قسمت 2 جهش های ERCC1 مانع از ترمیم آسیب DNA و ایجاد اختلال در عملکرد کبد و کلیه در بیماران می شود

تماس:ali.ma@wecistanche.com

برای قسمت 1 اینجا را کلیک کنید

قسمت 2

برای بیماری کلیوی روی Cistanche NZ کلیک کنید

بحث

مورد جدید دو آللیERCC1جهش فقط دو فرد با دو آللیERCC1جهش‌هایی تا به امروز گزارش شده‌اند که هر دو ویژگی‌های CS مانند را نشان می‌دهند. فرد شدیداً آسیب دیده (165TOR) یک نوع مزخرف (Q158X) و یک نوع بدمعنای F231L در موتیف (HhH)2 ERCC1 (شکل S5 F) داشت، عقب ماندگی رشد، نارسایی رشد و انقباضات را نشان داد و پس از مرگ درگذشت. سال اول زندگی به دلیل ذات الریه (یاسپرس و همکاران، 2007). دومین فرد مبتلا (CS20LO) دارای انقباضات، میکروسفالی و هیپرتونی بود و برای نوع نادرست F231L هموزیگوت بود و در سال دوم زندگی فوت کرد (Kashiyama et al., 2013).

ما دو خواهر و برادر را با دو آلل گزارش می کنیمERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) و یک آلل تهی به دلیل حذف درون ژنی ارثی مادر. تمام پروتئین ERCC1 باقیمانده که در سلول های این بیماران بیان می شود، حامل جایگزینی اسید آمینه R156W است، که پل نمکی بین باقی مانده R156 با بار مثبت و باقی مانده D129 با بار منفی مخالف را که درست در زیر پاکت اتصال XPA در ناحیه مرکزی قرار دارد، مختل می کند.ERCC1. تأثیر این جایگزینی دوگانه است: (1) پایداری کلی ERCC1 و شریک اتصال آن XPF را به شدت کاهش می دهد، و (2) به طور خاص بر تعامل با XPA تأثیر می گذارد (شکل 9).

کاهش سطح پروتئین هسته ای ERCC1 به دلیل تا شدن نادرست جزئی

وسترن بلات و ایمونوفلورسانس تجزیه و تحلیل نشان داد که به طور کلیERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>ت) در درون زاERCC1مکان سلول های RPE{0}}hTERT. جالب توجه است، از دست دادن کامل ERCC1 در موش ها منجر به مرگ در عرض 4 هفته شد، در حالی که افزایش سطح پروتئین به حدود 15 درصد از سطوح در موش های WT، طول عمر را 5 برابر افزایش داد (Weeda و همکاران، 1997)، که نشان می دهد حتی سطوح پایین ERCC1. به طور قابل توجهی پتانسیل زنده ماندن را افزایش می دهد. مطابق با یافته‌های ما، مطالعات قبلی نشان داده‌اند که جهش‌های نادرست در حوزه مرکزیERCC1به طور کلی باعث بی ثباتی می شود (Sijbers et al., 1996b)، که نشان می دهد این منطقه برای پایداری پروتئین مهم است.

ساختار میکروسکوپ الکترونی برودتی تمام طول به تازگی گزارش شده استERCC1-هترودایمر XPF (جونز و همکاران، 2020) نشان می دهد کهERCC1R156باقی مانده در لبه هترودایمر قرار دارد. ما حدس می زنیم که افزایش حجم و ساختار الکترونیکی تغییر یافته جایگزینی یک آرژنین توسط تریپتوفان نه تنها باعث اختلال در جیب اتصال XPA می شود، بلکه رابط دیمریزاسیون بین دامنه مرکزی ERCC1 و حوزه نوکلئاز XPF را مختل می کند و باعث بی ثباتی عمومی می شود (شکل 2). S5 F). جالب توجه است، نوع نامناسب XPFR799W در همان رابط در سمت XPF قرار دارد (شکل S5 F) و همچنین منجر به بی ثباتی و کاهش شدید سطح پروتئین XPF می شود (Mori et al., 2018). در یک فرد مبتلا (CALIF1010) که با ویژگی‌های پروژروئیدی CS مانند و سگمنتال ارائه شد، نوع XPFR799W همراه با یک حذف بین ژنی در آلل XPF دیگر به ارث برده شد که منجر به یک نقص NER قوی همراه با یک نقص خفیف ترمیم ICL شد (Mori et al. al., 2018)، مشابه خواهر و برادرهای گزارش شده در این مطالعه.

بیان نابجا یک نسخه القایی ازERCC1R156Wبه مدت 24 ساعت ما را قادر ساخت تا به سطوح WT این پروتئین جهش یافته برسیم، که منجر به مکان یابی نادرست در سیتوپلاسم، کاهش تعامل با XPF و افزایش تعامل با چاپرون های تاشو پروتئین، همانطور که توسط MS شناسایی شد. همه این یافته‌ها این مفهوم را پشتیبانی می‌کنندERCC1R156Wدر سلول های بیمار تا حدی به اشتباه تا شده و تخریب می شود که منجر به کاهش -80 درصدی سطح پروتئین هسته ای ERCC1 می شود. KI ERCC1R156W در سلول‌های RPE{4}}hTERT این نتیجه‌گیری را پشتیبانی می‌کند.

هنگام مقایسهERCC1و سطوح پروتئین XPF در سلول‌های PV46LD و PV50LD با سلول‌های افراد آسیب‌دیده‌تر (165TOR و CS20LO)، ما متوجه شدیم که این سطوح در سلول‌های خواهر و برادری که در این مطالعه توضیح داده شد، قابل مقایسه، یا شاید حتی کمتر بود (شکل 3). C و شکل S3، E و F؛ یاسپرس و همکاران، 2007؛ کاشیاما و همکاران، 2013). توجه داشته باشید که CS20LO برای ERCC1F231L هموزیگوت است، در حالی که 165TOR هتروزیگوت است و دارای یک توقف زودرس اضافی در دیگری است.ERCC1آلل (Q158X). این یافته ها نشان می دهد که علاوه بر کاهش سطح پروتئین، عملکرد پروتئین جهش یافته که هنوز بیان می شود و ترکیب دو آلل جهش یافته باید به عنوان تعدیل کننده بالقوه شدت فنوتیپی و بیان در نظر گرفته شود.

ERCC1R156W: تأثیر متفاوت بر مسیرهای ترمیم DNA وابسته به ERCC{2}}

بیان ERCC1R156W-GFP در سلول‌های ERCC{3}}KO در سطوحی مشابه ERCC1WT ما را قادر ساخت تا تأثیر جایگزینی اسید آمینه بر پایداری پروتئین را از تأثیر بر عملکرد پروتئین جدا کنیم. در حالی که پروتئین جهش یافته ERCC1R156W در تعامل ناشی از اشعه ماوراء بنفش با XPA و ماهی به شدت آسیب دیده بود و نتوانست به طور موثر در محل ضایعات DNA ناشی از اشعه ماوراء بنفش موضعی شود، ما همچنان فعالیت ترمیم قابل توجهی (تقریباً 40 درصد) را در سنجش UDS، بقای کلونوژنیک شناسایی کردیم. و در شرایط آزمایشگاهی سنجش NER. این یافته‌ها نشان می‌دهد که یک پروتئین جهش یافته ERCC1 که تنها با کمپلکس NER تعامل بسیار ضعیفی دارد، همچنان می‌تواند سطوح قابل‌توجهی از فعالیت NER (تقریبا ۴۰ درصد) را در داخل سلول‌ها پشتیبانی کند. این یافته‌ها با هم نشان می‌دهند که سطح بیان پایین ERCC1 (تقریبا 20 درصد) همراه با فعالیت باقی‌مانده GGR پروتئین‌های جهش‌یافته که هنوز بیان می‌شوند، حفاظت کافی برای جلوگیری از ایجاد XP کامل PV46LD و PV50LD را فراهم می‌کند. در واقع، در مقایسه با فیبروبلاست‌های یک بیمار XP-A که به شدت آسیب دیده و مستعد سرطان بود، فعالیت باقی‌مانده GGR هنوز در شرایط حساس‌تر در سنجش UDS شناسایی شد. با این وجود، هر دو بیمار همچنان ممکن است در معرض خطر ابتلا به سرطان پوست باشند، بنابراین محافظت در برابر نور خورشید توصیه می شود. فعالیت باقیمانده در سلول‌های PV46LD و PV50LD یا مشابه یا کمتر از فعالیت تعمیری بود که در سلول‌های 165TOR یا CS20LO شناسایی کردیم (شکل 6 J؛ Jaspers و همکاران، 2007؛ Kashiyama و همکاران، 2013). بنابراین، شدت بالینی با فعالیت NER مرتبط نیست، اما احتمالاً به دلیل نقش ERCC1 خارج از NER است که در طول توسعه مهم است.

