قسمت 1 اثرات پیشگیرانه گلیکوزیدهای فنیل اتانول از Cistanche Tubulosa بر فیبروز کبدی ناشی از آلبومین سرم در موش صحرایی

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

خلاصه

زمینه:Cistanche tubulosa یک داروی گیاهی سنتی چینی است که به طور گسترده برای تنظیم ایمنی استفاده می شود.گلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش(CPhGs) از این گیاه در درجه اول مواد موثر هستند. هدف از این مطالعه بررسی اثرات پیشگیرانه و درمانی CPhGs بر فیبروز کبدی ناشی از BSA در موش صحرایی و مکانیسم‌های مولکولی مرتبط با سلول‌های ستاره‌ای کبدی بود. Biejiarangan (BJRG)، یکی دیگر از داروهای گیاهی سنتی چینی، به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد. روش‌ها: در آزمایش‌های in vivo، 75 موش صحرایی SD به‌طور تصادفی به 6 گروه عادی (تحت تیمار با آب مقطر)، مدل (تحت درمان با BSA)، داروی مثبت (تحت درمان با BSA به‌علاوه BJRG 6{27}}{29} تقسیم شدند. } میلی‌گرم/کیلوگرم در روز)، و گروه‌های CPhG به علاوه تیمار شده با BSA (125، 250، و 500 میلی‌گرم/کیلوگرم در روز). شاخص های کبد و طحال، سطح سرمی آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)، آلانین آمینوترانسفراز (ALT)، اسید هگزادسنوئیک (HA)، لامینین (LN)، پروکلاژن نوع III (PCIII)، کلاژن نوع IV (IV-C)، هیدروکسی پرولین ( Hyp) و فاکتور رشد تبدیل کننده 1 (TGF{13}}) در کبد موش اندازه گیری شد. نمرات هیستوپاتولوژیک فیبروز کبدی برای هر گروه با استفاده از رنگ آمیزی H&E و تری کروم ماسون ارزیابی شد. بیان TGF{14}}، کلاژن I (Col-I) و کلاژن III (Col-III) با روش رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی تعیین شد. این اثرات بیشتر در شرایط آزمایشگاهی با تعیین سطوح بیان NF-κB p65 و Col-I توسط تجزیه و تحلیل کمی PCR زمان واقعی مورد ارزیابی قرار گرفت. بیان پروتئین Col-I نیز توسط وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها: همه گروه‌های دوز (125، 25{38}} و mg/kg/day 500) CPhGs به‌طور معنی‌داری باعث کاهش شاخص کبد و طحال، کاهش سطح سرمی ALT، AST، HA، LN، PCIII، IV-C، محتوای TGF{26}} (P <0.01، p=""><0.01 و="" p=""><0.01)، و="" محتوای="" hyp.="" cphgs="" همچنین="" تورم="" سلول="" های="" کبدی="" را="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" کاهش="" داد="" و="" به="" طور="" موثر="" از="" نکروز="" سلول="" های="" کبدی="" و="" نفوذ="" سلول="" های="" التهابی="" جلوگیری="" کرد.="" نتایج="" ایمونوهیستوشیمی="" نشان="" داد="" که="" cphgها="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" بیان="" tgf{33}}="" (p=""><0.01، p=""><0.01 و="" p=""><0.01)، col-i="" و="" col-iii="" را="" کاهش="" دادند.="" اثرات="" آزمایشگاهی="" cphgs="" (100،="" 75،="" 50،="" و="" 25="" میکروگرم="" بر="" میلی‌لیتر)="" بر="" hsc-t6="" نشان="" داد="" که="" cphgها="" به="" طور="" قابل‌توجهی="" بیان="" mrna="" nf-kb="" p65="" و="" col-i="" را="" کاهش="" دادند="" و="" cphgs="" همچنین="" بیان="" پروتئین="" col-i="" را="" کاهش="" داد.="" نتیجه‌گیری:="" cphgها="" اثر="" ضد="" فیبروز="" کبدی="" قابل="" توجهی="" دارند="" و="" می‌توانند="" به="" عنوان="" عوامل="" محافظ="" کبدی="" برای="" درمان="" فیبروز="" کبدی="" استفاده="">

کلیدواژه ها: فیبروز کبدی، سیستانش توبولوزا، فنیل اتانول گلیکوزید، کموکاین BSA، پیشگیری و درمان.

