بخش 2: ورباسکوزید از سلول های پانکراس در برابر استرس ER محافظت می کند

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

الساندرا گالی 1، پلاس، پائولا مارسیانی 1، الگرتا مارکو 1، سیلویا گیسلانزونی 1، فدریکو برتوزی 2، رافائلا روسی 3، آلسیا دی جیانکامیلو 3، میکلا کاستانیا 1 و کارلا پرگو 1،*

لطفاً اینجا را کلیک کنید تا به قسمت 1 برگردید

3.4 ورباسکوزید فعالیت و دینامیک میتوکندری سلول ها را تعدیل می کند

سنجش زنده ماندن MTT تأثیر احتمالی را نشان می دهدورباسکوزیدمستقیماً روی میتوکندری که جفت شدن ترشح انسولین با وضعیت تغذیه و بقای سلولی در این نوع سلول را تضمین می کند. شکل و پتانسیل غشاء نشانگرهای سلامت میتوکندری هستند [42]. ما ابتدا پتانسیل غشای میتوکندری را با برچسب گذاری سلول ها با MitoSpyw Orange CMTMRos، یک رنگ قابل نفوذ که غلظت آن به پتانسیل غشای میتوکندری داخلی بستگی دارد، ارزیابی کردیم، در حالی که MitoSpyw Green FM برای نرمال کردن داده ها به جرم میتوکندری استفاده شد (شکل 4A، B). پتانسیل غشایی میتوکندری درورباسکوزیدسلول های تیمار شده در مقایسه با شاهد در هر دو شرایط پایه و تنش افزایش یافت. جالب اینکه،ورباسکوزیدمتابولیت ها اثرات متفاوتی داشتند. کافه اسید پتانسیل میتوکندری را بهبود نمی بخشد، در حالی که هیدروکسی تیروزول باعث اختلال وابسته به دوز در عملکرد میتوکندری می شود، در توافق با داده های مربوط به زنده ماندن سلول، چنین اثری پس از قرار گرفتن در معرض H2O2 مشهودتر بود (شکل S3).

ورباسکوزید از سیستانچ

از آنجایی که این تابع به شدت با مورفولوژی مرتبط است، ما قطر، مساحت و دایره‌ای میتوکندری فرت را اندازه‌گیری کردیم. استرس اکسیداتیو حاد شکافت گسترده میتوکندری را تقویت می‌کند و در نتیجه میتوکندری‌های دایره‌ای کوچک‌تر ایجاد می‌کند [42]. تحت شرایط استرس H2O2، میتوکندری سلول‌های تیمار شده با ورباسکوزید درازتر بود و سطح افزایش‌یافته‌تری نسبت به نمونه‌های شاهد نشان داد (شکل 4C، D و شکل S4). دایره‌ای میتوکندری در سلول‌های تیمار شده با ورباسکوزید نسبت به گروه شاهد کمتر بود و تفاوت‌ها در سلول‌های تیمار شده با H2O2 مشهودتر بود (شکل S3)، که باز هم نقش محافظتی پلی‌فنل را تأیید می‌کند.

توانایی این اندامک ها برای تغییر شکل خود در پاسخ به حالت های تغذیه ای یا شرایط استرس زا تحت کنترل رویدادهای همجوشی و شکافت است و به تحرک میتوکندری نیاز دارد [39]. ردیابی حرکات میتوکندری ما را به محاسبه مسافت تجمعی پیموده شد و تجزیه و تحلیل نشان داد که در مقایسه با گروه شاهد، در حال حاضر در شرایط پایه، دینامیک میتوکندری در سلول‌های تیمار شده با ورباسکوزید افزایش قابل‌توجهی دارد (شکل 4E، F و ویدیوهای S1-S4). این اثر پس از درمان H2O2 بارزتر بود، در واقع پیش تیمار ورباسکوزید تقریباً به طور کامل تأثیر استرس اکسیداتیو بر پویایی میتوکندری را برگرداند.

این داده‌ها روی هم به شدت از نقش کلیدی ورباسکوزید در تضمین پویایی میتوکندری حمایت می‌کنند که برای ارتقای سازگاری سریع این اندامک با شرایط استرس بسیار مهم است.