علیرغم یافته‌های ما مبنی بر اینکه ERCC1R156W برهمکنش کاهش یافته با SLX4 را نشان داد و همچنین با کارایی کمتری در مکان‌های القای محلی ICL به کار گرفته شد، تجزیه و تحلیل بیشتر نشان داد که پروتئین جهش‌یافته ERCC1R156W زمانی که به صورت نابجا در ERCC بیان می‌شود، تنها در حمایت خفیف از ترمیم ICL تحت تأثیر قرار می‌گیرد{5} سلول های KO با این حال، تأثیر روی ترمیم ICL بسیار خفیف‌تر از تأثیر جایگزینی R156W بر NER بود، که همراه با یافته‌های قبلی مبنی بر اینکه ترمیم ICLها به پروتئین ERCC1 بسیار کمتری نسبت به ترمیم ضایعات DNA اختصاصی NER نیاز دارد (Jaspers et al. ، 2007؛ Sijbers و همکاران، 1996b)، ممکن است به خوبی تأثیر خفیف بر تعمیر ICL را توضیح دهد. در فیبروبلاست‌های بیمار، که سطوح ERCC1 را به شدت کاهش می‌دهند، حساسیت متوسط ​​و همچنین افزایش شکستگی کروموزوم پس از قرار گرفتن در معرض ترکیب القاکننده ICL MMC را تشخیص دادیم، البته بسیار خفیف‌تر از سلول‌های یک بیمار FA که به صورت موازی گنجانده شده بودند. نکته مهم این است که نه PV46LD و نه PV50LD هیچ نشانه آشکاری از ویژگی‌های بالینی مشابه FA نشان نداده‌اند، که نشان می‌دهد پروتئین جهش یافته ERCC1R156W محافظت کافی در برابر بار درون‌زای پایین ICL در این بیماران ارائه می‌کند.

کمبود ERCC1 باعث نارسایی کبد و کلیه می شود

موش هایی که برای ERCC1 یا XPF KO هستند تا دویدن شدید نشان دهند (یعنی کوچکتر و ضعیف تر از موش های WT) و قبل از 4 هفته اول زندگی به دلیل نارسایی شدید کبد می میرند (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b؛ تیان و همکاران، 2004؛ ویدا و همکاران، 1997). بیان اختصاصی کبدی ERCC1 در این موش‌ها تا حدی اندازه کوچک‌تر و طول عمر طولانی‌تر را تا 12 هفته تصحیح کرد، اما نقاب شدید را نیز آشکار کرد.اختلال عملکرد کلیهو نارسایی کلیه به عنوان یک علت ثانویه مرگ (سلفریج و همکاران، 2001). موش‌های KO مخصوص XP یا FA بیماری کبدی را نشان نمی‌دهند، که نشان می‌دهد این فنوتیپ ناشی از نقص ترمیم NER یا ICL نیست. این امکان وجود دارد که افزونگی جزئی بین این دو مسیر، که در موش‌های ERCC{1}KO که در هر دو مسیر کمبود دارند، از بین رفته است، بتواند این فنوتیپ را توضیح دهد. در راستای این ایده، هپاتوسیت وسلول های لوله پروگزیمال کلیهدر موش های ERCC{0}KO تبدیل به پلی پلوئید شد و سطوح بالایی از p53 را انباشته کرد (McWhir و همکاران، 1993؛ Selfridge و همکاران، 2001؛ Weeda و همکاران، 1997)، که نشان می دهد تجمع آسیب DNA درون زا در این اندام ها وجود دارد. ممکن است رخ دهد. با این حال، ماهیت دقیق این ضایعه DNA درون زا نامشخص است.

جالب توجه است، موش‌هایی که دارای غیرفعال‌سازی مشترک NER و ICL هستند، اختلال عملکرد کبدی را نشان نمی‌دهند، و این نشان می‌دهد که افزونگی بین این مسیرهای ترمیم DNA تنها توضیح نیست و عملکرد اضافی ERCC1-XPF خارج از این مسیرهای ترمیم DNA کمک می‌کند. به نارسایی کبد (مولدریگ و گارایکوچیا، 2020). این امکان وجود دارد که ERCC1-XPF در مسیرهای ترمیم DNA اضافی که با آسیب DNA درون زا سروکار دارند، دخیل باشد. برای مثال، اخیراً نشان داده شده است که ERCC{3}}XPF بر روی ساختارهای DNA جایگزین، مانند Z-DNA، که در طی آن با پروتئین های ترمیم ناسازگاری به جای عوامل ترمیم NER یا ICL همکاری می کند (مک کینی و همکاران، 2020) عمل می کند. علاوه بر این، نشان داده شد که ERCC{6}}XPF در یک مسیر فرعی ترمیم اکسیزیون پایه همراه با هلیکاز RECQ1 درگیر است (Woodrick et al., 2017).

دو خواهر و برادر (PV46LD و PV50LD) در این مطالعه عدم رشد، کوتاهی قد و کمبود چربی زیر جلدی را نشان دادند که یادآور اندازه کوچک مشاهده شده در موش‌های ERCC{2}}KO بود (McWhir et al., 1993; سلفریج و همکاران، 2001؛ ویدا و همکاران، 1997). علاوه بر این، خواهران و برادران دچار اختلالات کبدی با تصویری عمدتاً کلستاتیک شدند که منجر به پیوند کبد ارتوتوپی قبل از سن 9 سالگی شد. این مداخله به وضوح از مرگ زودهنگام جلوگیری کرد، اما شکست در رشد را بهبود بخشید، همانطور که از رشد وزن، قد و دور سر پس از پیوند بسیار کمتر از صدک سوم مشهود است.

جالب است که بیماری کلستاتیک کبدی به عنوان یک ویژگی مشترک در بیماران مبتلا به CS مصری گزارش شده است، که نشان می‌دهد که این امر باید در بیماران مبتلا به CS با پیشینه‌های قومی دیگر با دقت بیشتری بررسی شود تا ببینیم آیا این یک ویژگی شایع‌تر از آنچه قبلاً تشخیص داده شده است (عبد غفار و همکاران). ، 2011). اگرچه هیچ ناهنجاری کبدی در بیماران XP توصیف نشده است، مواردی از سیتولیز کبدی (تجزیه سلولی یا ترکیدن) در بیماران FA وجود دارد (Masserot-Lureau et al., 2012)، که ممکن است از ناهنجاری های کبدی مشاهده شده در ERCC متمایز باشد. 1- خواهر و برادر ناقص. بررسی بافت‌شناسی بیوپسی کبد از خواهر یا برادر بزرگ‌تر (PV50LD) تغییراتی را در مورفولوژی سلول‌های کبدی با بزرگ شدن و تنوع هسته‌ای نشان داد، همانطور که در موش‌های دارای کمبود ERCC ذکر شد (شکل S1 D؛ N´uñez و همکاران، 2000). ).