زمینه

فیبروز کبدی یک پاسخ ترمیم زخم به آسیب شدید کبدی است که در پاتوژنز هپاتیت مزمن ناشی از عوامل مختلف رخ می دهد. این عوامل عبارتند از عفونت ویروسی، سوء مصرف الکل، کلستاز و بیماری های متابولیک و خودایمنی [1-3]. تجمع پیشرونده ماتریکس خارج سلولی (ECM) و کاهش بازسازی، ساختار طبیعی کبد را مختل می کند و منجر به فیبروز کبدی می شود [4]. فیبروز کبدی در بیماری مزمن کبدی حیاتی است و اغلب به سیروز برگشت ناپذیر و سرطان زایی تبدیل می شود. در حال حاضر هیچ روش یا داروی موثری برای درمان فیبروز کبدی وجود ندارد. بنابراین، یافتن یک داروی ضد فیبروز کبدی که پیشرفت آسیب کبدی به فیبروز و سرطان را کاهش دهد، ضروری است.Cistanche tubulosaW (از خانواده Orobanchaceae) یک گیاه انگلی است که به طور گسترده در منطقه جنوبی سین کیانگ در چین رشد می کند [5]. مردم معمولاً از آن برای تقویت کلیه ها، تغذیه خون، آرام کردن روده و به تاخیر انداختن پیری استفاده می کنند. رسماً در فارماکوپه چینی [6] فهرست شده است. C. tubulosa حاوی انواع مختلفی از اجزای فعال است. این شاملگلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش(CPhGs)، ایریدوئیدها و پلی ساکاریدها. به عنوان یکی از بسیاری از اجزای فعال درC. tubulosaCPhGs اثرات آنتی اکسیدانی، ضد خستگی، محافظت کننده عصبی و ضد التهابی قانع کننده ای را در مطالعات in vivo و in vitro نشان داده اند [7]. در سال های اخیر گزارش شده است که CPhGs(گلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش) اثرات محافظتی کبدی دارند. مکانیسم‌های بالقوه زیربنایی این اثرات عبارتند از: از بین بردن رادیکال‌های آزاد، محافظت از غشاهای کبدی، تنظیم ایمنی، مهار آپوپتوز، مهار بیان HBsAg و HBeAg، و مهار تکثیر DNA HBV و موارد دیگر [8-11]. با این حال، مطالعات کمی در ادبیات به اثر ضد فیبروز کبدی گرافیک می پردازد. بنابراین، این مطالعه با هدف بررسی اثر ضد فیبروز کبدی GPhCs با استفاده از مدلی از آلبومین سرم گاوی (BSA) فیبروز کبدی القا شده در موش صحرایی انجام شد. مکانیسم‌های مولکولی مرتبط در سلول‌های HSC-T6 مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها

مواد شیمیایی و معرف ها

یک کیت هیدروکسی پرولین (هیدرولیز قلیایی) (لات: 20140616) از موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ (چین) خریداری شد. کیت‌های ELISA ساندویچ Rat TGF- 1 (لات: 238240615) از Lianke Biotech Co., Ltd. (چین) خریداری شد. آنتی بادی Rabbit Anti-Collagen I (Lot: 140619)، آنتی بادی Rabbit Anti-Collagen III (Lot: 980788 W) و Rabbit Anti-TGF{8}} (Lot: 140619) توسط Beijing Biosynthesis Biotechnology Co. LTD (چین). محصور شده با سرم گوسفند معمولی (مایع کاری) (Lot: WP141214)، PV{11}} (Lot: WK141225) و کیت DAB (Lot: K136621D) از Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (چین) خریداری شد. . تشخیص آنتی بادی های اولیه با استفاده از 2. محلول آنتی بادی (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) و 2. محلول آنتی بادی (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (لات: 272387) خریداری شده از شرکت Invitrogen (ایالات متحده آمریکا) انجام شد. ). آلبومین سرم گاوی (BSA) (لات: SLBG8239V) از سیگما (ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. قبل از استفاده، BSA با غلظت 18 گرم در لیتر در نرمال سالین تهیه شد، باکتری ها با فیلتراسیون حذف شدند و BSA در دمای 4 درجه نگهداری شد. ادجوانت ناقص فروند حاوی 1 گرم لیپید از موی گوسفند (لات: AF0220LA14، Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (چین،) با 2 گرم پارافین مایع مخلوط شد (Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chem, Tianjin Fuyu Fuyu Fine Chem. Ltd. (چین،)، استریل شده در اتوکلاو بخار، و در دمای 4 درجه نگهداری شد. داروی مثبت BJRG به عنوان قرص Biejiarangan از Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (چین) تهیه شد. ذخایر دارویی BJRG با حل کردن تهیه شد. قرص BJRG در آب مقطر با غلظت 600 میلی گرم بر کیلوگرم.

مواد گیاهی

C. tubulosa(خانواده Orobanchaceae) از منطقه Minfeng در سین کیانگ چین خریداری شد. این ماده توسط محقق جون ژائو، آزمایشگاه کلیدی پزشکی اویغور، موسسه ماتریا مدیکا در سین کیانگ تأیید شد. نمونه‌های کوپن در موسسه ماتریا مدیکا سین‌کیانگ سپرده شدند.