3.5 تأثیر ورباسکوزید بر بقا و عملکرد انسان لانگرهانس

با در نظر گرفتن پتانسیل ترجمه ازورباسکوزیدکاربرد آن در سلامت انسان، ما تأثیر آن را بر جزایر جدا شده انسانی لانگرهانس، مدلی مرتبط‌تر برای مطالعات فیزیوپاتولوژیک و فارماکولوژیک روی سلول‌ها تأیید کردیم. جزایر جدا شده با 16 میکرومولار ورباسکوزید به مدت 5 روز تحت درمان قرار گرفتند و پتانسیل غشای میتوکندری مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 5A گزارش شده است، در حالی که پتانسیل اندامک در جزایر انسانی کنترل پس از قرار گرفتن در معرض H2O2 به خطر افتاده است، پتانسیل غشای داخلی میتوکندری در جزایر پیش تیمار شده با ورباسکوزید به طور قابل توجهی کاهش نمی یابد، که از فرضیه نقش محافظتی ورباسکوزید در برابر ROS ناشی می شود - اختلال عملکرد سلولی تجزیه و تحلیل بیان نشانگرهای استرس ER کاهش مهم کسر P-eIF2 را در دو آماده‌سازی جزیره‌ای مجزا که در 16 میکرومولار ورباسکوزید نگهداری می‌شوند نشان داد، که تنظیم پایین این مسیر را در نمونه‌های انسانی نیز تأیید می‌کند (شکل 5D). اثرات مفید تیمار پلی فنل با افزایش محتوای انسولین مشاهده شده در جزایر تیمار شده با ورباسکوزید در مقایسه با گروه شاهد تایید شد (شکل 5B). پراکندگی داده‌ها در آزمایش‌های ما اجازه نمی‌دهد که تفاوت قابل‌توجهی در ترشح انسولین تحریک‌شده با گلوکز (GSIS) در جزایر تیمار شده با ورباسکوزید نشان داده شود، اگرچه یک روند مثبت در هر دو شرایط پایه و تنش آشکار به نظر می‌رسد (شکل 5C).

4. بحث

استرس اکسیداتیو و التهاب اساس اختلال عملکرد سلولی است که در طول T2D رخ می دهد [43،44] به همین ترتیب، مواد غذایی کاربردی، مواد مغذی و فیتوکمیکال ها به عنوان ابزاری برای پیشگیری از دیابت نوع 2 مورد بررسی قرار گرفته اند [45]. در این کار، ما بر روی ورباسکوزید تمرکز کردیم، که شناخته شده است که فعالیت های ضد التهابی و آنتی اکسیدانی در نورون ها اعمال می کند [18]. علیرغم پیچیدگی ساختاری بالا، verbascoside و isoverbascoside در پلاسمای خون موش های تغذیه شده با عصاره Lippia citriodora همراه با برخی متابولیت ها یافت شده است [20]. علاوه بر این، تجمع سلولی ورباسکوزید و ورباسکوزید در یک رده سلولی سرطان پستان SKBR3 [23] شناسایی شده است و مطالعات انجام شده بر روی سلول‌های کاکو نشان می‌دهد که مقادیر متوسطی از ورباسکوزید و ایزوورباسکوزید پس از هضم آزمایشگاهی دست نخورده و قابل دسترسی زیستی باقی می‌مانند. روند. علاوه بر این، Caco{13}} می‌تواند هر دو مولکول را از طریق یک انتقال سریع و خطی در محدوده 10 تا 100 میکرومولار جذب کند [22]. هیچ اطلاعاتی در مورد فراهمی زیستی ورباسکوزید در انسان گزارش نشده است، اما مطالعات ذکر شده در بالا نشان می دهد که ممکن است برای ورباسکوزید غیر متابولیزه شده از سد روده عبور کند، در پلاسمای خون گردش کند و اثرات آنتی اکسیدانی روی سلول های غدد درون ریز بگذارد. پانکراس

ما یک نقش محافظتی وابسته به دوز ({1}}.8-16 میکرومولار) ورباسکوزید بر روی سلول‌های کلونال و انسانی، هم در شرایط پایه و هم تحت شرایط استرس پیدا کردیم. این اثر به دلیل خود ورباسکوزید است و نه متابولیت های آن کافئین اسید و هیدروکسی تیروزول، که در واقع در غلظت 16 میکرومولار سیتوتوکسیک ظاهر می شوند. غلظت‌هایی که در آزمایش‌های ما فعال هستند، مطابق با غلظت‌هایی است که در حیواناتی که با ورباسکوزید تغذیه می‌شوند [20].

