جداسازی و تخلیص گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی از گیاه سیستانش دسرتیکولا با کروماتوگرافی جریان مخالف با سرعت بالا

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

لی آ، ب، رونگ تسائو بی،*، ریموند یانگ بی، چونمینگ لیو آ، جی. کریستوفر یانگ ب، هونگهوی ژو ب

خلاصه

پنج گلیکوزید فنیل اتانوئید (PhGs)، اکیناکوزید، سیستانوزید A، اکتئوزید، ایزواکتئوزید و 20-استیلاکتئوزید، جدا و خالص شدند.Cistanche deserticolaبرای اولین بار توسط کروماتوگرافی ضد جریان با سرعت بالا (HSCCC) با استفاده از دو سیستم دو فازی، یکی شامل اتیل استات-اتانول-آب (5:{4}}.5:4.5، v/v/v) و دیگری از اتیل استات-n-بوتانول-اتانول-آب ({{1{12}}}}.5:0.5:0.1:1، v/v/v/v). در مجموع 28.5 میلی‌گرم اکیناکوزید، 18.4 میلی‌گرم سیستانوزید A، 14.6 میلی‌گرم اکتئوزید، 30.1 میلی‌گرم ایزواکتئوزید و 25.2 میلی‌گرم 20-استیلاکتئوزید از 1412 میلی‌گرم عصاره ان-بوتانولا، هرکدام از ان-بوتانولا خالص‌سازی شد. با خلوص بیش از 92.5 درصد که توسط HPLC تعیین می شود. ساختارها با زمان ماند، UV، LC-ESI-MS در حالت یون منفی شناسایی شدند و با آزمایش NMR تأیید شدند. الگوی تکه تکه شدن مشخصه LC-ESI-MSn از پنج ترکیب مورد بحث قرار گرفته است و به عنوان یک ابزار بسیار خاص و مفید برای شناسایی ساختاری PhGs از این گیاه دارویی مهم شناخته شده است.

کلید واژه ها:Cistanche deserticola; فنیل اتانوئید؛ اکیناکوزید؛ سیستانوزید A; اکتئوزید؛ ایزواکتئوزید؛ 20-استیلاکتئوزید؛ HSCCC; LC-ESI-MS؛ NMR

1. مقدمه

Cistanche deserticola YC Maیک داروی گیاهی چینی شناخته شده است و به طور گسترده در آماده سازی های سنتی مشابه مواد غذایی کاربردی یا مکمل های غذایی امروزی استفاده می شود (ونگ، لی، چنگ و چن، 2006). ترکیبات فعال زیستی اصلی در C. deserticola، گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی (PhGs)، از جمله اکیناکوزید، آکتئوزید، ایزواکتئوزید، 20-استیلاکتئوزید و سیستانوزید A هستند (Kobayashi, Karasawa, & Miyase, 1984; Kobaya, 1984, al.7,). PhGها به طور گسترده در قلمرو گیاهی توزیع شده اند و به دلیل عملکردهای مختلف بیولوژیکی آنها مانند محافظت از کبد (Xiong et al., 1998)، فعالیت ضد التهابی، ضد درد (Schapoval et al., 1998) و فعالیت های آنتی اکسیدانی مورد مطالعه قرار گرفته اند. چنگ، وی، گو، نی، و لیو، 2005؛ او، لاو، زو، لی، و اما، 2000؛ لی، وانگ، و وانگ، 1997؛ لی، وانگ، ژنگ، لیو، و جیا، 1993؛ وانگ، جیانگ، وو، و وانگ، 2001؛ شیونگ، کادوتا، تانی، و نامبا، 1996)، بهبود عملکرد جنسی (زی و وو، 1993؛ زونگ، او، وو، و چن، 1996)، و اثر آرام بخش (لو، 1998) ).

