سیستانچ: اکیناکوزید رشد سلول های آدنوکارسینوم پانکراس را با القای آپوپتوز از طریق مسیر پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن سرکوب می کند.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG، JINBIN LUO، YINGHUI LIANG و XINFENG LI

خلاصه.

کاربرد بالینی محصولات طبیعی مشتق شده از طب سنتی چینی در شیمی درمانی سرطان مورد توجه قرار گرفته است.اکیناکوزید(ECH)، یکی از فنیل اتانوئیدها، جدا شده از ساقهسیستانچ(یک داروی گیاهی چینی) دارای اثرات محافظ بافت و ضد آپوپتوز بر روی سیستم عصبی مرکزی است. با این حال، تا حد زیادی مشخص نیست که آیا ECH دارای فعالیت سرکوب کننده تومور است یا خیر. در مطالعه حاضر، نشان داده شد که ECH می تواند به طور قابل توجهی از تکثیر سلول های آدنوکارسینوم پانکراس با القای تولید گونه های فعال اکسیژن و اختلال پتانسیل غشای میتوکندری و در نتیجه آغاز آپوپتوز جلوگیری کند. علاوه بر این، مشخص شد که ECH(اکیناکوزید)رشد سلول های تومور را از طریق تعدیل فعالیت MAPK سرکوب می کند. در نتیجه، این مطالعه یک عملکرد جدید از ECH (اکیناکوزید) در جلوگیری از توسعه سرطان، و به این معنی است که استفاده از ECH می تواند یک استراتژی شیمی درمانی بالقوه برای سرطان باشد.

مقدمه

مسیر سرکوبگر تومور p53 از طریق القای سرکوبگر تومور، ARF باعث کاهش انکوژن E{1}}لیگاز دو دقیقه ای موش (MDM)2-تخریب p53 با واسطه (3) می شود. این یک مکانیسم خودتنظیمی و خود محافظتی است که از تبدیل بدخیم سلول ها جلوگیری می کند. قابل‌توجه، p53 می‌تواند فعالیت Myc را با فعال‌سازی رونویسی، به عنوان مثال miR-145 که هدف قرار می‌دهد، سرکوب کند.MycmRNA برای خاموش کردن ترجمه (4،5)، بنابراین یک حلقه تنظیمی بازخورد منفی تشکیل می دهد.

ساده ترین و موثرترین استراتژی برای درمان سرطان، از بین بردن سلول های سرطانی است. داروهای ضد سرطانی که معمولاً مورد استفاده قرار می گیرند، مانند سیس پلاتین (6)، اکتینومایسین D (7) و آدریامایسین (8) نشان داده شده است که رشد تومور را با ترویج آپوپتوز مهار می کنند. اخیراً، شواهد رو به رشدی نشان داده است که تعدادی از محصولات طبیعی و مشتقات گیاهان، به ویژه از گیاهان دارویی که در طب سنتی چینی (TCM) استفاده می‌شوند، با القای آپوپتوز سلول‌های سرطانی، عملکرد سرکوب‌کننده تومور را نشان می‌دهند و پتانسیل کاربرد بالینی را دارند. در درمان سرطان (9). به عنوان مثال، امودین آنتراکینون طبیعی از انواع مختلفی از سلول های سرطانی جدا شده است (10،11). Camptothecin، مشتق شده از "درخت شاد" چینی،Camptotheca تیز کردن، یک محصول طبیعی با ارزش است که از بستن DNA به دنبال گسستن رشته ای با واسطه توپو I جلوگیری می کند (12). در مطالعه همگروهی گذشته نگر دیگری که روی 729 بیمار مبتلا به سرطان پستان پیشرفته انجام شد، پیشنهاد شد که درمان TCM می تواند به درمان سرطان کمک کند. از این گروه، 115 بیمار از TCM استفاده می کردند در حالی که 614 بیمار از TCM استفاده نمی کردند. تجزیه و تحلیل چند متغیره نشان داد که در مقایسه با غیرکاربران، استفاده از TCM با کاهش قابل توجهی خطر مرگ و میر ناشی از همه علل همراه بود (13). تمام یافته های ذکر شده نشان داد که TCM یک داروی مکمل و جایگزین مهم است که می تواند در درمان سرطان استفاده شود.