اگرچه ما نمی دانیم که آیا ورباسکوزید با اتصال به گیرنده غشایی به صورت خارج سلولی عمل می کند یا توسط اندوسیتوز درونی می شود و به صورت درون سلولی کار می کند، داده های ما تأیید می کند که ورباسکوزید دارای خواص آنتی اکسیدانی و ضد التهابی است و از سلول ها در برابر اختلالات ناشی از استرس ER محافظت می کند. UPR و ترویج دینامیک میتوکندری

در واقع، ما کاهش قابل توجهی از محتوای ROS را در سلول های تیمار شده با ورباسکوزید تشخیص دادیم که با کاهش پراکسیداسیون لیپیدی اندازه گیری شده از طریق بیان HNE و آکرولئین بیشتر تایید می شود. برخلاف بسیاری از پلی‌فنل‌های گیاهی، فعالیت مهاری ROS ورباسکوزید عمدتاً به‌جای مسیرهای مستقیم، غیرمستقیم (از طریق تنظیم مثبت آنزیم‌های حذف کننده ROS) دنبال می‌شود. در واقع، رونویسی ژنی برخی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان را از طریق فعال‌سازی مسیر Nrf2 (NF-E{3} مربوط به فاکتور 2) و از طریق مکانیسم وابسته به AhR (گیرنده هیدروکربن آریل) افزایش می‌دهد [24،29]. به این ترتیب، ما افزایش بیان SOD1 را در سلول‌های تیمار شده با ورباسکوزید یافتیم.

هموستاز ROS در آسیب شناسی سلولی بسیار مرتبط است. به دلیل کمبود آنزیم های آنتی اکسیدان، تولید افزایش یافته ROS را نمی توان خنثی کرد و باعث ایجاد استرس ER تا زدن اشتباه پروتئین می شود. استرس ER منجر به کاهش رونویسی و ترجمه انسولین از طریق فعال شدن UPR می شود [44،46]. هدف اصلی این مسیر بازیابی عملکرد ER از طریق برنامه ریزی مجدد بیان ژن است، با این حال، زمانی که بیش از حد تحریک شود، باعث آپوپتوز می شود. داده‌های ما نشان می‌دهد که یک اقدام مهم ورباسکوزید کاهش UPR است، که اجازه می‌دهد تا تغییرات لازم برای ترمیم اختلال عملکرد ER، بدون ایجاد آپوپتوز انجام شود. با توجه به این احتمال، بیان پروتئین‌های BIP، HSP70 و PERK در سلول‌های تیمار شده با ورباسکوزید کاهش یافت و فعال‌سازی مسیر PERK در پاسخ به استرس ER ناشی از تونیکامایسین کاهش یافت. اقدام مشابهی برای تیروزول در رده سلولی NIT{6}} انسولینوما گزارش شد [47].

به ویژه جالب، توانایی ورباسکوزید برای تعدیل فعال سازی شاخه PERK از UPR است. در سلول‌ها، این مسیر برای حفظ هموستاز ترشحی پایه و بقای سلولی مورد نیاز است و در دیابت به شدت از تنظیم خارج می‌شود [41،48]. حتی جالب‌تر، واریته‌های رایج در PERK به خطر پیش دیابت و جهش‌های مغلوب در ژن EIF2AK3 (رمزکننده PERK) زمینه‌ساز حساسیت به سندرم ولکات رالیسون است که با دیابت دائمی وابسته به انسولین نوزاد مشخص می‌شود [49،50].

کاهش مسیر التهابی IKB -NFKB نیز در سیستم ما در حضور ورباسکوزید تشخیص داده شد. NFKB مسیر اصلی التهابی را در سلول‌ها نشان می‌دهد و فعال‌سازی مداوم آن باعث آغاز مجموعه‌ای از رویدادها می‌شود که به مرگ سلولی منجر می‌شود. در سلول‌های تحت استرس، کاهش بیان NFKB از سلول‌های پانکراس در برابر عوامل دیابت زا محافظت می‌کند [27،51] و از کاربرد verbascoside در پیشگیری از دیابت حمایت می‌کند. جالب توجه است که سیگنال دهی PERK فاکتورهای رونویسی NFR2 (که در هموستاز ردوکس دخیل است) و NFKB را فعال می کند، بنابراین اثرات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی ورباسکوزید را توضیح می دهد [40،52].

داده‌های ما همچنین نقش مهم ورباسکوزید را بر فعالیت و پویایی میتوکندری نشان می‌دهد.