دومین علت مرگ در موش‌های ERCC1-KO با بیان خاص کبدی ERCC1 شدید بود.نارسایی کلیه(سلفریج و همکاران، 2001). هر دو خواهر و برادر همچنین اختلال عملکرد کلیه را نشان می دهند، با ویژگی هایی که نشان دهنده اختلال عملکرد لوله پروگزیمال است که منجر به پیش رونده می شود.کلیهاختلال. با این حال، عملکرد لوله پس از پیوند کبد تثبیت شد، اماکلیهعملکردنیاز به نظارت مستمر دارد. فنوتیپ کلیوی موش‌های ERCC1- KO - با لوله‌های گشاد شده حاوی مواد پروتئینی نشت‌شده مطابق با توبولوپاتی (McWhir و همکاران، 1993؛ Selfridge و همکاران، 2001؛ Weeda و همکاران، 1997) - مشابه است. نسبت به بیمارانی که در مطالعه ما شرح داده شد. علاوه بر این، نارسایی کلیوی و در برخی موارد، نارسایی در ترکیب XP/CS (بن چهیدا و همکاران، 2017؛ کوندو و همکاران، 2016؛ کرالوند و همکاران، 2013) و همچنین CS (فونکی و همکاران) گزارش شده است. .، 2006؛ ریس و همکاران، 1996؛ ساتو و همکاران، 1988)، در حالی که ارتباط بین FA و ناهنجاری های ساختاریکلیهhas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>الف) که در سن 37 سالگی درگذشت (گرگ و همکاران، 2011؛ ​​ایموتو، ک.، و همکاران 2007). بیماران مبتلا به نقص در پروتئین های ترمیم کننده برش نوکلئوتیدی برهمکنش ERCC1 یا XPF، پوسته پوسته پوسته پوسته با شروع دیرهنگام تخریب شدید عصبی را نشان می دهند. [چکیده] J. Invest.Dermatol. 127: S92). اگرچه هیچ اختلال کبدی گزارش نشد، این بیمار در سن 15 سالگی دچار آتروفی شدید مغز شد که به تخریب پیشرونده عصبی همراه با زوال عقل تبدیل شد. آتروفی خفیف مغزی نیز در هر دو خواهر و برادر در سنین 13 و 11 سالگی مشاهده شده است که نشان می دهد رشد عصبی هر دو خواهر و برادر باید به دقت تحت نظر باشد.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>ج یاسپرس و همکاران، 2007; Niedernhofer و همکاران، 2006) با یک فنوتیپ با مقداری همپوشانی با خواهر و برادرهای گزارش شده در اینجا، از جمله حساسیت به نور بدون سرطان پوست، کوتاهی قد، کمبود چربی زیر جلدی، تأخیر رشد و نارسایی کلیوی ارائه کردند (Niedernhofer et al., 2006). جدا از خواهر و برادرهای گزارش شده در اینجا، این پسر دارای ویژگی های پروژرویید سگمنتال برجسته بود، اما تصویر کبدی بسیار خفیف تری بدون کلستاز داشت. خواهر و برادرهایی که در اینجا گزارش شده‌اند نشان می‌دهند که جهش‌های دو آللی ERCC1 می‌توانند باعث ایجاد طیفی از فنوتیپ‌ها شوند، از فنوتیپ‌هایی که معمولاً در CS دیده می‌شود تا فنوتیپی که شامل کوتاه‌قدی خفیف‌تر، حساسیت به نور، و کبد شدیدتر است.کلیهاختلال، به طور بالقوه به دلیل تأثیر قوی ترکیبی بر NER و تأثیر همزمان بر ترمیم ICL، که ممکن است به ویژه بر این اندام ها تأثیر بگذارد.

مواد و روش ها

تمام مراحل انجام شده در این مطالعه مطابق با استانداردهای اخلاقی است و توسط کمیته اخلاق انسانی بیمارستان سلطنتی کودکان ملبورن، ویکتوریا، استرالیا (HREC36291C) و کمیته خدمات اخلاقی پژوهشی ملی بریتانیا در شمال شرق-نیوکاسل و شمال تاین ساید تایید شده است. 2. بیماران در برنامه های بیماری های تشخیص داده نشده برای بیماران اطفال مبتلا به اختلالات مندلی "یتیم" فرضی انتخاب شدند. نمونه بزاق یا خون از بیماران و اعضای خانواده آنها پس از اخذ رضایت آگاهانه کتبی برای استخراج DNA ژنومی جمع آوری شد. والدین اجازه داده اند که عکس های ویرایش نشده خواهر و برادر آسیب دیده را در شکل 1 الف نشان دهند.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T در هر دو فرد مبتلا در اگزون 4 از 8 ژن ERCC1 شناسایی شد. در بازجویی اولیه داده‌های اگزوم در هر دو فرد مبتلا، به نظر می‌رسد که این واریانت در حالت هموزیگوت است اما در حالت هتروزیگوت در پدر و در مادر وجود ندارد، که حاکی از حذف احتمالی در آلل مادری است. نوع اشتباه در پایگاه داده gnomAD با فرکانس 0.01 درصد (22 هتروزیگوت، بدون هموزیگوت) وجود دارد و قبلاً در افراد مبتلا گزارش نشده است. نوع اشتباه در پایگاه داده LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 و http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) و پایگاه داده ClinVar ( شناسه تنوع: 978472).

تشخیص حذف توسط qPCR

برای تشخیص حذف، DNA ژنومی از سلول‌های لنفوسیت/اپیتلیال استخراج شد و ناحیه مربوطه ژن ERCC1 در qPCR تکثیر شد. qPCR با استفاده از پروب ها و پرایمرهای خاص (فهرست شده در جدول S1) که با استفاده از مرکز طراحی سنجش کتابخانه جهانی پروب (Roche) طراحی شده و توسط سیگما آلدریچ سنتز شده است، انجام شد. پرایمرها به گونه ای طراحی شدند که ناحیه حذف شده در اگزون 4 و ناحیه ای در داخل ژن که به عنوان شاهد حذف نشده است (اگزون 5) باشد. یک qPCR مالتی پلکس با استفاده از میکس واکنشی LightCycler R 480 Probes Master (Roche) طبق پروتکل سازنده برای تقویت و کمی سازی ناحیه ژن ERCC1 با استفاده از ژن CFTR (اگزون 27) به عنوان استاندارد داخلی انجام شد (جدول) S1). qPCR بر روی ابزار LightCycler R 480 (Roche) انجام شد و تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار LightCycler R 480 نسخه 1.5.0 (Roche) انجام شد. دستورالعمل‌های کالج آمریکایی ژنتیک پزشکی برای تفسیر تغییرات توالی دنبال شد.

تشخیص نوع اشتباه با توالی سنگر

DNA ژنومی با تعلیق مجدد گلوله‌های سلولی در بافر لیزات کل سلولی (5{4}} میلی‌مولار KCL، 10 میلی‌مولار Tris، pH 8.0، 25 میلی‌مولار MgCl2، {{12}) جدا شد. }.1 mg/ml ژلاتین، 0.45 درصد توئین-20، و 0.45 درصد NP-40) حاوی 0.1 mg/ml پروتئیناز K (EO0491؛ ThermoFisher Scientific) و انکوباسیون برای 1 ساعت در 56 درجه و به دنبال آن 10-دقیقه غیرفعال‌سازی حرارتی پروتئیناز K در دمای 96 درجه. قطعات تقریباً 1 کیلوبایتی که جهش‌های نادرست را در بر می‌گیرند، با PCR تکثیر شدند (پرایمرهای توالی‌یابی در جدول S1 فهرست شده‌اند) و سپس با استفاده از پرایمر رو به جلو یا معکوس، توالی‌یابی سانگر انجام شد.

خطوط سلولی

رده های سلولی فیبروبلاست از بیوپسی پوست افراد مبتلا و والدین ایجاد شد. تمام رده های سلولی (ذکر شده در جدول S2) در دمای 37 درجه در اتمسفر 5 درصد CO2 ایندیم (Thermo Fisher Scientific) همراه با پنی سیلین/استرپتومایسین (Sigma-Aldrich) و 10 درصد FBS (Bodinco BV) کشت داده شدند. همه رده های سلولی به طور معمول برای عفونت مایکوپلاسما مورد آزمایش قرار گرفتند.

جاودانگی فیبروبلاست با hTERT

فیبروبلاست های WT (48BR) و PV50LD توسط نوکلئوفکشن p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) با استفاده از Amaxa Nucleofector (برنامه U23) جاودانه شدند. هر الکتروپوریشن حاوی 400،{8}} فیبروبلاست و 2.5 میکروگرم DNA پلاسمید بود. پس از الکتروپوراسیون، سلول ها در فلاسک های کشت بافت سانتی متر مربع حاوی 5 میلی لیتر DMEM و 10 درصد FBS کاشته شدند. پس از 2 روز، محیط کشت با محیط کشت حاوی 20 میکروگرم در میلی لیتر نئومایسین جایگزین شد.

/ استرپتومایسین (سیگما آلدریچ) و 10 درصد FBS (Bodinco BV). همه رده های سلولی به طور معمول برای عفونت مایکوپلاسما مورد آزمایش قرار گرفتند.

سازه های پلاسمید

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>جهش T در ERCC1. محصول PCR همپوشانی به عنوان یک قطعه NheI و AgeI برای تولید plenty-CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus وارد شد. ERCC1WT و ERCC1R156W به عنوان قطعات NheI و AgeI در pcDNA{10}}FRT-TO Puro-EGFP-N1 برای تولید pcDNA{15}}FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFPand pcDNA{10}FRT وارد شدند{21} -Puro-ERCC1R156W-EGFP. جهش زایی سایت جهت معرفی جهش های نقطه ای در pMacro Bac-XPF-ERCC1WT با استفاده از کیت جهش زایی KOD-plus (Toyobo) همانطور که در پروتکل سازنده توضیح داده شده است، با استفاده از پرمرهای فهرست شده در جدول S1 استفاده شد. تمام توالی ها با توالی یابی سنگر تأیید شدند.