با توجه به فعالیت‌های زیستی مهم بالا، مقادیر زیادی از ترکیبات خالص به‌عنوان استانداردهای مرجع و برای مطالعات مختلف in vitro و in vivo مربوط به استفاده از داروهای سنتی چینی ضروری است. بنابراین، روش‌های مؤثر برای جداسازی، خالص‌سازی و خصوصیات ساختاری PhGها ضروری است. با این حال، چنین کاری معمولاً نیاز به استفاده از مراحل کروماتوگرافی متعدد برای تمیز کردن و جداسازی نمونه دارد (گروس، لاهلوب، آنکلین، شولتن و استیچر، 1988؛ نیشیمورا، ساساکی، ایناگاکی، چین، و میتسوهاشی، 1991؛ راون، نیشیبه ، ساساهارا، و لی، 1990؛ شویاما، ماتسوموتو و نیشیکا، 1987)، که معمولاً به نرخ بازیابی پایین به دلیل جذب غیرقابل برگشت PhGs روی تکیه گاه جامد در طول جداسازی منجر می شود (لی و همکاران، 2001). در مقابل، کروماتوگرافی ضد جریان با سرعت بالا (HSCCC) به یک جایگزین موثر برای تکنیک های کروماتوگرافی مرسوم برای جداسازی برخی PhGs از عصاره های گیاهی تبدیل شده است (لی و همکاران، 2001؛ لی و همکاران، 2005). لی و همکاران اکتئوزید و 20-استیلاکتئوزید را با موفقیت از هم جدا کردسیستانچ سالسا(CA Mey.) G. Beck با استفاده از HSCCC (Lei et al., 2001). نویسندگان این مقاله قبلاً جداسازی اکتئوزید و ایزواکتئوزید از Plantago psyllium L. توسط HSCCC را گزارش کرده اند (Li et al., 2005). با این حال، هیچ گزارشی در مورد جداسازی و تصفیه چند PhG از C. deserticola با استفاده از HSCCC منتشر نشده است. به دلیل فقدان استانداردها، روش‌های LC-MS توسعه یافته و به‌عنوان یک ابزار تحلیلی قدرتمند برای شناسایی و شناسایی سریع برخی از PhGها در عصاره گیاهی استفاده شده‌اند (لی و همکاران، 2005؛ وانگ و همکاران، 2000).

در این مقاله، یک روش HSCCC توسعه یافته برای تهیه اکیناکوزید، سیستانوزید A، اکتئوزید، ایزواکتئوزید و 20-استیلاکتئوزید از C. deserticola را گزارش می‌کنیم. خصوصیات و تجزیه و تحلیل پنج PhG جدا شده با استفاده از LC همراه با طیف‌سنجی جرمی ESI درون خطی و آزمایش‌های NMR انجام شد. زمان ماند، وزن مولکولی و یون های قطعه مشخصه پنج PhG در این مقاله ارائه و مورد بحث قرار گرفته است. ساختار پنج PhG شناسایی شده در این تحقیق در شکل 1 نشان داده شده است.

ترکیبات موثر سیستانچ دسرتیکولا

2. تجربی

2.1. مواد شیمیایی و معرف ها

Acteoside از Sigma-Aldrich (Oak-Ville، ON)، echinacoside از ChromaDex (سانتا آنا، CA) خریداری شد. ایزواکتئوزید از P. psyllium L. جدا شد (لی و همکاران، 2005). C. deserticola از فروشگاه دارویی پکن TongRenTang (چین) خریداری شد. همه حلال ها از درجه HPLC بودند و از Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown, ON) خریداری شده بودند.

2.2. آماده سازی نمونه

C. deserticola (20 گرم) پنج بار در دمای اتاق به مدت 12 ساعت با 100 میلی لیتر اتانول آبی 80 درصد استخراج شد. هر بار که مخلوط استخراج از طریق کاغذ فیلتر Whatman شماره 1 (Whatman International Ltd., Maidstone, England) فیلتر می شد. فیلتر ترکیبی به 100 میلی لیتر در خلاء در دمای <40 درجه="" تغلیظ="" شد.="" محلول="" آبی="" حاصل="" دو="" بار،="" هر="" کدام="" با="" 100="" میلی="" لیتر="" هگزان،="" چربی="" زدایی="" شد="" و="" سپس="" به="" صورت="" متوالی="" به="" مدت="" 5="" بار،="" هر="" کدام="" با="" 100="" میلی="" لیتر="" n-بوتانول="" استخراج="" شد.="" لایه="" های="" n-بوتانول="" با="" هم="" ترکیب="" شده="" و="" در="" خلاء="" در="" دمای=""><40 درجه="" تا="" خشک="" شدن="" تغلیظ="" شدند="" که="" 2.2="" گرم="" عصاره="" n-بوتانول="" به="" دست="" آمد.="" عصاره="" در="" -20="" درجه="" قبل="" از="" جداسازی="" hsccc="" ذخیره="">