نشانگر کیفیت عملیاتی میتوکندری پویایی آنهاست، فرآیندی که با چرخه های هماهنگی از همجوشی و رویدادهای شکافت مشخص می شود که تعداد، توزیع، مورفولوژی و پتانسیل غشایی میتوکندری را تنظیم می کند [39]. در راستای این امکان، ورباسکوزید پتانسیل غشای میتوکندری tc3 را هم در شرایط پایه و هم در شرایط استرس بهبود می بخشد. باز هم، این اثر به دلیل ورباسکوزید است و نه متابولیت های آن، زیرا کافئین اسید عملکرد میتوکندری را بهبود نمی بخشد و هیدروکسی تیروزول به طور قابل توجهی پتانسیل اندامک ها را کاهش می دهد. افزایش پویایی میتوکندری و تغییرات در مورفولوژی آنها با ردیابی حرکات میتوکندری مشاهده شد، بنابراین نشان می دهد که ورباسکوزید یک برنامه میتومورفوزیس را ترویج می کند. تغییر شکل شبکه میتوکندری سلولی بر روی مونتاژ ابرکمپلکس‌های زنجیره تنفسی تأثیر می‌گذارد، بنابراین نه تنها متابولیسم سلولی بلکه حالت ردوکس آن را نیز تغییر می‌دهد و سلول‌ها را قادر می‌سازد تا با استرس اکسیداتیو و التهاب مقابله کنند [5،37،39].

اگرچه مکانیسم مولکولی هنوز ناشناخته است، می‌توانیم فرض کنیم که ورباسکوزید، مانند پلی‌فنل‌های دیگر، با کاهش غلظت ROS [53] از DNA میتوکندری محافظت می‌کند و از باز شدن منافذ انتقال نفوذپذیری میتوکندری [54] جلوگیری می‌کند و فعالیت فیزیولوژیکی میتوکندری را تضمین می‌کند. احتمال جالب دیگر این است که تغییر پویایی و فعالیت میتوکندری دوباره توسط عمل ورباسکوزید روی UPR واسطه می شود. در واقع، یک تحقیق اخیر در زمینه میتوکندری نشان می‌دهد که مکان‌های تعامل ER-میتوکندری نقش کلیدی در کنترل پویایی و فعالیت میتوکندری در پاسخ به استرس اکسیداتیو دارند و PERK در این پدیده دخیل است [55]. بیشتر مطالعات آزمایشگاهی با پلی فنل ها در رده های سلولی، اغلب با منشاء توموری، که از نظر متابولیسم و ​​تولید ROS با سلول های اصلی متفاوت است، انجام شد. ما در اینجا شواهدی ارائه می‌کنیم که نشان می‌دهد ورباسکوزید یک اثر محافظتی بر جزایر لانگرهانس جدا شده انسانی، هدف نهایی مداخله در دیابت، اعمال می‌کند. جالب توجه است، پلی فنل فعال سازی سیگنالینگ PERK را در شرایط پایه کاهش می دهد، بنابراین محتوای انسولین را افزایش می دهد و از اختلالات میتوکندری ناشی از استرس اکسیداتیو جلوگیری می کند. هنوز مشخص نیست که آیا اثر پلی فنل بر محتوای انسولین، توانایی ترکیب را برای جلوگیری از مرگ سلولی، کاهش استرس ER یا کنترل مستقیم بیان ژن انسولین، همانطور که برای سایر ترکیبات پلی فنولی نشان داده شده است، منعکس می کند [56]. این داده ها به ویژه با توجه به استفاده احتمالی از ورباسکوزید به عنوان یک درمان مکمل در درمان دیابت مرتبط هستند.

5. نتیجه گیری ها

مطالعات آزمایشگاهی گزارش شده در اینجا بر روی سلول های کلونال و انسانی نشان می دهد که ورباسکوزید اثرات محافظتی در برابر اختلالات مرتبط با استرس ER اعمال می کند، فعال شدن شاخه PERK UPR را کاهش می دهد و پویایی میتوکندری را بهبود می بخشد. از آنجایی که اختلال در هموستاز ER باعث آسیب سلولی و دیابت می شود، این داده ها دلیلی منطقی برای استفاده احتمالی از verbascoside به عنوان یک ماده غذایی در پیشگیری و درمان بیماری ها فراهم می کند. با این حال، بسیاری از مسائل برای کاربرد بالینی مؤثر ورباسکوزید باید حل شود. علیرغم انبوه مطالعات آزمایشگاهی، مطالعات بالینی قابل اعتمادی که اثرات سلامتی ورباسکوزید را در داخل بدن تأیید می کند، محدود است. علاوه بر این، افزایش پایداری و فراهمی زیستی آن برای کاربرد آتی این ترکیب در سلامت انسان الزامی است. از این نقطه، ورباسکوزید یک مولکول جالب است زیرا داربست آن مکان‌های واکنش‌پذیر متفاوتی دارد که می‌توان آن‌ها را با شیمی ترکیبی اصلاح کرد. ما انتظار داریم که اطلاعات حاصل از این مطالعات راه هایی را برای تعدیل درمانی استرس اکسیداتیو و التهاب در شرایط پاتولوژیک با استفاده از ترکیبات طبیعی باز کند.

