تماس:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

Pls اینجا را کلیک کنید به قسمت 2

سیستانچه اثر محافظت عصبی بسیار خوبی دارد

Gabriel Gonzalez 1,2 , Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Ka ˇnovsk2 and Miroslav Strnad1,2,*

1. آزمایشگاه تنظیم کننده رشد، موسسه گیاه شناسی تجربی آکادمی علوم چک،

and Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitel °u 27, CZ-78371 Olomouc, Czech Republic;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (G.G.); jiri.gruz@upol.cz (J.G.); waldacun@gmail.com (سی دبلیو دی)

2. گروه مغز و اعصاب، بیمارستان دانشگاهی علوم پزشکی و دانشکده پزشکی و دندانپزشکی،

Palacký University Olomouc, CZ-775 20 Olomouc, Czech Republic; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* مکاتبات: miroslav.strnad@upol.cz; 850-634-585-0520

چکيده:سیتوکینین هافیتوهورمون های مبتنی بر آدینین هستند که فرایندهای کلیدی را در گیاهان تنظیم می کنند، مانند تقسیم سلولی و تبعیض، رشد ریشه و ساقه، تسلط آپیک، شاخه بندی، و جوانه زنی دانه. در مطالعات اولیه نیز فعالیت های حفاظتی علیه بیماری های نورودژنراتیو انسان نشان داده اند. برای گسترش دانش حفاظت (فعالیت حفاظتی) آنها ارائه می دهند، ما به بررسی فعالیت های طبیعیسیتوکینین هادر برابر سالسولینول (SAL) ناشی از سمیت (aبیماری پارکینسونmodel) and glutamate (Glu)-induced death ofنورون-مانند سلول های SH-SY5Y دوپامینرجیک. ما متوجه شدیم که کینتین-3-گلوکوزید، سیس-زاتین ریبوساید، و N6-ایزوپنتینیل آدنوزین در مدل PD ناشی از SAL فعال هستند. علاوه بر این، ترانس، سیس زاتین، و کینتین به همراه دفروکستامین چلاتور آهن (DFO) و نکروستاتین مهارکننده نکروستوز 1 (NEC-1) به طور معنی داری میزان مرگ سلولی را در مدل ناشی از گلو کاهش داد. لاکتات dehydrogenase assays نشان داد کهسیتوکینین هاارائه شده پایین ترمحافظت عصبیفعالیت نسبت به DFO و NEC-1. همچنین فعالیت های آپوپتوتیک کاسپاز-۳/۷ را کمتر از DFO کاهش دادند. با این حال،سیتوکینین هااثرات بسیار مشابهی با DFO و NEC-1 بر تولید رادیکال سوپراکسید داشت. به طور کلی، آنها فعالیت حفاظتی را در مدل ناشی از SAL نشان دادندپارکینسونیاننورونیمرگ سلولی و مدل ناشی از گلو از آسیب اکسیداتیو عمدتا با کاهش استرس اکسیداتیو.

واژه های کلیدی: سیتوکینین؛ فیتوهورمون؛ محافظت عصبی; سلول های نورون مانند SH-SY5Y; cytotoxicity; salsolinol; گلوتامات؛ استرس اکسیداتیو; بیماری پارکینسون

گیاه سیستانچهبر روی اثرات برمحافظت عصبی

1. مقدمه

بیماری پارکینسون(PD) دومین بیماری نورودژنراتیو مرتبط با موتور شایع است و انتظار می رود تعداد موارد تشخیص داده شده در سطح جهانی از ۶ میلیون مورد در سال ۲۰۱۵ به بیش از ۱۲ میلیون تا سال ۲۰۴۰ افزایش یابد [۱]. این است که با علائم حرکتی مرتبط با تخریب خاص و از دست دادن حدود 30–70٪ از دوپامینرجیک (DA) مشخصنورونin the substantia nigra pars compacta and their projections to the striatum [2,3]. برخی، از بسیاری از مشخصه های مولکولی شناخته شده PD عبارتند از افزایش استرس اکسیداتیو و نیتروژنی، اختلال عملکرد میتوکندری [4–7]، اکسی توتیکسیتی [8]، اختلال عملکرد سیستم یوبی کیتین/ پروتهاستومالی [9]، و التهاب عصبی [10]. درمان های فعلی عوارض جانبی نامطلوب مختلفی دارند و تنها تسکین علامتی [11] را ارائه می دهند، بنابراین تلاش های شدیدی برای توسعه داروهایی با اثرات درمانی کارآمد بر تخریب DA وجود داردنورون. منابعی که ممکن است به چنین تلاش هایی کمک کنند شامل ترکیبات طبیعی است که تمایل دارند عوارض جانبی کمتری داشته باشند. اینتر آلیا، موادی از جینکو بیلوبا (جینجتین، جینکگولید، بیلوبالید)، جینسنگ (جینسنوزیدها)، و فلاونوئیدها (بایکالین، kaempferol, rutin, and luteolin) فعالیت حفاظتی گسترده ای را در چندین مدل آزمایشگاهی (از جمله سلول نوروبلاستومای انسانی SH-SY5Y) و در مدل های زنده ناشی از PD نشان داده اند by 1,1'-dimethyl-4,4'-bipyridinium dichloride (paraquat), 1-methyl- 4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+), and 6-hydroxydopamine (6-OHDA) [12].