2.3. روش جداسازی HSCCC

HSCCC مقدماتی در کروماتوگرافی با جریان متضاد با سرعت بالا مدل CCC{{0}} (Pharma-Tech Research، بالتیمور، مریلند ایالات متحده آمریکا) انجام شد. این دستگاه دارای سه کویل آماده سازی بود که به صورت سری (حجم کل، 325 میلی لیتر) به هم متصل شده بودند. سرعت چرخش دستگاه را می توان بین 0 تا 2000 دور در دقیقه تنظیم کرد. سیستم HSCCC مجهز به یک پمپ HPLC (Pharma-Tech Research، بالتیمور، مریلند، ایالات متحده آمریکا)، یک آشکارساز UV مدل 450 (Alltech، ایالات متحده)، یک ضبط کننده تخت تخت مدل L 120 E (Linseis Inc.، Princeton Jct، ایالات متحده آمریکا)، یک جمع کننده کسری (Advantec MFS Inc.، ایالات متحده آمریکا) و یک شیر تزریق نمونه با یک حلقه نمونه 10-mL.

مخلوطی از اتیل استات-اتانول-آب (5:0.5:4.5، v/v/v) به شدت در یک قیف جداکننده تکان داده شد و اجازه داد در دمای اتاق بماند و جدا شود. این دو فاز پس از رسیدن به تعادل در HSCCC مورد استفاده قرار گرفتند. کل ستون سیم پیچ شده ابتدا با لایه بالایی که به عنوان فاز ثابت عمل می کند پر شد. لایه زیرین (فاز متحرک) سپس با سرعت جریان 1.5 میلی لیتر در دقیقه به انتهای ستون پمپ شد. سرعت چرخش روی 1050 دور در دقیقه تنظیم شد. یک نمونه (هر بار حدود 230 میلی گرم) حل شده در 8 میلی لیتر از مخلوط اتیل استات-اتانول-آب (5:0.5:4.5، v/v/v) پس از رسیدن سیستم به هیدرودینامیک در شیر تزریق بارگذاری شد. تعادل این سیستم حلال دوفازی بر اساس ضریب تقسیم (K) انتخاب شد که برای آکتئوزید، ایزواکتئوزید و 20 استیلاکتئوزید به ترتیب 0.87، 1.11 و 1.32 بود. مقدار K نسبت غلظت در لایه های بالایی و پایینی همان ترکیب است که توسط HPLC تعیین می شود (شکل 2). پساب خروجی ستون به طور مداوم توسط یک آشکارساز UV در طول موج 254 نانومتر کنترل می‌شد و در لوله‌های آزمایش با یک کلکتور کسری که در 4 دقیقه برای هر لوله تنظیم شده بود جمع‌آوری شد.

2.4. شرایط LC

نمونه‌بردار خودکار استاتیک و آشکارساز آرایه فتودیود (DAD) برای تجزیه و تحلیل PhGs در عصاره N-بوتانولی C. deserticola و بخش‌های جمع‌آوری‌شده از جداسازی HSCCC استفاده شد. جداسازی در یک ستون Phenomenex ODS-C18 (250 × 4.6 میلی متر، 5 lm) با یک ستون محافظ C18 انجام شد. فاز متحرک دوتایی شامل استونیتریل (حلال A) و آب حاوی 2 درصد اسید استیک (حلال B) بود. تمام حلال ها از طریق a فیلتر شدند

{{0}}.45 lm فیلتر قبل از استفاده. سرعت جریان در 1.{6}} میلی‌لیتر در دقیقه برای کل زمان اجرای 25 دقیقه ثابت نگه داشته شد. سیستم با یک برنامه گرادیان اجرا شد: 0–20 دقیقه: 90 درصد B تا 60 درصد B; 20-22 دقیقه: 60 درصد B تا 0 درصد B. و 22-25 دقیقه، 0 درصد B تا 90 درصد B. حجم تزریق نمونه 10 لیتر بود. پیک های مورد نظر در طول موج 320 نانومتر توسط آشکارساز DAD بررسی شدند.

