محتوای ترکیبات فنلی و تنوع ژنتیکی در سطح جمعیت در سراسر محدوده توزیع طبیعی خرس (Arctostaphylos Uva-ursi، Ericaceae) در شبه جزیره ایبری

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

خلاصه:خرس (Arctostaphylos uva-ursi) یک گیاه دارویی است که به طور سنتی برای درمان عفونت های دستگاه ادراری به دلیل محتوای بالای آن استفاده می شود.آربوتین(هیدروکینون -D-گلوکوزید)، که در حال حاضر عمدتا به عنوان یک عامل سفید کننده طبیعی پوست در لوازم آرایشی استفاده می شود. Bearberry نیز به عنوان یک گیاه طبیعی پیشنهاد شده استآنتی اکسیدانافزودنی به دلیل محتوای بالای ترکیبات فنلی در برگ‌ها. ما تنوع ترکیبات فنلی را در 42 جمعیت وحشی خرس مورد مطالعه قرار دادیم تا مشخص شود که آیا عوامل زیستی، اقلیمی و/یا جغرافیایی ذاتی بر محتوای فنلی در سراسر توزیع طبیعی آن در شبه جزیره ایبری تأثیر می‌گذارند. برگ‌های توت خرس در طول پاییز طی یک دوره سه ساله (2014-2016) در جمعیت‌هایی در عرض جغرافیایی و شیب ارتفاع جمع‌آوری شدند. عصاره متانولی طیف وسیعی از تنوع در محتوای فنل کل و پروفایل های مختلف فنلی را نشان داد.آربوتین(میزان این ماده اصلی از 87 تا 232 میلی گرم در گرم وزنی متغیر بود)، همچنین محتوای کاتچین و میریستین نیز تحت تأثیر عوامل جغرافیایی و اقلیمی قرار گرفت. سطوح متوسط ​​تغییر در اندازه ژنوم - ارزیابی شده توسط فلوسیتومتری - و در دو ناحیه DNA پلاستید نیز در بین جمعیت ها شناسایی شد. تمایز ژنتیکی و سیتوژنتیکی جمعیت ها ضعیف بود اما به طور معنی داری با تنوع فیتوشیمیایی مرتبط بود. ژنوتیپ های خرس نخبه با بالاترآنتی اکسیدانظرفیت متعاقبا شناسایی شد.

کلید واژه ها: آربوتین; تنوع ژنتیکی و فیتوشیمیایی؛ اندازه ژنوم؛ هاپلوتیپ ها؛ طبیعیآنتی اکسیدان ها

سیستانچ آنتی اکسیدان های طبیعی هستند

1. مقدمه

سنتز متابولیت‌های تخصصی گیاهی از نظر زمان (به عنوان مثال، انتوژن، فنولوژی، و دفاع القایی) و مکان متفاوت است، زیرا نقش مهمی در سازگاری گیاه با شرایط محیطی دارد، در حالی که تنوع ژنتیکی نیز تنوع شیمیایی را به حساب می‌آورد [1]. در میان این ترکیبات، فنل دارای آرایه متنوعی از ساختارهای تک و پلیمری است که طیف وسیعی از نقش های فیزیولوژیکی را برآورده می کند [2]. بیوسنتز متابولیت های تخصصی تا حد زیادی تحت تأثیر عوامل محیطی مانند دما، بارش یا تابش خورشیدی است که به نوبه خود اغلب در معرض شیب های طولی، طولی یا ارتفاعی هستند. به ویژه، تجمع ترکیبات فنلی یک پاسخ کلی به سطوح افزایش یافته تابش UV-B (280-315 نانومتر) است. تنوع ترکیبی خاص در گیاهانی که در فصل تابستان و در ارتفاعات در منطقه مدیترانه رشد می‌کنند گزارش شده است، جایی که شیوع بیشتری از UV-B رخ می‌دهد و اسیدهای سینامیک و فلاونوئیدها بالاترین نرخ جذب UV را نشان می‌دهند [3].

آربوتین(hydroquinone -D-glucoside) یک ترکیب فنلی ساده با حضور محدود در برگ‌های برخی از گونه‌های متعلق به جنس‌هایی مانند Arbutus، Arctostaphylos، Pyrus یا Vaccinium است. منبع طبیعی اصلی آربوتین، توت خرس (Arctostaphylos uva-ursi). L.) Spreng.) برای قرن ها برای درمان عفونت های دستگاه ادراری و سایر بیماری های کلیوی استفاده شده است [4]، و فرمول های گیاهی هنوز هم امروزه تهیه می شود [5]. طي سالهاي گذشته طيف كاربردهايآربوتینبیشتر به عنوان یک عامل سفید کننده طبیعی پوست در صنایع آرایشی و بهداشتی [6] و در درمان های بالینی به دلیل آن گسترش یافته است.آنتی اکسیدانخواص آنتی بیوتیکی، ضد التهابی و ضد توموری [7]. در نتیجه، علاقه فزاینده ای به یافتن منابع طبیعی اضافی وجود داردآربوتینو همچنین فرآیندهای بیوتکنولوژیکی که می توانند جایگزین سنتز شیمیایی شوند [8،9]. در این زمینه، تولید آربوتین در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از کشت های سلولی Datura inoxia به مقیاس آزمایشی رسیده است [10].

بعلاوهآربوتینسایر ترکیبات فنلی به خواص فعال A.uva-ursi کمک می کنند، مانند فلاونوئیدها و تانن ها [11،12]، که کاتچین و کوریلاگین به ترتیب مرتبط ترین برگ ها هستند [13]. در صنایع غذایی ترکیبات طبیعی به عنوان فنل های گیاهی جایگزین سنتزی می شوندآنتی اکسیدانمواد نگهدارنده [14]. A. uva-ursi به عنوان یک افزودنی، به ویژه در محصولات گوشتی [15-19] و همچنین در بسته بندی فعال [20] استفاده شده است. در نهایت، پتانسیل A. uva-ursi به عنوان یک منبع دباغی برای صنعت چرم اخیراً پیشنهاد شده است [21].

مونوگراف "برگ خرس" آژانس دارویی اروپا [5] حداقل 7 درصد ازآربوتینمحتوای موجود در برگ های خشک به عنوان نیاز برای فرآورده های گیاهی. مطالعات انجام شده در دهه‌های گذشته، محتوای آربوتین در برگ‌های توت خرس را از 0 درصد تا 18 درصد، با روش‌های تحلیلی، تنوع طبیعی، شرایط رشد و تاریخ برداشت توضیح داده‌اند [4]. مقدار آربوتین معمولاً توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا [4،12،22-24] تعیین می شود، و مطالعات قبلی بالاتر تشخیص داده شده است.آربوتینمحتویات گیاهان توت خرس جمع‌آوری‌شده در پاییز نسبت به گیاهان جمع‌آوری‌شده در بهار [4]. کموتیپ‌های متنوعی توصیف شده‌اند که با توزیع جغرافیایی و تمایز درون گونه‌ای در زیرگونه‌های A. uva-ursi مرتبط است. قابل توجه ترین تغییر شیمیایی گیاهی گزارش شده عدم وجود آربوتین در گونه A. uva-ursi subsp است. stipitata Packer و Denford، اما همچنین تفاوت‌هایی در محتوای متیل آربوتین، الاژیک اسید یا میریستین ذکر شده است. کوئرستین همچنین در برگ‌های توت خرس وجود دارد که در آن هر دو آگلیکون و همچنین 3-O-گلیکوزیدهای آن‌ها فلاونوئیدهای رایج‌تری هستند [4]. با این حال، بیشتر این مطالعات چندین دهه قبل انجام شده است و امروزه تنوع درون گونه ای در توت خرس پیوسته در نظر گرفته می شود. 14 زیرگونه توصیف‌شده، از جمله یکی از اسپانیا (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre، Alcaraz و MB Crespo)، در حال حاضر نام‌های پذیرفته نشده و مترادف با A. uva-ursi هستند. 25]. بنابراین تحقیقات جدید برای بهبود دانش ما در مورد ترکیبات موجود در مواد خام که از مکان‌های مختلف برای مقاصد صنعتی برداشت می‌شوند، مورد نیاز است، زیرا مشخصات شیمیایی برگ‌های A.uva-ursi شامل مجموعه‌ای متنوع از فنل‌ها، تانن‌ها، توصیف شده است. و فلاونوئیدسین مطالعات اخیر بیشتری برای بررسی تفاوت ها در سطح بین گونه ای انجام شده است [23،26،27].