مطالعه ارائه شده در اینجا بر اثرات یک کلاس از فیتوهورمون های طبیعی به نام متمرکز شده استسیتوکینین ها(CKs)، و متابلیت های آن ها که تنظیم کننده های شناخته شده تقسیم سلولی، رشد، تغییر، و حساسیت برگ در گیاهان هستند [۱۳]. از نظر ساختاری، CKs مشتقات آدینین هستند که در موقعیت N6 با یک پرنیل (ایزوپنتینیل) یا زنجیره جانبی معطر جایگزین می شوند. اشکال طبیعی شامل ۶-(E)-۴-هیدروکسی-۳-متیل اما-۲-انیلامینوپورین (ترانس زاتین، tZ)، ایزومر ۶-(Z)-ایزومر آن (سیس-زاتین، cZ),N6-isopentenyl adenine (iP), 6-benzyl amino purine (BAP), 6-furfurylaminopurine (kinetin, K), and ortho-, meta-, and para-hydroxylated or methoxylated derivatives of BAP, called topolins (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MepT). ۹-ریبوسایدهای مختلف، ۹-هسته ای، و همچنین ۷-، ۹، و O-glucosides از این اشکال نیز معمولاً رخ می دهند، همان طور که در جدول ۱ نشان داده شده است. CKs علاوه بر نقش های بومی خود در گیاهان، فعالیت قوی مورچه اکسیدانی نسبت به گونه های اکسیژن واکنشی (ROS) را نشان داده است که حفاظت را در چندین مدل استرس آزمایشگاهی اختلالات مرتبط با پیری فراهم می کند [14].

جدول 1. سازه هایسیتوکینین هاو عوامل کنترل مثبت .

به طور خاص، CKs گزارش شده است که فعالیت سیتوتروکتیو در مدل هایی مانند H2O2- مرگ سلولی ناشی از فیبروبلاست های انسانی [15] و استرس قندی ناشی از D-galactose در آستراستروز موش صحرایی [16]. مهمتر از آن، در این زمینه نشان داده اندمحافظت عصبیاثرات در مدل های مربوط به بیماری های نورودژنراتیو مانند PD خانوادگی، مهارکننده پروتئزوم MG 132 القا شده یا سمیت ناشی از H2O2 در سلول های SH-SY5Y [17]، آسیب اکسیداتیو ناشی از گلو از هیپوکامپ موش HT22نورونیسلول ها [18], و مدل سلول PC12 از بیماری هانتینگتون [19]. مطالعات دیگر نشان می دهد که فعالیت های حفاظتی CKs شامل هر دو مستقیم [20,21] و غیر مستقیم [15,16,22] مدولاسیون سیستم های ردوکس سلولی. علاوه بر فعالیت های آنتی اکسیدانی مشخصه CKs، بنا به گزارش ها اثرات نظارتی در میتوکندری دارند که افزایش می دهندنورونیزنده ماندن [17]. همچنین، K می تواند پتانسیل غشای میتوکندری را تثبیت کند و تولید ATP را افزایش دهد و در نتیجه مرگ ناشی از گلو سلول های HT22 را کاهش دهد [18]. با این حال، با وجود یافته های مربوط به اثرات آنها در چندین مدل، دانش محدودی از فعالیت حفاظتی CKs در رایج ترین (پراکنده) شکل PD وجود دارد.