تولید سلول KO

خطوطی برای تولید سلول‌های تک KO، U2OS(FRT) و RPE{1}hTERT (PuroR/TP53-dKO) با pLV-U6g-PPB که یک RNA راهنمای از مرکز پزشکی دانشگاه لیدن/سیگما را کد می‌کند، همتراسفکت شدند. -کتابخانه تک راهنمای RNA آلدریچ (sgRNA) (جدول S3 را برای پلاسمیدها و جدول S4 را برای توالی‌های sgRNA ببینید) که ژن ERCC1 را همراه با یک ناقل بیان کدکننده Cas{11}}A-GFP (pX458؛ Addgene #48138) با استفاده از Lipofectamine20 مورد هدف قرار می‌دهد. (اینویتروژن). سلول‌های U2OS (FRT) ترانسفکت‌شده بر روی پورومایسین (1 میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت 3 روز انتخاب شدند و با چگالی کم کشت شدند و پس از آن کلون‌های منفرد جدا شدند. سلول‌های RPE{19}}hTERT ترانسفکت‌شده FACS بر روی BFP/GFP طبقه‌بندی شدند و با چگالی کم پوشش داده شدند، پس از آن کلون‌های منفرد جدا شدند. کلون های KO با آنالیز وسترن بلات تایید شدند. عدم وجود بیان ادغام/پایدار Cas9 با وسترن بلات تایید شد.

تولید رده های سلولی پایدار

یک کلون ERCC1 KO در پس‌زمینه U2OS (FRT) (جدول S2 را ببینید) برای بیان پایدار ERCC1WT-GFP، ERCC1R156W-GFP، یا GFP-NLS با ترانسفکشن همزمان pcDNA5-FRT-TO-Puroplasmid که این موارد را کد می‌کند، مورد استفاده قرار گرفت. cDNA (2 میکروگرم)، همراه با پلاسمید pOG44 که Flp recombinase را کد می کند ({14}}.5 میکروگرم). یک جمعیت سلولی پلی کلونال پس از انتخاب بر روی پورومایسین 1 میکروگرم در میلی لیتر و بلاستیسیدین S 4 میکروگرم در میلی لیتر به دست آمد. بیان پروتئین های ERCC1 با برچسب GFP یا GFP-NLS با افزودن 2 میکروگرم در میلی لیتر داکسی سایکلین به مدت 24 ساعت القا شد.

تولید رده های سلولی KI

برای تولید KI های هموزیگوت، سلول های RPE{{{0}}hTERT ابتدا به مدت 30 دقیقه با مهارکننده DNA-PK 1 میکرومولار (NU7441) تحت درمان قرار گرفتند تا ترمیم DSB مستعد خطا را سرکوب کرده و استفاده از ترمیم وابسته به همولوژی را افزایش دهد. متعاقباً، 350 سلول در 20 میکرولیتر بافر نوکلئوفکتور (V4XP{11}}؛ Lonza) در حضور 4.5 میکروگرم پلاسمید حاوی Cas9 و sgRNA که ژن ERCC1 را هدف قرار می‌دهد، مجدداً معلق شدند (جدول S3 را برای پلاسمیدها و Table ببینید). توالی‌های S4 forsgRNA) و 100 میکرومولار DNA دهنده تک رشته‌ای حاوی جهش بیمار و همچنین جهش‌های بی‌صدا برای از بین بردن محل PAM برای جلوگیری از برش مجدد توسط Cas9 و جهش‌های خاموش برای معرفی یک مکان محدود HindIII برای تسهیل غربالگری کلون‌های KI. سلول ها با استفاده از واحد هسته ای آمکسا 4D-X (Lonza) با استفاده از برنامه EA{24}} الکتروپوره شدند. پس از الکتروپوراسیون، سلول‌ها با چگالی کم در محیط McCoy با 10 درصد FBS قرار گرفتند. روز بعد، محیط با DMEM (10 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین) جایگزین شد و به سلول ها اجازه داده شد تا کلونی تشکیل دهند. تقریباً 400 کلنی جدا و گسترش یافتند. DNA ژنومی جدا شد و قطعه ای شامل جهش معرفی شده و محل محدودیت معرفی شده (HindIII) با PCR تودرتو تکثیر شد (جدول S1 را برای آغازگرها ببینید). قطعات PCR با HindIII (NEB) به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه هضم و سپس با الکتروفورز ژل جدا شدند. کلون هایی که دارای محل محدودیت معرفی شده HindIII بودند با توالی یابی سانگر آنالیز شدند (جدول S1 را برای آغازگرها ببینید). ما دو کلون KI هموزیگوت را در بین 400 کلون جدا شده به دست آوردیم که با راندمان KI حدود 0.5 درصد مطابقت دارد.

انتقال لنتی ویروسی

برای انتقال لنتی ویروسی، mVenus-ERCC1WT یا mVenus ERCC1R156W در ناقل لنتی ویروسی pLenti-CW57-TO قرار داده شد. HEK293T با وکتورهایی که این ترکیبات ERCC1، VSV-G، RRE و REV را رمزگذاری می‌کنند، با استفاده از JetPEI (سیگما آلدریچ) برای تولید ویروس ترانسفکت شد. مایع رویی حاوی ویروس پس از 24 ساعت جمع آوری شد و با فیلتر میکرومتر 0.44- فیلتر شد. فیبروبلاست های اولیه PV46LD و PV50LD به صورت لنتی ویروسی در حضور پلی برن (سیگما-آلدریچ) انتقال داده شدند. سلول ها با 15 میکروگرم بر میلی لیتر پورومایسین انتخاب شدند. بیان پروتئین‌های ERCC1 با mVenus با افزودن 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر داکسی‌سایکلین به مدت 24 ساعت القا شد.

سنجش بقا کلونوژنیک

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >20 سلول نمره گذاری شد. آزمایش های بقا در دو تکرار انجام شد و حداقل دو بار تکرار شد.

رسوب ایمنی برای Co-IP

سلول ها تحت درمان ساختگی قرار گرفتند یا تحت تابش UV-C (2{11}} J/m2) قرار گرفتند و پس از 1 ساعت برداشت شدند. گلوله های سلولی به مدت 2{26}} دقیقه روی یخ در بافر EBC (50 میلی مولار Tris، pH 7.5، 150 میلی مولار NaCl، 0.5 درصد NP{13}}، 2 میلی مولار MgCl2 و بازدارنده پروتئاز لیز شدند. کوکتل [روش]) همراه با 500 واحد بر میلی لیتر بنزوناز نوکلئاز (Novagen). لیزهای سلولی به مدت 1.5 ساعت در دمای 4 درجه با دانه های GFP-Trap A (Chromotek) انکوبه شدند. سپس دانه‌ها شش بار با بافر EBC (50 میلی‌مولار Tris، pH 7.5، 150 میلی‌مولار NaCl، 0.5 درصد NP{28}}، 1 میلی‌مولار EDTA و کوکتل بازدارنده پروتئاز) شسته و در Laemmli-SDS جوشانده شدند. بافر نمونه

وسترن بلات

سلول‌ها چرخانده شدند، با PBS شسته شدند و به مدت 10 دقیقه در بافر Laemmli (4{10}} میلی‌مولار Tris، pH 6.8، 3.35 درصد SDS، 16.5 درصد گلیسرول، 0.0005 درصد بروموفنول آبی، و 0.05 درصد جوشانده شدند. ام دی تیوتریتول). پروتئین‌ها روی ژل‌های 4 تا 12 درصدی Criterion XT Bis-Tris (#3450124; Bio-Rad) در بافر NuPAGE MOPSrunning (NP{17}}؛ Thermo Fisher Scientific) جدا شدند و روی غشاهای پلی‌وینیلیدین فلوراید (IPFL0 Millipore10;EIPFL0 Millipore10; ). غشا با بافر مسدود کننده (MB{19}}؛ زمین سنگ) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق مسدود شد. غشاء سپس با آنتی بادی ها (فهرست شده در جدول S5) همانطور که نشان داده شده است کاوش شد. یک سیستم Odyssey CLx (LI-COR Biosciences) برای تشخیص استفاده شد.