تنوع ژنتیکی (از جمله سیتوژنتیک) در سطح جمعیت، سازگاری با شرایط مختلف محیطی را ارتقا می دهد [28]. اثرات پلی پلوئیدی شدن بر تولید متابولیت های تخصصی در گیاهان دارویی و معطر اخیراً بررسی شده است [29]. در این زمینه، اندازه ژنوم پارامتری است که تا حد زیادی در ارزیابی تنوع گیاهی مورد استفاده قرار می گیرد، زیرا تنوع درون گونه ای اغلب شناسایی می شود ([30]، و منابع موجود در آن)، با بسیاری از صفات بیولوژیکی دیگر مرتبط است، و نقش مرتبطی در فرآیندهای تکاملی ایفا می کند [31-35]. ]. با این حال، مطالعات مربوط به ارتباط بین مقدار DNA هسته ای (یعنی اندازه ژنوم) و تنوع فیتوشیمیایی بسیار کمیاب است [36،37]. ارتباط بین تنوع فیتوشیمیایی و ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای هسته‌ای اما به‌ویژه plastidDNA [38]، به‌ویژه در گونه‌های گیاهی دارویی [39] و کشت شده [40] ارزیابی شده است.

Bearberry به طور گسترده در سراسر منطقه اطراف پراکنده شده است، اما بیشتر جمعیت های وحشی جمع آوری شده در اروپا در کشورهای شرقی، اتریش، سوئیس، ایتالیا و اسپانیا قرار دارند. Arctostaphylos uva-ursi در بخش میانه شرقی اسپانیا، در کوه ها، در ارتفاعات بین 550 تا 2350 متر از سطح دریا (اصل). در شمال رایج تر است، زیرا جمعیت هایی که در عرض های جغرافیایی پایین تر قرار دارند، تعداد کمتری دارند و معمولاً افراد کمتری دارند. مطالعات موجود در مورد تنوع محتوای آربوتین در اسپانیا به مقادیر متغیر از 8 درصد در جمعیت های شمال شرقی [41] و 19 درصد در مواد گیاهی اسپانیایی اشاره دارد که در مطالعه ای انجام شده در آلمان [42] ارزیابی شده است. هدف مطالعه ما توضیح عواملی از جمله اندازه ژنوم و تنوع ژنتیکی، توضیح تنوع فیتوشیمیایی در سراسر توزیع طبیعی توت خرس در اسپانیا است. نتایج ما می تواند به انتخاب مواد گیاهی برای صنایع دارویی، آرایشی و بهداشتی و غذایی کمک کند.

غذای سفید کننده پوست: CISATNCHE

2. نتایج و بحث

2.1. تجزیه و تحلیل تنوع شیمیایی

برگ‌های توت خرس نمونه‌برداری شده از 249 گیاه در حال رشد در 42 مکان اسپانیایی، و در طول دوره سه ساله، 2014-2016 (شکل 1، جدول S1)، درصدهای وزن خشک متفاوتی (dr wt) را نشان دادند که از 46.7 (LO) تا 55.1 درصد (CP)، با میانگین 2.7 ± 50.1 درصد (داده ها نشان داده نشده است). عصاره متانولی تهیه‌شده از نمونه‌های جمع‌آوری‌شده در سال‌های 2014 و 2015 برای تعیین محتوای فنل کل و آربوتین مورد استفاده قرار گرفت. ما طیف وسیعی از تغییرات پیوسته را برای هر دو پارامتر با تفاوت‌های معنی‌دار (001/0p<) در="" بین="" گیاهان="" مشاهده="" کردیم.="" عصاره="" برگ="" 80="" گیاه="" نمونه="" برداری="" شده="" در="" پاییز="" 2014="" (شکل="" 2a)="" محتویات="" کل="" فنلی="" را="" از="" 4.8="" ±="" 103.3="" میلی="" گرم="" gae/g="" در="" گرم="" وزنی="" (li{25}}="" نمونه)="" تا="" 6.5="" ±="" 206.4="" میلی="" گرم="" gae/r="" گرم="" وزنی="" نشان="" داد.="" -2)،="" در="" حالی="">آربوتینمحتویات از 92.{1}} ± 3.{3}} mg/g در وزن (AN-6) تا 194.2 ± 5.6 mg/g dr wt (SE-8) در نوسان بود. تجزیه و تحلیل عصاره های تهیه شده از برگهای جمع آوری شده در 2015 گیاه از 94 گیاه (شکل 2b) نیز تنوع فیتوشیمیایی وسیعی را نشان داد، از 3.6 ± 110.5 میلی گرم GAE / g dr wt (PI{17}}) تا 9.8 ± 200.9 میلی گرم GAE/g در گرم وزن (LO-4) در محتویات فنلی کل، در حالی که محتوای آربوتین بین 0.4 ± 87.1 میلی گرم بر گرم در گرم وزنی (ET{27}}) و 5.9 ± 211.5 میلی گرم در گرم وزنی (LI) بود. -2). علاوه بر این، صرف نظر از سال جمع آوری، تفاوت معنی داری در فنل کل وآربوتینمحتویات در بین گیاهان خرس در حال رشد در یک مکان برای اکثر جمعیت‌ها شناسایی شد (داده‌ها نشان داده نشده است). سطوح آربوتین به طور معنی‌داری با محتوای فنل کل در عصاره‌های برگ خرس همبستگی داشت زیرا ما ضرایب پیرسون قابل‌توجهی را از {{0}} برآورد کردیم. 0.332 (p=0.003) برای سال 2014، و 0.289 برای داده های 2015 (p=0.005). محتوای آربوتین 48 گیاه نمونه برداری شده در هر دو سال تفاوت معنی داری نداشت (p=0.380).

