قسمت 2 جداسازی و شناسایی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی از Aloysia Polystachya و فعالیت آن به عنوان بازدارنده مونوآمین اکسیداز-A

دلیل اینکه Cistanche Actosides می تواند فعالیت آنزیم را مهار کند چیست؟

اصل اثر آنتی اکسیدانی سیستانچ

برای اطلاعات بیشتر لطفا تماس بگیرید:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola اثرات زیادی دارد، برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

جداسازی و شناسایی اجزای تشکیل دهنده با کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده - طیف سنجی جرمی

آنالیزهای کروماتوگرافی با استفاده از سیستم Waters Acquity UPLC H-Class مجهز به آشکارساز آرایه دیودی (DAD) و طیف‌سنج جرمی چهار قطبی پشت سر هم Waters Xevo TQ-S با منبع اسپری Z که در حالت یون منفی کار می‌کند، انجام شد. محلول‌های حاوی 1.{4}}mg/ml عصاره یا استانداردهااکتئوزید, ایزواکتئوزید, 6'-استیلاکتئوزیدو 4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7-O-C7'']-biflavone در متانول درجه LC به طور جداگانه، با سونیکاسیون به مدت 3{15}} دقیقه در صورت لزوم، و از طریق فیلترهای میلی‌پور 0}.45 میکرومتر (Merck Millipore) فیلتر شدند. محلول‌ها با متانول به 10 میکروگرم در میلی‌لیتر رقیق شدند و مقدار کمی (5μL) به ستون Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 (1{3{33}}}}0×4.6 میلی‌متر id; اندازه ذرات 2.7 میکرومتر). فاز متحرک شامل آب حاوی 0.1 درصد اسید فرمیک (حلال A) و متانول حاوی 0.1 درصد اسید فرمیک (حلال B) بود که با سرعت جریان 0.5 میلی لیتر در دقیقه مطابق با مشخصات شستشو: ایزوکراتیک با 3 درصد B بین 0 و 4 دقیقه، به دنبال آن شیب های خطی از 3 تا 60 درصد B بین 4 و 19 دقیقه و از 60 تا 90 درصد B بین 19 و 23 دقیقه، و در نهایت به 3 درصد B بین 23 و 28 دقیقه بازگشت. پساب توسط DAD در محدوده 210 تا 720 نانومتر و توسط MS با منبع بهینه شده و پارامترهای عملیاتی به شرح زیر پایش شد: ولتاژ مویرگی 2.50 کیلو ولت، دمای منبع اسپری Z 150 درجه، دمای تخلیه (N2) 350 درجه، جریان گاز محلول‌سازی 600 L/h و محدوده جرمی m/z 150 تا 600 در حالت اسکن کامل.

تصفیه اجزای شناسایی شده

عصاره هیدرواتانولی خام (10 گرم) در آب حل شد: اتانول (50:50؛ V/V) و به طور متوالی در برابر هگزان، اتیل استات و n-بوتانول تقسیم شد. کسر بوتانول روی یک اواپراتور چرخشی متمرکز شد و یک نمونه 3 گرمی از عصاره تکه تکه شده روی یک ستون شیشه ای (10 × 3 سانتی متر روز) پر شده با سیلیکاژل C{7}} RP ({8}} مش؛ سیگما) اعمال شد. -آلدریچ) و با آب شسته و به دنبال آن مخلوط های متوالی آب: متانول (90:10، 50:50 و 10:90؛ v/v). بخش فرعی به‌دست‌آمده از شستشو با آب: متانول (90:10؛ V/V) توسط RP-HPLC با استفاده از یک سیستم Shimadzu LC{19}}AP همراه با یک آشکارساز SPD{20}}یک آشکارساز UV/Vis خالص‌تر شد. و مجهز به یک ستون Phenomenex Luna® C{21}} (250 × 10 میلی‌متر شناسه؛ اندازه ذرات 5 میکرومتر). فاز متحرک آب بود: متانول با شروع 90:10 (v/v) و تغییر به 30:70 (v/v) در 100 دقیقه برای تولید چهار ترکیب شناخته شدهاکتئوزید(750 میلی گرم)، سمت ایزوله (430 میلی گرم)، 6'-استیلاکتئوزید(42 میلی گرم)، و 4'،4'',5,5'-tetrahydroxy-6,6',3'''-trimethoxy-[C7-O-C7'']-biflavone ( 13 میلی گرم). سرعت جریان فاز متحرک 1 میلی لیتر در دقیقه، حجم تزریق 500 میکرولیتر، کروماتوگرام در 340 نانومتر ثبت شد و طیف UV در محدوده 240 تا 400 نانومتر به دست آمد. هویت اجزای خالص‌شده از طیف‌های 1H- (500 مگاهرتز) و 13C-NMR (125 مگاهرتز) آنها که بر روی یک طیف‌سنج مدل Bruker DPX 500 ثبت شده بود، تأیید شد و داده‌ها با داده‌های موجود در ادبیات مقایسه شدند [18، 19، 41]. خلوص ترکیبات جدا شده توسط UPLC-DAD-MS تایید شد (▶شکل. 1b–d) و NMR (▶شکل. S1–S12، اطلاعات پشتیبانی).

