بخش 2: شناسایی نورون های دوپامینرژیک که هم می توانند حافظه انجمنی ایجاد کنند و هم بیان رفتاری آن را به شدت خاتمه دهند.

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

تجزیه و تحلیل دندروگرام دندروگرام‌های نورون طرح‌های دوبعدی بازسازی‌های سه بعدی نورون از Eichler و همکاران هستند. (2017). دندروگرام‌ها به‌عنوان نسخه‌های «خطی‌شده» و مسطح‌شده‌ی نورون‌های پیچیده مورفولوژیکی، تجسم‌های فشرده‌ای هستند که توزیع فضایی سیناپس‌ها را نشان می‌دهند. جزئیات الگوریتم ترسیم دندروگرام توسط Strauch و همکاران شرح داده شد. (2018). به طور خلاصه، دندروگرام‌ها از نظر توپولوژیکی، طرح‌های نورون صحیحی هستند که یک شاخه اصلی غالب به صورت خط مستقیم کشیده شده است، و شاخه‌های جانبی کوتاه‌تر که در زوایای کلیشه‌ای منحرف شده‌اند و برای جلوگیری از همپوشانی به بالا و پایین اشاره می‌کنند. آنها طوری ترسیم می شوند که فاصله طول کابل و موقعیت سیناپس تقریباً صحیح باشد. تغییرات جزئی برای بهبود خوانایی شامل بازآرایی خودکار نمادهای سیناپس برای رفع بهم ریختگی و همپوشانی است (Strauch et al., 2018).

برای تجزیه و تحلیل سازمان سیناپسی، ما یک ماتریس فاصله (سیناپسی) حاوی فواصل ژئودزیکی (یعنی فاصله به عنوان "طول کابل" در امتداد نورون) بین مکان‌های همه سیناپس‌ها روی نورون محاسبه کردیم. فواصل ژئودزیکی به عنوان فواصل اقلیدسی در مختصات سه بعدی نورون بازسازی شده با پیمایش در امتداد شاخه های نورون محاسبه شد. ما مکان های سیناپس را با خوشه بندی تجزیه و تحلیل تقسیمی (DIANA) (Kaufman, 2005) که بر روی ماتریس فاصله ژئودزیکی کار می کنند، خوشه بندی کردیم. بر اساس تجزیه و تحلیل امتیاز silhouette، ما تعداد خوشه‌ها در هر نورون را 10 تنظیم کردیم. خوشه‌هایی که شامل هر چهار کلاس سیناپس مورد علاقه نیستند (KC!DAN-i1، DAN-i1!KC، DAN-i1!MBON-i1 باقی مانده، DAN-i1!MBON-i1 سمت راست) از تجزیه و تحلیل حذف شدند. برای هر خوشه، یک نقطه مرکزی به‌عنوان مرکزی‌ترین سیناپس خوشه تعریف شد که با تقسیم‌بندی در اطراف خوشه‌بندی medoids (PAM با k=1 خوشه) (Kaufman، 2005) بر اساس فواصل سیناپس ژئودزیکی در داخل خوشه تعیین شد. در نهایت، ما فواصل ژئودزیکی بین تمام سیناپس ها و نقطه مرکزی خوشه را تعیین کردیم.

سیستانچ می تواند حافظه را بهبود بخشد

طراحی تجربی و تجزیه و تحلیل آماری. از آزمون‌های ناپارامتریک دو طرفه استفاده شد و مفروضات آماری برای این آزمون‌ها در سرتاسر برآورده شد. هنگامی که مقایسه‌های چندگانه در یک تحلیل انجام شد، یک تصحیح بونفرونی-هولم برای حفظ میزان خطای آزمایش در سطح 5 درصد اعمال شد (هولم، 1979). تمامی آزمون‌های آماری انجام‌شده و نتایج آن‌ها در شکل داده‌های توسعه‌یافته 1-1 همراه با داده‌های منبع گزارش شده‌اند.

برای همه آزمایش‌های رفتاری، مقادیر در گروه‌های مختلف با آزمون‌های کروسکال-والیس مقایسه شد. در صورت معنادار بودن، مقایسه‌های زوجی بعدی از آزمون‌های U Mann-Whitney استفاده کردند. برای آزمایش اینکه آیا مقادیر یک گروه معین با صفر متفاوت است یا خیر، از آزمون های علامت تک نمونه ای استفاده شد.

آزمایش‌های شکل‌های 1، 6C-F، و 8 از یک طرح دو گروهی پیروی کردند و دو شرایط آزمایش را برای ژنوتیپ آزمایشی مقایسه کردند. هر دو گروه با آزمون Mann-Whitney U مقایسه شدند و معنی‌داری آنها از صفر با آزمون علامت تک نمونه‌ای مورد آزمایش قرار گرفت.