علیرغم تنوع یافت شده در جمعیت ها، و صرف نظر از سال برداشت، تجزیه و تحلیل واریانس نشان داد که محتوای آربوتین عصاره برگ خرس نیز بستگی دارد (p < {{0}}.{15}}0="" 1)="" مکان="" روی="" جمعیت="" (شکل="" 3a،b)،="" همانطور="" که="" برای="" محتوای="" فنل="" کل="" برگ‌های="" خرس="" در="" 2{21}}15="" تجزیه="" و="" تحلیل="" شد="" (p="">< 0.001،="" شکل="" 3b).="" در="" مقابل،="" تفاوت="" قابل="" توجهی="" در="" محتوای="" فنل="" کل="" مشاهده="" نشد="" (080/0="0)" در="" بین="" 10="" جمعیت="" نمونه="" برداری="" شده="" در="" سال="" 2014،="" که="" در="" یک="" منطقه="" نسبتاً="" کوچک="" واقع="" شده="" بودند،="" اما="" در="" دامنه="" وسیعی="" از="" ارتفاع،="" از="" 424="" (ba)="" پراکنده="" شدند.="" جمعیت)="" به="" 1410="" متر="" ارتفاع="" (جمعیت="" pa).="" این="" تنوع="" در="" ارتفاع="" با="" تفاوت="" در="" شرایط="" آب="" و="" هوایی="" (جدول="" s1)="" مرتبط="" بود،="" زیرا="" مکان‌هایی="" در="" ارتفاعات="" بالاتر="" با="" میانگین="" دمای="" پایین‌تر="" (ضریب="" همبستگی="" پیرسون،="" r="-0.666،" p=""><0.001) و="" بارندگی‌های="" سالانه="" بالاتر="" مشخص="" می‌شوند.="" r="0.485،" p=""><0.001)، که="" در="" نتیجه="" منجر="" به="" کاهش="" سطح="" تشعشع="" جهانی="" شد="" (r="-0.390،" p=""><0.001). علاوه="" بر="" این،="" از="" این="" مجموعه="" داده="" ها="" همبستگی="" مثبت="" کم="" اما="" معنی="" داری="" بین="" بارندگی="" سالانه="" و="" کل="" محتوای="" فنل="" گیاهان="" خرس="" تخمین="" زده="" شد="" (ضریب="" اسپیرمن="" rho="0.256،" p="0.022)،" در="" حالی="" که="" از="" مجموعه="" داده="" های="" 2015="" هنگامی="" که="" ما="" از="" جمعیت‌ها="" در="" یک="" منطقه="" بزرگ‌تر="" نمونه‌برداری="" کردیم،="" یک="" همبستگی="" مثبت="" معنی‌دار="" بین="" میزان="" بارندگی="" سالانه="" و="" محتوای="" آربوتین="" تشخیص="" دادیم="" (rho="0.246," p="0.017)." این="" همبستگی="" معنی‌دار="" نشان="" می‌دهد="" که="" گیاهان="" خرس="" که="" در="" مناطق="" شمالی="" و="" در="" ارتفاعات="" نسبتاً="" بالاتر="" رشد="" می‌کنند،="" غالباً="" رشد="" بیشتری="" نشان="">آربوتینمطالب (به ترتیب rho=0.217، p=0.035 و rho=0.269، p=0.009). همانطور که ذکر شد، این مقادیر بالاتر آربوتین به طور قابل توجهی با محتوای فنل کل بالاتر برگ های خرس همبستگی دارد که مشابه (به طور متوسط ​​19.6 ± 154.4 میلی گرم GAE / گرم در گرم وزن) با عصاره های آبی موجود در سایر گونه های گیاهی استفاده شده به عنوانآنتی اکسیدانمواد افزودنی در صنایع غذایی [43]، مانند اسرزماری (185.{2}} میلی‌گرم GAE/g در گرم وزن)، چای (149.3 میلی‌گرم GAE/g در گرم وزن)، یا گواوا (154.4 میلی‌گرم GAE/g در گرم وزنی). این نتایج با منابع قبلی مطابقت دارد و در مطالعه ای که توسط Wrona و همکاران انجام شد تأیید شد. [20] با استفاده از برخی از نمونه‌های برگ خرس اسپانیایی جمع‌آوری‌شده در سال 2015، که بیشترآنتی اکسیدانظرفیت با بالاتر همراه بودآربوتینفهرست. ژنوتیپ‌های نخبه خرس نیز می‌توانند برای این منظور شناسایی شوند، مانند افراد 1، 4، 7، و 8 از جمعیت LO که به طور متوسط ​​16.4 ± 183.3 میلی‌گرم GAE/g dr wt در دو سال مطالعه تجمع کردند.

به منظور روشن کردن بیشتر عوامل اقلیمی و جغرافیایی مؤثر بر الگوهای تغییر فنولی، مجموعه نمونه جامع تری را در پاییز 2016: 140 بوته‌های توت خرس که در 29 مکان رشد می‌کردند، انجام دادیم و پنج ترکیب فنولی را تعیین کردیم. (شکل S1a) که با شستشوی همزمان با استانداردها در یک گرادیان استونیتریل/آب شناسایی شدند (شکل S1b). تجزیه و تحلیل طیف وسیعی از تغییرات مداوم برای آربوتین، اسید کافئیک، کاتچین، میریستین، و محتوای گلوکزید کورستین را نشان داد، با تفاوت‌های قابل‌توجهی در بین گیاهانی که عموماً در جمعیت‌ها نیز مشاهده شدند (داده‌ها نشان داده نشده است). برای ترکیبات اصلی فنلی، متوجه شدیم که محتوای آربوتین از 5 ± 91.1 متغیر است. }})، در حالی که محتوای کاتچین از 4.1 ± 0.1 (AF{{2{44}}}) تا 45.5 ± 1.4 میلی گرم در گرم وزنی (LB-5) متغیر بود. با توجه به دو فلاونوئید دیگر تعیین‌شده، میریستین در برخی از گیاهان از چندین جمعیت شناسایی نشد، در حالی که به 21.2 ± 1.2 میلی‌گرم در گرم وزن در PO{3{48}}} رسید و گلوکزید کورستین از 0.1 ± 3.8 (CO) متغیر بود. -3) تا 0.8 ± 22.8 mg/g dr wt (BT{40}}). مقادیر کمتر کافئیک اسید در عصاره برگ خرس تعیین شد که از 0.0 ± 1.8 (IZ{45}}) تا 7.1 ± 0.3 mg/g dr wt (SI{50}}) متغیر بود.

علیرغم تنوع مشاهده شده در بین افراد، تفاوت های قابل توجهی بین جمعیت ها نیز برای این پنج ترکیب برآورد شد (آزمون های کروسکال-والیس، p < {{0}}.001،="" و="" p="0." 009="" محتوای="" اسید="" فورکافئیک).="" مقادیر="" بالاتر="" آربوتین="" به="" طور="" متوسط="" ​​در="" گیاهانی="" از="" جمعیت="" های="" طبیعی="" ab،="" gu،="" ln="" و="" lo="" تعیین="" شد="" (شکل="" 4a)،="" که="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" (پس="" از="" اصلاح="" bonferroni)="" با="" محتوای="" کم="" موجود="" در="" گیاهان="" از="" جمعیت="" lb="" (22.3="" ±="" 186.7)="" تفاوت="" داشت.="" 10.0="" ±="" 12.1="" ±="" 193.9="" و="" 5.2="" ±="" 169.2="" میلی="" گرم="" در="" گرم="" وزنی="" به="" 16.0="" ±="" 111.8="" میلی="" گرم="" در="" گرم="" وزنی="" در="" گرم="" وزنی.="" از="">آربوتینمحتویات گیاهانی که در 2{14}}15 نیز نمونه برداری شده بودند، تفاوت معنی داری بین سال ها نداشت (p=0.821). جمعیت LB به نوبه خود میانگین سطح کاتچین بالاتری را نشان داد (شکل 4b)، که به طور قابل توجهی با میانگین پایین محتوای این فلاونوئید شناسایی شده در جمعیت های AF و LC (32.8 ± 9.8 front to 5.7 ± 1.9 و 5.3 ± {{2{62}) متفاوت بود. }}}.۵ mg/g dr wt به ترتیب). میانگین محتوای گلوکوزید میریستین و کوئرستین در شکل 4c نشان داده شده است، با تفاوت های قابل توجهی در بین جمعیت های AB، CG، LB، و PO، با محتوای میریستین بالاتر (15.1 ± 4.{63}}، 14.6±5.7، 1{67}} به ترتیب 2.8 ± 7.7 و 3.9 ± 17.2 میلی‌گرم در گرم وزنی، در مقایسه با سطوح پایینی که در گیاهان متوسط ​​از جمعیت‌های CO و OD انباشته شد (به ترتیب 1.5 ± 1.2 و 3.6 ± 2.4 میلی‌گرم بر گرم در گرم وزنی) و همچنین به این معنی است که محتویات گلوکزید کوئرستین در جمعیت های AA، BT، CP، IZ، و LB تعیین شده است (7/3 ± 2/15، 6/4 ± 9/15، 3/2 ± 8/11، 4/3 ± 7/15 و 6/4 ± 13/1 drg/g) به طور قابل توجهی از نظر میانگین وزنی 4.6 از آن در جمعیت CO (4.{79}} ± 0.1 mg/g dr wt). در مقابل، میانگین محتوای اسید کافئیک از 0.2 ± 2.1 میلی گرم در گرم وزن در جمعیت های AB، CE، PT و SA به 3.5 ± 1.2 میلی گرم در گرم در گرم وزن در جمعیت AF یا 3.4 ± 2.2 میلی گرم بر گرم در گرم وزن در جمعیت AF نوسان کرد. جمعیت SI; بنابراین، به دلیل تنوع درون جمعیتی (میانگین محتوای 0.8 ± 2.7 میلی گرم بر گرم در گرم وزن) تفاوت معنی داری مشاهده نشد. این نتایج مکمل تغییرات متابولیت های فنلی مشاهده شده توسط Wrona و همکاران است. [20]، برای هشت مورد از مکان‌های bearberry نمونه‌برداری شده در سال 2015 که با استفاده از فناوری UPLC®-ESI-Q-TOF با MSE آنالیز شدند.