کمی سازی ازاکتئوزیدتوسط یک آشکارساز آرایه دیود HPLC

یک نمونه (1 میلی گرم) از عصاره آبی اتانولی خشک شده در 1 میلی لیتر مخلوط (8{6}}:20؛ v/v) متانول (گرید JT Baker HPLC) و Milli-Q مجددا حل شد. آب فوق خالص (Merck Millipore)، به مدت 3{21}} دقیقه تحت فراصوت قرار گرفت و از طریق یک فیلتر 0.45- میکرومتر میلی‌پور فیلتر شد. مقادیر جزئی (20 میکرولیتر) از این محلول بر روی یک سیستم Shimadzu LC{9}}APvp که به یک SPD-M10Avp DAD کوپل شده و با یک ستون Phenomenex Luna C18 (250 × 4.6 میلی‌متر شناسه، 5 میکرومتر) محافظت شده توسط یک Phenomenex آنالیز شد. پیش ستون C18 (4.0 × 3.0 میلی متر ID، 5 میکرومتر). جداسازی در دمای اتاق (1±22 درجه) با استفاده از یک فاز متحرک شامل اسید استیک 0.1 درصد در آب (حلال A) و متانول (حلال B) انجام شد.

درجه JT Baker HPLC) با سرعت جریان ثابت 1.{1}} میلی‌لیتر در دقیقه مطابق برنامه: گرادیان خطی از 10 تا 70 درصد B بین 0 تا 32 دقیقه، از 70 تا 10 درصد B بین 32 و 35 دقیقه، و شستشوی نهایی ایزوکراتیک با 10 درصد B بین 35 تا 40 دقیقه. طول موج تشخیص روی 330 نانومتر تنظیم شد.

محتوایاکتئوزیددر عصاره با استفاده ازاکتئوزید(Sigma-Aldrich; CAS no. 61276-17-3) به عنوان استاندارد خارجی. محلول های حاوی 500، 250، 125، 62.5، 31.2 و 15.6 ug/mL استاندارد مرجع تهیه شد و منحنی های کالیبراسیون با قرار دادن هر محلول در آنالیز HPLC در سه تکرار ساخته شد [42]. نسبت مساحت پیک استاندارداکتئوزیدغلظت مربوطه آنالیت از طریق رگرسیون خطی منحنی‌های استاندارد ایجاد شد (▶شکل. S13، اطلاعات پشتیبانی). داده های تحلیلی با توجه به خطی بودن، دقت و صحت مطابق دستورالعمل های صادر شده توسط Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42] اعتبارسنجی شدند. محدودیت های تشخیص (LoD) و کمیت (LoQ) ازاکتئوزیدبه ترتیب {{0}}.30 و 0.92 میکروگرم در میلی لیتر بودند.

سنجش های مهار مونوآمین اکسیداز-A

MAO-A نوترکیب انسانی، تیرامین، کلروژیلین، اسید وانیلیک، 4-آمینو آنتی پیرین و پراکسیداز ترب کوهی از سیگما آلدریچ خریداری شد. سنجش مهار MAO-A با استفاده از صفحات چاهک به دنبال نسخه اصلاح شده روش توصیف شده توسط López و همکاران انجام شد. [43]. هر چاهک با 5{7}} میکرولیتر محلول کروموژنیک (0.8 میلی‌مولار اسید وانیلیک، 2.5 میلی‌مولار 4-آمینو آنتی‌پیرین و 4 واحد بر میلی‌لیتر ترب‌اکسید پراکسیداز در بافر فسفات در pH 7.6)، 100 میکرولیتر از 3 بارگیری شد. mM تیرامین، و مقدار {17}} میکرولیتر از عصاره هیدرواتانولی خام یا یکی از فنیل اتانوئیدهای خالص شده محلول در متانول. در نهایت، مقدار 50 میکرولیتر از 8 U/mL MAO-A به هر یک از چاهک ها اضافه شد و پلیت به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شد، در این مدت جذب هر 5 دقیقه با استفاده از دستگاه میکروپلیت خوان ثبت شد. کلرژیلین (بیشتر یا مساوی 97 درصد GC؛ سیگما-آلدریچ) و متانول به ترتیب به عنوان کنترل مثبت و منفی در هر صفحه سنجش قرار گرفتند.