آزمایش‌ها در شکل‌های 6A، B از یک طرح شش گروهی، با سه ژنوتیپ (ژنوتیپ آزمایشی بیان‌کننده ChR{2}}XXL، محرک و یک کنترل مؤثر) و دو شرایط آزمایش پیروی کردند. ابتدا آزمون کروسکال-والیس در تمامی گروه ها انجام شد. در صورت معنادار بودن، ما آزمون‌های U Mann-Whitney را بین ژنوتیپ آزمایشی و هر یک از کنترل‌های ژنتیکی شرایط آزمایشی یکسان و همچنین بین شرایط آزمایش برای ژنوتیپ آزمایشی انجام دادیم (در مجموع پنج آزمایش U Mann-Whitney) . هر گروه از نظر معنی داری از صفر با آزمون علامت یک نمونه مورد آزمایش قرار گرفتند.

آزمایشات در شکل 7 از یک طرح سه گروهی با حیواناتی از ژنوتیپ آزمایشی که ChR2-XXL را بیان می‌کنند، پیروی کردند. پس از آزمایش اولیه کروسکال-والیس در همه گروه‌ها، آزمون‌های من-ویتنی U را برای گروه بدون قرار گرفتن در معرض نور آبی پس از تمرین و هر دو گروه دیگر انجام دادیم. معنی داری از صفر برای هر گروه مورد آزمایش قرار گرفت (آزمون های علامت یک نمونه).

آزمایش‌های شکل‌های 9 و 10 از یک طرح چهار گروهی با حیواناتی از ژنوتیپ آزمایشی که ChR{3}}XXL را بیان می‌کنند، دنبال کردند. پس از یک آزمون اولیه کروسکال-والیس در همه گروه‌ها، آزمون‌های من-ویتنی U را دو به دو بین گروه‌هایی که آموزش‌های زوجی و غیرجفتی را در همان شرایط آزمون دریافت کرده بودند، و بین شرایط آزمون برای یک نوع تمرین معین (در مجموع چهار من-ویتنی) انجام دادیم. تست های U). هیچ آزمایش علامت تک نمونه ای انجام نشد.

ما داده های رفتاری را به صورت نمودارهای جعبه با میانه به عنوان خط میانی و 25 درصد / 75 درصد و 10 درصد / 90 درصد به عنوان مرزهای جعبه و سبیل ارائه می کنیم. موارد پرت نمایش داده نمی شود. آزمایش‌کنندگان نسبت به ژنوتیپ و عدم وجود یا وجود پاداش قند در طول آزمون یادآوری، در صورت وجود، نابینا بودند. اندازه‌های نمونه (تکرارهای بیولوژیکی) بر اساس مطالعات قبلی که اندازه‌های اثر متوسط ​​تا خفیف را آشکار می‌کردند (Paisios et al., 2017; Saumweber et al., 2018) انتخاب شدند و در افسانه‌های شکل نمایش داده می‌شوند. حجم نمونه n =1 شامل 20 حیوان از هر دو جنس برای همه آزمایش‌های ترجیحی ذاتی، و 2 20 حیوان (20 برای هر گروه آموزش‌دیده متقابل) از هر دو جنس برای همه آزمایش‌های یادگیری بود.

برای مقایسه اعداد سیناپس بین دو طرف همان طرف و طرف مقابل نورون‌های MBON-i1 (نگاه کنید به شکل 3A)، توزیع آنها را با استفاده از تست‌های x2، به طور جداگانه برای سیناپس‌های KC!MBON-i1 و سیناپس‌های DAN-i1!MBON-i1 آزمایش کردیم. برای مقایسه فواصل سیناپس‌ها با مرکز ساختار مرکزی مربوطه آنها در نورون DAN-i1 (نگاه کنید به شکل 4C، D)، ما آزمایش‌های Kruskal-Wallis را در تمام انواع سیناپس و همچنین به‌صورت جفتی Mann-Whitney U انجام دادیم. تست بین تمام انواع سیناپس (در مجموع 6 آزمون U-آزمون Mann-Whitney)، به طور جداگانه برای نورون DAN-i1 چپ و راست.