موش با آسیب حاد ریه (16،17). همچنین ECH(اکیناکوزید)نشان داده شده است که اثرات محافظتی بر بافت عصبی و بهبود اختلالات رفتاری در مدل های موش بیماری پارکینسون دارد (18). قابل ذکر است، مشخص شده است که ECH تکثیر سلولی را تقویت می کند و آپوپتوز را در سلول های اپیتلیال MODE-K روده موش مهار می کند (19). با این حال، تاکنون توجه کمتری به نقش بالقوه ECH در پیشگیری از سرطان شده است.

در این مطالعه، بررسی شد که آیا درمان ECH بر رشد و تکثیر سلول های تومور تأثیر می گذارد و آیا ECH(اکیناکوزید)آپوپتوز را القا می کند، تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS) را افزایش می دهد و پتانسیل غشای میتوکندری (MMP) را کاهش می دهد، و در نتیجه رشد سلول های تومور را سرکوب می کند. علاوه بر این، مطالعه حاضر با هدف شناسایی مکانیسم‌های مولکولی مسئول مهار رشد سلولی با واسطه ECH انجام شد.

مواد و مواد و روش ها

سلول خط، معرف، و آنتی بادی هاسلول‌های آدنوکارسینوم پانکراس SW199 (ATCC، Manassas، VA، ایالات متحده آمریکا) در محیط Eagle اصلاح‌شده Dulbecco حاوی 10 درصد سرم جنین گاو، 50 U/ml پنی‌سیلین و 0.1 mg/ml استرپتومایسین در دمای 37 درجه سانتی‌گراد کشت داده شدند. اتمسفر مرطوب شده 5 درصد CO2. ECH(اکیناکوزید)از Jrdun Biotechnology Corp. (شانگهای، چین) خریداری شد. آنتی بادی علیه AKT، P-AKT، ERK، P-ERK، JNK، p-JNK، P38، p-P38، و GAPDH از سلول سیگنالینگ فناوری (Danvers، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. anti-Bax و anti-Bcl-2 از Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) خریداری شد. و ضد کاسپاز{10}} از Abcam (شانگهای، چین) خریداری شد.

سلول زنده بودنسنجش برای ارزیابی سرعت رشد سلول های تومور، کیت شمارش سلولی (CCK-8؛ Dojindo Molecular Technologies، Rockville، MD، ایالات متحده آمریکا) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. سوسپانسیون های سلولی در 5،{3}} سلول در هر چاهک با تیمار ECH به مدت 0، 12، 24، 48 یا 72 ساعت در صفحات کشت {9}}چاه کاشته شدند. مهار رشد سلولی با افزودن معرف WST از کیت CCK-8 با غلظت نهایی 10 درصد به هر چاهک تعیین شد و جذب نمونه‌ها در طول موج 450 نانومتر با استفاده از میکروپلیت‌خوان اندازه‌گیری شد (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

هوخست 33342 رنگآمیزی.سلول ها (60 درصد تلاقی) با Hoechst 33342 (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime، هایمن، چین) در غلظت نهایی 1 تیمار شدند.µگرم در میلی لیتر، در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انکوبه شد، دو بار با سالین بافر فسفات شسته شد، در پارافورمالدئید 4 درصد به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شد و بر روی اسلایدها نصب شد. تغییرات مورفولوژیکی هسته های سلولی در زیر میکروسکوپ فلورسانس (Olympus BX51، Melville، NY، ایالات متحده آمریکا) مشاهده شد. هسته های نرمال گرد و به رنگ آبی روشن رنگ آمیزی شده بودند، در حالی که هسته های آپوپتوز منقبض شده و به رنگ آبی روشن رنگ آمیزی شدند.