سنجش بازیابی RNA (RRS)

30،000 سلول بر روی ورقه‌های شیشه‌ای 12- میلی‌متری در 24-صفحات چاهی در DMEM با 1 درصد FBS کاشته شدند. پس از 24 ساعت، سلول ها با UV-C با دوز 6 ژول بر متر مربع تحت تابش قرار گرفتند و در یک محیط مطبوع برای دوره های زمانی مختلف ({2{33}}}} ساعت، 3 ساعت و 18 ساعت) انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، رونوشت های نوپا با انکوبه کردن سلول ها با 400 میکرومولار 5-اتینیل-اوریدین (CLK-N002-10؛ Jena Bioscience)، که سپس با یک مخلوط Click-iT متشکل از 50 مشاهده شد، برچسب گذاری شدند. بافر تریس میلی‌مولار، pH 8.0، 60 میکرومولار آتوآزید (647N{23}}؛ ATTO-TEC)، 4 میلی‌مولار CuSO4•5H2O، 10 میلی‌مولار اسید ال اسکوربیک (A0278؛ سیگما-آلدریچ) و 0.1 میکروگرم در میلی‌لیتر DAPI (D1306؛ Thermo Fisher Scientific) به مدت 1 ساعت. سلول ها سه بار به مدت 5 دقیقه با PBS شسته و بر روی لام های میکروسکوپ (Thermo Fisher Scientific) با استفاده از Aqua Polymount (Brunschwig) نصب شدند.

ایمونوفلورسانس

برای رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس، 250،000 سلول روی ورقه‌های شیشه‌ای 18- میلی‌متری کاشته شدند. روز بعد، سلول‌ها با پارافورمالدئید 4 درصد و به دنبال آن نفوذپذیری با 5.5 درصد تریتون ایکس-100 به مدت 10 دقیقه انجام شد. سلول ها با 100 گلایسین در PBS به مدت 10 دقیقه برای مسدود کردن گروه های آلدئیدی واکنش نداده تحت درمان قرار گرفتند، با PBS شستشو داده شدند و در بافر شستشو (PBS حاوی 0.5 درصد BSA و 0.05 درصد Tween{14}}؛ Sigma-Aldrich) به مدت 10 دقیقه متعادل شدند. مراحل آنتی بادی و شستشوها در بافر شستشو بود. آنتی بادی های اولیه به مدت 2 ساعت در دمای اتاق و سپس آنتی بادی های ثانویه به مدت 1 ساعت و DAPI به مدت 5 دقیقه انکوبه شدند. آنتی بادی های اولیه و ثانویه در جدول S5 فهرست شده اند. سلول ها با 0.1 میکروگرم بر میلی لیتر DAPI انکوبه شدند و با استفاده از Aqua Polymount سوار شدند.

رنگ آمیزی H2AX

200،000 سلول بر روی ورقه‌های شیشه‌ای 18- میلی‌متری در صفحات چاهی با DMEM (10 درصد FBS و 1 درصد P/S) کاشته شدند. روز بعد، سلول ها توسط ژنراتور پرتو ایکس YXlon بین المللی (200 کیلوولت، 4 میلی آمپر؛ نرخ دوز 2 گری در دقیقه) در معرض IR قرار گرفتند. در نقاط زمانی مشخص شده، سلول ها با 3 درصد پارافورمالدئید در PBS به مدت 10 دقیقه تثبیت شدند و برای H2AX به مدت 1 ساعت رنگ آمیزی شدند (به بالا مراجعه کنید). تصاویر با استفاده از یک ماکرو سفارشی ساخته شده در ImageJ اندازه‌گیری شدند که تجزیه و تحلیل خودکار و عینی تعداد کانون‌ها را در هر سلول، همانطور که قبلاً توضیح دادیم، ممکن می‌سازد (Typas et al., 2015).

تجزیه و تحلیل میکروسکوپی سلول های ثابت

تصاویر نمونه‌های ثابت بر روی میکروسکوپ فلورسانس میدان گسترده Zeiss AxioImagerM2 یا D2 مجهز به اهداف غوطه‌وری نفتی 63× PLAN APO (1.4 عددی دیافراگم [NA]) و یک لامپ متال هالید HXP 120 که برای تحریک استفاده می‌شود، تهیه شد. کاوشگرهای فلورسنت با استفاده از فیلترهای زیر برای DAPI (فیلتر تحریک: 350/50 نانومتر؛ آینه دو رنگ: 400 نانومتر؛ فیلتر انتشار: 460/50 نانومتر)، الکسا 555 (فیلتر تحریک: 545/25 نانومتر؛ آینه دو رنگ آمیزی: nm 545/25؛ آینه دو رنگی: nm: ؛ فیلتر انتشار: 605/70 نانومتر)، یا الکسا 647 (فیلتر تحریک: 640/30 نانومتر؛ آینه دو رنگ: 660 نانومتر؛ فیلتر انتشار: 690/50 نانومتر). تصاویر با استفاده از نرم افزار ZEN 2012 ضبط و در ImageJ تجزیه و تحلیل شدند.

میکرو تابش لیزر UV

سلول‌ها روی روکش‌های 18- میلی‌متری کوارتز (UV-C) یا شیشه (UV-A) رشد داده شدند و در یک محفظه مغناطیسی Chamlide CMB قرار گرفتند که در آن محیط رشد با CO2-لیبوویتز L مستقل جایگزین شد. {4}} محیط (Thermo Fisher Scientific). مسیرهای لیزر UV-C با استفاده از لیزر گارنت آلومینیوم ایتریوم با حالت جامد 266- میلی‌متری با پمپ دیود ساخته شدند (متوسط ​​توان ۵ میلی‌وات، سرعت تکرار تا ۱۰ کیلوهرتز، و طول پالس ۱ ns). قبل از تابش UV-Amicro، سلول ها با 6 میکرومولار تری اکسسالن به مدت 1 ساعت برای تولید ICL یا با 15 میکرومولار BrdU به مدت 24 ساعت برای تولید DSB حساس شدند. مسیرهای لیزر UV-A توسط یک لیزر گارنت ایتریوم آلومینیومی 355- نانومتری حالت جامد پمپ شده با دیود ساخته شد (متوسط ​​توان ۱۴ مگاوات و نرخ تکرار تا ۲۰۰ هرتز). هر دو لیزر در یک سیستم UGA{24}}Caliburn/2L Spot Illumination (Rapp OptoElectronic) ادغام شدند.

میکرو تابش با تصویربرداری سلول زنده در یک محفظه محیطی تنظیم شده روی 37 درجه روی میکروسکوپ فلورسانس میدان گسترده تمام کوارتز زایس Axio Observer 7، با استفاده از یک هدف غوطه‌وری گلیسرول اولترافیلتر 100× (1.2NA) ترکیب شد (UV-C) ) یا یک هدف غوطه وری در روغن Plan-Neofluar 63× (1.25 NA) (UV-A). سیستم لیزر از طریق TriggerBox به میکروسکوپ متصل می‌شود و یک فیلتر با چگالی خنثی (ND{17}}) 90 درصد نور لیزر را مسدود می‌کند. لامپ متال هالید AnHXP 120-V برای تحریک استفاده شد. تصاویر در Zeiss ZEN به دست آمد و در ImageJ اندازه گیری شد.

سنجش شکست کروموزوم

2 × 1{{20}}6 فیبروبلاست در فلاسک های کشت بافت 175-cm2 با DMEM (10 درصد FBS) کاشته شد و در حضور یا عدم حضور 50 نانومولار MMC در دمای 37 درجه کشت شد. پس از 48 ساعت، 600 میکرولیتر دمکولسین (10 میکروگرم بر میکرولیتر) به هر فلاسک کشت اضافه شد و سلول ها به مدت 30 دقیقه اضافی در دمای 37 درجه انکوبه شدند تا برای متافازها غنی شوند. سپس سلول ها تریپسینیز شدند و در 75 میلی مولار KCL مجدداً معلق شدند و به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. سلول ها چرخانده شدند، در 10 میلی لیتر فیکساتور (75 درصد متانول و 25 درصد اسید استیک) مجدداً معلق شدند، به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند و سانتریفیوژ شدند. گلوله ها مجدداً در 10 میلی لیتر فیکساتور معلق شدند و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. این مرحله تکرار شد و در نهایت گلوله در فیکساتور 0.5-1.0 میلی لیتری معلق شد. سوسپانسیون سلولی روی یک لام ریخته شد و اجازه داد خشک شود. اسلایدها به مدت 5 دقیقه در محلول 3 درصد گیمسا رنگ آمیزی شدند، در آب شیر شسته شدند و اجازه داده شد تا خشک شوند. اسلایدها کدگذاری شدند و از هر فرهنگ کدگذاری شده، 50 متافاز از نظر آسیب کروموزومی مورد بررسی قرار گرفت. پس از امتیاز دهی، اسلایدها رمزگشایی شدند و نتایج به صورت ارائه شده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (Stoepker et al., 2011).