نتایج

آرایش فضایی سیناپس ها در یک ماتریس DAN-KC-MBON

بازسازی میکروسکوپ الکترونی اخیر مدار کامل بدن قارچ لارو، اتصالی از DAN ها، KCs و MBON ها را بر اساس تعداد سیناپس های شیمیایی بین آنها ارائه کرده است (Eichler et al., 2017). شاخه های آکسونی از

شکل 3. سازماندهی ورودی های سیناپسی به نورون MBON-i1. تعداد سیناپس های KC!MBON-i1 و DAN-i1!MBON-i1 به هر نورون MBON-i1 که توسط نیمکره از هم جدا شده اند. هر دو نورون MBON-i1 سیناپس های بیشتری با آن KCها دارند و DAN-i1 در نیمکره مقابل بدن سلولی آنها قرار دارد. *آزمون‌های x2 قابل توجه (p، 0.05، تصحیح شده بر اساس Bonferroni-Holm). داده ها از Eichler و همکاران است. (2017). B، نمای کلی نیمه شماتیکی از توزیع سیناپس ها از نیمکره همان طرف و طرف مقابل به MBON-i1. KCs و هر دو نورون DAN-i1 سیناپس های بیشتری را با قسمت مقابل MBON-i1 تشکیل می دهند تا با قسمت همان طرف. C، توزیع تعداد KCهای بالغ که تعداد مشخص شده سیناپس ها را با نورون MBON-i1 چپ یا راست تشکیل می دهند. KCها از نیمکره چپ سیناپس های کمتری با نورون MBON-i1 راست (سمت چپ) تشکیل می دهند. برعکس، KCهای نیمکره راست، سیناپس های بیشتری را با سمت چپ نسبت به MBON-i1 راست (راست) تشکیل می دهند. با توجه به اینکه KC ها از خط وسط عبور نمی کنند، تمام سیناپس هایی که، به عنوان مثال، MBON-i1 راست با KCs از نیمکره چپ تشکیل شده اند، در بخشی از MBON-i1 در مقابل بدنه سلولی آن قرار دارند. D، علیرغم این واقعیت که نورون های MBON-i1 ورودی کمتری را از KCهای نیمکره همان طرف به بدنه سلولی خود نسبت به نیمکره طرف مقابل دریافت می کنند، هر دو نورون MBON-i1 اطلاعاتی در مورد فضای کامل ورودی های KC در هر یک از نیمکره ها دریافت می کنند. برای تعیین رابطه بین MBON-i1 و ورودی حسی پیش بینی شده بر روی KCها، ورودی کل MBON-i1 از KCها دریافت می کند که به نوبه خود ورودی خود را از نورون های برآمدگی بویایی تک گلومرولی (PNs) (سفید و خاکستری تیره)، بویایی چند گلومرولی دریافت می کنند. PNs (خاکستری روشن)، و PN های غیر بویایی (سیاه) برای محاسبه محصول ماتریس سیناپس های مربوطه PN!KC و KC!MBON-i1 در نظر گرفته شدند. این به طور جداگانه برای MBON-i1 سمت چپ و اتصالات آن به سمت راست (یعنی طرف مقابل) KC (بالا سمت چپ)، و اتصالات به سمت چپ (یعنی همان طرف) KC (بالا سمت راست) و بر این اساس برای MBON-i1 سمت راست انجام شد. پایین). داده ها بر اساس Eichler و همکاران است. (2017). همه آزمون‌های آماری و نتایج آنها به همراه داده‌های منبع در شکل داده‌های توسعه‌یافته 1-1 گزارش شده‌اند.

تک تک DAN ها و شاخه های دندریتیک تک تک MBON ها هر کدام به همراه بسته های آکسون KC در محفظه های خاص محدود شده و روی هم قرار دارند (لارو: Pauls et al., 2010;

Eichler et al., 2017; ساوم وبر و همکاران، 2018; اشباخ و همکاران، 2020؛ بزرگسالان: Aso et al., 2014a; تاکمورا و همکاران، 2017). DAN-i1 محفظه i لوب داخلی بدن قارچ را عصب می‌کند (که گاهی به آن انگشت بالایی لوب داخلی می‌گویند). بازسازی نشان داد که نه تنها به KCها سیگنال می دهد، بلکه در واقع دو هدف اصلی دارد: KCs و MBON-i1 (شکل 2A, B) (Eichler et al., 2017). به همین ترتیب، MBON-i1 دارای دو شریک اصلی بالادستی است: KCs و DAN-i1. سازمان‌دهی مشابهی از DAN و MBON در قسمت‌های بدن قارچ یافت می‌شود (لارو: Eichler و همکاران، 2017؛ بزرگسالان: Takemura و همکاران، 2017). به طور خاص، برای DAN-i1، 75 درصد و 21 درصد از سیناپس های خروجی آن در بدن قارچ به ترتیب به KCs و MBON-i1 متصل می شوند و MBON-i1 دریافت می کند؛ 74 درصد و 14 درصد از سیناپس های ورودی آن در بدن قارچ از KCs و DAN-i1 به ترتیب (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). اگرچه چنین تحلیل هایی از بسیاری جهات آموزنده هستند، اما آرایش فضایی سیناپس ها در امتداد نورون ها را در نظر نمی گیرند. برای روشن کردن این آرایش در محفظه i، از دندروگرام هایی استفاده می کنیم که به ما امکان می دهد گشتالت پیچیده و سه بعدی یک نورون را به عنوان یک طرح دوبعدی نمایش دهیم که ساختار انشعاب آن را نشان می دهد، طول شاخه ها را حفظ می کند و مکان سیناپس را در امتداد شاخه ها شناسایی می کند. Strauch و همکاران، 2018). چنین تحلیل‌های دقیقی از وضوحی که در حال حاضر می‌توان نورون‌ها را در حیواناتی که آزادانه رفتار می‌کنند دستکاری کرد، فراتر رفت (Aso and Rubin، 2020). با این حال، آن‌ها نگاهی اجمالی به پیچیدگی واقعی نورون‌های مورد مطالعه و مفاهیم محاسباتی موتیف‌های مداری که آنها بخشی از آن هستند را ارائه می‌دهند (همچنین به Bilz et al., 2020 مراجعه کنید). از تجزیه و تحلیل‌های خود، نکات زیر را برجسته می‌کنیم (تصاویر با وضوح بالا از نورون‌های DAN-i1 و MBON-i1 از هر دو نیمکره و همچنین از همه KCsare بالغ موجود در Extended Data Fig. 2-1، 2-2 و 2-3، به ترتیب):