برای پرداختن به شکاف دانشی که در بالا شرح داده شد، به طور سیستماتیک اثرات CKs طبیعی و متاپولیت های آنها را در دو مدل آزمایشگاهی ارزیابی کردیم: یک مدل ناشی از سالسولینول (SAL)PD و مدل گلوتامات (Glu)القایی آسیب اکسیداتیو درنورون-مثل سلول های SH-SY5Y. این خط به دلیل فنوتیپ دوپامینرجی، حساسیت به سموم دوپامینرجی مانند SAL، و تشکیل مناسب جمعیت های نسبتاً پایدار از دیمایس شده مورد استفاده قرار گرفت.نورونیسلول های با کاهش نرخ تکثیر پس از قرار گرفتن در معرض 48 ساعت به 10 uM تمام ترانس رتینوئیک اسید (ATRA) [23–25].

نورونسلول های مانند در معرض آندو / اکسوتوکسین SAL به تقلید آسیب شناسی PD از طریق اختلال عملکرد سیستم ردوکس سلولی: تهی شدن گلوتاتیون (GSH) ، و مهار هر دو فعالیت های آنزیم آنتی اکسیدان (Cu/Zn superoxide dismutase و کاتالاز) و مجتمع های میتوکندری (I و II) که منجر به آپوپتوز و نکروز [26]. در مدل دیگر، گلو با اختلال در sys-tem ردوکس، آسیب اکسیداتیو بالقوه کشنده ای را القا می کند. هر دو مدل در خط سلولی SH-SY5Y پیش از این در مطالعات محافظت عصبی [۲۶٬۲۷] مورد استفاده قرار گرفته اند.

Cytoprotective و / یا فعالیت های آنتی اکسیدانی مربوط به اختلالات دژنراتیو K، iP، BAP، iPR، tZR، و پایه های آزاد خود را آزمایش شده اند، و (همانطور که در بالا مشخص شد) برخی از CKs پیدا شده اند که فعالیت های حفاظتی درنورونیسلول. با این حال، هیچ مطالعه ای که قبلا منتشر شده است ساختار را بررسی کرده است-محافظت عصبیرابطه فعالیت (SAR) از CKs طبیعی (جدول 1). از این رو این مطالعه به منظور بررسی این مطالعه انجام شد.محافظت عصبی(ضد-پارکینسونیان) فعالیت های تقریبا همه شناخته شده به طور طبیعی رخ می دهد CKs در مدل های انتخاب شده SAL - و گلو ناشی از نورودژنراتاسیون. ابتدا هر یک از ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن CKs (ORAC) و (در آزمایش های ایمنی) سیتوتوکسی را نسبت به آن ارزیابی کردیم.نورون-مثل سلول های SH-SY5Y. سپس با اندازه گیری تولید سوپراکسید (O2.) (dihy- droethidium, DHE assay) و فعالیت های آپوپتوتیک کاسپاز-3,7، اثرات محافظت عصبی ترکیبات و تأثیر آن بر سطح استرس اکسیداتیو مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج اولین نشانه های سیستماتیک گزارش شده از روابط بین ساختارهای CKs طبیعی ومحافظت عصبیفعالیت.

سیستانچه هرباخيلي خوبهمحافظت عصبیاثر

2. نتایج و بحث

2.1. ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن سیتوکینین ها (ORAC)

از آنجا که بیماری های نورودژنراتیو با استرس اکسیداتیو بالا همراه هستند، فعالیت آنتی اکسیدانی نقش کلیدی در دفاع ازنورونیسلول. برای بررسی پتانسیل بیولوژیکی CKs از این لحاظ، ظرفیت آنتی اکسیدانی توسط ORAC تعیین شد که معمولاً برای تعیین ظرفیت آنتی اکسیدانی مواد استفاده می شود [28]. ظرفیت آنتی اکسیدانی به صورت معادل های ترولوکسی (TE) بیان شد که اثربخشی (پایین تر تا بالاتر) ترکیبات را نسبت به ترولوکسی به صورت همسو تعیین می کند. نتایج، ارائه شده در جدول 1، نشان می دهد که topolins (oT، mT، و pT) و ریبوسایدهای آنها (oTR، mTR، pTR) فعالیت های آنتی اکسیدانی بالایی دارند که احتمالاً ارتباط نزدیکی با سیستم غنی از الکترون از سوبستیومنت C6 هیدروکسی بنزیل آمینه خود دارند. با وجود ارزش های ORAC بالا، topolins بالا نداردمحافظت عصبیفعالیت. با این حال، چندین CKs هترواروماتیک از جمله K (N6-furfurylaminopurine) و غیر معطر cis-zeatin-O-glucoside (cZOG)، که دارای 4-هیدروکسی-3-متیل بوت-2-en-1-yl)، ظرفیت آنتی اکسیدانی بالا (جدول 2) نیز نشان داد. متابولیت های دیگر CK—از جمله کینتین-۳-گلوکوساید (K3G)، کینتین ریبوساید ۵<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