UDS

180،000 سلول روی ورقه‌های شیشه‌ای 18- میلی‌متری در 12-صفحه‌های چاهی در DMEM با 1 درصد FBS کاشته شدند. پس از 24 ساعت، سلول ها به صورت موضعی از طریق فیلتر 5-μm با 30 J/m2 UV-C تحت تابش قرار گرفتند. سلول‌ها متعاقباً با 20 میکرومولار EdU (VWR) و 1 میکرومولار{13}}فلورو-دئوکسی‌اوریدین (سیگما-آلدریچ) برای 1 ساعت یا 4 ساعت برچسب‌گذاری شدند. پس از برچسب زدن، سلول ها با 10 میکرومولار تیمیدین در DMEM بدون مکمل به مدت 30 دقیقه تحت تعقیب قرار گرفتند و به مدت 15 دقیقه با 3.7 درصد فرمالدئید در PBS تثبیت شدند. سلول ها به مدت 20 دقیقه در PBS با 0.5 درصد Triton-X100 نفوذپذیر شدند و در 3 درصد BSA (Thermo Fisher Scientific) در PBS مسدود شدند. EdU گنجانده شده با استفاده از شیمی Click-iT طبق دستورالعمل سازنده (Invitrogen) به Attoazide Alexa Fluor 647 جفت شد. پس از جفت شدن، سلول ها با فرمالدئید 2 درصد به مدت 10 دقیقه پس فیکس شدند و متعاقبا با 100 میلی مولار گلیسین مسدود شدند. DNA با 0.5 مولار NaOH به مدت 5 دقیقه دناتوره شد و سپس با 10 درصد BSA به مدت 15 دقیقه مسدود شد. در مرحله بعد، سلول ها با آنتی بادی علیه دایمرهای سیکلوبوتان پیریمیدین (به جدول S5 مراجعه کنید) به مدت 2 ساعت و سپس آنتی بادی های ثانویه به مدت 1 ساعت و DAPI به مدت 5 دقیقه انکوبه شدند. سلول ها در Polymount (Brunschwig) سوار شدند.

جمع آوری داده های MS

MS اساساً همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد (Salas Lloret et al., 2{17}}19). تمام آزمایش‌ها بر روی یک سیستم EASY-nLC 1000 (Proxeon) متصل به Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) از طریق یک منبع یون نانو الکترواسپری انجام شد. Q-Exactive به یک قطره چکان سیلیکا 25-سانتی متری (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) داخلی همراه با مهره‌های 1.9 میکرومتری C18-AQ (Reprospher) متصل شد. -DE؛ پور؛ دکتر مانیش، آمربوخ-انترینگن، آلمان). نمونه ها در یک گرادیان کروماتوگرافی 40- دقیقه از 0 تا 30 درصد استونیتریل اجرا شدند و سپس قبل از تعادل مجدد ستون با سرعت جریان 200 NL/min به 95 درصد استونیتریل افزایش یافتند. طیف سنج جرمی در حالت اکتساب وابسته به داده با روش هفت تاپ و محدوده اسکن 300-1600 m/z استفاده شد. طیف اسکن کامل MS در مقدار هدف 3×106 و وضوح 70،{34}} به دست آمد و طیف جرمی پشت سر هم تفکیک تصادم بالاتر (MS/MS) در مقدار هدف 105 ثبت شد، و با وضوح 35000، پنجره ایزوله 2.2 m/z، و انرژی برخورد عادی 25 درصد. حداقل هدف کنترل بهره خودکار 104 بود. حداکثر زمان تزریق MS1 و MS2 به ترتیب 250 و 120 میلی ثانیه بود. توده های یون پیش ساز یون های اسکن شده به صورت دینامیکی از آنالیز MS/MS برای 30 ثانیه حذف شدند. یون های با بار 1 و بالاتر از 6 از تحریک تجزیه و تحلیل MS2 حذف شدند.

تجزیه و تحلیل داده های MS همه داده های خام با استفاده از MaxQuant (نسخه 1.6.6.{3}}) همانطور که قبلاً توضیح داده شد (Tyanova et al., 2016a) تجزیه و تحلیل شدند. ما جستجو را در برابر یک پروتئوم مرجع UniProt هضم شده در سیلیکون برای هومو ساپینس، از جمله توالی های متعارف و ایزوفرم (27 مه، 2{20}}19) انجام دادیم. جستجو در پایگاه داده طبق تنظیمات استاندارد با تغییرات زیر انجام شد. هضم با تریپسین / P استفاده شد، اجازه می دهد چهار شکاف از دست رفته. اکسیداسیون (M) و استیل (پروتئین N-ترم) به عنوان تغییرات متغیر با حداکثر تعداد سه مجاز بودند. کاربامیدو متیل (C) به عنوان یک اصلاح ثابت غیرفعال شد. تعیین کمیت بدون برچسب (LFQ) فعال شد و اجازه LFQ سریع را نمی داد. داده های خروجی Max-Quant بیشتر با استفاده از پلت فرم محاسباتی Perseus پردازش شد (v 1.6.6.0؛ Tyanova et al., 2016b). مقادیر شدت LFQ log2 تبدیل شدند و آلاینده‌ها و پروتئین‌های بالقوه شناسایی شده توسط پپتیدهای مکان یا معکوس حذف شدند. نمونه‌ها در دسته‌های تجربی گروه‌بندی شدند و پروتئین‌هایی که در چهار تکرار از چهار تکرار در حداقل یک گروه شناسایی نشدند نیز حذف شدند. مقادیر گمشده با استفاده از مقادیر توزیع شده معمولی با 1.8 شیفت پایین (log2) و عرض تصادفی 0.3 (log2) با در نظر گرفتن مقادیر کل ماتریس منتسب شدند. تجزیه و تحلیل آماری (آزمون t) برای تعیین اینکه کدام پروتئین به طور قابل توجهی غنی شده است انجام شد. نمودارهای آتشفشان تولید شد و جداول خروجی تجزیه و تحلیل آماری بیشتر در Microsoft Excel پردازش شد. داده های پروتئومیکس MS از طریق مخزن شریک PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) با شناسه مجموعه داده PXD017940 به کنسرسیوم ProteomeXchange سپرده شده است.

خالص سازی ERCC نوترکیب1-XPF

تولید باکولوویروس با استفاده از سازه‌های pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA (Enzlin and Sch¨ arer, 2{12}}{14}}2) انجام شد. ERCC1WT و ERCC1R156W با XPFWT از یک باکولوویروس منفرد در سلول‌های حشره Sf9 بیان شدند. هترودایمرها بر اساس میل ترکیبی نیکل، حذف اندازه و کروماتوگرافی هپارین خالص شدند (Enzlin and Sch¨ arer, 2002). ERCC{10}}XPF از ستون هپارین در حدود 600 میلی مولار NaCl شسته شد. غلظت پروتئین از 0.1 تا 0.2 میلی گرم در میلی لیتر متغیر بود.

سنجش هسته ای

یک زیرلایه حلقه ساقه (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC) حاوی رنگ فلورسنت Cy5 (5{17}} pmol) در 39 انتهایی (IDT) در یک بافر بازپخت 100- میکرولیتر (1{21}) آنیل شد. میلی‌مولار تریس، pH 7.5 و 50 میلی‌مولار NaCl) با حرارت دادن در دمای ۹۵ درجه به مدت ۵ دقیقه و سرد شدن آهسته در مدت ۲ ساعت. 200 fmol از سوبسترای آنیل شده در واکنش‌های 20- میکرولیتر حاوی 25 میلی‌مولار HEPES، pH8.0، 2 میلی‌مولار MgCl2، 10 درصد گلیسرول، 0.5 میلی‌مولار - مرکاپتواتانول، 0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر BSA، 40 استفاده شد. mM NaCl و 0-40 نانومولار پروتئین. واکنش ها در دمای 30 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند و با افزودن 10 میکرولیتر 90 درصد فرمامید/10 میلی مولار EDTA متوقف شدند. پس از حرارت دادن در دمای 95 درجه به مدت 5 دقیقه و سرد شدن روی یخ، 15 میکرولیتر از هر نمونه بر روی ژل پلی آکریل آمید دناتوره کننده 15 درصد قرار گرفت. ژل ها در 30 میلی آمپر به مدت 30 دقیقه اجرا شدند و باندها توسط فلورسانس توسط Typhoon RGB (Amersham Biosciences) مشاهده شدند.