برخلاف نتایج به‌دست‌آمده در تجزیه و تحلیل انجام شده با نمونه‌های خرس در سال‌های 2014 و 2015،آربوتینمحتویات تعیین شده در 2{{10}}16 نمونه، همبستگی مثبت کم اما معنی‌دار را با تابش (rho{1}}.256، p=0.002) و حداکثر میانگین دما (rho{) نشان داد. {5}}.183، p=0.030)، و بنابراین با مقادیر بارندگی سالانه همبستگی معکوس داشتند (rho=-0.265، p=0.002). این تفاوت ها همچنین با تغییرات ارتفاع مرتبط بود (rho=0.192-0.192 p=0.023)، اما این همبستگی منفی با پایین بودن ذکر شده توضیح داده شد.آربوتینمحتویات گیاهان از جمعیت LB که در 1720 متر قرار دارند. الگوی مشابهی از تغییرات برای محتویات میریستین مشاهده شد زیرا سطوح بالاتر این ترکیب به طور قابل توجهی با گیاهان خرس که در مکان‌هایی تحت سطوح پرتوهای بالاتر رشد می‌کنند مرتبط بود (rho=0.226، p=0).{{1{{{ 12}}}07). الگوی مخالف الگوی آربوتین برای کاتچین مشاهده شد، زیرا همبستگی مثبتی بین این فلاونوئید و بارندگی سالانه تخمین زده شد (rho=0.398,p <0).{21}}{{23} }}1)،="" و="" بر="" این="" اساس،="" همبستگی="" های="" منفی="" با="" تشعشع="" و="" با="" حداکثر="" دمای="" میانگین="" تشخیص="" داده="" شد="" (rho="-0.307،" p=""><0.001 و="" rho="-0.470،" p=""><0.001، به="" ترتیب).="" این="" تنوع="" در="" عوامل="" اقلیمی="" توضیح="" داد="" که="" هم="" ارتفاع="" و="" هم="" عرض="" جغرافیایی="" بر="" محتوای="" کاتچین="" برگ‌های="" خرس="" تأثیر="" می‌گذارند="" (rho="0.410." و="" 0.490،="" به="" ترتیب،="" p=""><0.001). تجزیه="" و="" تحلیل="" مؤلفه="" های="" اصلی="" با="" داده="" های="" فیتوشیمیایی،="" اقلیمی="" و="" جغرافیایی="" مربوط="" به="" 29="" مکان="" نمونه="" برداری="" شده="" در="" سال="" 2016،="" که="" در="" آن="" دو="" مؤلفه="" اول="" 60="" درصد="" از="" تغییرات="" مشاهده="" شده="" را="" توضیح="" می="" دادند،="" این="" نتایج="" را="" تأیید="" کرد="" (شکل="" 5).="" ما="" هیچ="" ارتباط="" معنی‌داری="" بین="" محتوای="" گلوکوزید="" کافئیک="" یا="" کوئرستین="" در="" گیاهان="" خرس="" و="" عوامل="" اقلیمی="" یا="" جغرافیایی="" مشاهده="" نکردیم،="" اگرچه="" همبستگی="" جزئی="" اما="" معنی‌دار="" بین="" محتوای="" گلوکزید="" میریستین="" و="" کورستین="" برآورد="" کردیم="" (rho="0.184،" p="" {{31}="" }.030)و="" بین="" محتوای="" میریستین="" و="" اسید="" کافئیک="" (rho="−0.176," p="0.037)" از="" گیاهان="">

الگوهای متضاد تغییرات آب و هوایی مشاهده شده درآربوتینمحتوای گیاهان خرس نشان می دهد که اگرچه بیوسنتز این متابولیت احتمالاً در شرایط تابش و دمای بالاتر افزایش می یابد، احتمالاً کمبود آب یک عامل محدود کننده برای A. uva-ursi در مناطق مدیترانه و جنوبی است. دل واله و همکاران [44] یک الگوی عرضی از تجمع فلاونوئیدهای Silene littorea (Caryophyllaceae) در اسپانیا را گزارش کرد، که در آن محتوای فلاونوئیدهای بالاتر در جمعیت های جنوبی تعیین شد، زیرا عرض جغرافیایی با تابش UV-B و دما همبستگی منفی داشت، و با بارندگی مثبت بود. تشعشع جهانی یک گرادیان عرضی واضح با بروز بیشتر در جنوب و شرق شبه جزیره ایبری را نشان می دهد، و همچنین یک اثر نوروگرافی قابل توجهی وجود دارد زیرا تداوم ابر، بروز این تابش را در ارتفاعات بالاتر تعدیل می کند. نقشه تابش UV اسپانیا [45] همبستگی بالا (r > 0.9) بین داده‌های UV-B و تشعشع جهانی ذکر شده است. بر اساس این مرجع، جمعیت های خرس که میانگین بالاتری را نشان دادندآربوتینمحتویات مطالعه ما بیشتر در مناطقی تحت سطوح تابش UV-B 2403-2451 J/m2 قرار دارند.

نتایج ما برای تنوع کاتچین در توت خرس یک الگوی جغرافیایی (شکل 5) و با مطالعات انجام شده در سایر گونه های گیاهی از کشورهای شمالی اروپا را نشان داد. محتویات بیشتری از متابولیت‌های تخصصی، مانند فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها، در گیاهانی که در عرض‌های جغرافیایی بالاتر رشد می‌کنند، گزارش شده است، احتمالاً به دلیل دوره‌های طولانی‌تر نور روز و دمای پایین‌تر در شب [46]. بنابراین، محتوای فنلی محلول در سوزن‌های Juniperus communis با عرض جغرافیایی و ارتفاع در جمعیت فنلاند افزایش یافت [47]، و همچنین 10 تا 19 درصد محتوای فنلی بالاتر در عرض جغرافیایی بالاتر در میوه‌های سه گونه Ribes یافت شد. ارقام در دو مکان فنلاندی تجزیه و تحلیل شدند [48]. این نویسندگان محتوای فنل کمتر را با سطوح بالاتر تشعشع و دما مرتبط کردند. محتوای فلاونوئیدها در میوه‌های دو گونه Vaccinium (همچنین از خانواده Ericaceae) یک گرادیان جغرافیایی با مقادیر بالاتر افلاونوئیدها در عرض‌های جغرافیایی شمالی نشان داد [49،50].

در رابطه با تنوع ارتفاعی، سطوح بالاتری از فلاونوئیدها در جمعیت های گونه های دیگر Ericaceae، Calluna vulgaris، که در ارتفاعات بالاتر رشد می کنند، تعیین شد [51]. شیب های ارتفاعی همچنین بر متابولیسم تخصصی جمعیت های اسپانیایی Arnica montana [52] و Quercus robur [53] تأثیر گذاشت. کار اخیر به ارتباط مثبت معنی داری بین غلظت کل فنول های برگ و ارتفاع اشاره کرد، که گرادیان تنها به فلاونوئیدها بستگی دارد، بنابراین نشان می دهد که این ها ترکیبات رابطه را برای کل فنل ها ایجاد کردند. این نتایج با برآوردهای ما برای الگوی محتوای کاتچین مطابقت دارد. در نهایت، یک گرادیان بارندگی با تفاوت‌های قابل‌توجهی در ترکیب پلی‌فنل‌ها در یک درختچه دارویی آفریقایی (Myrothamnus flabellifolia) که تفاوت‌های متابولومیک آن با ساختار ژنتیکی جمعیت‌ها همخوانی داشت، مرتبط بود [54].