مزایای ساقه سیستانچهدربیماری ضد آلزایمر

2.2. متفاوت سازی سلول های SH-SY5Y

برای مطالعه CKs'محافظت عصبیاثرات, SH-SY5Y سلول های نوروبلاستوما (انتخاب شده به دلایل در حال حاضر توصیف [23]) با قرار گرفتن در معرض 10 uM ATRA به مدت 48 ساعت به عنوان قبلا توصیف [23,24]. سپس با استفاده از یک کیت رنگ آمیزی غشایی رنگ آمیزی شدند تا تفاوت های مورفولوژیک بین سلول های بی تفاوت و تفاوت یافته را بررسی کنند. همانطور که در شکل 1A نشان داده شده است،نورون-مانند سلول های تفاوت یافته کمتر متراکم رشد کردند، طولانی تر بودند، و نوریت های بیشتری (نشان داده شده توسط فلش های زرد در شکل) نسبت به سلول های بی تفاوت تولید کردند. این تغییرات مورفولوژیک مرتبط با دیمایراسیون قبلاً مشاهده شده اند، حتی پس از قرار گرفتن در معرض کوتاه تر (۲۴ ساعت) به ATRA [۲۴٬۳۰]. مهمتر از آن، تعداد نوریت ها به طور چشمگیری به سطحی افزایش می یابد که می توانند یک شبکه نوریت ایجاد کنند. به همین دلیل، زنده ماندن سلول ها برای مقایسه میزان تکثیر سلول های SH-SY5Y نامتفاوم و قابل تفاوت اندازه گیری شد. زنده ماندن SH-SY5Y بی تفاوت به عنوان حداکثر میزان تکثیر گرفته شد. نتایج حاضر در

شکل 1B نشان می دهد که میزان تکثیر (ارزیابی شده توسط ارزیابی زنده ماندن Calcein AM) SH-SY5Y پس از درمان 48 ساعت ATRA 23 درصد کاهش یافته است.

شکل 1. (A) میکروگراف فلورسنت از سلول های SH-SY5Y با غشای رنگی با استفاده از کیت رشد نوریت (Invitro- gen™): کنترل، سلول های بی تفاوت (در معرض راه حل درمان مسخره:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p=""><>

جدول 2. ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن (ORAC) از آزمایش شدهسیتوکینین ها(CKs) به عنوان معادل های ترولوکسی (TE) بر اساس equimolar بیان شده است. نام ها، اختصارات، و ساختارهای CKs در شکل ۱ ارائه شده است.

2.3. سیتو توکسی سیتوکینین ها نسبت به سلول های SH-SY5Y نورون مانند

در آزمایش های سمیت بالقوه CKs با آزمون زنده ماندن Calcein AM [31] بیشتر سمیت پایین نسبت به نشان دادنورون-مثل سلول های SH-SY5Y. کاهش زنده ماندن زیر 90 درصد به عنوان آستانه ای برای اثر نوروتوکسیک در نظر گرفته شد. تنها دو استثنا KR (9/11 درصد) و pTR (5/10 درصد) مطابق با یافته های قبلی بودند که برخیسیتوکینینمتابولیت ها، به ویژه ریبوسایدها، ممکن است اثرات سیتوتوکسی داشته باشند [32]. ریبوسایدهای دیگر مانند cZR، iPR، oTR، mTR باعث هیچ کاهش آشکاری درنورون-مانند زنده ماندن سلول های SH-SY5Y (جدول 3). DFO [33,34] و NEC-1 [35,36] مورد استفاده به عنوان کنترل مثبت در مدل آزمایشگاهی ما نیز توسط مطالعات دیگر بر روی سلول های SH-SY5Y غیر سمی ثابت شد. در نتیجه، عمدتاً مشتقات KR و pTR زنده ماندن کمتری نسبت به 90 درصد نشان دادند و به همین دلیل برای ارزیابی بیشتر در هر دو مدل آزمایشگاهی نورودژنراتاسیون کمتر جالب در نظر گرفته شدند.

