قسمت 1: اثرات بازسازی عروقی نیترات معدنی به دنبال ایسکمی- پرفیوژن مجدد کلیه

برای اطلاعات بیشتر. مخاطبtina.xiang@wecistanche.com

چکیده

زمینه: آسیب ایسکمی- پرفیوژن مجدد کلیه (IR).یک علت شایع استآسیب حاد کلیه(AKI)، که با استرس اکسیداتیو و کاهش فعالیت زیستی اکسید نیتریک (NO) و افزایش خطر ابتلا همراه است.بیماری مزمن کلیوی(CKD) و بیماری های قلبی عروقی (CVD). استراتژی‌های جدیدی که تعادل ردوکس را بازیابی می‌کنند ممکن است پیامدهای درمانی در طول AKI و عوارض مرتبط با آن داشته باشند.

هدفبررسی ارزش درمانی تقویت مسیر نیترات-نیتریت-NO در طول ایجاد اختلال عملکرد کلیوی و قلبی عروقی ناشی از IR.

مواد و روش ها: موش‌های نر C57BL/6 J نیترات سدیم (10 میلی‌گرم بر کیلوگرم، داخل صفاقی) یا وسیله نقلیه 2 ساعت قبل از ایسکمی گرم کلیه چپ (45 دقیقه) و سپس مکمل نیترات سدیم در آب آشامیدنی (1 میلی‌مول بر کیلوگرم در بدن) داده شدند. روز) برای 2 هفته بعد. فشار خون و میزان فیلتراسیون گلومرولی اندازه‌گیری شد و خون و کلیه‌ها جمع‌آوری شد و برای آنالیزهای بیوشیمیایی و بافت‌شناسی و همچنین مطالعات واکنش‌پذیری عروق کلیوی استفاده شد. سلول های اندوتلیال گلومرولی در معرض هیپوکسی- اکسیژن رسانی مجدد، با یا بدون آنژیوتانسین Ⅱ، برای مطالعات مکانیکی استفاده شد.

نتایجIR با کاهش عملکرد کلیوی و کمی افزایش فشار خون همراه با آسیب کلیوی، التهاب، اختلال عملکرد اندوتلیال، افزایش سطح آنگ Ⅱ، و واکنش پذیری با واسطه Ang II همراه بود که همگی با نیترات بهبود یافتند. علاوه بر این، تیمار با نیترات (in vivo) و نیتریت (in vitro) فعالیت زیستی NO را بازسازی کرد و استرس اکسیداتیو میتوکندری و آسیب‌ها را کاهش داد.

نتیجه گیریدرمان حاد با نیترات معدنی قبل از ایسکمی کلیوی ممکن است به عنوان یک رویکرد درمانی جدید برای جلوگیری از AKI و CKD و خطر ابتلا به آن عمل کند.اختلال عملکرد قلبی عروقی.

برای دسترسی به تامین کننده برای تجربه cistanche کلیک کنید

1. مقدمه

آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد (IR) کلیه، همراه با پیوند، جراحی بای پس قلبی و شوک، یک خطر عمده برای ایجاد آسیب حاد کلیه (AKI) و متعاقب آن بیماری مزمن کلیوی (CKD) است [1]. مکانیسم های زیربنایی پیچیده هستند و شامل استرس اکسیداتیو مرتبط با خونرسانی مجدد، کمبود اکسید نیتریک و فعال شدن سلول های ایمنی هستند که با هم منجر به اختلال عملکرد اندوتلیال می شوند [2، 3]. تحقیقات در حال انجام بر روی یافتن درمان های جدید و موثر برای پیشگیری و درمان AKI و پیشرفت آن به CKD، مانند پیش شرط ایسکمیک از راه دور، هیپوترمی موضعی موقت و همچنین مداخلات دارویی جدید متمرکز شده است [3،4].