CISTANCHE می تواند ضد پیری

2.2. تجزیه و تحلیل داده های اندازه و توالی ژنوم

مقادیر اندازه ژنوم 2C گیاهان خرس از 2.50 تا 3.15 pg بود (جدول 1). تفاوت جزئی در مقدار DNA هسته ای در بین جمعیت ها یافت شده است (Kruskal-Wallis χ2=87.639, df=36, p=3.39 × 10-6). آزمون دان با تصحیح بونفرونی تفاوت‌های آماری معنی‌داری را بین جمعیت‌های AL و SI نشان داد (Z=-3.972، p=0.024)، LE و SI (Z=-4.196، p {{{ 21}}.009)، و SEand SI (Z=−4.236, p=0.008). جمعیت Pontils (PO) نوع محلی A. uva-ursi var.crassifolius است که متعاقباً به عنوان A. uva-ursi subsp ترکیب شد. crassifolius، و در حال حاضر از نظر طبقه بندی در نظر گرفته نمی شود (به مقدمه مراجعه کنید)، دارای یک مقدار متوسط ​​(2.88 pg)، در محدوده مقادیر به دست آمده در سایر جمعیت های گونه است. این اولین مطالعه جمعیتی گسترده در مورد مقدار DNA هسته ای در گونه و کل جنس است زیرا تنها اطلاعات موجود تا کنون از یک جمعیت بالکان از همان تاکسون می آید [55]. مقدار 2C که در آنجا گزارش شده است، 2.49 pg، دقیقاً در حد پایینی دامنه تغییرات مجموعه داده مورد بررسی قرار می گیرد. هیچ ارتباطی بین مقادیر اندازه ژنوم و ارتفاع جمعیت یافت نشد. مقدار DNA افراد همبستگی ضعیف مثبت و معنی داری را با مقدار نشان دادآربوتینزمانی که داده‌های 158 گیاه توت خرس مقایسه شدند (rho=0.187، p=0.018)، در حالی که هیچ ارتباط معنی‌داری بین اندازه ژنوم و سایر متغیرها یافت نشد. این نتیجه با افزایش گزارش شده در تولید متابولیت های تخصصی که به طور کلی در گیاهان دارویی و معطر پس از پلی پلوئیدی شدن مشاهده می شود، مطابقت دارد [29].

توالی‌های جدید تولید شده برای فاصله‌کننده‌های بین‌ژنی rpl{{0}}trnL و psbE-petN در دو ماتریس (به ترتیب حاوی 566 و 874 جفت باز) که در یک ماتریس منفرد 144{{15} bp به هم پیوسته بودند، تراز شدند. متوسط سطوح تغییرات در این مناطق پلاستید شناسایی شد (شش جایگزینی نوکلئوتیدی و چهار ایندل). ده هاپلوتیپ مختلف با تنوع هاپلوتیپ کل (Hd) 468.468.0 یافت شد (جدول 1). اکثر جمعیت ها (21) فقط یک هاپلوتیپ داشتند، در حالی که پنج نفر از آنها تنوع خاصی را در بین افراد به نمایش گذاشتند. فراوان ترین هاپلوتیپ 1 بیشترین فراوانی (71.4 درصد) و پس از آن هاپلوتیپ 2 (15.2 درصد) را نشان داد، در حالی که بقیه آنها فرکانس بسیار پایین تری (0.04-0.01 درصد) را نشان دادند. توزیع جغرافیایی هاپلوتیپ ها در شکل 6 نشان داده شده است. هاپلوتیپ 1 در 32 جمعیت یافت شد - در 18 مورد از آنها ثابت شد - در تمام مناطق نمونه برداری شده به جز برای جنوبی ترین محلات توزیع شده است. هاپلوتیپ 2 در ده جمعیت یافت شد و هاپلوتیپ انحصاری در دو جنوبی ترین جمعیت (HU و LV) و همچنین در PR بود. هاپلوتیپ 4 از سه جمعیت پیرنه خصوصی بود، در حالی که هاپلوتیپ 8 در دو جمعیت از شبه جزیره ایبری شرقی ظاهر شد. با توجه به روابط تکاملی نشان داده شده در شبکه صرفه جویی (شکل 6)، اکثر هاپلوتیپ ها با یک یا دو مرحله جهش به هم متصل می شوند. هاپلوتایپ 1 یک موقعیت مرکزی را اشغال می کند و هفت هاپلوتیپ به آن متصل هستند.

آزمایش Mantel بین ماتریس فاصله ژنتیکی و شیمیایی pDNA همبستگی ضعیف اما معنی‌دار (r=0.301؛ p=0.048) بین تمایز ژنتیکی و غلظت پنج جزء شیمیایی اندازه‌گیری شده برای مجموعه داده 2016. آزمون منتل هیچ ارتباط معنی داری بین فاصله ژنتیکی و جغرافیایی در بین 25 جمعیت نمونه برداری شده در سال 2016 نشان نداد (r=0.103, p=0.207) یا بین فواصل جفتی شیمیایی و جغرافیایی در بین اینها 25 جمعیت (r=0.191, p=0.050). تنوع فیتوشیمیایی گزارش شده در اینجا برای جمعیت های وحشی خرس در سراسر اسپانیا با سطوح متوسط ​​تنوع هاپلوتیپ pDNA تکمیل می شود، که تمایز ژنتیکی شمال به جنوب است که در جمعیت های توت خرس قابل مقایسه با الگوهای فیلوژئوگرافی موجود در گیاهان دیگر است (به عنوان مثال، [56-58]). همه این همگنی در گیاهان با ظرفیت تولیدمثلی پایین [59] انتظار می رود، به عنوان A.uva-ursi، که نرخ جوانه زنی ضعیف و نرخ مرگ و میر بالای گیاهچه های جوان را نشان می دهد [4]. فاصله‌های دوتایی برآورد شده از پروفایل‌های پنج فنلی شکل 6. توزیع جغرافیایی هاپلوتیپ‌های pDNA بر روی جمعیت‌های ایبری Arctostaphylos uva-ursi. کدهای جمعیتی مطابق با جدول S1 است و نمودارهای دایره‌ای نشان‌دهنده درصد افراد هستند که هر هاپلوتیپ را در هر جمعیت نشان می‌دهند. مستطیل، شبکه آماری صرفه‌جویی که روابط تکاملی TE را نشان می‌دهد n هاپلوتیپ پلاستید موجود در جمعیت A. uva-ursi نشان داده شده است. هر نوار در امتداد خطوطی که هاپلوتیپ‌ها را به هم متصل می‌کند، نشان‌دهنده یک مرحله جهش در نواحی pDNA تعیین‌شده در این مطالعه است. آزمون Mantel بین ماتریس‌های فاصله زوجی ژنتیکی و شیمیایی pDNA، همبستگی ضعیف اما معنی‌دار را نشان داد (r=0}.301; p {{28 }}.048) در میان تمایز ژنتیکی و غلظت پنج جزء شیمیایی اندازه‌گیری شده برای مجموعه داده‌های 2016. آزمون منتل هیچ ارتباط معنی داری بین فاصله ژنتیکی و جغرافیایی در بین 25 جمعیت نمونه در سال 2016 (r=0.103, p=0.207) یا بین فواصل جفتی شیمیایی و جغرافیایی در بین این 25 جمعیت نشان نداد. r=0.191, p=0.050). بنابراین تنوع فیتوشیمیایی گزارش شده در اینجا برای جمعیت های وحشی خرس در سراسر اسپانیا با سطوح متوسط ​​تغییر هاپلوتیپ pDNA تکمیل می شود، که تمایز ژنتیکی شمال به جنوب است که در جمعیت های توت خرس قابل مقایسه با الگوهای فیلژوگرافی موجود در سایر گیاهان است (به عنوان مثال، [56-58]). همه این همگنی ها انتظار می رود گیاهانی با ظرفیت تولیدمثلی پایین [59]، به عنوان A.uva-ursi، که نرخ جوانه زنی ضعیف و نرخ مرگ و میر بالای نهال های جوان را نشان می دهد [4]. این الگوی تنوع ژنتیکی و فیتوشیمیایی (که همانطور که گفته شد با فواصل جغرافیایی مرتبط نبود) و همچنین همبستگی ضعیف اما معنی دار بین اندازه ژنومی و محتوای آربوتین، ممکن است نشان دهد که تنوع ژنومی طبیعی بر عملکرد ترکیبات فنلی در A. uva-ursi با این حال، m مولکولی بیش متغیر آرکرها در نمونه‌گیری جمعیتی گسترده‌تر برای تأیید این الگوهای فیلژوگرافی و ارتباط بین تنوع ژنتیکی و بیوشیمیایی ضروری هستند.