2.5. آزمایشات LC-ESI-MS

آزمایش‌های LC-MS با استفاده از طیف‌سنج جرمی تله یونی Finnigan LCQ DECA (Thermo Finnigan، San Jose، CA، USA) مجهز به منبع یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) انجام شد. نمونه ها در شرایط کروماتوگرافی یکسان آنالیز شدند. برای جمع آوری داده ها از مدل منفی استفاده شد. دبی گاز غلاف و جریان کمکی به ترتیب 96 و 7 (واحد دلخواه) تعیین شد. ولتاژ مویرگی روی 29 ولت تنظیم شد و دمای آن در 350 درجه کنترل شد. ولتاژ لنز ورودی روی 40 ولت و دامنه RF چند قطبی روی 540 ولت تنظیم شد. ولتاژ سوزن ESI در 4.5 کیلو ولت کنترل شد. آفست لنز لوله 16 ولت، عدسی چند قطبی 1 8.20 ولت و عدسی چند قطبی 2 10.5 ولت بود. ولتاژ ضرب الکترون برای تشخیص یون روی 980 ولت تنظیم شد.

2.6. NMR برای شناسایی

طیف‌های NMR روی طیف‌سنج Bruker Avance{0}} (Bruker BioSpin Ltd., Milton, Canada) ثبت شد. فقط ترکیبات 2 و 5 (هیچ استانداردی در دسترس نیست) تحت آزمایش NMR قرار گرفتند. نمونه ها در CD3OD حل شدند.

ترکیبات فعال سیستانچ: اکیناکوزید و اکتئوزید

3. نتایج و بحث

یک جداسازی موفقیت آمیز HSCCC تا حد زیادی به یک سیستم حلال دو فازی مناسب بستگی دارد که ضریب تقسیم ایده آل (K) در حدود 1 را برای ترکیب مورد نظر فراهم می کند. چنین سیستم دو فازی همچنین باید زمان ته نشینی نسبتاً کوتاهی داشته باشد (چن، گیمز، و جونز، 2003؛ فوکو و شوولوت، 1998؛ اوکا، اوکا، و ایتو، 1991). در آزمایش خود، ما چهار سری از سیستم های حلال را با توجه به حلالیت ترکیبات هدف در C. deserticola انتخاب کردیم. برای اندازه گیری غلظت در هر فاز از HPLC استفاده شد که از آن مقادیر K ترکیبات هدف محاسبه شد. دو سیستم، اتیل استات - n - بوتانول - اتانول - آب (4:0.6:0.6:5، v/v/v/v) و اتیل استات آب (1:1، v/v)، قبلا در HSCCC برای جداسازی اکتئوزید و 20-استیلاکتئوزید از

C. salsa، و اکتئوزید و ایزواکتئوزید از P. Psyllium،

به ترتیب (لی و همکاران، 2001؛ لی و همکاران، 2005). اگرچه سیستم اول زمان ته نشینی نسبتاً کوتاهی داشت، اما عملکرد ضعیفی در جداسازی PhGs C. deserticola داشت، به دلیل مقادیر کم K برای ترکیبات 1 و 2 و مقادیر بالای K برای ترکیبات 3-5. مقادیر K برای ترکیبات 1-4 در سیستم دوم بسیار کم بود، اما برای ترکیب 5 بسیار بالا بود (جدول 1). یک سیستم اصلاح شده حاوی اتیل استات-اتانول-آب (5:0.5:4.5، v/v/v)، مقدار K ایده آل را برای ترکیبات 3-5 به ترتیب 0.87، 1.11 و 1.32 به دست آورد و منجر به جداسازی خوب شد. از این سه ترکیب (شکل 3A و B). این سیستم اما تولید کرد