مولکول سیگنال دهی گازی اکسید نیتریک (NO) به طور مهمی به تنظیم هموستاز قلبی عروقی و کلیوی کمک می کند و نشان داده شده است که نقش محافظتی در هنگام آسیب های IR ایفا می کند [5،6]. با این حال، در طول رویداد ایسکمیک، فقدان اکسیژن عملکرد NO سنتاز اندوتلیال (eNOS) را به خطر می اندازد، که ممکن است به "پدیده بدون جریان مجدد" در بافت ایسکمیک در طول فاز خونرسانی مجدد کمک کند. این به نوبه خود آسیب های سلول های اپیتلیال اندوتلیال و لوله ای را منتشر می کند [7] که به توسعه کاهش عملکرد کلیه کمک می کند. علاوه بر هیپوکسی در طول دوره ایسکمیک، تولید بیش از حد گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) بیش از حد توسط نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید فسفات (NADPH) اکسیداز و میتوکندری در طول فاز خونرسانی مجدد، NO را از بین می‌برد [8]. رویکردهای جدید که استرس اکسیداتیو را کاهش می‌دهند و زیست فعالی NO را حفظ می‌کنند، ممکن است ارزش درمانی در نبرد با نارسایی کلیه ناشی از IR داشته باشند.

نیترات معدنی (NO3) و نیتریت (NOZ) قبلاً به عنوان محصولات نسبتاً بی اثر مشتق شده از متابولیسم NO مشاهده می شدند. با این حال، تحقیقات انجام‌شده برای بیش از دو دهه نشان داده است که این آنیون‌ها می‌توانند از طریق کاهش‌های متوالی تحت تبدیل زیستی قرار گیرند و دوباره NO و دیگر گونه‌های اکسید نیتروژن زیست فعال را تشکیل دهند [9]. فعالیت این مسیر جایگزین نیترات-نیتریت-NO در شرایطی با هیپوکسی و pH پایین که سیستم NOS کلاسیک می تواند ناکارآمد شود، افزایش می یابد [10].

رژیم غذایی، علاوه بر سیستم NOS، منبع مهمی از نیترات و نیتریت در گردش است، به دلیل سطوح بالای نیترات به عنوان مثال در سبزیجات برگ سبز. مکمل نیترات معدنی و نیتریت با اثرات مطلوب قلبی عروقی از جمله کاهش فشار خون در هر دو مطالعات تجربی و بالینی همراه بوده است [11]. اثرات محافظتی اندام نیز در مدل‌های آسیب IR تجربی کبد [12]، مغز [13]، ریه [14] و قلب [12،15] نشان داده شده است. با این حال، ارزش درمانی بالقوه نیترات معدنی و نیتریت در آسیب IR کلیه بحث برانگیز است. همانطور که اخیرا بررسی شد [5]، نتایج متغیر در مدل های IR، با استفاده از نیتریت درمانی، شاید به دلیل تفاوت در دوز مورد استفاده، مسیر تجویز، مدت درمان و همچنین خود مدل تجربی [16،17] باشد. چندین مطالعه تجربی اثرات محافظتی مکمل نیترات رژیم غذایی را در مدل های بیماری قلبی- عروقی، از طریق مکانیسم هایی که شامل کاهش استرس اکسیداتیو و بهبود زیست فعالی NO و همچنین تعدیل می شود، نشان داده اند.پاسخ های التهابی[5]. تا به امروز، دانش محدودی در مورد اثرات درمان با نیترات معدنی در آسیب IR کلیه وجود دارد. ما قبلاً نشان داده‌ایم که پیش‌درمان رژیم غذایی مزمن با نیترات، آسیب‌های کلیوی ناشی از IR را کاهش می‌دهد [18]. با این حال، دانش کمتری در مورد ارزش بالقوه تقویت مسیر نیترات-نیتریت-NO در شروع IR برای کاهش خطر ابتلا به AKI و CKD وجود دارد. اگر محافظتی باشد، این می تواند کاربردهای بالینی گسترده ای در بیمارانی که در معرض خطر ابتلا به AKI هستند، به عنوان مثال کسانی که تحت عمل جراحی بزرگ قرار می گیرند، داشته باشد.