سیستانچ دارای اثرات ضد اکسیداسیون است

3. مواد و روشها

3.1. ماده ی گیاهی

برای تجزیه و تحلیل فیتوشیمیایی، در مجموع 249 گیاه خرس در 42 جمعیت در پاییز 2014، 2015 و 2016 نمونه برداری شد که نماینده پراکنش طبیعی این گونه گیاهی در شبه جزیره ایبری است (شکل 1 و جدول S1). ابتدا، در پاییز 2014، ما شاخه های انتهایی را از 80 گیاه در ده جمعیت اسپانیایی (AG، AN، BA، LI، LO، PE، PÁ، SR، SC، و SE) که در یک منطقه نسبتا کوچک (80 × 50 کیلومتر تقریباً) قرار داشتند، جمع آوری کردیم. در شمال اسپانیا اما در دامنه وسیعی از ارتفاع (424-1410 متر از سطح دریا). دوم، در پاییز 2015، ما 48 گیاه از شش مورد از این جمعیت ها (AG، LI، LO، PA، SE، و SR) و 46 گیاه خرس را از شش جمعیت واقع در عرض های جغرافیایی پایین (AL، CH، ET، HU، LV) جمع آوری کردیم. ، و PI). برای هر جمعیت، ما هشت گیاه را که حداقل 5 متر از هم جدا شده بودند، نمونه برداری کردیم، به جز در HU، که در آن تنها شش نفر را یافتیم. سوم، در پاییز 2016، در مجموع 140 گیاه در 29 مکان مختلف (1 تا 6 نفر از هر کدام) شامل 26 محل جدید اسپانیایی (IZ، CE، BT، MO، AA، GU، SI، AF، SA، PT، AB، CG، OD، PS، LB، CO، LE، MA، CP، PO، MZ، AV، LC، AY، LN، و ZU). نمونه برداری ما دامنه ارتفاعی از 534 تا 1750 متر را در بر می گیرد. در مجموع، 42 جمعیت طیف وسیعی از شرایط آب و هوایی را نشان می‌دهند (جدول S1): میانگین دمای حداکثر 2-تغییر چندگانه (13-26 درجه سانتیگراد) و بارش سالانه از 399 (ZU) تا 1589 میلی‌متر (PT) در نوسان است. تابش جهانی بین 4.2 تا 5.1 کیلووات ساعت بر متر مربع در روز است. شش تا ده شاخه انتهایی (طول 15 تا 20 سانتی‌متر) برای هر گیاه جمع‌آوری شد تا 6 تا 15 گرم برگ سالم به دست آید، که سپس جدا شده و در دمای 60 درجه سانتیگراد به وزن ثابت (3 تا 4 روز) خشک شدند. پس از تعیین وزن خشک، برگها به صورت دستی در ملات همگن شدند و تا زمان تجزیه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. این ماده گیاهی برای تعیین فنل کل و HPLC استفاده شد.

مواد برگ برای ارزیابی‌های فلوسایتومتری از برگ‌های تازه 178 فرد که در مجموع 37 جمعیت بودند به‌دست آمد (جدول 1). نمونه‌ها از 33 جمعیت ذکر شده در بالا، و از چهار جمعیت جدید (BE، JO، و PR در اسپانیا، و EN در آندورا) که در آن‌ها برگ‌ها در بهار 2017 جمع‌آوری شدند، و بنابراین در آنالیز شیمیایی گیاهی لحاظ نشدند (شکل 1 و جدول S1). از یک تا شش نفر در هر جمعیت به صورت تکراری اندازه گیری شد. مواد برگ برای استخراج DNA در ژل سیلیکا خشک و در دمای اتاق نگهداری شدند. تجزیه و تحلیل تنوع DNA در مجموع 105 گیاه از 35 مکان انجام شد (جدول 1).

کوپن‌های گیاهی از 46 جمعیت خرس مورد مطالعه در هرباریوم قبل از میلاد مسیح، موسسه گیاه‌شناسی بارسلونا، در هرباریوم BCN، مرکز اسناد زیستی تنوع گیاهی، دانشگاه بارسلونا یا در هرباریوم JACA، انستیتو پیرنایکو د E قرار می‌گیرد. CSIC).

3.2. تهیه عصاره برگ و تعیین فنل کل

سه تکرار از عصاره برگ خرس با استفاده از 50 میلی گرم نمونه خشک و 10 میلی لیتر متانول 80 درصد تهیه شد. لوله‌ها به مدت 3{16}} دقیقه در حمام اولتراسونیک انکوبه شدند و سپس عصاره‌ها (0.45 میلی‌متر) فیلتر شدند و تا زمان آنالیز در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. محتوای فنلی کل در عصاره های تهیه شده از نمونه های جمع آوری شده در سال های 2014 و 2015 تعیین شد. ما از روش Folin-Ciocalteume [60,61] با تغییرات جزئی پیروی کردیم: به 0.1 میلی لیتر عصاره، 0.4 میلی لیتر متانول (80 درصد)، 0.5 میلی لیتر لوف فولین- معرف سیوکالتیو و 8 میلی لیتر آب فوق خالص اضافه شد. پس از 5 دقیقه در حمام اولتراسونیک، 1 میلی لیتر Na2CO{22}} درصد (w/v) اضافه شد. نمونه ها به مدت 30 دقیقه قبل از اندازه گیری جذب در 760 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مرئی UV (CARY 50 BIO، Varian، AgilentTechnologies) در تاریکی رها شدند. نتایج در معادل اسید گالیک (GAE) بیان شد. یعنی میلی گرم اسید گالیک در گرم وزنی، با استفاده از منحنی استاندارد اسید گالیک (40-340 میکروگرم بر گرم).