تهیه CPhGs(گلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش)

ریزوم های خشک و برش داده شده ازC. tubulosa(6.{1}} کیلوگرم) به‌طور متوالی سه بار با 70 درصد اتانول تحت رفلاکس استخراج شد و حلال برای تولید عصاره اتانولی خارج شد. عصاره اتانولی با استفاده از رزین AB{3}} برای به دست آوردن گلیکوزیدهای فنیل اتانول (CPhGs) خالص شد. محلول‌های ذخیره CPhGs مورد استفاده برای گروه‌های دوز مختلف در مطالعات حیوانی (به ترتیب mg/kg 500، mg/kg 250 و mg/kg 125) در 0.5 درصد (5 گرم در لیتر) کربوکسی متیل سلولز (نمک سدیم) حل شد.

تعیین کمیت CPhGs(گلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش)

محتویات دو جزء (اکیناکوزید و آکتئوزید) در CPhGs توسط HPLC با استفاده از روشی که قبلا گزارش شده بود تعیین شد (Zhang et al. 20}04) [12]. HPLC با استفاده از Shimadzu LC-10 HPLC مجهز به آشکارساز UV انجام شد. ستون HPLC یک ستون Phenomenex Gemini ODS (250 × 4.6 میلی متر، 5 میکرومتر) بود. فاز متحرک ایزوکراتیک متانول-استونیتریل{8}} درصد اسید استیک (15:10:75، حجم/حجم/حجم) بود. شستشو به مدت 40 دقیقه و سرعت جریان در 0.6 میلی لیتر در دقیقه نگه داشته شد. دمای ستون در 30 درجه ثابت نگه داشته شد. تشخیص UV در 334 نانومتر بود.

حیوانات و رده سلولی HSC-T6

[درجه SPF] موش های نر بالغ سالم Sprague-Dawley (SD) (180-220 گرم) از مرکز حیوانات دانشگاه پزشکی سین کیانگ، شماره مجوز: SCXK (جدید) 2011-0004 خریداری شدند. موش‌ها با غذای بدون پاتوژن خاص (SPF) تغذیه شدند. تمام مراحل مربوط به آزمایشات حیوانی توسط کمیته اخلاق حیوانات اولین بیمارستان وابسته دانشگاه پزشکی سین کیانگ تایید شد. موش ها در قفس تحت شرایط محیطی کنترل شده (25 درجه و چرخه نور/تاریکی 12 ساعت) قرار گرفتند و دسترسی آزاد به غذای استاندارد پلت موش و آب لوله داشتند. موش ها قبل از درمان سازگار شدند. یک خط سلول ستاره ای کبد موش صحرایی جاودانه، HSC-T6، از شرکت بیوتکنولوژی ژن پروسل ووهان، با مسئولیت محدود به دست آمد. (ووهان، چین). سلول های HSC-T6 در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (گلوکز بالا) (DMEM، پکن، چین) همراه با 10 درصد سرم جنین گاو (Gibco، آمریکای جنوبی)، 100 IU/ml پنی سیلین و 100 ug/ml استرپتومایسین (Beijing) کشت داده شدند. ، چین) در انکوباتور مرطوب شده در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2.

آسیب کبدی ناشی از BSA و درمان

هفتاد و پنج موش SD به طور تصادفی به شش گروه تقسیم شدند: نرمال (تحت تیمار با آب مقطر)، مدل (درمان شده با BSA)، داروی مثبت (درمان شده با BSA به همراه BJRG 600 میلی گرم بر کیلوگرم در روز)، و تیمار شده با BSA به همراه CPhGs.(گلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش)(125، 250، 5{{20}}0 mg/kg/day) گروه. گروه های تحت درمان با BSA به علاوه CPhGs (125، 250، 500 میلی گرم/کیلوگرم در روز) در هر گروه 13 موش و گروه دیگر دارای 12 موش در هر گروه بودند. مدل آسیب کبدی ناشی از BSA به حساسیت اولیه و به دنبال آن یک حمله ایمونولوژیک تقسیم می شود) [13]. به جز گروه نرمال، به سایر گروه ها تزریق زیر جلدی متعدد با 0.5 میلی لیتر (9 میلی گرم بر میلی لیتر) ادجوانت ناقص BSA فروند در روز 1، روز 15، روز 22، روز 29 و روز 36 برای حساسیت اولیه داده شد. هفت روز پس از تزریق پنجم، خون از طریق شبکه سیاهرگ شبکیه موش گرفته شد و از نظر وجود آنتی بادی های آلبومین سرم مورد آزمایش قرار گرفت. آنتی بادی BSA در سرم موش با استفاده از روش انتشار دوگانه آگار شناسایی شد. تزریق حمله با تجویز 0.4 میلی لیتر BSA در نرمال سالین از طریق ورید دمی در موش های صحرایی آنتی بادی مثبت BSA دو بار در هفته به مدت ده بار انجام شد. غلظت و زمان تزریق 5.00، 5.50، 6.00، 6.50، 7.00، 7.50، 8.50، 9.{42}}، 9.50 و 10.00 بود. گرم در لیتر به ترتیب در روز 46، روز 50، روز 53، روز 57، روز 60، روز 64، روز 67، روز 71، روز 74 و روز 78. در گروه نرمال، از نرمال سالین برای تزریق اولیه ایمونولوژیک (حساسیت) و ثانویه (حمله) به جای BSA استفاده شد و سایر شرایط مانند گروه مدل بود. به گروه نرمال آب مقطر خوراکی با دوز 10 میلی لیتر بر کیلوگرم در روز داده شد. گروه مدل به صورت خوراکی 10 ml/kg/day محلول 0.5 درصد CMC-Na تجویز شد. گروه دارویی مثبت به صورت خوراکی mg/kg/day 600 BJRG تجویز شد. CPHGهای تیمار شده با BSA (125،