در این مطالعه، ما از یک مدل موش آسیب IR کلیوی برای بررسی مزایای بالقوه درمان حاد نیترات بلافاصله قبل از رویداد ایسکمیک استفاده کردیم. این با مطالعات مکانیکی عروق ازمایشگاهی و آزمایش‌های کشت سلولی در شرایط آزمایشگاهی با تیمار نیتریت ترکیب شد. ما فرض کردیم که تقویت مسیر نیترات-نیتریت-NO از طریق تعدیل استرس اکسیداتیو و زیست فعالی NO و همچنین عملکرد میتوکندری، محافظت کلیه در برابر آسیب IR را ارتقا می دهد.

2. روش ها

2.1. معرف ها

مگر اینکه خلاف آن ذکر شود، تمام معرف ها از سیگما آلدریچ، سوئد تهیه شده اند.

2.2. مدل ایسکمی-خونرسانی مجدد حیوانات و کلیه

موش‌های C57BL/6 J (نر، 10 هفته) از آزمایشگاه‌های Janvier (فرانسه) به‌دست آمدند و در محیط‌های حیوانی ما در مؤسسه Karolinska تحت شرایط آب و هوایی کنترل‌شده با چرخه نور/تاریکی 12- ساعت نگهداری شدند و ارائه شدند. با غذای استاندارد جوندگان و آب لوله کشی. همه رویه‌های حیوانی توسط کمیته اخلاقی منطقه‌ای برای آزمایش‌های حیوانی تأیید شد (شناسه پروتکل: N139/15) و طبق دستورالعمل‌های مؤسسه ملی بهداشت (NIH) و با دستورالعمل اتحادیه اروپا 2010/63/EU برای انجام آزمایش‌ها انجام شد. آزمایش بر روی حیوانات

پس از 1 هفته سازگاری، به موش ها دارونما (NaCl) یا نیترات سدیم (NaNO3) به صورت داخل صفاقی (10 mg/kg) 2 ساعت قبل از ایسکمی یک طرفه کلیه چپ تجویز شد. کلیه راست معاینه شد اما در غیر این صورت دست نخورده باقی ماند. جراحی های ساختگی نیز به همین روش انجام شد، اما بدون بستن کلیه چپ. موش‌ها با ایزوفلوران بیهوش شدند و دمای بدن با استفاده از یک لامپ گرمایشی و یک پد گرمایشی کنترل‌شده در طول جراحی روی 0.5±37 درجه نگه داشت. پس از جراحی، موش ها با نیترات سدیم (1 میلی مول بر کیلوگرم در روز) یا دارونما به مدت 2 هفته تا پایان درمان تحت درمان قرار گرفتند.

2.3. اندازه گیری فشار خون

فشار خون در موش‌ها با استفاده از روش غیرتهاجمی دم کاف قبل از ختم اندازه‌گیری شد. یک کاف با سنسور پالس پنوماتیک به دم متصل شد و مقادیر فشار خون با سیستم CODA (Kent Scientific, Torrington, CT, USA) ثبت شد. حیوانات حداقل سه روز قبل از ثبت فشار خون با مهار کننده ها روی صفحه گرم کننده آموزش داده شدند. فشار سیستولیک، دیاستولیک و میانگین شریانی طی 3 روز متوالی جمع‌آوری شد و میانگین فردی تمام مقادیر پذیرفته‌شده برای ارزیابی جمع‌آوری شد.

2.4. برداشت بافت

قبل از ختم، موش ها برای جمع آوری ادرار برای محاسبه نرخ فیلتراسیون گلومرولی (GFR) در قفس های متابولیک قرار داده شدند. سپس حیوانات با ایزوفلوران بیهوش شدند و نمونه خون از طریق ورید اجوف تحتانی جمع آوری شد. همه نمونه‌ها بلافاصله در 6000 × گرم، 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه در حضور EDTA (سیگما آلدریچ، استکهلم، سوئد) با غلظت نهایی 2 میلی‌مولار سانتریفیوژ شدند. نمونه‌های پلاسما به داخل لوله‌های جدید منتقل شدند و بلافاصله در یخ خشک منجمد شدند و در نهایت در درجه -80 نگهداری شدند. کلیه‌ها استخراج و به چندین قسمت برای آزمایش‌های عملکرد عروقی (شریان‌های بین‌لوبار و شریان‌های آوران)، بافت‌شناسی (History) برش داده شدند. رنگ‌آمیزی HE و PAS)، و کمی‌سازی آپوپتوز و التهاب (Tissue-Tek Optimum Cutting Tempera-ture (OCT)ترکیب تعبیه شده و منجمد برای رنگ‌آمیزی TUNEL و F4/80).