مقدار K بسیار کوچک برای ترکیبات 1 و 2، که باعث می شود این دو ترکیب در نزدیکی جلوی حلال با هم شسته شوند (کسر 1 در شکل 3A). یک تغییر بیشتر در سیستم (اتیل استات-n-بوتانول-اتانول-آب (0.5:0.5:0.1:1، v/v/v/ v) مقادیر K برای ترکیب 1 و 2 را به ترتیب به 0.52 و 0.92 افزایش داد و منجر به جداسازی کامل شد (شکل 3C). شکل 3A جداسازی HSCCC یک نمونه حاوی 230 میلی‌گرم عصاره n-بوتانولی C. deserticola با استفاده از اتیل استات-اتانول-آب (5:{55}}.5:4.5، v/v/v). کسری‌هایی که تأیید شدند بوسیله HPLC فقط ترکیبات 3، 4 یا 5 را به طور جداگانه با هم ترکیب کردند، و آنهایی که حاوی ترکیبات 3 و 4 بودند، با هم ترکیب شدند، در حالت انجماد خشک شدند و برای جداسازی بیشتر در معرض HSCCC قرار گرفتند (شکل 3B). جداسازی HSCCC که در بالا توضیح داده شد در مجموع 14.6 میلی گرم، 30.1 میلی گرم، و 25.2 میلی گرم از ترکیبات 3-5 از 1412 میلی گرم عصاره n-بوتانول به دست آمد. شکل 3C جداسازی HSCCC نمونه حاوی ترکیبات 1 را نشان می دهد. و 2 (کسر 1 در اولین جداسازی) با استفاده از اتیل استات-n-بوتانول-اتانول-آب ({59}}.5:0.5:0.1:1، v/v/v/v). مجموعا 28.5 و 1 8.4 میلی گرم از ترکیبات 1 و 2 به دست آمد. خلوص کروماتوگرافی ترکیبات انجمادی 1-5 بیش از 92.5 درصد بود که مستقیماً برای آنالیزهای LC-ESI-MS و NMR استفاده شد.

شناسایی آزمایشی ترکیبات 1، 3، و 4 با زمان‌های ماندگاری و داده‌های طیفی UV با موارد اکیناکوزید، آکتئوزید و ایزواکتئوزید معتبر به دست آمد (شکل 2). ترکیبات 2 و 5 ناشناخته بودند، با این حال، طیف UV هر پنج ترکیب بسیار مشابه بود، که نشان دهنده ویژگی های ساختاری مشابه است.

برای بررسی بیشتر ساختار این پنج ترکیب، آزمایش‌های LC-ESI-MSn انجام شد و نتایج در شکل 4 و جدول 2 نشان داده شده است. [MH] - در m/z 785، 799، 623، 623، و 665، به ترتیب، در حالت منفی. یون‌های دایمریک [2MH]- نیز برای پیک‌های 1-4 در شکل 2 مشاهده شدند. این یون‌ها وزن مولکولی پیک‌های 1-5 را به ترتیب 786، 800، 624، 624 و 666 تأیید کردند. داده های LC-MSN (جدول 2) اطلاعات ساختاری بسیار مفیدی را برای پنج PhG ارائه می کند، مانند از دست دادن خنثی یک روش آزمایشی: تقریباً 1 میلی گرم از هر نمونه در یک لوله آزمایش 10 میلی لیتری که 1 میلی لیتر از هر فاز در آن قرار می گیرد، وزن می شود. سیستم حلال دو فازی از پیش متعادل اضافه شد. لوله آزمایش درپوش گذاشته شد و به مدت 1 دقیقه به شدت تکان داده شد و اجازه داده شد بماند تا کاملا جدا شود. مقدار 100 لیتر از هر لایه خارج شده و به طور جداگانه تبخیر شد تا در خلاء خشک شود.<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

LC-ESI-MS پیک 1 در شکل 4A نشان داده شده است. یون مولکولی deprotonated [MH] - در m/z 785 با فراوانی بالا و یک مولکولی deprotonated dimeric.یون [2M H] - در m/z 1571 در حالت منفی مشاهده شد، که نشان دهنده وزن مولکولی 786 بود که همان وزن اکیناکوزید بود. بررسی بیشتر در آزمایش LC-MS2 یون‌های m/z 785، یک یون اصلی دختر در m/z 623 (شکل 4B) به‌دست آمد که مستقیماً از m/z 785 با از دست دادن یک بخش کافئویل یا یک بخش هگزوز به عنوان [M] تولید شد. 162 H]-. طیف LC-MS3 m/z 623 دو یون اصلی را در m/z 477 و 461 و دو یون فرعی را در m/z 315 و 179 نشان داد (شکل 3C، جدول 2). تفاوت جرمی بین m/z 623 و یون های قطعه m/z 477 و 461 به ترتیب 146 و 162 بود که مربوط به از دست دادن یک واحد رامنوز و یک بخش گلوکز یا یک قسمت کافئویل [M 162 H] - است. یون‌های m/z 623 نیز برای تولید یون‌های m/z 315، یک بخش کافئویل و یک بخش رامنوز را از دست دادند. یون m/z 179 از برش قسمت کافئویل تولید شد و بار منفی در قسمت کافئویل باقی ماند. آزمایش LC-ESI-MSN روی اکیناکوزید معتبر همان الگوی تکه تکه شدن را نشان داد. بنابراین پیک 1 تایید شد که اکیناکوزید است.