تحلیل آماری

سه ارزیابی مستقل از فعالیت های بازدارنده MAO-A انجام شد و داده های به دست آمده با استفاده از نرم افزار Graph-Pad Prism تجزیه و تحلیل شد. آی سی₅₀مقادیر عصاره هیدرواتانولی، فنیل اتانوئیدهای تصفیه شده و کنترل مثبت با رگرسیون غیرخطی، شبیه سازی نمودارهای ورود به سیستم (غلظت بازدارنده) در مقابل درصد مهار نرمال محاسبه شد.

اطلاعات پشتیبانی

طیف H- و 13C-NMR ازاکتئوزید، ایزواکتئوزید، 6'-استیلاکتئوزید، و 4،4،5،5-تتراهیدروکسی-6،6،3 تری متوکسی-[C7-O-C7'']-بی فلاون و همبستگی HSQC/HMBC برای سه فنیل اتانوئید به عنوان اطلاعات پشتیبانی در دسترس هستند.

منابع

[1] سازمان بهداشت جهانی. افسردگی و سایر ذهنیات رایج

اختلالات: برآوردهای جهانی بهداشت. ژنو: WHO; 2017

[2] فرگوسن جی ام. داروهای ضد افسردگی SSRI: عوارض جانبی و قابل تحمل. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3: 22-27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. طب مکمل و جایگزین در درمان اضطراب و افسردگی. Curr Opin Psychiatry 2008; 21: 37-42

[4] ساریس جی، مک اینتایر ای، کمفیلد دی. داروهای گیاهی برای اختلالات اضطرابی، بخش 1: مروری بر مطالعات پیش بالینی. CNS Drugs 2013; 27: 207-219

[5] ساریس جی، مک اینتایر ای، کمفیلد دی. داروهای گیاهی برای اختلالات اضطرابی، بخش 2: مروری بر مطالعات بالینی همراه با شواهد پیش بالینی. CNS Drugs 2013; 27: 301-319

[6] Del Vitto LA، Petenatti EM، Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (جمهوری آرژانتین). قسمت اول: Plantas Nativas. Multequina 1997; 6: 49-66

[7] González Y، Arrúa RD، Rojas GD، García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito"،آلویزیا پلی استاکیا (Griseb.) Moldenke (Verben- aceae), kultivdo en پاراگوئه. روژیانا 2014; 13: 31-41

[8] Mora S، Díaz-Véliz G، Millán R، Lungenstrass H، Quirós S، Coto-Morales T، Hellión-Ibarrola MC. اثرات ضد اضطراب و ضد افسردگی عصاره هیدروالکلی ازآلویزیا پلی استاکیادر موش ها Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373-378

[9] Hellión-Ibarrola MC، Ibarrola DA، Montalbetti Y، Kennedy ML، Heinichen O، Campuzano M، Tortoriello J، Fernández S، Wasowski C، Marder M، De Lima TCM، Mora S. اثرات مشابه ضد اضطرابآلویزیاپلی استاکیا(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) در موش. J Ethnopharmacol- col 2006; 105: 400-408

[10] Hellión-Ibarrola MC، Ibarrola DA، Montalbetti Y، Kennedy ML، Heinichen O، Campuzano M، Ferro EA، Alvarenga N، Tortoriello J،

De Lima TCM, Mora S. اثرات مشابه ضد افسردگیآلویزیاپلی استاکیا(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) در موش. فیتومدیسین 2008; 15: 478-483

[11] Herraiz T، González D، Ancín-Azpilicueta C، Arán VJ، Guillén H.

آلکالوئیدهای کربولین موجود در اسپند هارمالا و مهار مونوآمین اکسیداز انسانی (MAO). Food Chem Toxicol 2010; 48: 839-845

[12] Herraiz T، Guillén H، Arán VJ، Salgado A. شناسایی، وقوع و فعالیت آلکالوئیدهای کوینازولین در اسپند هارمالا. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261-269

[13] Herraiz T، Guillén H. مهار مونوآمین اکسیداز-A و فعالیت آنتی اکسیدانی مرتبط در عصاره های گیاهی با اثرات ضد افسردگی بالقوه. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carradori S، D'Ascenzio M، Chimenti P، Secci D، Bolasco A. مهارکننده‌های انتخابی MAO-B: درسی از محصولات طبیعی. Mol Divers 2014; 18: 219-243

[15] Fajemiroye JO، Silva DM، Oliveira DR، Costa EA. درمان اضطراب و افسردگی: گیاهان دارویی در گذشته. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198-215

[16] Fišar Z. داروها با فعالیت مونوآمین اکسیداز مرتبط هستند. Prog Neuropsy- chopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112-124

[17] Naoi M، Maruyama W، Shamoto-Nagai M. مونوآمین اکسیداز نوع A و سروتونین به طور هماهنگ در اختلالات افسردگی نقش دارند: از عدم تعادل انتقال دهنده های عصبی تا اختلال در نوروژنز. J Neural Transm 2017; 125: 53-66