بخش Ⅱ: جداسازی هدایت‌شده با بازیابی دی‌گلیکوزیدهای جدید جایگزین‌شده با فنیل پروپانوئید از سیستانش سالسا و فعالیت بازدارنده آنها بر تولید NO در ماکروفاژها

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

بازگشت به قسمت Ⅰ

یک 3-گروه متیل بوتنیل، یک زیرساخت آگلیکون، توسط همبستگی COZY H-2 با H-1a و H-1b و همبستگی HMBC بین H{{ 4}} و H-5 و کربنهای اولفینی، در kC 120.7 (C-2) ​​و 136.4 (C-3). دو بخش قند با تجزیه و تحلیل طیف NMR و تجزیه و تحلیل طیف HPLC از هیدرولیز اسید، با الگوی قطعه MS ایجاد شد. پیکربندی مطلق آنها D-گلوکز و L-rhamnose با استفاده از تجزیه و تحلیل HPLC از هیدرولیز اسید تعیین شد [17]. این بخش‌های قند با جفت کردن ثابت‌های پروتون‌های آنومری به‌عنوان یک گلوکز و یک رامنوز تعریف شدند. طیف 1H{18}}H COZY همبستگی های متوالی از H{19}} به H{20}} و از H-133 به H-633 را نشان داد (شکل 4).

یک پروتون گلوکز کاهش یافته در kH 4.70 (H-43) یک جایگزین آسیل بر روی گلوکز پیشنهاد کرد. از طیف HMBC، همبستگی بین H{4}} و C{5}} موقعیت جایگزین کافئویل را تأیید کرد. همبستگی HMBC بین H-13 و C-1 (kC 64.5) و بین H{10}} (kH 3.68) و C{13}} (kC 101.2) موقعیت های هر جایگزین را پیشنهاد می کند. . بر این اساس، ساختار 6 به عنوان 3-متیل بوتنیل-O{19}}L-rhamnopyranosyl-(1→3){24}}}O-(E)-کافئویل- -D- تعیین شد. گلوکز-پیرانوزید و سیستانسالساید B نامیده می شود.

Cistansalside C (12)، یک پودر آمورف قهوه‌ای، دارای فرمول مولکولی C26H38O13 توسط (+)-HR-ESI-QTOF-MS تعیین شد که اوج خود را در m/z 581.2213 [M به علاوه Na] به علاوه (محاسبه) نشان داد. برای C26H38O13Na، 581.2205). یک یون مشخصه در m/z 163 نشان داد که یک جایگزین کافئویل در ساختار وجود دارد. یون های قطعه در m/z 325 و m/z 471 وجود یک واحد رامنوز و یک واحد گلوکز را پیشنهاد کردند.

مقایسه طیف NMR 12 با طیف 6 نشان داد که آنها به جز ساختار آگلیکون مشابه هستند. در طیف NMR 12، دو کربن پارافینی در kC 38.0 (C-2) و 24.4 (C-3) ​​به جای دو کربن اولفینی در kC 12 مشاهده شد{16 }}.7 (C-2) و 136.4 (C-3) در آگلیکون 6. گروه های متیل ژرمینال (kH 0.88) در آگلیکون 12 به سمت بالا منتقل شدند. نسبت به H{19}} و H{20}} (kH 1.71 و 1.63) در آگلیکون 6 (جدول 2). آگلیکون 12 به عنوان یک گروه متیل بوتیل 3- پیشنهاد شد که توسط طیف‌های 1H و COZY NMR تأیید شد. پیک های گروه 3-متیل بوتیل در 3.81 (1H، m، H{34}}a)، 3.48 (1H، m، H{38}}b)، 1.71 (1H، m مشاهده شد. ، H-3)، 1.44 (2H، m، H-2)، و 0.88 (H-4، 5).

دو بخش قند با تجزیه و تحلیل HPLC هیدرولیز اسید و تجزیه و تحلیل طیف NMR و همچنین الگوی قطعه MS مجدداً تأیید شدند. پیکربندی مطلق قندها به عنوان D-گلوکز و L-rhamnose با استفاده از تجزیه و تحلیل HPLC هیدرولیز اسید [17] شناسایی شد. یک نیمه گلوکز و یک نیمه رامنوز با جفت شدن ثابت های پروتون های آنومری تایید شدند. طیف 1H-1H COZY همبستگی های متوالی از H-13 به H-53، از H-133 به H{10}}، و از H{11} را نشان داد. } تا H{12}} (شکل 4).

موقعیت جانشین ها با استفاده از آنالیز HMBC تایید شد. در طیف HMBC، همبستگی بین H-13 و C-1 (kC 67.2)، بین H-33 (kH 3.68) و C-133 (kC 101.2) و بین H{10}} (kH 4.70) و C{13}} (kC 165.7) شناسایی شدند. در نتیجه، ساختار 12 به عنوان 3-متیل بوتیل-OaL-رامنوپیرانوسیل-(1→3){25}}O-(E)-کافئویل- -D-گلوکز-پیرانوزید و به نام سیستانسالاید سی.

سیستانسالساید D (17)، یک پودر قهوه ای آمورف، با فرمول مولکولی C31H38O14 توسط حالت مثبت با وضوح بالا ESI-QTOF-MS تعیین شد که پیک یون اضافی را در m/z 657.2147 [M به علاوه Na] به علاوه نشان داد. (برای C31H38O14Na، 657.2154 محاسبه می شود). یون های قطعه شامل [M به علاوه H x آگلیکون x Rha x استیل Glc] به علاوه یون در m/z 147، یک [M به علاوه H x آگلیکون x Rha] به علاوه یون در m/z 351 و یک [M به علاوه H x Aglycone] به علاوه یون در m/z 497 نیز شناسایی شد. یک یون مشخصه در m/z 147 نشان داد که یک جایگزین کوماروئیل در ساختار آن وجود دارد. یون های قطعه در m/z 351 و m/z 497 وجود یک واحد رامنوز و یک واحد گلوکز جایگزین شده با استیل را پیشنهاد کردند.