فلورسانس فعال شده است سلول مرتب سازی (FACS) تجزیه و تحلیلبرای ارزیابی آپوپتوز، کیت تشخیص آپوپتوز فلورسئین ایزوتیوسیانات (FITC)-Annexin V (BD Biosciences، شانگهای، چین) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، 5×1{4}}4 سلول با PBS سرد شسته شد، در بافر اتصال 0.1 میلی‌لیتری (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) مجدداً معلق شد و با 10 میلی‌لیتر Annexin V کونژوگه با FITC (10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) و 10 رنگ‌آمیزی شد. میلی لیتر پروپیدیوم یدید (PI) (50 mg/ml). پس از انکوباسیون به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی و افزودن 400 میلی لیتر بافر اتصال، سلول ها توسط فلوسایتومتر (C6؛ BD Biosciences، شانگهای، چین) آنالیز شدند.

اندازه گیری از واکنش پذیر اکسیژن گونه ها (ROS).برای ارزیابی تولید ROS، از کیت سنجش گونه های اکسیژن واکنش پذیر (بیوتکنولوژی قوی، پکن، چین) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، سلول‌ها (80 درصد تلاقی) جمع‌آوری شدند و قبل از رنگ‌آمیزی با محلول دی هیدرواتیدیوم (DHE) با PBS شسته شدند (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime). سپس سلول ها با آنالیز فلوسایتومتری آنالیز شدند.

اندازه گیری از میتوکندری غشاء پتانسیل (MMP).

کیت سنجش متیل استر تترمتیل رودامین (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies، Bloomington، MN، USA) برای تشخیص تغییرات در MMP استفاده شد. به طور خلاصه، سلول ها (80 درصد تلاقی) برداشت، با PBS شسته و با TMRM به مدت 15 تا 20 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد رنگ آمیزی شدند. سپس سلول ها یک بار با PBS شسته و تحت آنالیز فلوسایتومتری قرار گرفتند.

ایمونوبلاتتجزیه و تحلیل سلول‌ها (8{10}} درصد تلاقی) برداشت و در بافر RIPA (Jrdun Biotechnology) متشکل از 50 میلی‌مولار Tris-HCl، pH 7.4 لیز شدند. 150 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار EDTA، 1 درصد NP-40، 1 درصد اسید دئوکسی کولیک سدیم و 0.1 درصد SDS و مهارکننده‌های پروتئازوم تازه اضافه شده. همانطور که قبلاً توضیح داده شد، مقادیر مساوی از لیز سلولی شفاف برای آنالیز ایمونوبلات استفاده شد (20).

آماری تحلیل و بررسی.داده های کمی به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان می شوند. تفاوت‌های آماری با استفاده از آزمون t-paired Student با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS 15 بررسی شد.{2}}. پ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

نتایج

ECH (اکیناکوزید)سرکوب می کند تومور سلولرشد اگرچه گزارش شده است که ECH(اکیناکوزید)نقش محافظتی را با مهار آپوپتوز و سیگنال‌های التهابی در سلول‌های سوماتیک، مانند سلول‌های اپیتلیال عصبی و روده (16-19) نشان می‌دهد، هنوز مشخص نیست که آیا ECH رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی را کنترل می‌کند یا خیر. برای آزمایش این، یک سنجش بقای سلولی با درمان سلول‌های SW1990، مشتق‌شده از آدنوکارسینوم پانکراس درجه II، با دوزهای تیتر شده ECH همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، انجام شد. به‌ویژه، نشان داده شد که ECH به طور قابل‌توجهی تکثیر سلول‌های تومور را در یک دوز به تاخیر می‌اندازد. به روشی وابسته در طول یک دوره فرهنگ 5-روزه (شکل 1).ECH باعث می شودآپوپتوز از آنجایی که از دست دادن آپوپتوز یکی از مکانیسم های اصلی تکثیر کنترل نشده سلول های سرطانی پانکراس است (21)، مطالعه حاضر مجموعه ای از آزمایشات را برای تعیین اینکه آیا ECH باعث آپوپتوز می شود انجام داد. ابتدا، با رنگ آمیزی هسته سلول های تومور با Hoechst 33342، نشان داده شد که ECH به روشی وابسته به دوز منجر به آپوپتوز می شود (شکل 2A). علاوه بر این، تجزیه و تحلیل FACS با استفاده از رنگ آمیزی Annexin V/PI برای تایید بیشتر اثر آپوپتوز ty ECH انجام شد (شکل 2B). میانگین درصد سلول های آپوپتوز در شرایط کشت نرمال 1.1 درصد بود، در حالی که این درصد به طور قابل توجهی در پاسخ به درمان ECH به روش وابسته به دوز به 10.6، 21.4 و 51.3 درصد افزایش یافت (شکل 2C). این نتایج، همراه با سنجش زنده ماندن سلولی نشان داده شده در شکل 1، نشان می دهد که درمان ECH با تحریک آپوپتوز، تکثیر سلول های تومور را سرکوب می کند.