• هر دو DAN-i1 و MBON-i1 دارای اتصالات بین نیمکره ای عظیم هستند. این قابل توجه است با توجه به اینکه چقدر تداخل بین نیمکره ای در مسیرهای صعودی مشاهده می شود، از جمله KCs (شکل 2A) (برک و همکاران، 2016؛ ایچلر و همکاران، 2017؛ ساوم وبر و همکاران، 2018؛ توم و گربر، 2019). ). به طور خاص، هر دو نورون DAN-i1 به طور متقابل با اکثر KCهای بالغ در هر دو نیمکره مرتبط هستند. علاوه بر این، نورون‌های DAN-i1 خروجی را برای هر دو نورون MBON-i1، هم به‌صورت هم‌طرف و هم در مقابل ارائه می‌کنند (شکل 2E؛ برای تصاویر با وضوح بالا از هر دو نورون DAN-i1، به داده‌های توسعه‌یافته شکل 2-1 مراجعه کنید). این نشان می‌دهد که هر نورون MBON-i1، به نوبه خود، ورودی از هر دو نورون DAN-i1، هم به صورت همان طرف و هم در مقابل دریافت می‌کند. }}). به همین ترتیب، نورون‌های MBON-i1 ورودی اکثر KCهای بالغ را در هر دو نیمکره دریافت می‌کنند (Eichler et al., 2017)، و خروجی را در خارج از بدن قارچ، همچنین در هر دو نیمکره، ارائه می‌کنند. دندروگرام ها به طور خاص نشان می دهند که خروجی های DAN-i1 به نورون MBON-i1 نیمکره همان طرف و طرف مقابل، و همچنین ورودی های MBON-i1 از نورون DAN-i1 نیمکره همان طرف و طرف مقابل در هم آمیخته می شوند (شکل . 2E,F). قابل توجه است که MBON-i1 از نظر تعداد سیناپس هایی که در بدن قارچ دریافت می کند به صورت نیمکره متقارن نیست: هر دو نورون MBON-i1 سیناپس های بیشتری را در نیمکره مقابل بدن سلولی خود دریافت می کنند (شکل 2F, 3A, B). با این وجود، هر دو نورون MBON-i1 اطلاعات فضای ورودی حسی کامل در هر دو نیمکره را دریافت می کنند (شکل 3C,D).

سیستانچ فارما ویژه

• الگوهای انشعاب هر دو DAN-i1 و MBON-i1 در چند منطقه اصلی ساختار یافته اند. برای DAN-i1، سه منطقه اصلی را می توان شناسایی کرد. با شروع از بدن سلولی، در ناحیه اول، DAN-i1 ورودی را از شرکای خود از خارج از بدن قارچ دریافت می کند (در شکل 2C-E با 1 مشخص شده است) (Eschbach et al., 2020)، در حالی که ناحیه دوم و سوم به ترتیب با i-compartment بدنه قارچ همان طرف و طرف مقابل (در شکل 2C-F با 2 و 3 مشخص شده است) منطبق است. در بدنه قارچ، DAN-i1 به طور متقابل به KCها متصل است و خروجی را به سمت MBON-i1 ارائه می دهد. نوریت اولیه MBON-i1 از خط وسط عبور می کند و سپس نورون قسمت i بدن قارچ را در مقابل بدنه سلولی آن عصب می کند (منطقه ای که با 3 در شکل 2C-F مشخص شده است). در اینجا، عمدتا ورودی از KC و DAN-i1 دریافت می کند. سپس، MBON-i1 از خط وسط عبور می کند و به همین ترتیب بدن قارچ را همان طرف به بدنه سلولی خود عصب می دهد (منطقه ای که با 2 در شکل 2C-F مشخص شده است). علاوه بر این، MBON-i1 دارای چندین شاخه کوچک در هر دو نیمکره است که به شرکای نزدیک، اما بلافاصله خارج از بدن قارچ متصل می شود.