2.5. اندازه گیری نیترات، نیتریت، cGMP، کراتینین، نیتروژن اوره خون (BUN) و آنژیوتانسین II

نیتریت و نیترات با HPLC (ENO{0}}) همانطور که قبلاً 【19】 توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل شدند. نمونه های پلاسما (10 ul) با سرنگ همیلتون به سیستم HPLC تزریق شد. پس از آن، نیتریت و نیترات توسط کروماتوگرافی فاز معکوس / تبادل یونی و سپس احیای نیترات به نیتریت توسط کادمیوم و مس احیا شده جدا شدند. نیتریت با استفاده از معرف گریس برای تشکیل ترکیبات دیازو مشتق شد و در 540 نانومتر شناسایی شد. برای جلوگیری از تخریب cGMP، پلاسما به لوله های حاوی یک مهارکننده PDE، BMX(3-ایزوبوتیل-1متیل گزانتین؛ Sigma-Aldrich #I5879) منتقل شد تا غلظت نهایی (10 میکرومولار) بدست آید. پس از آن منجمد و در{10}} درجه قبل از آنالیز cGMP با کیت ELISA (GE Healthcare #RPN226)، طبق دستورالعمل‌های سازنده، ذخیره می‌شود.

سطح کراتینین پلاسما و ادرار با استفاده از کیت های سنجش رنگ سنجی کراتینین (Cayman Chemical، #700460 و #500701) شناسایی شد. فرمول کلیرانس کراتینین (CLcr =Urinecrx جریان ادرار/Plasmacr) برای تخمین GFR استفاده شد. سطوح BUN پلاسما با استفاده از کیت تشخیص رنگ سنجی BUN (Invitrogen،#EIA-BUN) شناسایی شد. سطوح آنگ در پلاسما و بافت کلیه با استفاده از کیت Ang ⅡI ELISA (Cloud-Clone Corp., # CEA005Mu) طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. با این حال، تهیه عصاره بافت کمی با توصیه شده متفاوت بود. 10 جلد 50 میلی مولار HCl در 50 درصد EtOH به بافت اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در 100 درجه حرارت داده شد، 10 000×g 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس نمونه‌ها منجمد شدند و قبل از آنالیز در درجه{13} نگهداری شدند. تمام قرائت های جذب در SpextraMax iD3 از دستگاه های مولکولی انجام شد.

2.6. جداسازی و پرفیوژن شریان های بین لوبار

کلیه‌ها پس از قربانی برداشت و در محلول نمک فیزیولوژیکی سرد یخی (PSS) تا جداسازی شریان‌های بین لوبار نگهداری شدند. شریان های بین لوبار کلیوی (طول 2 میلی متر) تشریح شد و در a نصب شد

محفظه مایوگرافی (مدل 620 M، دانمارکی Myo Technology، دانمارک) با PS همانطور که قبلاً توضیح داده شد [20]. کشش ایزومتریک با یک سیستم Powerlab (Powerlab 4/30، AD Instruments، استرالیا) ثبت شد. پس از نصب، عروق به مدت 20 دقیقه در PS های حباب با کربن (95 درصد O2؛ 5 درصد CO2) در 37 درجه pH7.4 متعادل شدند. سپس کشش در حالت استراحت شریان ها همانطور که قبلا توضیح داده شد تنظیم شد [21]، که مطابق با روش عادی سازی مولوانی [22]. پس از تعادل دوم، 0.1 mol / L KCl برای ارزیابی زنده ماندن حلقه شریانی اعمال شد.

2.7. جداسازی و میکرو پرفیوژن شریان های آوران

موش‌های C57BL/6 J با ایزوفلوران استنشاقی بیهوش شدند و کلیه‌ها به سرعت برداشته شدند و همانطور که قبلاً توضیح داده شد [{3}}]. برش های کلیه در محیط سرد دولبکو اصلاح شده عقاب (DMEM) قرار داده شد. یک شریان آوران منفرد با گلومرول متصل زیر یک استریومیکروسکوپ جدا شد و به یک دستگاه انتقال داده شد.