در این مطالعه برای ارزیابی تولید ROS از تولید اتیدیوم که با DNA ترکیب می‌شود، استفاده شد. مشخص شد که مانند سایر داروهای ضد سرطان، ECH همچنین تولید ROS را به روشی وابسته به دوز تحریک می کند، همانطور که با افزایش شدت فلورسانس در درمان ECH نشان داده شده است (شکل 3).

ECH (اکیناکوزید)کاهش می دهد MMP.نشان داده شده است که اختلال عملکرد میتوکندری در القای آپوپتوز نقش دارد. نشان داده شده است که باز شدن منافذ انتقال نفوذپذیری میتوکندری باعث دپلاریزاسیون پتانسیل گذر غشایی و آزادسازی فاکتورهای پرو آپوپتوز می شود (23). بنابراین، آزمایش شد که آیا ECH می‌تواند با انجام یک سنجش TMRM، که یک روش کاملاً ثابت است، از دست دادن MMP در سلول‌های تومور را القا کند، زیرا شدت فلورسانس TMRM متناسب با پتانسیل غشاء است. نشان داده شد که درمان ECH به طور قابل توجهی MMP را به روشی وابسته به دوز کاهش می دهد (شکل 4).ECH کنترل ها تومور سلول رشد از طریق پروتئین فعال شده با میتوژناساس مولکولی مرگ سلولی تومور با واسطه ECH، فعالیت چندین مسیر سیگنالینگ حیاتی، مانند MAPK و AKT (24،25)، که بقای سلولی و مرگ را کنترل می کنند، مورد بررسی قرار گرفت. MAPK ها از نظر تکاملی، پروتئین کینازهای Ser/Thr هدایت شده با پرولین هستند، از جمله کینازهای تنظیم شده با سیگنال خارج سلولی (ERKs)، C-Jun NH2-کیناز پایانی (JNKs) و اعضای خانواده p38 که از طریق سه فعال می شوند. آبشارهای سیگنالینگ کیناز ردیف (26،27). در این مطالعه، بیان MAPKs و AKT، و همچنین اشکال فسفریله فعال شده آنها، مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص شد که ECH به طور قابل توجهی فعالیت JNK و ERK1/2 را سرکوب می کند، اما فعالیت p38 را افزایش می دهد (شکل 5). قابل توجه، نشان داده شد که فعالیت AKT، که برای تکثیر سلولی نیز بسیار مهم است، تحت تأثیر درمان ECH قرار نمی گیرد (شکل 5). علاوه بر این، نشان داده شد که درمان ECH بیان Bax و کاسپاز{16}} را افزایش می‌دهد در حالی که بیان Bcl{17}} را کاهش می‌دهد (شکل 5)، که مطابق با شکل 2 است. بنابراین، نتایج نشان می‌دهد که ECH از طریق مسیر MAPK باعث آپوپتوز سلول تومور می شود.