سیستانسالساید ازگیاه سیستانچ

طیف 13C-NMR حضور 31 اتم کربن را نشان داد. دو پروتون آنومری در kH 4.61 (1H، m، H-13) و 4.60 (1H، s، H{{1{0}}) در طیف 1H و HSQC مشاهده شد. . طیف 1H-NMR حضور یک گروه متیل را در 1.97 (3H، s، استیل-CH3)، یک ترانس الفین در kH 7.55 (1H, d، J=15}.9 هرتز، H{{ ​​نشان داد. 25}}) و 6.34 (1H، d، J=15.9 هرتز، H-8333) و دو حلقه بنزن پارا جایگزین شده در kH 7.53 (2H، d، J=6). 9 هرتز، H-3333، 5333) و 6.79 (2H، d، J=6.9 Hz، H-2333، 6333)/ kH 6.98 (2H، d، J {{5 0}}.0 هرتز، H-2، 6) و 6.65 (2H، d، J=8.0 هرتز، H-3، 5) (جدول 2) . از طیف HMBC NMR، همبستگی بین کربن کربونیل در kc 165.5 (C-9333) و H-8333 و بین H-2333، 6333، و C-7333 (kc) 145.4) یک گروه (E)-coumaroyl را پیشنهاد کرد. همبستگی HMBC بین پیک پروتون متیل و کربن کربونیل در kc 169.0 وجود یک گروه استیل را تایید کرد.

یک 4-گروه هیدروکسی فنیل بر اساس همبستگی HMBC بین H-3، 5 و کربن‌های آروماتیک چهارتایی در kC 155.6 (C-4) و 128.6 (C-1) ​​پیشنهاد شد. . یک گروه اتیل هیدروکسیله توسط سیگنال‌های COZY NMR در kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7)، 3.90 (1H, m, H{18}}a) تأیید شد. ) و 3.54 (1H، m، H{22}}b). همبستگی HMBC بین H-7 و C-1 (kC 128.6) و C{27}}، 6 (kC 129.7) یک گروه 4-هیدروکسی فنیل اتیل را به عنوان یک زیرساخت آگلیکون پیشنهاد کرد.

دو بخش قند، پیشنهاد شده از الگوی قطعه MS، توسط تجزیه و تحلیل HPLC از هیدرولیز اسید و طیف NMR تایید شد. D-گلوکز و L-rhamnose با استفاده از تجزیه و تحلیل HPLC هیدرولیز اسید [17] مشخص شدند. یک نیمه گلوکز و یک نیمه رامنوز با جفت شدن ثابت های پروتون های آنومری ایجاد شد. طیف 1H-1H COZY همبستگی های متوالی از H-13 به H-53 و از H-133 به H{10}} را نشان داد (شکل 4).

از طیف 1H-NMR، تغییر میدان پایین H-23 (kH 4.69) و H{5}} (kH 4.80) موقعیت جایگزین شده با آسیل را روی گلوکز پیشنهاد می‌کند. ارتباط بین گلوکز و دو گروه آسیل با همبستگی HMBC بین H{9}} (kH 4.80) و C{12}} و بین H{13}} و کربن کربونیل یک گروه استیل (kC 169.0) تأیید شد. ). موقعیت یک آگلیکون و رامنوز با همبستگی HMBC بین H{16}} (kH 3.95) و C{19}} و بین H{20}} و C{21}} داده شد. بر این اساس، ساختار 17 به عنوان 4-هیدروکسی فنیل اتیل-2-O-acetyl-O- -}L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- اختصاص داده شد. کومارویل{35}D-گلوکوپیرانوزید و سیستانسالید D نامیده می شود.

سیستانسالاید E (18) به صورت پودر قهوه ای آمورف جداسازی شد. فرمول مولکولی آن توسط داده‌های 13C-NMR و حالت مثبت با وضوح بالا ESI-QTOF-MS در m/z 657.2166 [M به علاوه Na] پلاس (محاسبه برای C31H38O14Na، 657.2154) C31H38O14 تعیین شد. علاوه بر این، یون های قطعه شامل یک یون کافئویل در m/z 163، یک [M به علاوه H x Aglycone x Rha] به علاوه یون در m/z 367 و یک یون [M به علاوه H x Aglycone] در m/z 513 نیز شناسایی شدند. یون های قطعه وجود یک واحد رامنوز و یک واحد گلوکز جایگزین شده با استیل را پیشنهاد کردند.

طیف 1H-NMR وجود دو پروتون آنومریک را در kH 4.63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) و 4.60 (1H, s, H{11}}) پیشنهاد کرد. ) و دو پروتون گلوکز جایگزین شده با آسیل در kH 4.71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H-23) و 4.81 (1H, dd, J=9.7) ، 9.5 هرتز، H-43). طیف 1H و HMBC وجود یک گروه استیل را در kH 1.94 (3H, s, acetyl-CH3) و یک قسمت (E)-caffeoyl در kH 7.48 (1H, d, J=15}.9Hz) پیشنهاد کردند. H{41}})، 7.02 (1H، d، J=1.6 هرتز، H-2333)، 6.98 (1H، dd، J=8.1، 1.6 Hz، H{55}})، 6.76 (1H,d، J=8.1 Hz، H{-5333) و 6.21 (1H, d، J {= 15}.9 Hz، H{ {67}}) و یک حلقه بنزن تک جایگزین در kH 7.29 (2H, m, H-3, 5), 7.21 (2H, m, H-2, 6) و 7.20 (1H, m، H-4) (جدول 2). یک گروه فنیل متیل، یک زیرساخت آگلیکون، توسط همبستگی HMBC بین H{84}} (2H, kH 2.80، m) و C{88}} (kC 138.8) و بین H-7 و C پیشنهاد شد. -2, 6 (kC 128.9) and the COZY NMR signals of H{96}} with H{97}}a (1H, kH 3.99, m) and H{101}}b (1H, kH 3.63، متر).

