شوند.01 در مقابل کنترل، #P \ 0.05، ##P \0.01 در مقابل MPP ؟ رفتار). C تصاویر میکروسکوپی نوری از تغییرات مورفولوژیکی ناشی از MPP؟ یا MPP؟ و ECH. الف، کنترل PBS؛ b، 40 لیتر در میلی لیتر ECH؛ c، 1 mmol/L MPP؟ d، 1 mmol/L MPP؟ و 10 لیتر در میلی لیتر ECH. e، 1 mmol/L MPP؟ و 20 لیتر در میلی لیتر ECH. f، 1 mmol/L MPP؟ و 40 لیتر در میلی لیتر ECH (نوار مقیاس، 200 لیتر).

سیستانچ اکیناکوزید دارای اثر مهار آپوپتوز است

کشت سلولی SH-SY5Y

سلول های SH-SY5Y از بانک سلولی موسسه زیست شناسی سلولی شانگهای (آکادمی علوم چین، شانگهای، چین) و در DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاو، 100 U/ml پنی سیلین و 100 U/mL استرپتومایسین کشت شدند. سلول ها در یک انکوباتور 37 درجه سانتیگراد مرطوب شده با 5 درصد CO2 نگهداری شدند. MPP؟ در آب استریل حل شد و بلافاصله مورد استفاده قرار گرفت. ECH در PBS حل شد. برای بررسی بیان ژن و سطوح پروتئین مرتبط با ROS، سلول‌ها در 6-صفحه‌های چاهی کاشته شدند و به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. سپس سلول ها با محیط تازه حاوی MPP?، ECH، ترکیبی از MPP? و ECH یا PBS به تنهایی به عنوان کنترل. پس از 24 ساعت درمان، سلول ها با 1 درصد بافر لیز SDS (1 درصد SDS، 25 میلی مول در لیتر EDTA، 45 میلی مول در لیتر Tris-HCl، pH 6.5) برای آنالیز وسترن بلات لیز شدند و RNA کل مستقیماً با آن جدا شد. معرف TRIZol.

برای تجزیه و تحلیل توزیع ATF3 و CHOP پس از درمان، کیت‌های معرف استخراج هسته‌ای و سیتوپلاسمی (Thermo Fisher، Waltham، MA) برای استخراج فراکسیون‌های سیتوپلاسمی و هسته‌ای از سلول‌های تحت درمان و کنترل با دارو استفاده شد.

سنجش زنده ماندن سلولی

سلول‌های SH-SY5Y در پلیت‌های چاهک کاشته شدند و یک شبه انکوبه شدند. سلول ها هر 24 ساعت با یک محیط کامل تازه حاوی داروهای مختلف تغذیه شدند و به مدت 3 روز نگهداری شدند. سپس زنده ماندن با استفاده از کیت شمارنده سلولی CCK8 (دوجیندو، ژاپن) ارزیابی شد. داده ها به نتایج حاصل از کنترل PBS نرمال شدند و به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شدند. برای تجزیه و تحلیل قابلیت زنده ماندن در سلول‌های ATF{6}} SH-SY5Y (ATF3 shRNA) و کنترل (GFP shRNA)، سلول‌ها به صفحات چاهی اضافه شدند و به مدت 14-16 ساعت کشت داده شدند. پلاسمیدهای ATF3 shRNA یا GFP shRNA با استفاده از Lipofectamine 2000 به سلول های SH-SY5Y ترانسفکت شدند (Life Technologies، Carlsbad، CA). سلول ها با 1 mmol/L MPP تیمار شدند؟ یا حجم مساوی از PBS پس از 24 ساعت ترانسفکشن و سپس به مدت 3 روز انکوبه شدند. شماره سلول ها هر روز شمارش می شد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه می شوند.

ساختارهای shRNA و آغازگرهای الیگو

ساختارهای pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) و GFP کنترل shRNA از شرکت GeneChem (شانگهای، چین) بودند. توالی هدف ATF3 50-GCAAAGT G!CCGAAACAAGA-30 از روش‌های توصیف‌شده قبلی بود [17، 18]. برای تشخیص بیان ژن القا شده توسط MPP؟، ژن های مرتبط با استرس ROS و مرتبط با PD برای qRT-PCR انتخاب شدند و GAPDH به عنوان کنترل استفاده شد. تمام آغازگرها توسط شرکت Sangon Biotech (شانگهای، چین) سنتز شدند و توالی های آغازگر در جدول 1 فهرست شده اند.

Real-Time PCR

RNA کل با معرف TRIZol طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. رونویسی معکوس و PCR زمان واقعی کمی (qRT-PCR) همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد. واکنش رونویسی معکوس با استفاده از کیت سنتز cDNA رشته اول RevertAid (Thermo Scientic, Waltham, MA) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. کیت SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa، Dalian، چین) برای qRT-PCR استفاده شد: 20-سیستم های واکنش lL با ABI (Life Technologies، Carlsbad، CA) استفاده شد. پارامترهای PCR شامل مراحل زیر است: 95 درجه سانتیگراد برای 3 دقیقه، 1 سیکل. 95 درجه سانتیگراد برای 5 ثانیه و 60 درجه سانتیگراد برای 40 ثانیه، 40 چرخه. داده های نهایی هیچ

به GAPDH اخلاقی شده و به عنوان نسبتی به کنترل ارائه می شوند. پرایمرهای مورد استفاده برای تقویت در جدول 1 فهرست شده است.

وسترن بلاتینگ

آنالیز وسترن بلات همانطور که قبلا توضیح داده شد [19] انجام شد. آنتی بادی های اولیه ضد شکاف کاسپاز 3 و p53 (فناوری سیگنالینگ سلولی، Danvers، MA)، ضد GAPDH (گروه Proteintech، شیکاگو، IL)، ضد GADD153/CHOP (Wanlei Bio، Shenyang، چین) و ضد ATF3، ضد PARP، ضد PUMA و آنتی هیستون 3 (سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، کالیفرنیا). آنتی بادی های ثانویه نشاندار شده با پراکسیداز ترب از آزمایشگاه تحقیقات ایمنی جکسون (Western Grove, PA) بودند. غشاهای PVDF از EMD Millipore (Billerica، MA) و بستر ECL از CWBio (سوژو، چین) بود. سطوح پروتئین نسبی بر اساس سطوح خاکستری از تصویر با نرم افزار Tanon GIS (Tanon Biotech، شانگهای، چین) تجزیه و تحلیل شد و داده ها به عنوان نسبت پروتئین هدف به GAPDH ارائه می شود.

سیستانچاکیناکوزیداثر محافظت از کبد دارد