بحث

تا جایی که ما می دانیم، این اولین مطالعه ای است که نشان می دهد ECH با تحریک آپوپتوز (شکل 2)، ترویج تولید ROS (شکل 3) و القای دپلاریزاسیون بالقوه غشای میتوکندری (شکل 4) عملکرد سرکوب کننده تومور دارد (شکل 4). ، در نتیجه منجر به مهار رشد سلول های تومور می شود (شکل 1). علاوه بر این، پایه مولکولی مرگ سلولی تومور با واسطه ECH با تنظیم مسیرهای سیگنالینگ MAPK نشان داده شد (شکل 5). این یافته‌ها عملکرد جدیدی از ECH را در جلوگیری از تومورزایی نشان می‌دهند و بنابراین پیشنهاد می‌کنند که ممکن است یک عامل کاندید برای درمان سرطان باشد.

اکثر داروهای ضد سرطان می توانند آپوپتوز سلول تومور، پیری و/یا توقف چرخه سلولی را القا کنند که منجر به مهار رشد و تکثیر سلول های تومور می شود. توقف چرخه سلولی یک پاسخ سلولی به سیگنال های استرس خفیف است که به سلول ها اجازه می دهد تا DNA آسیب دیده را قبل از شروع سنتز DNA همانندسازی یا میتوز ترمیم کنند، در حالی که آپوپتوز و پیری (ایست چرخه سلولی دائمی) در پاسخ به سیگنال های استرسی رخ می دهد که سلول های غیرقابل ترمیم یا بدخیم را از بین می برد. 28،29). بنابراین، تنها اثر آپوپتوز ECH بر سلول‌های تومور در این مطالعه بررسی شد، زیرا کشتن سلول‌های سرطانی معیار اصلی برای ارزیابی قدرت یک عامل ضد سرطانی است. قابل توجه، نشان داده شد که ECH باعث القای بیان می شودباکس(شکل 5)، یک ژن پرو آپوپتوز، که به صورت رونویسی توسط سرکوبگر تومور p53 فعال می شود (30). بنابراین، آزمایش اینکه آیا ECH می تواند مسیر سیگنالینگ p53 را فعال کند، ارزشمند است. در این صورت، ECH ممکن است قادر به توقف چرخه سلولی وابسته، پیری، آپوپتوز یا اتوفاژی p53- باشد. در این مطالعه، عملکرد سرکوب کننده تومور ECH در رده سلولی آدنوکارسینوم پانکراس SW1990 مشخص شد. با این حال، مطالعات بیشتری برای مشاهده خطوط سلولی سرطان پانکراس بیشتر مورد نیاز است. نشان داده شده است که جهش در پروتئین انکوژنیک RAS و سرکوبگر تومور p53 با ایجاد سرطان پانکراس مرتبط است (31). با این حال، طبق پایگاه داده p53 IARC (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx)، رده سلولی SW1990 دارای جهش p53 نیست. از این رو، بررسی اینکه آیا ECH می‌تواند بر رشد و تکثیر سایر رده‌های سلولی سرطان پانکراس با جهش‌های مختلف p53 تأثیر بگذارد یا خیر، مهم است. علاوه بر این، تعیین اینکه آیا ECH قادر به ترویج آپوپتوز و مهار رشد انواع دیگر تومورها است یا خیر، جالب خواهد بود.

نشان داده شده است که افزایش ROS و کاهش MMP، که توسط درمان ECH ایجاد شده‌اند، در القای آپوپتوز ضروری هستند (22). علاوه بر این، مشخص شده است که ROS می تواند اکسیداسیون منافذ میتوکندریایی را القا کند که به آزادسازی سیتوکروم کمک می کند.cیک واسطه در آپوپتوز، به دلیل اختلال در MMP (22). بنابراین، باید مشخص شود که آیا ECH MMP را به طور غیر مستقیم از طریق القای ROS مختل می کند یا خیر. علاوه بر این، استرس اکسیداتیو ناشی از ROS نیز در تعدیل سیگنال‌های کنترل کننده رشد سلولی، از جمله p53، NF-kB، HIFs و PI3K نقش دارد (32). باید مشخص شود که آیا و اگر چنین است، چگونه ECH این مسیرهای سیگنالینگ مهم را تنظیم می کند. شایان ذکر است، استرس اکسیداتیو به دلیل مصرف زیاد اکسیژن، سیستم های آنتی اکسیدانی ضعیف و ویژگی های تمایز انتهایی سیستم عصبی مرکزی باعث بیماری های تخریب کننده عصبی مختلف می شود (33). با این حال، چندین مطالعه نشان داده است که ECH دارای اثرات محافظتی و ضد آپوپتوز بر روی بافت عصبی است. در این رابطه، منطقی است که فرض کنیم ECH ممکن است تولید ROS را در سلول‌های عصبی تمایز یافته با ترمینال کاهش دهد. بنابراین، همچنین باید مشخص شود که آیا تنظیم تولید ROS توسط ECH به وضعیت تمایز سلولی بستگی دارد یا خیر. از این رو، نتایج حاضر همراه با سایر مطالعات نشان می‌دهد که ECH، TCM پرکاربرد، می‌تواند یک استراتژی شیمی‌درمانی مهم نه تنها برای درمان بیماری‌های نورودژنراتیو بلکه برای سرطان‌های بدخیم باشد.