دو بخش قند با تجزیه و تحلیل HPLC از هیدرولیز اسید و تجزیه و تحلیل طیف NMR دوباره تایید شد. پیکربندی مطلق قندها با استفاده از آنالیز HPLC هیدرولیز اسیدی مشخص شد که تایید شد D-گلوکز و L-rhamnose هستند [17]. یک نیمه گلوکز و یک نصفه -رامنوز با جفت شدن ثابت های پروتون های آنومری ایجاد شد. طیف 1H-1H COZY همبستگی های متوالی از H-13 به H-53، از H-133 به H{10}}، و از H{11} را نشان داد. } تا H{12}} (شکل 4).

از طیف HMBC، همبستگی بین H{{0}} و C-8 (kC 69.4)، بین H-23 و کربن کربونیل یک گروه استیل (kC 169.1)، بین H{7}} (kH 3.95) و C{10}} (kC 102.0) و بین H{13}} (kH 4.81) و C{16}} (kC 165.6) موقعیت جایگزین‌ها را در ساختار. بنابراین، ساختار 18 مشخص شد که فنیل اتیل-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3){29}}O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranoside و به نام سیستانسالساید E.

بسیاری از جایگزین های ترانس سیناموئیل به ایزوفرم سیس در شرایط آزمایشگاهی ایزومریزه شدند. گزارش شده است که نور مشتقات اسید ترانس سینامیک را به ایزوفرم های سیس تبدیل می کند [18،19]. تعادل تبدیل trans-cis جایگزین‌های سیناموئیل برای حفظ تقریباً 70 درصد از ایزوله‌ها در ایزوفرم ترانس مشاهده شد. برای پروتون‌های الفین شکل cis، تقریباً در ppm 6.90 (d, J=12~13 Hz, H-7333) و ppm 5.80 (d, J=12~13 Hz) می‌رسد. H{18}}) در طیف‌های 1H-NMR قابل تخصیص بود، در حالی که پیک‌ها در حدود 7.55 ppm (d, J=15.8 Hz, H-7333) و 6.40 ppm (d, J { {28}}.8 هرتز، H{30}}) برای تبدیل [20] مشاهده شد. در طیف 1H-NMR مخلوط‌های ترانس سیس، پیک برای دو پروتون اولفینی (H{35}} و H{36}}) در نسبت 7:3 (trans:cis) مشاهده شد. قله های 13C-NMR از فرم کشورهای مستقل مشترک المنافع شبیه به کسانی که از تبدیل بود.

ترکیبات موثر سیستانچ: اکتئوزیدها

تمام جدایه ها برای اثرات بازدارندگی آنها بر تولید NO القا شده با LPS در RAW مورد آزمایش قرار گرفتند.

تمام جدایه ها برای اثرات بازدارندگی آنها بر تولید NO القا شده با LPS در سلول های RAW 264.7 مورد آزمایش قرار گرفتند. دگزامتازون به عنوان کنترل مثبت استفاده شد و IC50 آن 7.{18}} uM بود. از ترکیبات آزمایش شده، ترکیبات 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM)، 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM)، 13 (IC50 40).{{2{{{ 24}}}} o 4.0 uM) و 18 (IC50 27.9 o 0.8 uM) فعالیت های بازدارنده متوسطی را روی NO سنتاز القایی نشان دادند، در حالی که سایر ترکیبات در این سنجش غیرفعال بودند (IC50) مقادیر > 100 میکرومولار). برای بررسی اینکه آیا این ترکیبات دارای سمیت سلولی هستند، زنده ماندن سلول با استفاده از روش MTT اندازه‌گیری شد. در نتیجه، هیچ یک از آنها سمیت سلولی قابل توجهی را نشان ندادند (شکل تکمیلی S{28}}). این چهار ترکیب برای ارزیابی فعالیت مهاری آنها در برابر مسیر NF-λB ​​در سلول‌های RAW 264.7 تحریک‌شده با LPS انتخاب شدند. تحریک سلول‌های RAW 264.7 با LPS باعث فسفوریلاسیون I入B و NF-入B (p65) پس از 0.5 ساعت انکوباسیون شد. فسفوریلاسیون NF-入 B (p65) به طور قابل توجهی با پیش تیمار با ترکیبات 11، 13 و 18 کاهش یافت، همانطور که توسط تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داده شده است (شکل 5). بنابراین، ترکیبات 11، 13 و 18 ممکن است از طریق مهار NF-入B در ماکروفاژها، اثرات ضد التهابی داشته باشند.

شکل 5.اثر چهار ترکیب بر فسفوریلاسیون I入B و NF-入B (p65) در سلول های RAW 264.7 تحریک شده با LPS. (الف) وسترن بلات در LPS و سلول های RAW 264.7 تیمار شده با نمونه انجام شد. (B, C) سیگنال‌های ایمونوبلات با استفاده از نرم‌افزار مولکولی آنالیز/دانسیتومتری PC (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) اندازه‌گیری شدند. تجزیه و تحلیل تراکم سنجی ایزوفرم های فسفریله گزارش شده است. NF- 入 B در سلول RAW 264.7 به محتوای -اکتین نرمال شد.