جدول شماره 3. زنده ماندن سلولنورون-مانند سلول های SH-SY5Y پس از قرار گرفتن در معرضسیتوکینین هابه مدت ۲۴ ساعت. زنده ماندن به عنوان درصدی از کنترل DMSO بیان می شود.

2.4. شناسایی سیتوکینین های محافظت عصبی در مدل ناشی از SAL از PD

برای این آزمایش ها،نورونیسلول های SH-SY5Y به مدت 48 ساعت و سپس با 500 uM SAL و هر CK در سه غلظت (0.1، 1، 10 uM) با هم درمان شدند. همانطور که توسط خط نقطه چین در شکل 2A نشان داده شده است، استفاده از سم عصبی SAL در 500 uM زنده ماندن سلول های SH-SY5Y متفاوت را کاهش داد، با توجه به اندازه کالسین AM، 30٪. N-استیل سیستئین (NAC) به دلیل اثر محافظت عصبی که قبلاً گزارش شده بود در همان مدل آزمایشگاهی مبتنی بر سلول SH-SY5Y به عنوان یک کنترل مثبت در این آزمایش ها مورد استفاده قرار گرفت [37]. غلظت های 10، 100 و 1000 uM NAC برای القای بهبودی جزئی یا تقریباً کامل در مدل SAL مورد استفاده قرار گرفت. NAC قادر به افزایش زنده ماندن سلول در غلظت 100 uM و 1 میلی متر، مربوط به 83.39 ± 1.74٪ و 89.21 ± 2.89٪. فعالیت حفاظتی NAC در 100 uM (نشان داده شده توسط خط خط تیره در شکل 2A) به عنوان آستانه قدرت برای انتخاب CKs برای آزمایش های بیشتر مورد استفاده قرار گرفت. با توجه به این راه اندازی، فعالیت های حفاظت عصبی قابل توجه بیولوژیکی با K3G در 10 uM (81.84 ± 2.36٪)، cZR در 0.1 uM (81.14 ± 2.30٪) و 1 uM (81.53 ± 2.24٪) و iPR در 1 uM (82.43 ± 2.51٪). به این ترتیب، iPR و cZR در غلظت های میکرو یا زیر میکرومولر پایین تر از NAC، محافظت کننده های عصبی مؤثری بودند. Theسیتوکینینغربالگری همچنین نشان داد که بسیاری از متا بولیت های دیگر می توانند به طور متوسط زنده ماندن سلول های SH-SY5Y در معرض SAL را افزایش دهند. با این حال، برخی از CKs آزمایش شده (از جمله tZR، tZMP، mT، mTR، pT، و pTR) اثر حفاظتی بسیار کمی داشت.

شکل 2. (ا)محافظت عصبیفعالیتسیتوکینین هاو N-استیل سیستئین (NAC) در مدل القایی SAL از PD درنورون-مثل سلول های SH-SY5Y. خط خط تیره آستانه اثر NAC را نشان می دهد که در آنسیتوکینین هابرای آزمایش بیشتر انتخاب شدند؛ خط نقطه چین و سپس شمارش تعداد سلول های زنده در کالسین AM پس از درمان سلول های با 500 uM SAL; سلول های کنترل سالم (CTR، DMSO< 0.1%).="" triplicates="" in="" at="" least="" three="" separated="" days.="" (b)="" normalized="" sh-sy5y="" cell="" death="" after="" propidium="" iodide="" staining.="" triplicates="" in="" at="" least="" five="" independent="" days.="" *="" p="" compared="" with="" the="" vehicle="" with="" 500="" um="" sal,="" #="" p="" compared="" with="" the="" vehicle="" without="" 500="" um="">