3.3. تعیین آربوتین و سایر متابولیت های فنلی

محتویات فنلی عصاره‌های متانولی برگ خرس بوسیله RP-HPLC با استفاده از سیستم HPLC-UV/Vis (LaChrom Merck Hitachi L-7400) با کینتکس 5 میکرومتر-EVO C18 (250 میلی‌متر × 4.6 میلی‌متر) اندازه‌گیری شد. ) ستون و جذب در 280 نانومتر تعیین شد. عصاره‌های نمونه‌های جمع‌آوری‌شده در سال‌های 2014 و 2015 به نسبت 1:10 (V/V) رقیق شدند و با فاز متحرک متانول و استونیتریل تزریق شدند. برنامه گرادیان شامل 0-5 دقیقه، 25 درصد متانول بود. 5-6 دقیقه، 100 درصد؛ 6 تا 10 دقیقه، 100 درصد و 10 تا 20 دقیقه، دوباره 25 درصد متانول. سرعت جریان 1 میلی لیتر در دقیقه و حجم تزریق 20 میکرولیتر بود. در این شرایط زمان ماندگاری ازآربوتین2.6 دقیقه بود که ما را قادر می‌سازد غلظت این ترکیب را با استفاده از منحنی کالیبراسیون تعیین شده با 6 رقت استاندارد، از 40 تا 340 میکروگرم بر گرم، با ضریب همبستگی r= 0 تعیین کنیم. 9997. عصاره‌های نمونه‌های جمع‌آوری‌شده در سال 2016 با استفاده از فاز متحرک متانول و آب با برنامه گرادیان زیر آنالیز شدند: 0-5 دقیقه، 10 درصد متانول. 5-6 دقیقه، 20 درصد؛ 6 تا 10 دقیقه، 20 درصد؛ 10-11 دقیقه، 30 درصد؛ 11 تا 15 دقیقه، 30 درصد؛ 15 تا 16 دقیقه، 40 درصد؛ 16-20 دقیقه، 40 درصد؛ 20 تا 21 دقیقه، 50 درصد؛ 21 تا 25 دقیقه، 50 درصد؛ 25-26 دقیقه، 60 درصد؛ 26 تا 30 دقیقه، 60 درصد؛ 30 تا 31 دقیقه، 10 درصد؛ و 31-36 دقیقه، دوباره 10 درصد متانول. در این شرایط تصمیم گرفتیمآربوتین و4 ترکیب فنلی دیگر: کافئیک اسید، کاتچین، میریستین و کوئرستین-3-O-glucopyranoside با استفاده از منحنی های کالیبراسیون مربوطه که با 5 رقت استاندارد (25-500 میکروگرم در میلی لیتر) ایجاد شده است. ,که ضرایب همبستگی {{10}}.9992 برای کاتچین (زمان ماند 12.{20}} دقیقه)، 0.9924 برای کافئیک اسید (زمان ماند 13.4 دقیقه)، 0.9981 برای کوئرستین را نشان داد{16} }O-glucoside (زمان ماند 23.4 دقیقه)، و 0.9997 برای myricetin (زمان ماند 25.1 دقیقه).

متانول و استونیتریل در درجه HPLC بودند و از Panreac (بارسلون، اسپانیا) خریداری شدند.آربوتیناسید کافئیک و اسید گالیک و همچنین معرف Folin–Ciocalteu از سیگما آلدریچ (بارسلونا، اسپانیا) خریداری شده‌اند. استانداردهای کاتچین و کوئرستین-3-O-glucopyranosides از Extrasynthese (Genay Cedex، فرانسه) خریداری شد، در حالی که myricetin از Alfa Aesar (کارلسروهه، آلمان) خریداری شد.

نتایج حاصل از تعیین‌های شیمیایی با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 25 و R 3.5.2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. به عنوان آزمون مقایسه چندگانه کروسکال-والیس و دان با تصحیح بونفرونی. ما همچنین ضرایب همبستگی (پیرسون یا اسپیرمن بسته به اینکه داده ها از توزیع نرمال پیروی می کردند) بین متغیرها، از جمله اندازه ژنوم، تخمین زدیم.

سیستانچ دارای اثرات ضد اکسیداسیون است

3.4. تخمین اندازه ژنوم و توالی یابی DNA

اندازه ژنوم گیاهان خرس با روش فلوسیتومتری در مراکز Científicsi Tecnològics، Universitat de Barcelona (CCiTUB) به دنبال روش‌هایی که در Pellicer و همکاران توضیح داده شده است، برآورد شد. [62].Petunia hybrida Vilm. 'PxPc6' (2C=2.85 pg) به عنوان استاندارد داخلی استفاده شد. دانه های استاندارد توسط Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif، CNRS-I2BC (Gif-sur-Yvette، فرانسه) ارائه شد. محتویات DNA هسته ای (2C) با ضرب محتوای DNA شناخته شده استاندارد در ضریب بین محاسبه شد. موقعیت های پیک (حالت) گونه هدف و استاندارد در هیستوگرام شدت فلورسانس، با فرض یک همبستگی خطی بین سیگنال های فلورسنت از هسته های رنگ آمیزی شده نمونه ناشناخته، استاندارد داخلی شناخته شده و مقدار DNA [63].

تقریباً 20 میلی‌گرم از بافت برگ خشک شده با سیلیس برای استخراج DNA با استفاده از پروتکل CTAB [64] با تغییرات جزئی استفاده شد. کیفیت DNA کل با اسپکتروفتومتر NanoDrop 1000 (ThermoScientific، Wilmington، DE، USA) بررسی شد. نواحی بین ژنی پلاستیدی rpl{4}}trnLand psbE-petN، و همچنین ناحیه DNA ریبوزومی هسته ای ITS، تکثیر شدند و برای هر جمعیت، 3 نفر تعیین توالی شدند. توالی ITS هیچ گونه تغییری در 105 فرد مورد تجزیه و تحلیل ارائه نکرد، به جز چند موقعیت که پلی‌مورفیسم‌های نوکلئوتیدی درون ژنومی را نشان می‌دهد. بنابراین، این منطقه DNA ریبوزومی هسته ای از تجزیه و تحلیل بیشتر حذف شد. سایر مناطق DNA پلاستید (یعنی ndhF؛ ndhF-rpl32؛ psbA-trnH؛ psbD-trnT؛ rps16؛ و trnL-trnF) نیز مورد آزمایش قرار گرفتند اما به دلیل تنوع کم یا مشکلات توالی یابی نادیده گرفته شدند. روش تقویت همانطور که در Vitales و همکارانش توضیح داده شد انجام شد. [65]. توالی‌یابی مستقیم بخش‌های DNA تقویت‌شده با Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems، Foster City، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) در Unitatde Genòmica، CCiTUB، روی یک آنالایزر DNA ABI PRISM 3700 (PE Biosystems) انجام شد. دنباله‌های rpl{17}}trnL andpsbE-petN با نسخه BioEdit 7.1.3.0 [66] مونتاژ شدند، با ClustalW MultipleAlignment نسخه 1.4 [67] تراز شدند و به صورت دستی تنظیم شدند. شماره دسترسی GenBank در جدول S2 ارائه شده است.

3.5. اندازه ژنوم و تجزیه و تحلیل ژنتیکی

یک آزمون ناپارامتریک کروسکال-والیس برای بررسی تفاوت های آماری معنی دار در مقادیر 2C در بین جمعیت ها انجام شد. همچنین برای تعیین اینکه کدام جمعیت ها تفاوت معنی داری بین آنها نشان دادند، آزمون مقایسه چندگانه دان نیز انجام شد. تصحیح Bonferroni برای به حداقل رساندن خطای نوع I (مثبت کاذب) اعمال شد.

پارامترهای تنوع ژنتیکی (محل‌های چندشکلی، سایت‌های اطلاعاتی صرفه‌جویی، تعداد هاپلوتیپ‌ها و تنوع کل هاپلوتیپ) با استفاده از DnaSP v6 [68] برآورد شدند. هاپلوتیپ های پلاستید در یک مجموعه داده ترکیبی که شامل هر دو ناحیه rpl32-trnL و psbE-petN بود، تعیین شدند. روابط تکاملی بین هاپلوتیپ ها بر اساس یک شبکه صرفه جویی ساخته شده با استفاده از TCS [70] همانطور که در PopArt [71] پیاده سازی شده است، استنباط شد. حداکثر تعداد تفاوت‌های حاصل از تعویض‌های تک در میان هاپلوتیپ‌ها با محدودیت اطمینان 95 درصد محاسبه شد.