گروه‌های 250 و 500 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روز) به‌صورت خوراکی 125، 250 و 500 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روز CPhGs تجویز شدند.(گلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش)، به ترتیب. دوز روزانه موش ها به مدت دو هفته پس از آخرین تزریق ادامه یافت. پس از دوره آزمایشی، موش‌ها قبل از مصرف 10 درصد هیدرات کلرال به مدت 12 ساعت ناشتا قرار گرفتند و بلافاصله معدوم شدند. نمونه های سرم از هر موش صحرایی جمع آوری و بلافاصله مورد استفاده قرار گرفت. کبد برای دو هدف برداشت شد: (1) نگهداری در نیتروژن مایع برای کیت هایپ و (2) تثبیت در فرمالدئید 10 درصد برای بررسی های بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی. کل مدت مطالعات حیوانی 93 روز بود.

شاخص های کبد و طحال

كبد و طحال با لاپاراتومي تشريح و با سالين 4 درجه شسته شدند. پس از جذب آب اضافی با کاغذ صافی، کبد و طحال برای محاسبه شاخص های مربوطه وزن شدند: وزن نسبی اندام=جرم اندام (گرم) / توده بدن فردی (گرم) × 100 درصد [14].

آزمایشات سلولی

سلول‌های HSC-T6 در یک صفحه چاهک قرار گرفتند. در ابتدا سلول ها با DMEM حاوی 1{7}} درصد FBS به مدت 48 ساعت کشت داده شدند. سپس محیط با DMEM بدون FBS جایگزین شد تا سلول ها به مدت 12 ساعت گرسنگی نگه دارند. سپس سلول ها با DMEM حاوی 5.0 نانوگرم در میلی لیتر TGF{8}} (بدون FBS) به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. در نهایت، غلظت های مختلف CPhGs(گلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش)(100 میکروگرم در میلی‌لیتر، 50 میکروگرم در میلی‌لیتر، و 25 میکروگرم در میلی‌لیتر)، آکتئوزید (6 میکروگرم در میلی‌لیتر، 3 میکروگرم در میلی‌لیتر، و 1.5 میکروگرم در میلی‌لیتر)، و اکیناکوزید (500 میکروگرم در میلی‌لیتر، 250 میکروگرم در میلی‌لیتر، و 125 میکروگرم در میلی‌لیتر) در چاهک چهارتایی در پلیت انجام و به مدت 48 ساعت انکوبه شدند.