• در این مناطق، تقسیم‌بندی‌های محفظه مانندی که در نورون‌های DAN-i1 و MBON-i1 هر دو نیمکره قابل تشخیص هستند، قابل شناسایی نیستند (شکل 2E,F؛ شکل‌های داده‌های گسترده. 2-1، {{7). }}). با این حال، برای نورون‌های DAN-i1، ساختارهای مركز احاطه‌ای غنی از سیناپس از جهت جانبی «ویدیوسنكراتیك» مشهود است (شكل 4). در مرکز آنها، تمام انواع فوق الذکر از سیناپس ماتریس DAN-KC-MBON یافت می شود، در حالی که ویژگی های فراگیر آنها تقریباً منحصراً سیناپس های KC!DAN هستند (شکل 4). قابل‌توجه، هر KC معینی معمولاً تمام سیناپس‌های خود را تنها در یک یا دو مورد از آن ساختارهای مركز احاطه‌ای ایجاد می‌كند (Extended Data Fig. 1-1).

• در مورد KCهای بالغ، 86 درصد و 88 درصد از آنها به ترتیب با نورون DAN-i1 چپ و راست، و 78 درصد و 74 درصد با نورون MBON-i1 چپ و راست، سیناپس ایجاد می‌کنند. KCهای منفرد دارای میانه 4 سیناپس KC!DAN-i1، 4 DAN-i1!KC، و 5 KC!MBON-i1 هستند (Eichler و همکاران، 2017؛ برای جزئیات بیشتر در مورد DAN-i1، Saumweber و همکاران، 2018 را ببینید. ). با توجه به دندروگرام همه KCهای منفرد، KC!DAN-i1، DAN-i1!KC، و KC! به نظر می‌رسد که سیناپس‌های MBON-i1 بدون تقسیم‌بندی آشکار در سراسر آرایه‌های KC در هم آمیخته شده‌اند، همانطور که سیناپس‌ها با theleftandtherightDAN-i1neuron، و چپ و راست MBON-i1neuron (ExtendedDataFig.{31}}).

این تجزیه و تحلیل ها با هم، سازماندهی فضایی دقیق ماتریس DAN-KC-MBON از i-compartment را نشان می دهد. نکته قابل توجه این است که سیناپس‌های DAN-i1 با دو هدف اصلی آن، KCs و MBON-i1، به‌جای جدا شدن بین آن‌ها، به صورت محلی در ساختارهای متعدد غنی از سیناپس در امتداد شاخه‌های آکسونی DAN-i1 در هم می‌آمیزند. شکل 2E, 4; Extended Data Fig. 2-1). چنین معماری ممکن است به این معنا باشد که DAN-i1 سیگنال‌های مرتبط، به جای مدوله‌شده مستقل، را به KCs و MBON-i1 در این ساختارهای غنی از سیناپس ارائه می‌دهد.

فعال سازی همان نورون ها می تواند ایجاد شودحافظهو فراخوانی آن را خاتمه دهید

ما شیفته این واقعیت شدیم که DAN-i1 دو هدف اصلی دارد، یعنی KCs و MBON-i1. که سیناپس های آن با این دو هدف بسیار نزدیک است. و اینکه پاداش های طبیعی دو کارکرد دارند، یعنی ایجاد کردنحافظهدر آموزش و خاتمه حاد بیان رفتاری اینحافظهدر طول آزمون یادآوری (شکل 1A) (گربر و

شکل 4. سازماندهی سیناپس ها روی نورون DAN-i1. تجزیه و تحلیل خوشه ای نشان داد که سیناپس ها از و به سمت نورون DAN-i1 سمت چپ در مناطق 2 و 3 (نگاه کنید به شکل 2) در شش خوشه (با برچسب 29299 و غیره) مرتب شده اند. به نظر می‌رسد که این خوشه‌ها سازماندهی مرکز-محاطره‌ای دارند: به سمت مرکز آنها، سیناپس‌های DAN!KC، KC!DAN و DAN!MBON یافت می‌شوند، در حالی که ویژگی‌های فراگیر آنها تقریباً منحصراً سیناپس‌های KC!DAN هستند. B، مانند A، اما برای نورون DAN-i1 مناسب. هفت ساختار مرکز-محاططی را می توان شناسایی کرد. ج، برای تعیین کمیت این سازماندهی سیناپس‌ها، فاصله انواع مختلف سیناپس‌ها را تا مرکز خوشه مربوطه (بر حسب طول کابل در امتداد نورون) تعیین کردیم و دریافتیم که سیناپس‌های KC!DAN از همه انواع دیگر دورتر از مرکز هستند. از سیناپس ها این امر سازماندهی خوشه ها را به عنوان ساختارهای مرکز - پیرامونی تأیید می کند. D، مانند C، اما برای نورون DAN-i1 مناسب. E، طرح شماتیک ساختار مرکز-محاط (بالا) و بزرگنمایی اتصالات در مرکز (پایین). حروف مختلف بالای نمودارهای کادر نشان‌دهنده اهمیت دوتایی است (آزمون Mann-Whitney U, p, 0.05, تصحیح شده طبق Bonferroni-Holm). همه آزمون‌های آماری و نتایج آنها به همراه داده‌های منبع در شکل داده‌های توسعه‌یافته 1-1 گزارش شده‌اند.