مواد تکمیلی: موارد زیر به صورت آنلاین در http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1 موجود است. شکل S1: اثرات کافئین اسید و هیدروکسی تیروزول بر زنده ماندن سلول. شکل S2: اثرات ورباسکوزید بر استرس ER ناشی از تونیکامایسین. شکل S3: اثرات کافئین اسید و هیدروکسی تیروزول بر پتانسیل غشای میتوکندری. شکل S4: تجزیه و تحلیل تصویر کمی از میتوکندری در سلول های تیمار شده با اسید کافئین و هیدروکسی تیروزول. ویدئوهای S1، S2: دینامیک میتوکندری در شرایط پایه، در غیاب (S1) یا حضور (S2) ورباسکوزید ثبت شده است. ویدئو S3، S4: دینامیک میتوکندری در شرایط استرس اکسیداتیو، در غیاب (S3) یا حضور (S4) ورباسکوزید ثبت شده است.

مشارکت نویسنده: Conceptualization، AG، PM و CP. مدیریت داده، AG و PM؛ تجزیه و تحلیل رسمی، AG و PM. تامین مالی، CP; تحقیق، MC; روش، AM و SG. منابع، FB، RR و ADG؛ نظارت، CP; اعتبار سنجی، AM، SG و MC. تجسم، AG و AM. نوشتن-پیش نویس اصلی، AG; نوشتن-بررسی و ویرایش، PM، AM، FB، RR، ADG، MC و CP همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند.

بودجه: این تحقیق هیچ بودجه خارجی دریافت نکرد.

تشکر و قدردانی: مایلیم از کارلو کورینو و ماریو دل آگلی برای معرف ها و بحث مفید تشکر کنیم.

تضاد منافع: نویسندگان هیچ گونه تضاد منافعی را اعلام نمی کنند.

منابع

1. چو، NH; شاو، جی. کارورانگا، اس. هوانگ، ی. دا روشا فرناندز، JD; Ohlrogge، AW; Malanda، B. IDF Diabetes Atlas: برآوردهای جهانی شیوع دیابت برای سال 2017 و پیش بینی ها برای سال 2045. Diabetes Res. کلین تمرین کنید. 2018، 138، 271-281. [CrossRef]

2. Leslie, RD; پالمر، جی. Schlott، NC; Lernmark، A. دیابت در تقاطع: ارتباط طبقه بندی بیماری با پاتوفیزیولوژی و درمان. Diabetologia 2016، 59، 13-20. [CrossRef] [PubMed]

3. توکارز، وی. مک دونالد، PE; کلیپ، A. زیست شناسی سلولی عملکرد سیستمیک انسولین. J. Cell Biol. 2018، 217، 2273-2289. [CrossRef] [PubMed]

4. پرگو، سی. دا دالت، ال. پیریلو، ا. گالی، ع. کاتاپانو، آل. نوراتا، متابولیسم کلسترول GD، عملکرد سلول های پانکراس و دیابت. بیوشیم. et Biophys. Acta (BBA) Mol. پایه دیس. 2019، 1865، 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]

5. گالی، ع. الجزایر، م. مارسیانی، پ. شولت، سی. لئوناردی، سی. میلانی، پ. مافولی، ای. تدشی، جی. Perego، C. تمایز و عملکرد سلول های پانکراس شکل دادن: تأثیر انتقال مکانیکی. Cells 2020, 9, 413. [CrossRef]

6. اشکرافت، اف ام; رورسمن، پی. دیابت شیرین و سلول: ده سال گذشته. سلول 2012، 148، 1160-1171. [CrossRef] [PubMed]

7. روزنگرن، ق. براون، ام. مهدی، ت. اندرسون، SA; Travers، ME; شیگتو، م. ژانگ، ای. آلمگرن، پی. لادنوال، سی. اکسلسون، AS; و همکاران کاهش اگزوسیتوز انسولین در سلول‌های پانکراس انسانی با انواع ژنی مرتبط با دیابت نوع 2. دیابت 2012، 61، 1726-1733. [CrossRef] [PubMed]

8. Polonsky، KS دینامیک ترشح انسولین در چاقی و دیابت. بین المللی جی. اوبز. 2000، 24، S29–S31. [CrossRef]

9. رودن، م. شولمن، GI زیست شناسی یکپارچه دیابت نوع 2. Nature 2019، 576، 51–60. [CrossRef]