3. مواد و مواد و روش ها

3.1. آزمایش عمومی روش

چرخش های نوری با یک قطب سنج دیجیتال Jasco P{0} (جاسکو، توکیو، ژاپن) اندازه گیری شد. طیف UV بر روی یک طیف سنج Chirascan به علاوه دایره رنگی (Chirascan، APL، UK) ثبت شد. طیف IR با استفاده از اسپکتروفتومتر Jasco FT/IR{1}} ثبت شد. طیف سنجی جرمی چهار قطبی یونیزاسیون الکترواسپری با وضوح بالا در زمان پرواز (HR-ESI-qTOF-MS) بر روی Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS مجهز به سری Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc.) انجام شد. ، پالو آلتو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)، و ستون مورد استفاده یک ستون Jasco SFCpak Crest C18T{14}} بود (id 150 4.6 mm, 5 um). برای جمع آوری داده ها از نرم افزار MassHunter Workstation استفاده شد.

طیف NMR 1 بعدی (1H و 13C) و 2 بعدی (1H-1H COSY، HSQC، HMBC، NOESY) با Jeol LA 300 (Jeol، توکیو، ژاپن)، Bruker AVANCE-400، Bruker به دست آمد. طیف‌سنج‌های AVANCE-500، Bruker AVANCE-600 و Bruker AVANCE 800 HD همراه با یک کاوشگر سرمایی (بروکر، اتلینگن، آلمان). DMSO-d6 (آزمایشگاه های ایزوتوپ کمبریج، در سیستانش آندوور، MA، ایالات متحده آمریکا) به عنوان حلال NMR و پیک های مرجع (kH 2.50 و kC 39.5) استفاده شد. کروماتوگرافی ستونی (CC) با استفاده از Sephadex LH{17}} (25-100 um; Pharmacia، Uppsala، سوئد) یا Kieselgel 60 سیلیکاژل (40-63 um, 230-400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt) انجام شد. ، آلمان). کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) بر روی صفحات کیزلژل 60 سیلیکا ژل F254 از پیش روکش شده انجام شد (مرتک 5715؛ مرک). نقاط روی TLC با استفاده از یک لامپ UV در 254 نانومتر و 365 نانومتر شناسایی شدند (VL{33}}.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, France). کروماتوگرافی مایع با فشار متوسط ​​(MPLC) بر روی یک ستون فلاش سیلیکا 120 گرمی RediSep (Isco، لینکلن، NE، ایالات متحده آمریکا) و سیلیکاژل Kiesegel 60 (40-63 um, 230-400 mesh, Art. 9385; Merck) با استفاده از یک همراه Combiflash (ایسکو). سیستم کروماتوگرافی مایع پرفشار (HPLC) یک دستگاه HPLC گیلسون مجهز به پمپ Gilson 321 و آشکارساز UV.VIS 151 (گیلسون، میدلتون، WI، ایالات متحده آمریکا)، با استفاده از ستون‌های ODS نیمه آماده‌سازی (Luna 5 um C18 (2) بود. 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA؛ Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf1 C11, Germany; Å، شناسه 250: 10 میلی‌متر، 5 م.، شرکت یانگ جین بیوکروم، سئونگنام، کره). سیستم تحلیلی RP-HPLC یک سیستم اتحاد Waters 2695 با آشکارساز 996 Photodiode Array (PDA) بود (Waters Corp, Milford, MA, USA) و ستون مورد استفاده یک ستون Hypersil™ BDS C18 (A130، شناسه 150: 4.6) بود. mm، 5 um، Thermo Scientic™). اسید فرمیک از Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (سئول، کره) خریداری شد. حلالهای درجه HPLC از Fisher Scientic Korea Ltd. (سئول، کره) خریداری شدند. حلال های H2SO4، Na2CO3 و درجه یک برای استخراج، تفکیک و جداسازی از شرکت Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (سئول، کره) خریداری شد. L- و D-سیستئین متیل استر هیدروکلراید و o-tolylisothiocyanate از صنایع شیمیایی توکیو (توکیو، ژاپن) خریداری شد.

3.2. گیاه مواد

کل گیاهان ازسالسا سیستانچکه از اویغور شینجانگ جمع آوری شد، از طریق شرکت عمده فروشی داروسازی Daerim (چئونگجو، کره) وارد شد. آنها توسط پروفسور دکتر جیهیون لی (دانشگاه دونگ گوک، سئول، کره) شناسایی شدند. نمونه کوپن (SNUPH2016-03) در هرباریوم باغ گیاهان دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه ملی سئول سپرده شد.

3.3. استخراج و انزوا

گیاهان کامل خشک شده ازسالسا سیستانچ(5.7 کیلوگرم) خرد شده و سه بار با MeOH (2{16}} L) در دمای اتاق با فراصوت به مدت 99 دقیقه استخراج شد. پس از حذف حلال در خلاء، عصاره خام (35/1 کیلوگرم) در H2O (5 لیتر) معلق شد، سپس با EtOAc (5 لیتر) تقسیم شد. باقیمانده EtOAc (55.3 گرم) به 16 بخش (E{12}}) در کروماتوگرافی ژل سیلیکا با شستشو با CHCl3/MeOH (50:1-0:1، سیستم گرادیان گام) جدا شد.

E{8}}8 (611.7 میلی‌گرم) تحت کروماتوگرافی مایع با فشار متوسط ​​سیلیکاژل (25 گرم) قرار گرفت و با CHCl3/MeOH (18:1–0:1، سیستم گرادیان مرحله‌ای) و شسته شد. 11 کسر داد (E{19}}8a-k). از E08g، ترکیبات 13 (0.7 میلی‌گرم) و 18 (0.6 میلی‌گرم) با استفاده از یک ستون Luna 5 um HPLC و شستشوی ایزوکراتیک با 28 درصد آب خالص شدند. MeCN. خالص سازی HPLC (Hypersil GOLD، 25 درصد آب. MeCN) E08h (138.5 میلی گرم) ترکیبات 7 (10.6 میلی گرم)، 8 (17.2 میلی گرم)، 14 (13.4 میلی گرم) و 17 (4.9 میلی گرم) را فراهم کرد.