سنجش NER در شرایط آزمایشگاهی

عصاره سلولی با کمبود XPF (XP2YO) و پلاسمید حاوی ضایعه dG-AAF مخصوص سایت همانطور که قبلاً توضیح داده شد ایجاد شد (Gillet و همکاران، 2{19}}05؛ Shivji و همکاران، 1999) . برای هر واکنش، 2 میکرولیتر بافر ترمیمی (2{4{47}}}}}0 میلی‌مولار Hepes-KOH، 25 میلی‌مولار MgCl2، 2.5 میلی‌مولار DTT، 10 میلی‌مولار ATP، 110 میلی‌مولار فسفوکراتین، و 1.8 میلی‌مولار / میلی لیتر BSA، pH نهایی 7.8)، 0.2 میکرولیتر بافر کراتین فسفوکیناز (2.5 میلی گرم بر میلی لیتر کراتین فسفوکیناز از عضله خرگوش [سیگما آلدریچ]، 10 میلی مولار گلیسین، pH 9.0 و 50 درصد گلیسرول)، 3 میکرولیتر گلیسرول XP با کمبود عصاره نمک طعام (تا غلظت نهایی 70 میلی مولار) و پروتئین های ERCC{30}}XPF خالص شده در حجم کل 9 میکرولیتر در دمای 30 درجه به مدت 10 دقیقه از قبل گرم شدند. 1 میکرولیتر پلاسمید حاوی dG-AAF (ng/μl 50) به هر واکنش اضافه شد و واکنش ها در دمای 30 درجه به مدت 45 دقیقه انکوبه شدند. سپس مخلوط واکنش به مدت 5 دقیقه روی یخ خنک شد و سپس 0.5 میکرولیتر از 1 میکرومولار رشته مکمل d (GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC) اضافه شد و مخلوط واکنش با حرارت دادن در دمای 95 درجه به مدت 5 دقیقه دناتوره شد. پس از 15 دقیقه بازپخت در دمای اتاق، 1 میکرولیتر مخلوط توالی (حاوی 0.13 U توالی و 2.0 μCi [-32}P] dCTP برای هر واکنش) اضافه شد. پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه به مدت 3 دقیقه، 1.2 میکرولیتر مخلوط تری فسفات دئوکسی ریبونوکلئوتید (50 میکرومولار dCTP، 100 میکرومولار dTTP، 100 میکرومولار dATP، و 100 میکرومولار dGTP) اضافه شد. مخلوط واکنش در دمای 37 درجه به مدت 12 دقیقه انکوبه شد و با افزودن 8 میکرولیتر رنگ بارگذاری (80 درصد فرمامید و 10 میلی مولار EDTA) واکنش متوقف شد. نمونه ها به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه حرارت داده شدند، روی یخ سرد شدند و روی ژل پلی آکریل آمید دناتوره کننده 14 درصد قرار گرفتند. ژل‌ها در 45 وات به مدت 2.5 ساعت اجرا شدند و باندها با استفاده از PhosphorImager (Typhoon RGB) مشاهده شدند.

مطالب تکمیلی آنلاین

شکل S1 مقادیر آزمایشگاهی عملکرد کبد و کلیه را در خواهر و برادر 1 و خواهر و برادر 2 نشان می دهد. شکل S2 داده های توالی ژنومی را نشان می دهد که جهش نادرست و حذف درون ژنی در ژن ERCC1 را تایید می کند. شکل S3 بیان پروتئین ERCC1 و XPF را در فیبروبلاست های بیمار نشان می دهد. شکل S4 پروتئین های ERCC1 و XPF نوترکیب خالص شده و Co-IP ERCC1WT و ERCC1R156W را نشان می دهد. شکل S5 تصاویر میکروسکوپی UDS، کانون های H2AX، و محل جهش های بیمار در ERCC{15}}XPF را نشان می دهد. جدول S1 شامل توالی تمام آغازگرها و پروب های مورد استفاده در این مطالعه است. جدول S2 تمام رده های سلولی آزمایش شده در این مطالعه را فهرست می کند. جدول S3 تمام پلاسمیدهای درگیر در این مطالعه را فهرست می کند. جدول S4 توالی های sgRNA مطالعه و جدول S5 آنتی بادی ها را نشان می دهد. جدول S6 تعداد سلول های مورد استفاده برای تعیین کمیت را در شکل ها نشان می دهد. Data S1 تمام فایل‌های وسترن بلات برش‌نخورده را نمایش می‌دهد.

قدردانی

نویسندگان از هر دو خواهر و برادر و والدین آنها برای مشارکت در این مقاله، سیلوی نوردرمیر (مرکز پزشکی دانشگاه لیدن [LUMC]، لیدن، هلند) برای ناقل بیان لنتی ویروسی pLenti-CW57-TO-GFP و توصیه در مورد ایجاد KI قدردانی می کنند. سلول ها، یواخیم گودهارت (دانشگاه آمستردام، آمستردام، هلند) برای mVenus cDNA، برت ون درکویج (LUMC، لیدن، هلند) برای مهارکننده DNA-PK، ویم ورمولن و آنیا رامز (اراسموس MC، روتردام، هلند) برای ارائه سلول‌های 165TOR، تومو اوگی (دانشگاه ناگویا، ژاپن) برای ارائه سلول‌های CS20LO، آلن لمن (دانشگاه ساسکس، انگلستان) برای ارائه سلول‌های CSL16NG و CSL16NG hTERT، و Joost Schimmel (LUMC، لیدن، هلند) برای مشاوره در مورد تولید سلول‌های KI .

این کار توسط یک کمک هزینه تحقیقاتی مرکز پزشکی دانشگاه لیدن و یک سازمان Nederlandse Voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI (ALW.016.161.320) به MSLuijsterburg، یک کمک هزینه شروع شورای تحقیقات اروپا (310913) به ACO Vertegaal, a KWF 11367) به R. Gonz´alez-Prieto، کمک مالی KWF Kan kerbestrijding (VU 2013-5983) به MA Rooimans، و کمک های مالی از موسسه کره ای علوم پایه (IBS-R022-A1) و ملی موسسه سرطان (P01CA092584) به ODSch arer.

مشارکت نویسنده: K. Apelt سلول های KO، سلول های KI و خطوط سلولی پایدار را تولید کرد. وسترن بلات و رنگ‌آمیزی‌های ایمنی برای بیان ERCC1 و XPF، انتقال لنتی ویروسی، بقای کلونوژنیک (UV، MMC، IR)، آزمایش‌های Co-IP برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات، آزمایش‌های UDS، آزمایش‌های Co-IP برای MS، و رنگ‌آمیزی H2AX انجام شد. و کاغذ را نوشت. A. Kragten پس از UV موضعی UDS، RRS و رنگ‌آمیزی‌های ایمنی را انجام داد. AP Wonder Gem سلول‌های KO و KI را تولید کرد و آزمایش‌های UDS، وسترن بلات و توالی‌یابی سانگر را برای تأیید جهش نادرست انجام داد. اس ام وایت برای بیماران مشاوره ارائه کرد، داده های اگزوم را تجزیه و تحلیل کرد، بیوپسی انجام داد، فیبروبلاست های اولیه تولید کرد و توضیحات بالینی بیمار را نوشت. S. Lunke و BT Wilson داده های NGS را تولید کردند. S. Pantaleo and D. Flanagan qPCR را برای اعتبارسنجی حذف انجام دادند. C.Quinlan شرح بالینی کلیه را نوشت. W. Hardikar شرح بالینی کبد را نوشت. MA Rooimans و R.MF Wolthuis فیبروبلاست‌های 48BR andPV50LD جاودانه‌شده با hTERT تولید کردند و سنجش شکست کروموزوم ناشی از MMC را انجام دادند. R. Gonzalez-Prieto و ACO Vertegaal تمام آزمایشات MS را تجزیه و تحلیل کردند. WW Wiegant و H. vanadium بقای کلونوژنیک را در سلول‌های U2OS (IR) انجام دادند. J.-E.Yeo و HS Kim پروتئین‌های نوترکیب را خالص‌سازی کردند و سنجش نوکلئاز و سنجش NER را در شرایط آزمایشگاهی انجام دادند. OD Sch¨arer تحت نظارت بر کار NER in vitro به تفسیر ساختاری آلل R156W کمک کرد و مقاله را ویرایش کرد. MS Luij sterburg بر پروژه نظارت کرد و مقاله را نوشت.