تجزیه و تحلیل زمان واقعی PCR

سطح بیان mRNA NF-kB، p65، و کلاژن I توسط PCR زمان واقعی تعیین شد. برای تعیین بیان mRNA در سلول های HSC-T6، سلول ها (4 × 105 سلول) در صفحات شش چاهی با 3 میلی لیتر DMEM با 10 درصد FBS کاشته شدند و یک شب در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 انکوبه شدند، پس از آن محیط کشت سلولی به DMEM بدون سرم تغییر یافتند. بعد، CPhGs(گلیکوزیدهای فنیل اتانول از سیستانش)(1{17}}0 ug/ml، 50 ug/ml، و 25 ug/ml)، اکتئوزید (6 ug/ml، 3 ug/ml و 1.5 ug/ml) و اکیناکوزید (500 ug/ml) 250 ug/ml و 125 ug/ml) به چاهک ها اضافه شد. پس از 48 ساعت انکوباسیون با CPhGs یا ترکیبات مونومر، RNA کل با استفاده از معرف TRIzol (Invitrogen، ایالات متحده آمریکا) استخراج شد و به مدت 15 ثانیه به شدت با کلروفرم به هم زد. پس از قرار گرفتن در دمای اتاق به مدت 3 دقیقه، لیزات در دمای 12،{14}} × گرم به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتریفیوژ شد. RNA در فاز آبی با ایزوپروپانول رسوب داده شد و فاز آبی بالایی به یک لوله میکروسانتریفیوژ جدید منتقل شد. RNA با افزودن 0.75 درصد اتانول رسوب داده شد و پس از آن لوله میکرو سانتریفیوژ و در دمای 12 × گرم در دمای 4 درجه به مدت حداکثر 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی برداشته شد و RNA به مدت 5 تا 10 دقیقه در دمای اتاق خشک شد. مجموعه خاصی از پرایمرها (Sangon، شانگهای، چین) که برای تقویت موش اکتین [GenBank: NM_031144.3]، Collagen I [GenBank: NM{_ 053304.1] و NF استفاده شد. ژن -kB p65 [GenBank: NM_199267}.2] با استفاده از Batch Primer 3 طراحی شد. پرایمرهای فوروارد (fw) و معکوس (rv) به شرح زیر بودند: کلاژن I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG). ، rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA)، NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG، rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA)، -اکتین (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G، rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). نتایج به mRNA ژن خانه داری -اکتین به عنوان یک کنترل داخلی نرمال شد و به عنوان سطوح mRNA نسبی ارائه شد. واکنش ها با 8 میکرولیتر iQ SYBR Green Supermix، 1 میکرولیتر جفت پرایمر 10 pM، 8.5 میکرولیتر آب مقطر و 2.5 میکرولیتر cDNA انجام شد. هر واکنش زنجیره ای پلیمراز تحت شرایط زیر انجام شد: 95 درجه برای 3 دقیقه، سپس 40 سیکل 10 ثانیه ای در 95 درجه، 30 ثانیه در 55 درجه، و 10 ثانیه در 55 درجه تا 95 درجه برای گسترش، و به دنبال آن اندازه گیری فلورسانس منفرد. . نتایج نهایی با مقادیر نسبی (2-ΔΔCt) توصیف شد. محاسبه و آنالیز توسط سیستم تشخیص PCR Real-Time iQ5 انجام شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سطح بیان پروتئین کلاژن I (Abcam، Cambridge، UK، Art No: ab34710) با وسترن بلات [با -اکتین (Lot: 60008-1-lg؛ Proteintech، چین) به عنوان کنترل خانه داری تعیین شد. عصاره های کل سلولی با استفاده از بافر سنجش رادیو ایمونوپسیتیشن (RIPA) (Thermo Scientific, USA) با کوکتل بازدارنده پروتئاز 1 درصد (Thermo Scientific, USA) و 1 درصد کوکتل های بازدارنده فسفاتاز Halt (Thermo Scientific, USA) تهیه شد. غلظت پروتئین با روش برادفورد [18] اندازه گیری و کمی سازی شد. پروتئین (50-10 میکروگرم) روی ژل 10 درصد SDS-PAGE جدا شد و به غشاهای PVDF (میلیپور، ایالات متحده آمریکا) منتقل شد. غشاها به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با 5 درصد BSA مسدود شدند و آنتی بادی های اولیه (آنتی بادی Anti-Colla gen I، رقت 1:200 یا mAb موش از -اکتین، رقت 1:5000) در دمای 4 درجه یک شبه انکوبه شدند. Alk-Phos مربوطه. آنتی بادی های ثانویه کونژوگه در دمای اتاق انکوبه شدند. در نهایت، غشاها سه بار با 1×Tris-HCl سالین با 0.1 درصد Tween 20 شسته شدند و سیگنال ها توسط سیستم تصویربرداری GEL DOC XR (Bio-Rad) اسکن و مشاهده شدند. آنالیز تراکم سنجی بر روی پروتئین های مورد نظر و نرمال شدن به اکتین توسط نرم افزار GEL DOC Image Studio (Bio-Rad) انجام شد. اکتین به عنوان کنترل داخلی استفاده شد.