E{8}}9 (1.15 گرم) بیشتر روی یک ستون سیلیکا-MPLC (2{24}} گرم) با شستشوی CHCl3/MeOH (10:1-0:1، مرحله-1) خالص شد. سیستم گرادیان) برای به دست آوردن 11 بخش فرعی (E09a-k). E09e (398.7 میلی‌گرم) در معرض سفادکس LH{17}} (MeOH) قرار گرفت و هشت زیرکسری (E09e{19}}) به دست آورد. E09e6 متعاقباً با استفاده از ستون Hypersil GOLD HPLC (22 درصد آب. MeCN) برای تهیه ترکیب 11 (0.4 میلی گرم) خالص شد. از E09e7، ترکیب 5 (0.6 میلی‌گرم) با شستشوی ایزوکراتیک از یک ستون HPLC Luna 5 um با 40 درصد آب خالص شد. MeOH.

E1 0 (1.20 گرم) به نه بخش (E10ai) در ستون Sephadex LH-20 شسته شده با MeOH جدا شد. از E1{31}} گرم (147.5 میلی گرم)، ترکیبات 4 (13.4 میلی گرم)، 9 (8.0 میلی گرم) و 15 (5.0 میلی گرم) با جداسازی HPLC (Inno، 23 درصد آب. MeCN) جدا شد. فراکسیون E10h (470.0 میلی گرم) بر روی ستون Hypersil GOLD با شستشوی ایزوکراتیک (40 درصد آبی، MeOH) خالص شد تا ترکیبات 1 (3.8 میلی گرم)، 10 (42.1 میلی گرم) و 16 (3.0 میلی گرم) به دست آید.

E11 (2.96 گرم) در معرض سفادکس LH{3}} شسته شده با MeOH قرار گرفت تا 9 فراکسیون (E11a-i) بدست آورد. E11e توسط کارتریج Sep-Pak C18 با شستشوی مرحله ای با 10 درصد، 20 درصد، 30 درصد، 50 درصد و 100 درصد آب جدا شد. MeOH برای تولید هفت فراکسیون (E11e{15}})، و به دنبال آن Luna 5 um HPLC (28 درصد آب. MeCN) برای ایجاد ترکیبات 3 (3.4 میلی گرم)، 6 (1.4 میلی گرم) و 12 (1.2 میلی گرم).

E12 (19.{2}} گرم) با استفاده از یک سیستم گرادیان گام به گام CHCl3/MeOH در معرض MPLC سیلیکا (12{8}} گرم) قرار گرفت تا شش کسر (18:1-0:1) بدست آورد. ، E12a-f). E12f بر روی یک ستون Sephadex LH{13}} (MeOH) کروماتوگرافی شد و هفت بخش (E12f1-7) را بدست آورد. تصفیه HPLC (Hypersil GOLD، 25 درصد آب. MeCN) از E12f7 ترکیب 2 (3.3 میلی گرم). تمام حلال های مورد استفاده برای HPLC 0.05 درصد بافر اسید فرمیک بود. سرعت جریان معمول برای کروماتوگرافی HPLC و MPLC به ترتیب 3 و 40 میلی لیتر در دقیقه بود.

3.4. شخصیت پردازی

Cistansalside A (5): پودر آمورف قهوه ای؛ [ |20 x33.7 (c 0.1، MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3.18); IR (تمیز) vmax 3359، 1748، 1705، 1602، 1516 cmx1. داده های 1H-NMR (800 مگاهرتز) و 13C-NMR (200 مگاهرتز)، جدول 2 را ببینید. HRMS (ESI-TOF) m/z [M به علاوه Na] به اضافه 645.2146 (محاسبه شده برای C30H38O14Na، 645.2154).

Cistansalside B (6): پودر آمورف قهوه ای؛ [ |20 x72.9 (c 0.1، MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3.32); IR (تمیز) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; داده های 1H-NMR (500 مگاهرتز) و 13C-NMR (125 مگاهرتز)، جدول 2 را ببینید. HRMS (ESI-TOF) m/z [M به علاوه Na] به اضافه 579.2054 (محاسبه شده برای C26H36O13Na، 579.2048).

Cistansalside C (12): پودر آمورف قهوه ای؛ [ |20 x61.6 (c 0.1، MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3.25); IR (تمیز) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; داده های 1H-NMR (800 مگاهرتز) و 13C-NMR (200 مگاهرتز)، جدول 2 را ببینید. HRMS (ESI-TOF) m/z [M به علاوه Na] به اضافه 581.2213 (محاسبه شده برای C26H38O13Na، 581.2205).

Cistansalside D (17): پودر آمورف قهوه ای. [ |20 x51.1 (c 0.1، MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3.53)، 315 (3.52); IR (تمیز) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; داده های 1H-NMR (400 مگاهرتز) و 13C-NMR (75 مگاهرتز)، جدول 2 را ببینید. HRMS (ESI-TOF) m/z [M به علاوه Na] به اضافه 657.2147 (محاسبه شده برای C31H38O14Na، 657.2154).