محفظه تنظیم دما در مرحله یک میکروسکوپ معکوس. گلومرول با میکروپیپت نگهدارنده ثابت شد و شریان آوران کانوله شد و با مجموعه ای از میکروپیپت ها پرفیوژن شد. فشار داخل مجرای شریان آوران پرفیوژن در طول آزمایش در 60 میلی متر جیوه حفظ شد. زمان تشریح و میکروپرفیوژن زیر به 120 دقیقه پس از قربانی شدن موش همانطور که قبلاً توضیح داده شد محدود شد [26]. پس از 30 دقیقه دوره تعادل در 37 درجه، منحنی‌های تجمعی دوز-پاسخ به Ang II ({8}} تا 10-8 mol/L) به‌دست آمد. هر غلظت Ang II به مدت 2 دقیقه پرفیوژن شد، پاسخ انقباضی ثبت شد و سپس قطر شریان آوران اندازه‌گیری شد.

2.8. بررسی بافت شناسی

نمونه های کلیه برداشت و در محلول 4 درصد پارافورمالدئید تثبیت شد. بافت های ثابت کلیه در پارافین جاسازی شده و سپس برش داده شده و با هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) یا اسید دوره ای شیف (PAS) برای ارزیابی بافت شناسی رنگ آمیزی شدند. چهار حیوان به طور تصادفی انتخاب شده از هر گروه آزمایش برای تجزیه و تحلیل استفاده شد. ده میدان به طور تصادفی انتخاب شده از هر بخش با بزرگنمایی 400× گرفته شد. تمام آنالیزهای مورفومتریک به صورت کور انجام شد.

2.9. رنگ آمیزی TUNEL

نمونه های کلیه تعبیه شده در OCT برای رنگ آمیزی TUNEL استفاده شد. مقاطع با ضخامت 6- میکرومتر با 20 میکروگرم بر میلی لیتر پروتئیناز K به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند و واکنش های TUNEL با استفاده از روش Click-iTTM Plus TUNEL (Invitrogen C10618، USA) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. در پایان پروتکل، رنگ آمیزی DAPI انجام شد. برای تعیین کمیت، سه حیوان و سه ناحیه از تصویر (200×) به‌طور تصادفی انتخاب و با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال زایس عکس‌برداری شدند، سیگنال‌های مثبت با استفاده از نرم‌افزار ImageJ/Fiji کمی‌سازی شدند و به‌عنوان نسبت سیگنال های مثبت به DAPI

2.10. رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس بافتی و میکروسکوپ کانفوکال (F4/80)

کلیه‌ها در OCT (Tissue-Tek، Torrence، CA، USA) منجمد شدند و بخش‌های (6 میکرومتر) آماده و پردازش شدند. مقاطع منجمد با 1× PBS شسته و با 2 درصد BSA در PBS به مدت 30 دقیقه مسدود شدند و سپس با anti-F4/80 (1:50، BIO-RAD Cl: A{11}}) یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شدند. اتاق سرد، و متعاقبا با یک آنتی بادی ثانویه (1:200 Cell signaling Tech #4417) در دمای اتاق به مدت 1 ساعت، و سپس با رنگ آمیزی متقابل با 300 نانومول در لیتر DAPI (4'6-دیامیدینو{20}} فنیل -ایندول، دی هیدروکلراید، اینویتروژن) به مدت 3 دقیقه. سیگنال‌های ایمونوفلورسانس زیر میکروسکوپ کانفوکال هوای Zeiss LSM{23} مشاهده شدند. سه حیوان و سه ناحیه میدان تصویر (200×) به طور تصادفی انتخاب شدند. سیگنال‌های مثبت F4/80 با استفاده از نرم‌افزار ImageJ/Fiji اندازه‌گیری شدند و به عنوان نسبت سیگنال‌های مثبت به DAPI محاسبه شدند.