سیستانچ فارما ویژه

هندل، 2006; Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a,b, 2018; پایسیوس و همکاران، 2017). بنابراین، ما تعجب کردیم که آیا فعال سازی اپتوژنتیک DAN ها در تمرین و در طول آزمایش می تواند این دو عملکرد را به همراه داشته باشد. ما کار خود را با استفاده از کرنش درایور 58E02- Gal4 شروع کردیم که DAN-i1 را پوشش می‌دهد به‌علاوه دو DAN که بخش‌های دیگر لوب داخلی را عصب می‌کنند (شکل 5A, B) (Rohwedder et al., 2016) و UAS-ChR{ {14}}XXL به عنوان سویه مؤثر (Dawydow et al., 2014). 58E{17}}DAN ها به صورت جفت یا بدون جفت با بو در تمرین فعال شدند، و تفاوت در ترجیح بو در آزمون یادآوری بعدی برای تعیین کمیت ارتباطی استفاده شد.حافظهاز طریق PI ما نمرات PI مثبت را مشاهده کردیم که نشان دهنده اشتها آور انجمنی استحافظهدر ژنوتیپ تجربی، در حالی که کنترل های ژنتیکی هتروزیگوت فقط برای عامل تراریخته یا سازه محرک نشان ندادند.حافظه(شکل 6A، بالا، نمودار جعبه سیاه پر شده) (Rohwedder et al., 2016). بنابراین، 58E{4}}فعال‌سازی DAN در طول آموزش می‌تواند یک سیگنال پاداش برای انجمن ارائه دهد.حافظهتشکیل.

سپس، آزمایش را تکرار کردیم، اما 58E02-DAN را نیز در طول آزمون فراخوان فعال کردیم. با انجام این کار مقادیر PI کاهش می یابد (یعنی کاهش می یابدحافظهجستجوی مبتنی بر) تا تقریباً نصف (شکل 6A، نمودارهای کادر بالا و آبی پر شده؛ برای تکرار این نتیجه، شکل 6C را ببینید). به طور بحرانی، درست همانطور که در مورد پاداش های طبیعی (شکل 1B) (Schleyer et al., 2011, 2015a,b)، 58E{8}}فعال سازی DAN بر رفتار بویایی ذاتی تأثیر نمی گذارد (شکل 6A، پایین). بنابراین، فعال‌سازی 58E{11}} DAN همچنین می‌تواند سیگنال خاتمه جستجوی حاد را در طول آزمایش فراخوان ارائه دهد.

آزمایش‌های قبلی نشان می‌دهد که سه DAN 58E02- می‌توانند همان دو سیگنال را به عنوان یک پاداش طبیعی به ارمغان بیاورند (یعنی