Cistansalside E (18): پودر آمورف قهوه ای؛ [ |20 x59.2 (c 0.1، MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3.22); IR (تمیز) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; داده های 1H-NMR (800 مگاهرتز) و 13C-NMR (200 مگاهرتز)، جدول 2 را ببینید. HRMS (ESI-TOF) m/z [M به اضافه Na] به اضافه 657.2166 (محاسبه شده برای C31H38O14Na، 657.2154)

3.5.HPLC-QTOF-MS تحلیل و بررسی

تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی جرمی کروماتوگرافی بر روی یک سیستم LC سری Infinity 126{8}} (Agilent Technologies, Inc., USA) انجام شد. ستون تحلیلی یک ستون SFCpak Crest C18T-5 بود (id 15{{10}} : 4.6 mm, 5 um, Jasco, Japan). فاز متحرک شامل 0.1 درصد (v/v) اسید فرمیک در MeCN (A) و آب (B) با استفاده از شستشوی گرادیان 0-35 دقیقه (23 درصد A)، 35-45 دقیقه ( 23-28 درصد A)، 45-75 دقیقه (28 درصد A) و 75-80 دقیقه (90 درصد A). سرعت جریان در 0.3 میلی لیتر در دقیقه نگه داشته شد. جذب در طول موج 320 نانومتر اندازه گیری شد. شرایط منبع ESI به شرح زیر بود: نرخ جریان گاز خشک کردن (N2)، 10 لیتر در دقیقه. دمای گاز خشک کردن، 350 درجه؛ نبولایزر 30 psig; نرخ جریان گاز غلاف، 12.0 لیتر در دقیقه. دمای گاز غلاف 350 درجه ; مویرگی، 4000 ولت; کفگیر، 60 ولت; هشت قطبی RF، 750 ولت؛ ولتاژ قطعه قطعه، 180 ولت؛ حالت مثبت این سیستم تحت نرم افزار ایستگاه کاری Masshunter کار می کرد. محدوده جرم در m/z 50-1000 تنظیم شد.

3.6. اسید هیدرولیز

ترکیبات با استفاده از 1 N H2SO4 (1{14}}0 uL) که با حمام آب در دمای 9{32}} درجه به مدت 2 ساعت گرم شد، هیدرولیز شدند، سپس با محلول آبی اشباع Na2CO3 خنثی شدند. پس از خشک شدن محلول ها تحت جریان N2، محصولات و قندهای استاندارد (D-Glc، L-Glc، L-Rha) در پیریدین (100 uL) حاوی L-cysteine ​​متیل استر هیدروکلراید (0.5 میلی گرم) حل شدند. یک نمونه L-رامنوز در پیریدین (100 میکرولیتر) حاوی دی سیستئین متیل استر هیدروکلراید (0.5 میلی گرم) حل شد. سپس به مدت 1 ساعت در دمای 60 درجه حرارت داده شدند. محلول ها با 1 uL (1.11 میلی گرم) o-tolylisothiocyanate تیمار شدند که دوباره در دمای 60 درجه به مدت 1 ساعت حرارت داده شدند. هر مخلوط نهایی مستقیماً توسط RP-HPLC تحلیلی (ستون Hypersil™ BDS C18، 17 درصد آب. MeCN، 0.8 میلی لیتر در دقیقه، 40 دقیقه، 35 درجه) آنالیز شد. tR از اوج در 21.9 و 40.4 دقیقه با مشتق تیوکاربامویل تیازولیدین از D-گلوکز و L-رامنوز، همزمان بود.

3.7. سلول فرهنگ

ماکروفاژهای موش، RAW 264.7، از مؤسسه تحقیقاتی علوم زیستی و بیوتکنولوژی کره (Daejeon، کره) به دست آمدند و در محیط کشت RPMI حاوی 10 درصد سرم جنین گاو و 100 واحد بر میلی لیتر پنی سیلین/سولفات استرپتومایسین رشد کردند. سلول ها در اتمسفر 5 درصد CO2 مرطوب شده در دمای 37 درجه انکوبه شدند.

3.8. داروها و مواد شیمیایی

RPMI، پنی سیلین و استرپتومایسین از HyClone (Logan، UT، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. آلبومین سرم گاوی و LPS از سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد.

3.9. اندازه گیری تولید NO

غلظت نیتریت در محیط کشت به عنوان شاخص تولید NO با توجه به واکنش گریس اندازه گیری شد. سلول ها در 2: 105 سلول در چاهک در 96-صفحه های کشت چاه کاشته شدند. پس از انکوباسیون سلول‌های RAW 264.7 به مدت 18 ساعت، سلول‌ها با ترکیبات (5{20}} میکرومولار، 10 میکرومولار، 5 میکرومولار یا 1 میکرومولار) پیش تیمار شدند و با LPS (500 نانوگرم در میلی‌لیتر) به مدت 24 تحریک شدند. ساعت ترکیبات آزمایشی حل شده در DMSO. سلول ها نیز با 0.05 درصد DMSO به عنوان کنترل وسیله نقلیه تحت درمان قرار گرفتند. سلول‌های RAW 264.7 (2: 105 سلول/چاه) در صفحات چاهک با استفاده از RPMI بدون فنل قرمز کشت داده شدند و با نمونه‌ها به مدت 0.5 ساعت از قبل تیمار شدند. تولید NO سلولی با افزودن 500 نانوگرم در میلی لیتر LPS غلظت نهایی و انکوباسیون 24 ساعته القا شد. پس از انکوباسیون، 100 میکرولیتر محیط مطبوع با همان حجم معرف گریس مخلوط شد و به مدت 15 دقیقه انکوبه شد. جذب مخلوط در طول موج 540 نانومتر با دستگاه میکروپلیت خوان الایزا (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) اندازه گیری شد. مقادیر به‌دست‌آمده با غلظت‌های استاندارد نیتریت سدیم محلول در RPMI مقایسه شد و غلظت نیتریت در محیط‌های شرطی‌شده سلول‌های تیمار شده با نمونه محاسبه شد.