برای پیک 2، LC-ESI-MS m/z 799 را به عنوان یون مولکولی deprotonated [MH]- و m/z 1599 را به عنوان یون دیمری آن نشان داد، که بیانگر جرم مولکولی 800 است. در طول آزمایشات MS2، m/z 799 یون سه دختر را در m/z 637، 623 و 475 تشکیل دادند (جدول 1). یون m/z 637 مستقیماً از یون اصلی m/z 799 دوباره به دلیل از بین رفتن خنثی کافئویل [M-162-H]- یا یک نیمه گلوکز [M-162-H]- تولید شد. یون در m/z 623 ناشی از از دست دادن یک رادیکال CH2 است. یون در m/z 475 از از دست دادن خنثی هر دو قسمت کافئویل [M 162 H] - و نیمه گلوکز از یون اصلی تشکیل شد. آزمایش MS3 روی m/z 637 سه یون در m/z 619، 491 و 475 تولید کرد که به ترتیب مربوط به تلفات یک آب، یک واحد رامنوز و یک نیمه گلوکز است. یون دختر m/z 623 m/z 461 و 315 را در مطالعه MS3 تولید کرد که همان مسیرهای تکه تکه شدن اکیناکوزید را دنبال کرد که در بالا بحث شد. داده‌های LC- ESI-MSN از یک شناسایی آزمایشی برای پیک 2 به عنوان سیستانوزید A پشتیبانی می‌کنند. هر دو پیک [MH] - یون یکسان در m/z 623 و دایمر در m/z 1247 در حالت منفی (جدول 1) را نشان دادند. آنها احتمالا ایزومرهایی با وزن مولکولی یکسان هستند

624، همان اکتئوزید و ایزواکتئوزید. طیف MS2 یون‌های [MH]- نیز یک یون دختر m/z 461 را نشان داد که نشان‌دهنده از بین رفتن بخش کافئویل از یون اصلی m/z 623 بود (جدول 1). طیف MS3 مشابهی برای این دو ترکیب به دست آمد. برای پیک 3، طیف MS3 یون در m/z 461 سه یون در m/z 315، 161 و 135 تشکیل داد. یون m/z 161 از برش بخش کافئویل و به دنبال آن از دست دادن بیشتر یک آب تولید شد. بار روی بخشی از قسمت کافئویل باقی ماند. یون در m/z 135 [آگلی- مخروط 18 H] - از شکاف پیوند گلیکوزیدی در موقعیت C1 با از دست دادن اضافی یک آب به وجود آمد، و باعث می‌شود که بار در قسمت آگلیکون باشد. طیف MS3 پیک 4 همان مسیر تکه تکه شدن قله 3 را دنبال کرد به جز یون گمشده در m/z 135. یون مولکولی و الگوهای تکه تکه شدن این دو ترکیب با داده های ادبیات مربوط به آکتئوزید و ایزواکتئوزید مطابقت دارد (وانگ و همکاران .، 2000)، اگرچه یک یون اضافی m/z 153 پیدا شد و داده های پروتون NMR سیستانوزید A و 20-استیلاکتئوزید به عنوان [آگلیکون H] - توسط وانگ و همکاران اختصاص داده شد. (وانگ و همکاران، 2000). این یون ممکن است ناپایدار بوده باشد و آب خود را از دست داده تا m/z 135 در آزمایش ما بدهد. بر اساس داده‌های MS و زمان‌های ماند پیک‌های 3 و 4 با استانداردها، آنها به ترتیب به‌عنوان اکتئوزید و ایزواکتئوزید شناسایی می‌شوند.