شکل 5. الگوی بیان تراریخته سویه های محرک 58E02-DAN و 864-DAN. A، B، تجزیه و تحلیل قبلی مبتنی بر بازگردانی از سویه محرک 58E02-DAN نورون‌های DAN-h1، DAN-i1، و DAN-j1 (همچنین pPAM1، pPAM3 و pPAM4 نامیده می‌شوند) را شناسایی کرد. همچنین یک نورون اضافی در خارج از بدن قارچ (Rohwedder et al., 2016). این الگو تأیید شد: فشار راننده به یکی از (A{18}}A5) pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP یا (B{24}}B4) UAS-ChR{{ 27}}XXL. A1، B1، سیگنال آنتی بادی a-GFP یا a-ChR، به ترتیب. A2، B2، سیگنال رنگ آمیزی پس زمینه از طریق آنتی بادی a-FASII یا a-HRP به ترتیب. A3، B3، ادغام سیگنال های مربوطه. A4، B4، یک برآمدگی جزئی z عصب قوی در لوب داخلی بدن قارچ را نشان می دهد. A5، هیچ عصب دهی آپاندیس جانبی تشخیص داده نمی شود (فلش). C، D، 864-سویه راننده DAN به شدت در DAN-i1 بیان شده است (Saumweber et al., 2018). در اینجا، آن را به یکی از (C{45}}C5) pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP یا (D{51}}D4) UAS-ChR2-XXL منتقل کردیم. C1، D1، سیگنال آنتی بادی a-GFP یا a-ChR، به ترتیب. C2، D2، سیگنال رنگ آمیزی پس زمینه از طریق آنتی بادی a-FASII یا a-HRP به ترتیب. C3، D3، ادغام سیگنال های مربوطه. C4، D4، یک طرح ریزی جزئی z عصب دهی قوی محفظه i در هر دو نیمکره (فلش) را نشان می دهد که بیان در DAN-i1 را تأیید می کند. C5، همانطور که قبلاً گزارش شد (Saumweber et al., 2018)، فشار محرک گهگاه در نورون های اضافی بیان می شود، اما اگر چنین است، معمولاً فقط در یک نیمکره مغز و در نورون هایی که از نظر هویت بین آماده سازی ها متفاوت هستند. نسبتاً اغلب، ما نورون MBON-d1 را مشاهده کردیم که آپاندیس جانبی را در یک نیمکره عصب دهی می کند (فلش). در میان حیوانات متعددی که برای سنجش مبتنی بر گروه ما استفاده می‌شوند، چنین بیان تصادفی اضافی بعید است که اثرات سیستماتیک ایجاد کند.

سیگنال پاداش در طول آموزش و سیگنال پایان جستجو در طول آزمون فراخوان). با این حال، مشخص نیست که آیا هر یک از سه DAN هر دو سیگنال را ارائه می دهند یا اینکه تقسیم کار وجود دارد، با DAN های مختلف مسئول سیگنال پاداش و سیگنال پایان جستجو هستند. بنابراین، ما سویه درایور split-Gal4 864 را انتخاب کردیم که از بیان ترانس ژن قوی و قابل اعتماد تنها در یکی از DAN های تحت پوشش 58E{4}}DAN، نورون DAN-i1، در هر دو نیمکره پشتیبانی می کند. شکل 5C، D) (Saumweber et al., 2018). فعال‌سازی انجمنی 864-DAN در آموزش، شاخص‌های عملکرد مثبت را ایجاد کرد (به عنوان مثال،حافظهجستجوی مبتنی بر شکل 6B، نمودارهای جعبه سیاه پر شده بالا) (Saumweber et al., 2018). فعال کردن 864-DAN همچنین در طول آزمون فراخوانی این کار را خاتمه دادحافظهجستجوی مبتنی بر (شکل 6B، بالا، نمودار جعبه پر شده با آبی). سه مجموعه داده مستقل مشاهده جستجوی تنظیم شده را تایید می کنند (شکل 6D-F). رفتار بویایی ذاتی تحت تأثیر864-فعال‌سازی DAN (شکل 6B، پایین) قرار نگرفت.

قبلاً مشخص شده بود که فعالیت DAN بین تمرین و آزمون یادآوری (یعنی در طول دوره ماندگاری) باعث فراموشی در بزرگسالان D. melanogaster می شود (Berry et al., 2012, 2015; Shuai et al., 2015; Aso. و روبین، 2016). بنابراین، ما متعجب بودیم که آیا در پارادایم خود، 864-فعالیت DAN فراموشی را ترویج می‌کند، در مقایسه با پایان دادن به جستجوی مبتنی بر حافظه و خروج از آن.حافظهسالم. برای آزمایش این احتمال، لاروها مانند قبل، اما قبل از فراخوان آموزش داده شدند