10-3

سلول‌ها در صفحات چاهک با تراکم 5: 104 سلول در چاهک کاشته شدند و در حضور نمونه‌ها با محیط‌های بدون سرم انکوبه شدند. ترکیبات آزمایشی حل شده در DMSO. سلول ها نیز با 0.05 درصد DMSO به عنوان کنترل وسیله نقلیه تحت درمان قرار گرفتند. پس از انکوباسیون به مدت 24 ساعت، 10 uL MTT (5 میلی گرم در میلی لیتر در سالین) اضافه شد و انکوباسیون برای 4 ساعت دیگر ادامه یافت. سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری در سلول های زنده، MTT را در طی انکوباسیون به کریستال های فرمازان قابل مشاهده تبدیل می کند. سپس بلورهای فورمازان در دی متیل سولفوکسید حل شدند و جذب در طول موج 540 نانومتر با استفاده از دستگاه میکروپلیت خوان سنجش ایمنی متصل به آنزیم (ELISA) (Benchmark، Bio-Rad Laboratories) اندازه گیری شد. زنده ماندن نسبی سلول در مقایسه با جذب گروه کنترل درمان نشده محاسبه شد. همه آزمایشات در سه تکرار انجام شد.

3.11. تجزیه و تحلیل ایمونوبلات

بیان پروتئین با وسترن بلات مطابق روش های استاندارد ارزیابی شد. به طور خلاصه، سلول‌های RAW264.7 در ظروف کشت 6{{2{41}}}} میلی‌متری (2: 106/mL) کشت داده شدند و سپس 50 میکرومولار ترکیبات را پیش تیمار کردند. . سلول ها دو بار در PBS سرد یخ (pH 7.4) شسته شدند، گلوله های سلولی به مدت 15 دقیقه در بافر لیز روی یخ معلق شدند و بقایای سلولی سپس با سانتریفیوژ خارج شدند. غلظت پروتئین با استفاده از معرف سنجش پروتئین Bio-Rad بر اساس دستورالعمل سازنده تعیین شد. پروتئین (20-30 میکروگرم) 1:1 با بافر نمونه 2: (20 درصد گلیسرول، 4 درصد SDS، 10 درصد) مخلوط شد 2- ME، 0.05 درصد بروموفنول آبی، و 1.25 مولار Tris [pH 6.8]، بر روی ژل های SDS-PAGE 8 یا 15 درصد بارگذاری شده و در 150 ولت به مدت 90 دقیقه اجرا می شود. پروتئین های سلولی با استفاده از سیستم انتقال نیمه خشک Bio-Rad بر روی غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید Immunoblot (Bio-Rad) بر اساس دستورالعمل سازنده منتقل شدند. سپس غشاها در طول شب با آنتی‌بادی‌های اولیه p-NF-入B، NF-入B، pI入B و -اکتین (Abcam، Cambridge، UK) در سالین بافر Tris حاوی 5 درصد شیر بدون چربی و 0.1 درصد Tween انکوبه شدند. 20. روز بعد، بلات ها سه بار با تریس بافر سالین (0.1 درصد توئین 20) شسته شدند و به مدت 1 ساعت با آنتی بادی ضد IgG ثانویه کونژوگه HRP (رقیق شده 1:2000-1) انکوبه شدند. : 20000). لکه‌ها مجدداً سه بار با سالین بافر Tris (0.1 درصد Tween 20) شسته شدند و باندهای واکنش‌گر ایمنی با استفاده از بستر نورتابی شیمیایی ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) ایجاد شدند.

3.12.تحلیل آماری

داده های تجربی به عنوان میانگین o SEM ارائه می شوند. سطح معنی داری آماری با استفاده از آنالیز واریانس (ANOVA) و سپس آزمون t دانت برای مقایسه های چندگانه تعیین شد. p مقادیر کمتر از 05/0 0 معنی دار در نظر گرفته شد.

عصاره سیستانچ سالسا

4. نتیجه گیری

در این مطالعه، ما ساختارهای پنج گلیکوزید جدید جایگزین شده با فنیل پروپانوئید، به نام‌های سیستانسالساید AE (5، 6، 12، 17، و 18) را جداسازی و روشن کردیم، علاوه بر جداسازی و شناسایی 13 ترکیب شناخته شده، با استفاده از استراتژی حذف تکثیر. ترکیبات شناخته شده لیپدوزید AI (1) [21]، 23-استیللاکتئوزید (2) [22]، ایزوسیستانوزید C (3) [15]، اسمانتوزید B (4) [21]، اپی مریدینوزید A ( 7) [15]، سیستانوزید D (8) [23]، سالساید B (9) [6]، توبولوزید E (10) [16]، سیستانوزید M (11) [15]، ایزومارتینوزید (13) [24]، سالساید C (14) [6]، جیونوساید C (15) [25] و سالساید F (16) [6]. ساختار آنها از طریق تجزیه و تحلیل داده های طیف سنجی گسترده و با مقایسه با داده های گزارش شده در ادبیات ایجاد شد. تایید شد که ساختارهای آزمایشی پیش بینی شده گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید به درستی با ساختارهای واقعی آنها مطابقت دارند.

فواید عصاره سیستانچ سالسا

منابع

1. شیمامورا، اچ. میازاوا، م. انوموتو، ک. ناکامورا، S.-I. Kameoka، H. سرکوب فعالیت القای SOS Trp-P-1 توسط اسیدهای چرب از Cistanche salsa در آزمون Umu Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002. نات. تولید Lett. 1997، 10، 261-265. [CrossRef]

2. جئون، ای. چانگ، ک.-اس. آن، اچ.-جی. اثرات ضد تکثیر Cistanches salsa بر پیشرفت هیپرپلازی خوش خیم پروستات. می توان. جی. فیزیول. داروسازی 2016، 94، 104-111. [CrossRef] [PubMed]

3.Xu، C.; جیا، ایکس. خو، آر. وانگ، ی. ژو، Q. Sun, S. Rapid Discrimination of Herba Cistanches با اثرانگشت ماکرو مادون قرمز چند مرحله ای همراه با مدل سازی مستقل نرم از قیاس کلاس (SIMCA). اسپکتروشیم. Acta Part A Mol. بیومول. SpectrosCistanche2013، 114، 421-431. [CrossRef] [PubMed]