داده های LC-ESI-MS پیک 5 در جدول 2 نشان داده شده است. یک یون مولکولی deprotonated [MH]— (m/z 665) تنها یونی بود که در حالت منفی یافت شد که به جرم مولکولی 666 دلالت دارد. سه یون دختر در آزمایش MS2 در m/z 623، 503 و 461 مشاهده شد (جدول 2). یون های دختر در m/z 623 و 503 به ترتیب با از دست دادن یک گروه COCH2 و یک بخش کافئوئیل مستقیماً از یون اصلی تشکیل شدند. یون m/z 461 از از دست دادن هر دو بخش کافئویل و COCH2 [M 162 42 H] - از یون مادر به وجود آمد. در آزمایش MS، ​​m/z 623 m/z 461 تولید کرد و m/z 503 سه یون در m/z 485، 461 و 315 تولید کرد. طیف MS3 یون دختر m/z 461 دو یون در 443 داد. و 315. با مقایسه الگوی تکه تکه شدن LC- MSN پیک 5 با سایر ترکیبات گزارش شده در این مطالعه و با سایر گزارشات (لی و همکاران، 2005؛ وانگ و همکاران، 2000)، به این نتیجه رسیدیم که قله 5 از نظر ساختاری بسیار مرتبط است. به اکتئوزید با تنها تفاوت واحد COCH3 در موقعیت R3. بنابراین یک هویت آزمایشی به قله 5 به عنوان 20-استیلاکتئوزید داده شد (شکل 1).

ساختار دو ترکیب آزمایشی شناسایی شده، پیک 2 (به عنوان سیستانوزید A) و قله 5 (به عنوان 20- استیل-اکتئوزید) ساختار آنها توسط 1H NMR تأیید شد. تغییرات شیمیایی و ثابت های جفت شدن همه پروتون ها در ترکیبات 2 و 5، همانطور که در جدول 3 نشان داده شده است، به ترتیب با داده های NMR گزارش شده برای سیستانوزید A و 20-استیلاکتئوزید مطابقت دارد (کوبیاشی و همکاران، 1984، 1987). . آزمایش‌های NMR دوبعدی (همبستگی COSY، ROESY و CH دوربرد) نیز در مطالعه حاضر انجام شد و آنها شناسایی را بیشتر تأیید کردند (داده‌ها نشان داده نشده است).

Acteoside از Cistanche deserticola

4. نتیجه گیری

در مقاله حاضر، HSCCC با موفقیت برای جداسازی و خالص‌سازی اکیناکوزید، سیستانوزید A، اکتئوزید، ایزواکتئوزید و 20-استیلاکتئوزید از عصاره n-بوتانولی C. deserticola استفاده شد. بنابراین این یک وسیله اثبات شده برای جداسازی نیمه آماده سازی زیست فعال است. در همین حال، ساختار پنج PhGs در C. deserticola با استفاده از LC-ESI-MSN بررسی شده است. برخی از ویژگی های مشخصه PhGs پیدا شد که به ما امکان می دهد گروه های عملکردی را در ساختارها تعیین کنیم. بنابراین روش LC-ESI-MSN یک ابزار قدرتمند برای شناسایی سریع فنیل اتانوئیدها و گلیکوزیدهای آنها در عصاره های C. deserticola است، به ویژه هنگامی که با داده های NMR اثبات شود.

تصدیق

نویسندگان مایلند از Jun Gu از مرکز تشدید مغناطیسی هسته‌ای، دانشگاه گوئلف، انتاریو، کانادا برای کمک او در آزمایش‌های NMR تشکر کنند. این پروژه تا حدی با بودجه استان جیلین، چین (شماره 20060904) حمایت شد.

منابع

Chen, LJ, Games, DE, & Jones, J. (2003). جداسازی و شناسایی چهار ترکیب فلاونوئیدی از بذر Oroxylum Indicum با کروماتوگرافی ضد جریان با سرعت بالا. مجله کروماتوگرافی A، 988، 95-105.

چنگ، ایکس‌ای، وی، تی، گوئو، بی، نی، دبلیو و لیو، سی‌زی (2005). کشت های سوسپانسیون سلولی Cistanche deserticola: بیوسنتز و فعالیت آنتی اکسیدانی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی. بیوشیمی فرآیند، 40، 3119-3124.