2.11. کشت سلولی

سلول‌های اندوتلیال گلومرولی موش صحرایی (DSMZ ACC262، آلمان) در محیط کشت RPMI1640 (Gibco 21870-076) با 10 درصد سرم جنین گاو و 2 متر ML-گلوتامین (Gibco 25030-082)، پنی سیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند. (50 میلی گرم در لیتر، Gibco 15140-122). سلول ها در دمای 37 درجه در اتمسفر مرطوب 5 درصد CO2 نگهداری شدند. در آزمایش های هیپوکسی، سلول ها در HBSS (Gibco 14025-092) به جای محیط بدون سرم در محفظه ای با اکسیژن 1 درصد در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 2 ساعت انکوبه شدند. سلول ها با نیتریت (10 میکرومولار) با/بدون فبوکسوستات بازدارنده گزانتین اکسیدوردوکتاز (XOR) (100 نانومولار)، به مدت 30 دقیقه قبل از هیپ-اکسی از قبل انکوبه شدند. زنده ماندن سلولی با روش PrestoBlue⑧ (Invitrogen، A13261، و A13262) و مرگ و میر سلولی با روش حذف تریپان بلو (Sigma, T{24}} ML) ارزیابی شد.

2.12. تشخیص ROS میتوکندری

سطح سوپراکسید میتوکندری با یک رنگ فلوروژنیک (MitoSOXTM، Invitrogen M36008) شناسایی شد. پس از درمان، سلول های اندوتلیال با 2 میکرومول در لیتر MitoSox در محیط کشت در دمای 37 درجه به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند. سپس سلول ها با 1× HBSS دو بار شسته شدند و سیگنال فلورسنت اندازه گیری شد (Reader SpectraMax iD3, Molecular Devices, USA) و به زنده ماندن سلول نرمال شد.

2.13. تجزیه و تحلیل ایمونوبلات

نمونه های منجمد کلیه یا سلول های اندوتلیال در بافر حاوی 10 میلی مول در لیتر Tris-HCl pH 8، 150 میلی مول در لیتر NaCl، 5 میلی مول در لیتر EDTA، 60 میلی مول در لیتر N-octyl-glucoside، 1 درصد Triton X لیز شدند. }}، کوکتل بازدارنده پروتئاز و مهارکننده های پروتئین فسفاتاز. لیزهای سلولی یا بافتی به مدت 5 دقیقه در دمای 10، 000×g در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند. مواد رویی/پروتئین ها به لوله های جدید منتقل شدند و با استفاده از Bio-Rad اندازه گیری شدند

سنجش پروتئین عصاره های پروتئینی حاوی مقدار معادل پروتئین با استفاده از الکتروفورز ژل دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) {{0}} درصد آنالیز شدند. پروتئین ها به مدت 1 ساعت با 300 میلی آمپر به یک غشای پلی وینیلیدین دی فلوراید ایموبیلون منتقل شدند. غشاها در 20 میلی مولار Tris-HCl (pH7.4)، 150 میلی مولار NaCl و 0.1 درصد Tween 20 (TBS-T) حاوی 5 درصد بدون چربی مسدود شدند. شیرخشک به مدت 1 ساعت و با آنتی بادی های ضد TFAM (1:2000، ab131607)، anti-OXPHOS (1:1000، ab110413)، آنتی وینکولین (1:5000، ab129002) (Abcam Cambridge، UK) و ضد سیستم ایمنی شناسایی شده است. -کاسپاز بریده شده{30}} (1:1000,#9664) (فناوری سیگنالینگ سلولی، بورلی، MA، ایالات متحده). همه آنتی بادی های ثانویه برای تجزیه و تحلیل ایمونوبلات از فناوری سیگنالینگ سلولی بودند. برای وسترن لکه‌ها، تصاویر تمام‌قد برش‌نخورده، حاشیه‌نویسی شده با نشانگرهای MW در فایل تکمیلی نشان داده شده‌اند.

2.14. تحلیل آماری

مقایسه‌های چندگانه بین گروه‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک یا دو طرفه و سپس آزمون تعقیبی توصیه شده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. تمام محاسبات آماری با استفاده از Graphpad Prism 8 انجام شد.{4}}. معنی داری آماری به صورت p تعریف شد<>