تحلیل آماری

از آزمون نرمال بودن شاپیرو-ویلک و آزمون همگنی واریانس لوون برای تأیید نرمال بودن استفاده شد و You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2{8}}15) 23:52 صفحه 4 از 13 همگنی واریانس. تجزیه و تحلیل واریانس (ANOVA) و به دنبال آن آزمون تعقیبی توکی برای شناسایی تفاوت‌های آماری داده‌های ناهمگن و با توزیع نرمال استفاده شد. از آزمون ناپارامتریک کروسکال-والیس برای تجزیه و تحلیل داده هایی که به طور معمول توزیع نشده یا همگن هستند استفاده شد. نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد. اهمیت در P < 0.05="" تنظیم="" شد.="" تمامی="" داده="" ها="" با="" استفاده="" از="" نرم="" افزار="" spss="" 16.0="" (دانشگاه="" پزشکی="" سین="" کیانگ)="" مورد="" تجزیه="" و="" تحلیل="" قرار="">

نتایج

تعیین کمی CPhGs

CPhGs در C. tubulosa حاوی دو گلیکوزید فنیل اتیل الکل، اکیناکوزید و اکتئوزید است و محتوای آنها در CPhGها با تجزیه و تحلیل HPLC (شکل 1) 42.71 ± 0.42 درصد و 14.27 ± {{7} تعیین شد. }}.18 درصد بود.

شاخص های کبد و طحال

همانطور که جدول 1 نشان داده شد، شاخص های کبد و طحال گروه مدل به طور قابل توجهی افزایش یافت [P < 0.01،="" p=""><0.05]. شاخص="" های="" کبد="" و="" طحال="" داروی="" مثبت="" bjrg="" و="" cphgs="" در="" گروه="" های="" دوز="" مختلف="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" مدل="" [pliver="0.004،" pliver="0.003،" pliver="0" به="" طور="" قابل="" توجهی="" کاهش="" یافت.="" 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017،" pspleen="0.027،" pspleen="0.024،" pspleen="0.070،" به="" ترتیب].="" شاخص="" های="" کبد="" و="" طحال="" کمتر="" از="" گروه="" مدل="">

اثرات CPhGs بر فعالیت های ALT، AST و نشانگرهای فیبروز کبدی

در مطالعه حاضر، سطح سرمی آنزیم های کبدی AST و ALT در گروه مدل به طور قابل توجهی افزایش یافت که نشان دهنده آسیب سلولی کبدی در موش های فیبروز کبدی ناشی از BSA است. با این حال، آزمایشات.

نشان داد که درمان با BJRG (600 میلی‌گرم/کیلوگرم) و CPhGs (125، 250، و 5{{1{22}}}}}0 mg/kg) به طور قابل توجهی AST [PAST < 0="" را="" کاهش="" داد.0{{60}}1،="" past="">< 0.001،="" past=""><0.001، past=""><0.001 به="" ترتیب]="" و="" سطوح="" alt="" [palt="0.117،" palt="0.139،" palt="0.189،" palt="0.255،" به="" ترتیب]="" در="" موش‌های="" صحرایی="" فیبروز="" کبدی="" .="" (جدول="" 2).="" سطوح="" ha،="" ln،="" pc="" و="" iv-c="" در="" موش‌های="" مدل="" به‌طور="" معنی‌داری="" افزایش="" یافت="" [به="" ترتیب="" pha=""><0.001، pln=""><0.001، ppciii="0.002،" piv-c=""><0.001]. در="" مقایسه="" با="" گروه="" مدل،="" سطوح="" ha="" [pha="0.009،" pha="0.007،" pha="0.009،" pha="0.023،" به="" ترتیب]،="" ln="" [pln="0.011،" p="" ln="0.004،" p="" ln="0.026،" p="" ln="0.069،" به="" ترتیب]،="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006،="" pciii="0.067،" p="" pciii="0.136،" p="" pciii="0.296،" به="" ترتیب]="" و="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001،="" p="" iv-c="">< 0.001،="" p="" iv-c="">< 0.001،="" p="" iv-c=""><0.001، به="" ترتیب]="" در="" موش="" ها="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" توسط="" bjrg="" (600="" میلی="" گرم="" بر="" کیلوگرم)="" و="" cphgs="" در="" گروه="" های="" دوز="" مختلف="" (125،="" 250،="" و)="" کاهش="" یافت.="" 500="" mg/kg)="" (جدول="" 3).="" محتوای="" hyp="" و="" tgf{73}}="" محتوای="" کلاژن="" نیز="" با="" اندازه‌گیری="" سطح="" hyp="" در="" بافت="" کبد="" شناسایی="" شد.="" همانطور="" که="" در="" جدول="" 4="" نشان="" داده="" شده="" است،="" میانگین="">سطح در گروه مدل به طور قابل توجهی بالاتر از گروه نرمال بود، اما در گروه BJRG و گروه های دوز مختلف CPhGs به طور قابل توجهی کاهش یافت. غلظت کبدی TGF{{0}} گروه مدل در موش‌ها به طور قابل‌توجهی افزایش یافت [P < 0.001].="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" مدل،="" سطوح="" tgf-="" 1="" داروی="" مثبت="" و="" گروه‌های="" دوز="" مختلف="" cphgs="" بطور="" قابل="" توجهی="" کاهش="" یافت="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1=""><0.001، p="" tgf{10}}=""><0.001، ptgf{13}}="" به="" ترتیب=""><0.001]. نتایج="" در="" جدول="" 4="" خلاصه="" شده="">