Foucault, AP, & Chevolot, L. (1998). کروماتوگرافی ضد جریان: ابزار دقیق، انتخاب حلال، و برخی کاربردهای اخیر در تصفیه محصول طبیعی. مجله کروماتوگرافی A، 808، 3-22.

Gross, G.-A., Lahloub, MF, Anklin, C., Schulten, H.-R., & Sticher, O. (1988). توکریوزید، یک گلیکوزید فنیل پروپانوئید از Teucrium Chamaedrys. فیتوشیمی، 27، 1459-1463.

He, ZD, Lau, KM, Xu, HX, Li, PC, & But, PPH (2000). فعالیت آنتی اکسیدانی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از شانس براندیسیا مجله Ethnopharmacology، 71، 483-486.

Kobayashi, H., Karasawa, H., & Miyase, T. (1984). مطالعات بر روی اجزای تشکیل دهنده Cistanchis Herba. III. جداسازی و ساختار گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید جدید، سیستانوزید A و B. بولتن شیمیایی و دارویی، 32، 3009-3014.

Kobayashi, H., Oguchi, H., Takizawa, N., Miyase, T., Ueno, A., Usmanghani, K., et al. (1987). گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی جدید از Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. FI. بولتن شیمیایی و دارویی، 35، 3309-3314.

لی، L.، یانگ، FQ، Zhang، TY، Tu، PF، وو، LJ، و Ito، Y. (2001). جداسازی آماده‌سازی و خالص‌سازی اکتئوزید و 2'-استیل اکتئوزید از Cistanches salsa (CA Mey) G. Beck با کروماتوگرافی ضد جریان. مجله کروماتوگرافی A، 912، 181-185.

Li، L.، Tsao، R.، Liu، ZQ، Liu، SY، Yang، R.، Young، JC، و همکاران. (2005). جداسازی و خالص سازی اکتئوزید و ایزواکتئوزید از Plantago psyllium L. توسط کروماتوگرافی ضد جریان با سرعت بالا. مجله کروماتوگرافی A، 1063، 161-169.

لی، LL، وانگ، XW، و وانگ، XF (1997). پراکسیداسیون ضد چربی و اثر ضد رادیکال گلیکوزیدها در گیاه سیستانچ مجله چینی ماتریا مدیکا، 22، 364-367.

Li, J., Wang, PF, Zheng, RL, Liu, ZM, & Jia, ZJ (1993). محافظت از گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید از Pedicularis در برابر همولیز اکسیداتیو در شرایط آزمایشگاهی. Planta Medica، 59، 315-317.

لو، ام سی (1998). مطالعاتی در مورد اثر آرام بخش سیستانش دسرتیکولا. مجله Ethnopharmacology، 59، 161-165.

نیشیمورا، اچ.، ساساکی، اچ.، ایناگاکی، ن.، چین، ام.، و میتسوهاشی، اچ. (1991). نه گلیکوزید فنتیل الکل از Stachys szeboldzz. فیتوشیمی، 30، 965-969.

Oka, F., Oka, H., & Ito, Y. (1991). جستجوی سیستماتیک برای سیستم‌های حلال دو فازی مناسب برای کروماتوگرافی ضد جریان با سرعت بالا مجله کروماتوگرافی، 538، 99-108.

Ravn, H., Nishibe, S., Sasahara, M., & Li, X. (1990). ترکیبات فنلی از Plantago Asiatica. فیتوشیمی، 29، 3627-3631.

Schapoval, EES, Winter de Vargas, MR, Chaves, CG, Bridi, R., Zuanazzi, JA, & Henriques, AT (1998). فعالیت های ضد التهابی و ضد درد عصاره ها و ترکیبات جدا شده از Stachytarpheta cayennensis. مجله Ethnopharmacology، 60، 53-59.

Shoyama, Y., Matsumoto, M., & Nishioka, I. (1987). گلیکوزیدهای فنولیک از ریشه های بیمار Rehmannia glutinosa Var. پورپوره. فیتو شیمی، 26، 983-986.

وانگ، XW، جیانگ، XY، وو، LY، و وانگ، XF (2001). اثر مهاری گلیکوزیدهای گیاه سیستانش دسرتیکولا بر رادیکال های آزاد و محافظت از آن در برابر آسیب DNA ناشی از OH در شرایط آزمایشگاهی. مجله فارماکولوژی چینی، 36، 29-31.