منابع

عبدالغفار، تی، ای اس السبکی، و اس ام السید. 1390. کلستاز در بیماران مبتلا به سندرم کوکاین و معیارهای اصلاح شده پیشنهادی برای تشخیص بالینی. OrphanetJ. دیس کمیاب 6:13. -1172-6-13

عبدالله، یو.بی.، جی اف مک گوران، اس. برولین، دی. پچلکین، اچ الساغیر، تی. براون، و پی جی مک هیو. 2017. RPA اندونوکلئاز XPF-ERCC1 را برای شروع پردازش پیوندهای عرضی بین رشته ای DNA فعال می کند. EMBO J. 36: 2047–2060.

Adair، GM، RL Rolig، D. Moore-Faver، M. Zabelshansky، JH Wilson، و RS Nairn. 2000. نقش ERCC1 در حذف دم های بلند غیر همولوگ در طول نوترکیبی همولوگ هدفمند. EMBO J. 19:5552-5561.

احمد، ا.، آر. رابینسون، آ. دوئنسینگ، ای. ون درونن، اچ بی بورلو، دی بی ویزبرگ، پی. هاستی، جی اچ هویج میکرز، و ال جی نیدرنهوفر. 2008. ERCC1-Endonuclease XPF ترمیم شکستگی دو رشته ای DNA را تسهیل می کند. مول. سلول. Biol. 28:5082-5092.

احمد، A.، JH Enzlin، NR Bhagwat، N. Wijgers، A. Raams، E. Appledoorn، AF Theil، JH J Hoeijmakers، W. Vermeulen، NG J Jaspers، و همکاران. 2010. مکان یابی نادرست نوکلئاز XPF-ERCC1 به کاهش ترمیم DNA در بیماران XP-F کمک می کند. PLoS Genet. 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. کم خونی فانکونی و تشخیص آن. موتات. Res. 668:4-10.

بن چهیده، ع.، ن. غالی، ر. بن عبدالعزیز، ف. بن موسی، و ن. طبیب. 2017. درگیری کلیه در 2 خواهر و برادر مبتلا به سندرم کوکاین. ایران. جی. کلیه دیس. 11:253-255.

Biggerstaff، M.، DE Szymkowski، و RD Wood. 1993. تصحیح همزمان نقایص ترمیم DNA ERCC1، ERCC4 و xeroderma pigmentosum گروه F در شرایط آزمایشگاهی. EMBO J. 12:3685-3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol ، و همکاران 2013. جهش در ERCC4، کد کننده اندونوکلئاز XPF ترمیم کننده DNA، باعث کم خونی فانکونی می شود. صبح. جی. هوم. ژنت 92:800-806.

Ceccaldi، R.، P. Sarangi، و AD D'Andrea. 2016. مسیر کم خونی فانکونی: بازیکنان جدید و عملکردهای جدید. نات. کشیش مول. سلول بیول. 17: 337-349.

de Laat، WL، E. Appeldoorn، NG Jaspers، و JH Hoeijmakers. 1998 a. عناصر ساختاری DNA مورد نیاز برای فعالیت اندونوکلئاز ERCC1-XPF. جی بیول. شیمی. 273:7835-7842.

de Laat، WL، AM Sijbers، H. Odijk، NG Jaspers، و JH Hoeijmakers. 1998b. نقشه برداری از حوزه های تعامل بین پروتئین های ترمیم انسانی ERCC1 و XPF. Nucleic Acids Res. 26:4146-4152.

nar/26.18.4146

de Vries، A.، CT van Oostrom، FM Hofhuis، PM Dortant، RJ Berg، FR de Gruijl، PW Wester، CF van Kreijl، PJ Capel، H. van Steeg، و SJ Verbeek. 1995. افزایش حساسیت به اشعه ماوراء بنفش-B و مواد سرطان زا در موش های فاقد ژن ترمیم برش DNA XPA. طبیعت. 377:169-173.

دیجیوانا، جی جی، و کی اچ کریمر. 2012. تابیدن نور بر روی پوسته پوسته پوسته پوسته. ج. سرمایه گذاری درماتول. 132:785-796.

Enzlin، JH، و OD Schrer. 2002. محل فعال اندونوکلئاز ترمیم DNA XPF-ERCC1 یک موتیف نوکلئاز بسیار حفاظت شده را تشکیل می دهد. EMBO J. 21:2045–2053.

فوناکی، اس.، اس. تاکاهاشی، اچ. موراکامی، کی. هارادا و اچ. کیتامورا. 2006. سندرم کوکین با نفریت توبولو اینترستیشیال حاد راجعه. پاتول. بین المللی 56:678-682.

.02029.x

Gillet، LC، J. Alzeer، و OD Schrer. 2005. ادغام مکان خاص N- (دئوکسی گوانوزین-8-یل)-2-استیلامینوفلوورن (dG-AAF) به الیگونوکلئوتیدها با استفاده از سنتز DNA اصلاح شده "فوق العاده خفیف". Nucleic Acids Res. 33:1961-1969.

Gregg، SQ، AR Robinson و LJ Niedernhofer. 2011. پیامدهای فیزیولوژیکی نقص در ERCC{1}}آندونوکلئاز ترمیم DNA XPF. ترمیم DNA (Amst.). 10:781-791.

گوو، سی.، ی. ناکازاوا، ال. وودبین، آ. بیورکمن، ام. شیمادا، اچ. فاوست، ان. جیا، ک. اوهایما، تی اس لی، ی. ناگایاما، و همکاران. 2015. کمبود XRCC4 در افراد انسانی باعث یک فنوتیپ عصبی مشخص اما عدم نقص ایمنی آشکار می شود. کلین آلرژی جی. ایمونول. 136:1007–1017.

Helfricht، A.، PE Thijssen، MB Rother، RG Shah، L. Du، S. Takada، M. Rogier، J. Moritz، H. IJspeert، C. Stoepker، و همکاران. 2020. از دست دادن ZBTB24 اتصال انتهایی غیرهمولوگ و نوترکیبی سوئیچ کلاس را در بیماران مبتلا به سندرم ICF مختل می کند. J. Exp. پزشکی 217:e20191688.

Houtsmuller، AB، S. Rademakers، AL Nigg، D. Hoogstraten، JH Hoeij-makers، و W. Vermeulen. 1999. عمل ترمیم DNA اندونوکلئاز ERCC1/XPF در سلول های زنده. علوم پایه. 284:958-961. ساعت

علم.284.5416.958

یاسپرس، NG، A. Raams، MC Silengo، N. Wijgers، LJ Niedernhofer، AR Robinson، G. Giglia-Mari، D. Hoogstraten، WJ Kleijer، JH Hoeij- makers، و W. Vermeulen. 2007. اولین بیمار گزارش شده با کمبود ERCC1 انسانی دارای سندرم مغزی-اکولوفاسیو-اسکلتی با نقص خفیف در ترمیم برداشتن نوکلئوتید و نارسایی شدید رشدی است. صبح. جی. هوم. ژنت 80:457-466.

Joenje، H.، AB Oostra، M. Wijker، FM di Summa، CG van Berkel، MA Rooimans، W. Ebell، M. van Weel، JC Pronk، M. Buchwald، و F. Arwert. 1997. شواهدی برای حداقل هشت ژن کم خونی فانکونی. صبح. جی. هوم. ژنت 61:940-944.

جونز، ام.، اف. بیرون، آ. بورگ، ا. نانس، سی پی ارل، دی سی بریگز، ای پی اسنایدرز، ام. بولز، ای پی موریس، ام. لینچ، و ان کیو مک دونالد. 2020. ساختارهای Cryo-EM اندونوکلئاز XPF-ERCC1 نشان می دهد که چگونه درگیری پیوند DNA یک ترکیب مهار شده خودکار را مختل می کند. نات. اشتراک. 11: 1120.

Karikkineth، AC، M. Scheibye-Knudsen، E. Fivenson، DL Croteau، و VA Bohr. 2017. سندرم کوکاین: ویژگی های بالینی، سیستم های مدل و مسیرها. Aging Res. مکاشفه 33:3–17.002

کاشیاما، ک.، ی. ناکازاوا، دی تی پیلز، سی. گوئو، ام. شیمادا، کی. ساساکی، اچ. فاوست، جی اف وینگ، سو لوین، ال. کار، و همکاران. 2013. عملکرد نادرست نوکلئاز ERCC1-XPF منجر به تظاهرات بالینی متنوعی می‌شود و باعث سندرم کوکاین، خشکی پیگمنتوزوم و کم‌خونی فانکونی می‌شود. صبح. جی. هوم. ژنت 92:807-819.