برای تایید، فعال ترین فعالیت های ضد PD CKs طبیعی، نرخ کلی مرگ و میر سلول ها توسط رنگ آمیزی پروپیدیوم ید (PI) کمی شد، که (در مقابل آزمایش های زنده ماندن مبتنی بر سوخت و ساز سلول) تنها برچسب سلول های با یکپارچگی غشای مختل، سلول های در حال مرگ، و در حال حاضر سلول های مرده [38]. نتایج با توجه به میزان مرگ و میر سلول پس از درمان با SAL به تنهایی (تعیین شده به عنوان 100٪) طبیعی شد. همانطور که در شکل 2B نشان داده شده است، ماده کنترل مثبت NAC به طور قابل توجهی نرخ مرگ و میر سلولی را در هر دو 100 و 1000 uM (به 77.3 ± 2.21٪ و 77.5 ± 4.44٪) کاهش داد. به طور کلی ، NAC ثابت کرد کهمحافظت عصبیعامل با فعالیت های قابل مقایسه با کسانی که در مطالعات دیگر ثبت شده در شیوه وابسته به دوز (در محدوده 50–500 uM) برای سلول های SH-SY5Y [37]. اندازه PI همچنین نشان داد که CKs cZR، K3G، و iPR فعالیت های حفاظتی به ویژه cZR دارند که میزان مرگ سلول ها را به ۷۱٫۶ ± ۵٫۰۸٪ در ۰٫۱ uM کاهش داد. در مقابل cZR، K3G اثرات وابسته به دوز را معکوس کرده بود، با حداکثر فعالیت در 10 uM (کاهش میزان مرگ و میر سلول به 75.0 ± 3.69٪) و فعالیت NPR در 1 uM (کاهش نرخ به 73.9 ± 4.99٪) به اوج خود رسید. گرفته شده با هم، همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، CKs ارائه قابل مقایسهمحافظت عصبیفعالیت به 100 uM NAC با توجه به هر دو زنده ماندن و cytototoxicity assays. همچنین غلظت های مؤثر CKs مانند cZR و iPR بسیار کمتر از غلظت های NAC، در محدوده های زیر میکرومولر و میکرومولر بود. مشاهدات قبلی به دست آمده به دنبال رنگ آمیزی مضاعف با PI و آنکسین V/PI نشان می دهد که K ممکن است آپوپتوز [39] را کاهش دهد، بنابراین ما همچنین به بررسی اثرات CKs و NAC بر استرس اکسیداتیو و فعال سازی کاسپاز-3،7 (یک نشانگر آپوپتوز شناخته شده) پرداختیم.