شکل 6. فعال سازی همان نورون ها می تواند ایجاد شودحافظهو فراخوانی آن را خاتمه دهید. بالا، لاروها با بو آموزش داده شدند که به صورت جفت یا بدون جفت با فعال سازی 58E{1}}DAN توسط نور آبی ارائه شد. در آزمون یادآوری، مقادیر مثبت PI در ژنوتیپ آزمایشی، اما نه در کنترل‌های ژنتیکی، نشان‌دهنده رفتار جستجوی آموخته‌شده بر اساس حافظه انجمنی برای بو (سمت چپ نمودار جعبه) است. بنابراین، در طول آموزش، فعال سازی 58E{3}}DAN می تواند سیگنال پاداش را واسطه کند. راحافظهجستجوی مبتنی بر ژنوتیپ آزمایشی هنگامی که 58E{2}}DAN توسط نور آبی در طول آزمایش فراخوان نیز فعال شد، تنظیم شد (سمت چپ ترین نمودار جعبه پر شده با آبی). بنابراین، فعال‌سازی 58E02 می‌تواند سیگنال پایان جستجو را نیز ارائه دهد. اندازه های نمونه: 16، 15، 17، 18، 15، 18. پایین، لارو برای ترجیح بو ذاتی، چه در غیاب یا در حضور نور آبی مورد آزمایش قرار گرفتند. همه ژنوتیپ‌ها بو را در هر دو شرایط به شدت ترجیح می‌دهند، که نشان می‌دهد فعال‌سازی 58E{13}}DAN هیچ تأثیری بر ترجیح بو ذاتی نداشت. حجم نمونه: هر کدام 24 عدد B، مانند A، اما با 864-فعال‌سازی DAN توسط نور آبی. بالا، یک PI مثبت، و بنابراینحافظهجستجوی مبتنی بر، تنها در ژنوتیپ تجربی و تنها زمانی که آزمون یادآوری در تاریکی انجام شد، مشاهده شد. اندازه‌های نمونه: 19، 19، 19، 19، 19، 20. پایین، 864-فعال‌سازی DAN هیچ تأثیری بر ترجیح بو ذاتی نداشت. حجم نمونه: هر کدام 16 عدد ج، در تکرار آزمایش نشان داده شده در A (بالا) برای ژنوتیپ آزمایشی، لاروها نشان دادندحافظهجستجوی مبتنی بر تاریکی هنگامی که 58E02-DAN با نور آبی در طول آزمایش فراخوان فعال شد، این جستجو کاهش یافت. اندازه نمونه: 15، 16. D، در تکرار آزمایش نشان داده شده در B (بالا) برای ژنوتیپ آزمایشی، لاروها به نمایش گذاشته شدند.حافظهجستجوی مبتنی بر تاریکی هنگامی که 864-DAN در طول آزمون فراخوان فعال شد، این جستجو پایان یافت. اندازه نمونه: 28، 28. E، در تکرار بعدی D، آزمایش بر روی ظرف پتری با قطر داخلی 9 سانتی متر به جای 15 سانتی متر انجام شد.حافظهجستجوی مبتنی بر آزمایش در طول آزمون یادآوری در تاریکی مشاهده شد و در این مورد، تا حدی از طریق 864-فعال‌سازی DAN تنظیم شد. اندازه نمونه: 22، 22. F، لاروها در یک نسخه متفاوت و دو بو از آزمایش، با استفاده از n-آمیل استات رقیق شده 1:50 و 1-اکتانول رقیق نشده آموزش دیدند. آزمون یادآوری بر روی ظرف پتری با قطر داخلی 9 سانتی متر انجام شد. راحافظهجستجوی مبتنی بر - در تاریکی مشاهده شد و از طریق 864-فعال‌سازی DAN تنظیم شد. اندازه‌های نمونه: 26، 26. حروف مختلف بالای نمودارهای کادر نشان‌دهنده اهمیت دوتایی است (آزمون Mann-Whitney U، p,0.05، اصلاح شده طبق Bonferroni-Holm). *اهمیت از صفر (تست علامت یک نمونه، p، 0.05، تصحیح شده بر اساس Bonferroni-Holm). ns: عدم معنی‌داری در تمام شرایط تجربی (آزمون کروسکال-والیس، ص 0.05). همه آزمون‌های آماری و نتایج آنها به همراه داده‌های منبع در شکل داده‌های توسعه‌یافته 1-1 گزارش شده‌اند.

شکل 7. فعال سازی 864-DAN بین تمرین و آزمون یادآوری، فراموشی یا خاموشی را افزایش نمی دهد. گروهی از لاروها مانند شکل 6 آموزش داده شدند. سپس لاروها به مدت 3 دقیقه در تاریکی یا نور آبی نگهداری شدند (صبر کنید) و سپس مورد آزمایش قرار گرفتند. هنگامی که آن آزمون یادآوری در تاریکی انجام شد، الفحافظهجستجوی مبتنی بر - مستقل از شرایط نور، و بنابراین مستقل از 864-فعالیت DAN، در طول فاز انتظار (نقشه کادر چپ و میانی) مشاهده شد. ما تأیید کردیم که همچنین پس از یک دوره انتظار 864- فعال سازی DAN در طول آزمون فراخوان پایان می یابدحافظهجستجوی مبتنی بر (نقشه کادر سمت راست). اندازه نمونه: 25، 24، 19. B، مانند A، اما این بار با بوی موجود در طول دوره انتظار. حجم نمونه: هر کدام 28 عدد حروف مختلف بالای نمودارهای کادر نشان‌دهنده اهمیت جفتی است (آزمون Man-Whitney U، p، 0.{10}}5، اصلاح شده طبق Bonferroni-Holm). *معنی داری از صفر (تست علامت یک نمونه، p، 0.05، تصحیح شده بر اساس Bonferroni-Holm). همه آزمون‌های آماری و نتایج آنها به همراه داده‌های منبع در شکل داده‌های توسعه‌یافته 1-1 گزارش شده‌اند.

سیستانچ فارما ویژه