بررسی هیستوپاتولوژیک

مشاهدات برش های بافت طبیعی کبد رنگ آمیزی شده با H&E و تری کروم ماسون، لوبول های کبدی و سینوسوئیدهای کبدی مشخصی را نشان می دهد. ساختار بافت کبد در موش‌های مدل دچار اختلال شد و بافت کبد و سینوس‌های کبدی با مقدار زیادی بافت همبند جایگزین شدند. با این حال، ساختار سلولی طبیعی بیشتر و بافت همبند کمتری در گروه درمان نسبت به گروه مدل شناسایی شد.

رنگ آمیزی H&E

در گروه نرمال، یکپارچگی ساختاری لوبول کبدی بدون نواحی پورتال غیرطبیعی و سینوسوئیدهای کبدی مشاهده شد. طناب‌های کبدی به‌صورت منظم، با هسته گرد و شفاف چیده شدند. هسته ها در مرکز سلول با سیتوپلاسم فراوان قرار دارند. فقط ناحیه پورتال دارای مقدار کمی بافت فیبری است (شکل 2a). در گروه مدل، ساختار لوبولار به شدت آسیب دیده بود. سلول های کبد انحطاط آبکی خفیف، عمدتاً انحطاط بالونی و/یا دژنراسیون چربی را نشان دادند. تشکیل انفیلتراسیون سلولی التهابی، هیپرپلازی وسیع بافت فیبری، تشکیل تعداد زیادی از سپتوم فیبری، لوبول‌های شکافته و تکثیر قابل توجه سلول‌های کبدی نیز مشاهده شد. این مشاهدات موفقیت ایجاد مدل حیوانی آسیب ایمنی موش فیبروز کبدی را تایید کرد (شکل 2b). در مقایسه با گروه مدل، کاهش نفوذ سلول های التهابی در CPhG های مختلف وجود داشت. همچنین نکروز و دژنراسیون چربی سلول های کبدی کمتر و همچنین کاهش فیبروز مشاهده شد. CPhGs به طور قابل توجهی آسیب شناسی فیبروز کبدی ناشی از BSA را در موش ها کاهش داد، تورم سلول های کبدی را کاهش داد، و به طور موثر از نکروز سلول های کبدی و نفوذ سلول های التهابی جلوگیری کرد، که نشان می دهد CPhGs یک اثر محافظتی بر فیبروز کبدی موش های صحرایی ناشی از BSA اعمال می کند. (شکل 2c-f). رنگ آمیزی تری کروم ماسون در گروه نرمال، بافت کبد طبیعی بود. ناحیه پورتال کبدی تعداد کمی فیبرهای کلاژن آبی را نشان داد و بافت کبد به طور طبیعی ساختار یافته بود (شکل 3a). در مقایسه با بافت کبدی گروه نرمال، بافت فیبری توسط برگچه مرکزی تکثیر شده و به داخل پارانشیم کبد گسترش یافته است. الیاف کلاژن گسترش یافته و پیوند خورده و

کل لوبول را در بر گرفته و ورید مرکزی را احاطه کرده است. این اثرات همراه با فیبروز هپاتوسیت، آسیب ساختاری لوبولار، فیبروز اطراف پورتال و تشکیل شبه لوبول (شکل 3b) شواهدی را ارائه کردند که مدل ایجاد شده است. در مقایسه با گروه مدل، الیاف کلاژن در گروه کنترل داروی مثبت به طور خفیفی از ناحیه پورتال محیطی به سمت بیرون کشیده شد (شکل 3c). در مقایسه با گروه مدل، فیبرهای کلاژن در گروه‌های دوز مختلف CPhGs به طور قابل‌توجهی کاهش یافت، تکثیر فیبر مهار شد، و تکثیر بافت فیبری در پارانشیم کبد به طور قابل‌توجهی کاهش یافت. این نتایج نشان داد که CPhGs از موش ها در برابر فیبروز کبدی ناشی از BSA محافظت می کند (شکل 3d-f).

رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی

نکته مهم، بیان کلاژن نوع I و کلاژن نوع III نقش اساسی در ایجاد فیبروز کبدی دارد و تولید و رسوب آنها در بافت کبد می تواند به عنوان یک عامل تعیین کننده مهم در اثربخشی ضد فیبروز کبدی عمل کند. نتایج در جدول 5 خلاصه شده است

کلاژن نوع I

گروه نرمال کلاژن نوع I را عمدتاً در رگ‌های خونی و ناحیه پورتال بیان کردند. گروه مدل، فیبروز عروقی کلاژن نوع I را در نواحی پورتال به شدت بیان کرد. در فضای دیسه، رنگ‌آمیزی کلاژن نوع I به صورت رگه‌ها یا به صورت توزیع تکه‌ای مشاهده شد. کلاژن سپتوم های فیبری را پوشانده و شبه لوبولی تشکیل می دهد. در این آزمایش‌ها، سپتوم‌های فیبری کمتری برای BJRJ (600 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و گروه‌های دوز مختلف CPhGs (125، 250 و 500 میلی‌گرم بر کیلوگرم) تشکیل شد [PCol I=0.002، PCol I {{{ 6}}.001، PCol I=0.023، و P Col I=0.044، به ترتیب]. نتایج نیمه کمی نشان داد که بیان کلاژن نوع I آنها در مقایسه با گروه مدل به طور قابل توجهی کمتر بود (شکل 4).

کلاژن نوع III

کلاژن نوع III در گروه نرمال ضعیف بیان شد و نواحی محیطی اطراف وریدهای پورتال و کبدی مقدار کمی زرد ریز را به جای الیاف پیوسته نشان دادند (شکل 5a). در گروه مدل، الیاف کلاژن طناب های پهن و ضخیم را نشان می دهند که بیانگر بیان قوی است که عمدتاً در نواحی پورتال و بافت فیبری قرار دارد (شکل 5b). فیبرهای کلاژن BJRJ (600 میلی گرم بر کیلوگرم) و گروه های دوز مختلف CPhGs (125، 250 و 500 میلی گرم بر کیلوگرم) رشته ای بودند و در اطراف ورید مرکزی و نواحی پورتال توزیع شدند. در مقایسه با گروه مدل، فیبرهای کلاژن به طور قابل توجهی کاهش یافت، رنگ‌آمیزی کم‌رنگ و نازک بود، و رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی ضعیف بود (شکل 5c-f). این نتایج نیمه کمی نشان می‌دهد که سلول‌های بیان شده مثبت در گروه‌های دوز مثبت و متفاوت [PCol III=0.015، PCol III=0.001، PCol III=0.010، و P Col III=0.037، به ترتیب] با گروه مدل متفاوت بود.

TGF- 1

بیان کمی از TGIF{{0}} در سلول‌های کبدی موش صحرایی طبیعی وجود داشت. بیان به تعداد کمی از سلول های بینابینی محدود شد (شکل 6a). در گروه مدل، بیان TGF{2}} به طور گسترده در ناحیه پورتال، فضاهای فیبری، سلول‌های ستاره‌ای کبدی، سلول‌های التهابی، دیواره سینوسی و سیتوپلاسم توزیع شد. یک ناحیه پورتال خاص بیانی قویاً مثبت با رنگ‌آمیزی زرد مایل به قهوه‌ای نشان داد (شکل 6b). مقدار کمی بیان در ناحیه پورتال و سپتوم های فیبری BJRJ (600 میلی گرم بر کیلوگرم) و گروه های دوز مختلف CPhGs (125، 250 و 500 میلی گرم بر کیلوگرم) وجود داشت. میزان رنگ‌آمیزی مثبت در این گروه‌ها در مقایسه با گروه مدل کاهش معنی‌داری داشت. رنگ آمیزی در سلول های بینابینی در سپتوم فیبری و سیتوپلاسم سلول های التهابی کاهش یافت (شکل 6c-f). نتایج نیمه کمی نشان داد که BJRJ و گروه‌های دوز مختلف CPhGs [P TGF 0.004، به ترتیب] در مقایسه با گروه مدل معنی دار بود. همانطور که قبلا در مقاله ذکر شد، TGF یک سایتوکین مهم در پاتوفیزیولوژی کبد است.

فیبروز، تحریک تولید ماتریکس خارج سلولی [19]. ما نشان دادیم که سطح TGF- 1 در گروه مدل به روشی مطابق با شدت فیبروز کبد افزایش یافت. سطح بیان TGF- 1 در کبد با سطح سرمی TGF{3}} مطابقت داشت. این نشان می دهد که CPhGها می توانند فیبروز کبدی را به دلیل بیان TGF{4}} با مشارکت در سنتز و تخریب ECM به طور قابل توجهی کاهش دهند. بیان کلاژن نوع I، کلاژن نوع III و TGF{5}} می تواند روند پاتولوژیک فیبروز کبدی را تشخیص دهد. سطح بیان آنها در گروه های درمانی به طور قابل توجهی کاهش یافت و نشان داد که CPhG ها می توانند فعالیت کلاژناز را بهبود بخشند، تعادل دینامیکی سنتز و تخریب ECM کبد را حفظ کنند، بنابراین تشکیل فیبروز کبدی را به تاخیر می اندازند و از آن جلوگیری می کنند.