اخیراً استفاده از TCM در درمان سرطان به طور فزاینده ای مورد توجه قرار گرفته است. پتانسیل محصولات طبیعی از گیاهان دارویی مورد استفاده در TCM توسط جامعه علمی حتی در جهان غرب شناخته شده است (9). تلاش‌هایی برای روشن کردن مکانیسم‌های عمل این محصولات طبیعی مورد نیاز است، که ممکن است در نهایت منجر به توسعه داروهای کارآمد و ایمن برای درمان سرطان شود.

در نتیجه، مطالعه حاضر عملکرد مهاری تومور ECH را نشان داد و همچنین اساس مولکولی سرکوب تومور با واسطه ECH را توضیح داد، بنابراین کاربرد بالقوه بالینی ECH در درمان سرطان را پیشنهاد می‌کند.

قدردانی ها

این مطالعه توسط برنامه کلیدی تحقیقات علمی FMU (گرنت شماره 09ZD014) تامین و حمایت شد. نویسندگان مایلند از Biomedworld (شانگهای، چین) برای کمک در ویرایش دست‌نوشته تشکر کنند.

منابع

1. Hanahan D و Weinberg RA: نشانه های سرطان: نسل بعدی. سلول 144: 646-674، 2011.

2. Alderton GK: رونویسی: اثرات رونویسی MYC. Nat Rev Cancer 14: 513، 2014.

3. Zindy F، Eischen CM، Randle DH، Kamijo T، Cleveland JL، Sherr CJ و Roussel MF: سیگنال‌دهی Myc از طریق سرکوبگر تومور ARF، آپوپتوز وابسته و جاودانه‌سازی p{{1} را تنظیم می‌کند. Genes Dev 12: 2424-2433، 1998.

4. Sachdeva M، Zhu S، Wu F، Wu H، Walia V، Kumar S، Elble R، Watabe K و Mo YY: p53 c-Myc را از طریق القای سرکوبگر تومور miR سرکوب می‌کند-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212، 2009.

5. Liao JM، Cao B، Zhou X و Lu H: بینش جدید در مورد عملکرد p53 از طریق microRNAهای هدف آن. J Mol Cell Biol 6: 206-213، 2014.

6. Zamble DB و Lippard SJ: سیس پلاتین و ترمیم DNA در شیمی درمانی سرطان. Trends Biochem Sci 20: 435-439، 1995.

7. Kleeff J، Kornmann M، Sawhney H و Korc M: اکتینومایسین D باعث القای آپوپتوز و مهار رشد سلول های سرطانی پانکراس می شود. Int J Cancer 86: 399-407، 2000.

8. Tacar O، Sriamornsak P و Dass CR: Doxorubicin: به روز رسانی در مورد عملکرد مولکولی ضد سرطان، سمیت و سیستم های دارورسانی جدید. جی فارم فارماکول 65: 157-170، 2013.

9. Efferth T، Li PC، Konkimalla VS و Kaina B: از طب سنتی چینی تا درمان منطقی سرطان. Trends Mol Med 13: 353-361، 2007.