2.5. سیتوکینین ها کاهش ایجاد رادیکال سوپراکسید ناشی از SAL

استرس اکسیداتیو (OS) یک کمک کننده آسیب شناختی کلیدی به چندین بیماری نورودژنراتیو است، و هر دو SAL (در > 100 uM) و تتراهیدرویزوکینولین ها القاگر سیستم عامل قوی [26,40]. به این ترتیب، ما همچنین تشکیل سوپراکسید (یک ROS و نشانگر مهم OS) را در حضور SAL با و بدون CKs یا NAC انتخاب شده اندازه گیری کردیم. برای اطمینان از اینکه SAL باعث آسیب کافی سیستم عامل در سلول های SH-SY5Y برای تشخیص پاسخ ها شد، سلول ها به مدت 24 ساعت در معرض 500 uM SAL قرار گرفتند، مانند کار قبلی [37] و مطابق با یافته های ارائه شده در بالا. سپس سلول ها توسط دی هدروتیدیوم (DHE) رنگ آمیزی شدند تا تشکیل رادیکال سوپراکسید [۴۱٬۴۲] را تشخیص دهند. همان طور که در شکل ۳A دیده می شود، سلول ها پس از برچسب زدن با DHE (که سیگنال های فلورسانس قرمز را به دنبال واکنش با سوپراکسید فراهم می کند) به صورت بصری مشاهده شدند. SAL افزایش روشنی را در فلورسانس DHE، نسبت به سطوح کنترل و سلول های تحت درمان با NAC القا کرد. همچنین سه CKs (cZR، K3G و iPR) اثرات بصری مشابهی با NAC (100 uM) بر فلورسانس DHE داشت. علاوه بر این، کمی سازی طیف سنجی با توجه به سطوح تشخیص داده شده در سلول های تحت درمان توسط SAL به تنهایی (مجموعه ای به عنوان 100٪)، در راستای مشاهده میکروسکوپی بود. همان طور که در شکل 3B نشان داده شد، سطح سوپراکسید نرمال شده در سلول های کنترل سالم (CTR) کمتر از 39 درصد بود، و ماده کنترل مثبت NAC کاهش متوسط تا کامل تولید ROS ناشی از SAL را در 100 و 1000 uM (به 76.3 ± 4.33 و 44.3 ± 5.12٪) فراهم کرد، نشان می دهد که تهی شدن گلوتاتیون (GSH) نقش کلیدی در مدل [26]. جالب اینجاست که SAL کاهش چشمگیری را در محتویات GSH سلول های SH-SY5Y همراه با ارتفاع سیستم عامل، به سطوحی شبیه به سطوحی که قبلاً در مطالعه ای مشاهده شده بود که اثرات میانجی NAC را نیز بر زنده ماندن سلول، مرگ سلولی، و محتویات گلوتاتیون [43] ثبت کرده بود، القا کرد. نتایج ارائه شده در اینجا نشان می دهد که NAC همچنین تشکیل رادیکال سوپراکسید را به سطوح بازال کاهش داد (به عنوان یکی از سطوح در کنترل های تحت درمان با DMSO). ریبوسایدهای CK در غلظت های فعال (0.1–1 uM) همراه با K3G مورد آزمایش قرار گرفتند، و به طور قابل توجهی محتویات رادیکال سوپراکسید سلول ها را به سطوح زیر کاهش دادند (نسبت به سلول های تحت درمان با SAL به تنهایی): cZR 80.34 ± 5.99٪ در 0.1 uM؛ K3G 77.1 ± 4.89٪ در 10 uM; iPR 79.2 ± 5.91٪ در 1 uM, قابل مقایسه با اثرات 100 uM NAC. در مجموع، تظاهرات متوژنال به شدت نشان می دهد که فعالیت قوی ضد OS نقش کلیدی در اثرات حفاظتی NAC و CKs در مدل PD ناشی از SAL دارد. ارتباط بین آملیوراسیون سیستم عامل و محافظت عصبی نیز توسط نویسندگان دیگر [29] اشاره شده است، و مطالعات متعددی دریافته اند که K و BAP می توانند به طور مستقیم فعالیت های OS [44] را از طریق تشکیل مجتمع هایی با پیاز Cu2+ بهبود بخشند و در نتیجه فعالیت شبیه سوپراکسید دیسموتاز [45,46]. با این حال، CKs همچنین به عنوان آنتی اکسیدان های غیر مستقیم با اثرات میانجی گری القای عامل هسته ای erythroid 2 مرتبط با عامل 2 (NRF2) مسیر پاسخ آنتی اکسیدانی (iPR) [22] و یا ترمیم جزئی فعالیت های گلوتاتیون پراکسیداز و SOD (K) [16] توصیف شده است. علاوه بر این ، K گزارش شده استمحافظت عصبیفعالیت ها علیه آسیب سیستم عامل ناشی از H2O2 در SH- سلول های SY5Y [17]. هر دو نوع فعالیت ضد ROS گزارش شده از CKs به طور بالقوه می تواند به اثرات cZR، K3G، و iPR در کاهش رادیکال های سوپراکسید در مدل PD سلول SH-SY5Y ناشی از SAL توضیح [47–50].

شکل 3. (A) میکروفوتوگراف نشان می دهد SAL ناشی از استرس اکسیداتیو و فعالیت های کاهش دهنده استرس اکسیداتیوسیتوکینین هادر انسان متفاوتنورون-مانند سلول های SH-SY5Y که توسط میکروسکوپ فلورسانس به دنبال برچسب گذاری دی هدروتیدیوم (DHE) تجسم یافته اند. میله = 50 ام. تصاویر نشان می دهد سلول های درمان شده با محلول DMSO (کنترل) ، 500 uM سالسولینول (SAL) به تنهایی ، و ترکیبی از 500 uM SAL و 1000 uM NAC (+NAC) ، 0.1 uM cZR (+cZR) ؛ 10 uM K3G (+K3G), 1uM iPR (+iPR) برای 24 ساعت قبل از رنگ آمیزی با DHE. (ب) ایجاد رادیکال سوپراکسید ناشی از SAL وسیتوکینینیا N-استیل سیستئین (NAC) فعالیت حفاظتی. گراف کمی سازی سلول های رنگی DHE را با استفاده از خواننده میکروپلیت نامتناهی M200 Pro (تکان، اتریش) نشان می دهد. سه برابر حداقل در پنج روز مستقل. * P در مقایسه با خودرو با 500 uM SAL، # P در مقایسه با خودرو بدون 500 uM SAL.