4. جیانگ، ی. لی، اس پی; وانگ، YT; چن، XJ; تمایز Tu، PF سیستانچ های هربا با اثر انگشت با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا - تشخیص آرایه دیود - طیف سنجی جرمی. J. کروماتوگر. 2009، 1216، 2156-2162. [CrossRef] [PubMed]

5. کوبایاشی، ح. کاراساوا، اچ. میاسه، تی. فوکوشیما، S. مطالعات بر روی اجزای تشکیل دهنده سیستانچیس هربا. V. جداسازی و ساختار دو گلیکوزید فنیل پروپانوئید جدید، سیستانوزیدهای E و F. Chem. فارم. گاو نر 1985، 33، 1452-1457. [CrossRef]

6. لی، ال. جیانگ، ی. لیو، X.-M. تو، پ.-ف. وو، ال.-جی. چن، F.-K. گلیکوزیدهای جدید از سیستانچ سالسا. Helv. چیم. Acta 2007, 90, 79-85. [CrossRef]

7. Kartbaeva، EB; ساکیپووا، ز.بی. ایبراگیمووا، LN; کپسالیاموا، EN; Ternynko، II مطالعه ترکیبی ترکیبات فنلی Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck، در حال رشد در جمهوری قزاقستان. جی. شیمی. فارم. Res. 2015، 7، 120-122.

8. لیو، J.-Y. Guo، Z.-G. زنگ، ز.-ال. بهبود تجمع گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید با تغذیه پیش ساز به کشت سوسپانسیون سالسا Cistanche. بیوشیمی. مهندس J. 2007, 33, 88-93. [CrossRef]

9. مارویاما، س. آکاساکا، تی. یامادا، ک. عصاره سالسا Tachibana، H. Cistanche به طور مشابه به پروتئین متصل می شود

پلی ساکارید-K (PSK) بر روی انواع مختلف رده های سلولی. جی. سنت. پزشکی 2008، 25، 166-169.

10. تیان، X.-F. Pu، X.-P. گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از Cistanches salsa، آپوپتوز ناشی از یون 1-متیل-4-فنیل پیریدینیم در نورون ها را مهار می کنند. J. Ethnopharmacol. 2005، 97، 59-63. [CrossRef] [PubMed]

11. میشل، تی. هالابالکی، م. Skaltsounis، AL مفاهیم جدید، رویکردهای تجربی، و استراتژی های حذف برای کشف فیتواستروژن های جدید از منابع طبیعی. Planta Med. 2013، 79، 514-532. [CrossRef] [PubMed]

12. دی مدیروس، LS; Abreu، LM; نیلسن، ا. اینگمار، اچ. لارسن، TO; نیلسن، KF; Rodrigues-Filho، E. جداسازی با هدایت حذف دپسیدهای تافلاوین ST و lecanora DF از قارچ اندوفیت Setophoma sp. فیتوشیمی 2015، 111، 154-162. [CrossRef] [PubMed]

13. Rakotondraibe، LH; Rasolomampianina، R. پارک، H.-Y.; لی، جی. اسلبودنیک، سی. برودی، پی جی. Blasiak، LC; هیل، آر. تن دایک، ک. شن، ی. و همکاران ترکیبات ضد تکثیر و آنتی پلاسمودیال از گونه های انتخابی استرپتومایسس. Bioorg. پزشکی شیمی. Lett. 2015، 25، 5646-5649. [CrossRef] [PubMed]

14. جیانگ، ی. لیو، اف.-جی. وانگ، ی.-م. لی، اچ.-جی. جداسازی ساپونین های تری ترپنوئیدی محافظ کبدی جدید از سلوزیا با استفاده از کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا همراه با طیف سنجی جرمی چهار قطبی-زمان پرواز پشت سر هم یونیزاسیون الکترواسپری. جی. فارم. بیومد. مقعدی 2017، 132، 148-155. [CrossRef] [PubMed]

15.ژانگ، جی. لی، سی. چه، ی. وو، جی. وانگ، ز. کای، دبلیو. لی، ی. ما، ز. Tu, P. استراتژی مبتنی بر LTQ-Orbitrap برای طب سنتی چینی با هدف کشف طبقاتی، شناسایی و تحقیقات اومیکس: مطالعه موردی روی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید در سه گونه مختلف از هربا سیستانچ. RSC Adv. 2015، 5، 80816–80828. [CrossRef]

16. یوشیزاوا، ف. دیاما، ت. تاکیزاوا، ن. عثمانقانی، ک. احمد، م. اجزای تشکیل دهنده Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. جداسازی و ساختارهای یک گلیکوزید فنیل اتانوئید جدید و یک گلیکوزید نئولینان جدید. شیمی. فارم. گاو نر 1990، 38، 1927-1930. [CrossRef]

17. تاناکا، ت. ناکاشیما، تی. اوئدا، تی. تومی، ک. Kouno، I. تشخیص آسان انانتیومرهای آلدوز توسط HPLCistancheChem فاز معکوس. فارم. گاو نر 2007، 55، 899-901. [CrossRef] [PubMed]

18. Wong، WS; گوا، دی. وانگ، XL; یین، ZQ؛ شیا، بی. Li، N. مطالعه سیس-سینامیک اسید در Arabidopsis thaliana. فیزیول گیاهی بیوشیمی. 2005، 43، 929-937. [CrossRef] [PubMed]

19.Kahnt، G. ترانس سیس-تعادل هیدروکسی سینامیک اسیدها در طول تابش محلول های آبی در pH های مختلف. Phytochemistry 1967، 6، 755-758. [CrossRef]