برای تجزیه و تحلیل رابطه بین داده های ژنتیکی و شیمیایی از آزمون Mantel استفاده شد. ابتدا، ما فاصله فنوتیپی را در بین 25 جمعیت با استفاده از داده‌های گیاهان خرس جمع‌آوری‌شده در سال 2016، که برای پنج جزء فنولی اندازه‌گیری شده بود، تخمین زدیم.آربوتینکاتچین، کافئیک اسید، کوئرستین و میریستین). ما از R Commander برای استانداردسازی این داده ها [72] و متعاقباً برای محاسبه فاصله شیمیایی حاصل از ماتریس استاندارد شده با تابع "Dist" onR بر اساس فواصل اقلیدسی استفاده کردیم. دوم، ماتریس فاصله ژنتیکی جمعیت Nei بین 25 جمعیت با استفاده از DnaSP v6 محاسبه شد. در نهایت، ما فاصله‌های جغرافیایی زوجی را در میان این جمعیت‌ها با استفاده از بسته "geodist" در R محاسبه کردیم. همبستگی‌های زوجی بین ماتریس‌های فاصله با استفاده از آزمون Mantel با 10،{4}} جایگشت با functionmantel موجود در بسته R "وگان" محاسبه شد [ 73].

4. نتیجه گیری

همه بوته های توت خرس مورد تجزیه و تحلیل را نشان دادندآربوتینمطالب بالاتر از 7 درصد بنابراین، این ماده گیاهی برای آماده سازی گیاهی مناسب است. تجزیه و تحلیل ما نشان داد که مقدار آربوتین بالاتر از آربوتین (تا 9 درصد) ارجاع شده توسط Parejo و همکاران. [40]، که چهار جمعیت واقع در شمال شرقی پیرنه را در ارتفاعات 1580-2030 متر تجزیه و تحلیل کرد و تفاوت های کم در محتوای آربوتین را در بین جمعیت ها تشخیص داد. علاوه بر این، بسیاری از مقادیر تعیین شده در اینجا در محدوده مواد گیاهی انتخاب شده برای کشت در لهستان [74] و در توافق با مقدار بالا هستند.آربوتینمحتوای نمونه‌های برگ خرس اسپانیایی گزارش شده توسط Sonnenschein و Tegtmeier [42] هنگام انتخاب گیاهان برای کشت در آلمان. ژنوتیپ‌های نخبه A. uva-ursi را می‌توان به صورت رویشی تکثیر کرد، اما اکثر کلون‌های به‌دست‌آمده در طول استقرار مزرعه شکست خوردند، که بهره‌برداری از این منابع را محدود کرد. ما همچنین تغییرات موجود در محتوای سه فلاونوئید (کاتچین، میریستین، و کوئرستین گلوکوزید)، و همچنین اسید کافئیک را در میان جمعیت‌های خرس اسپانیایی، و چگونگی عوامل اقلیمی (عمدتاً تشعشعات جهانی و بارندگی)، که با عرض و ارتفاع همبستگی دارند، توصیف کردیم. گرادیان، بر آن تنوع تأثیر می گذارد. در همان زمان، با وجود سطوح پایین تنوع هاپلوتیپ و اندازه ژنوم تعیین‌شده در ایبری A. uva-ursi، تمایز ژنتیکی و سیتوژنتیکی جمعیت‌ها ضعیف اما به طور قابل‌توجهی با تنوع فیتوشیمیایی مرتبط بود. به طور کلی، این نتایج نشان می‌دهد که برای توضیح تنوع فیتوشیمیایی درون گونه‌ای موجود در گیاهان از جمعیت‌های وحشی، باید تأثیر عوامل ژنتیکی و غیرزیستی در نظر گرفته شود.

اثرات CISTANCHE

منابع

1. مور، بی.دی. اندرو، RL; کولهیم، سی. فولی، WJ توضیح تنوع درون گونه ای در متابولیت های ثانویه گیاهی در یک زمینه اکولوژیکی. فیتول جدید. 2014، 201، 733-750. [CrossRef] [PubMed]

2. Cheynier، V. کنت، جی. دیویس، KM; Lattanzio، V. فنولیک های گیاهی: پیشرفت های اخیر در بیوسنتز، ژنتیک و اکوفیزیولوژی آنها. فیزیول گیاهی بیوشیمی. 2013، 72، 1-20. [CrossRef]

3. برنال، م. لورنز، ال. جولکونن-تیتو، آر. بادوسا، جی. Verdaguer, D. تغییرات ارتفاعی و فصلی ترکیبات فنلی در برگ و کوتیکول Buxus sempervirens. فیزیول گیاهی بیوشیمی. 2013، 70، 471-482. [CrossRef] [PubMed]

4. آپتون، آر (ویرایش) Uva-ursi Leaf. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. استاندارد تجزیه و تحلیل، کنترل کیفیت، و درمان. داروسازی گیاهی آمریکایی: Scotts Valley, CA, USA, 2008; 30p

5. آژانس دارویی اروپا. گزارش ارزیابی Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. فولیوم. EMA/HMPC/750266/2016؛ آژانس دارویی اروپا: آمستردام، هلند، 2018.6. Kanlayavattanakul، M. لوریث، N. گیاهان و محصولات طبیعی برای درمان پرپیگمانتاسیون پوست - مروری. Planta Med. 2018، 84، 988-1006. [CrossRef]

7. میگاس، پ. Krauze-Baranowska، M. اهمیت آربوتین و مشتقات آن در درمان و آرایشی. Phytochem. Lett. 2015، 13، 35-40. [CrossRef]

8. Seo, DH; یونگ، جی اچ. لی، جی. جئون، ای جی; کیم، دبلیو. پارک، CS تولید بیوتکنولوژیک آربوتین (- و -آربوتین)، عوامل روشن کننده پوست، و مشتقات آنها. Appl. میکروبیول. بیوتکنول. 2012، 95، 1417-1425.[CrossRef]

9. زو، ایکس. تیان، ی. ژانگ، دبلیو. ژانگ، تی. گوانگ، سی. Mu, W. پیشرفت اخیر در تولید بیولوژیکی -arbutin. Appl. میکروبیول. بیوتکنول. 2018، 102، 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Davey, M. متابولیسم ثانویه در کشت سلولی گیاهی. Incyclopedia of Applied Plant Sciences, 2nd ed.;Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, Eds.; الزویر: لندن، بریتانیا، 2017; جلد 2، ص 462-467. [CrossRef]

11. کورکین، VA; Ryazanova، TK; داوا، ED; Kadentsev، VI اجزای تشکیل دهنده برگ Arctostaphylos uva-ursi. Chem. نات. Compd. 2018، 54، 278-280. [CrossRef]

12. پاندا، ا. پتروچی، آر. ماروسو، جی. مولتری، جی. Romana-Gallo، F. HPLC-PDAESI-TOF/MS متابولیک پروفایل Arctostaphylos pungens و Arctostaphylos uva-ursi: مطالعه مقایسه ای ترکیبات فنلی از عصاره متابولیک برگ. فیتوشیمی 2015، 115، 79-88. [CrossRef]

13. Olennikov، DN; Chekhirova، GV 60-Galloylpicein و سایر ترکیبات فنلی از Arctostaphylos uva-ursi.Chem. نات. Compd. 2013، 49، 1-7. [CrossRef]

14. Brewer، MS آنتی اکسیدان های طبیعی: منابع، ترکیبات، مکانیسم های عمل، و کاربردهای بالقوه. Rev. Food Sci. Food Saf. 2011، 10، 221-247. [CrossRef]

15. آماروویچ، آر. Pegg، RB; رحیمی مقدم، پ. بره، بی. Weil، JA ظرفیت مهار رادیکال های آزاد و فعالیت آنتی اکسیدانی گونه های گیاهی منتخب از چمنزارهای کانادا. مواد شیمیایی مواد غذایی 2004، 84، 551-562.[CrossRef]

16. نجار، ر. O'Grady، MN; O'Callaghan، YC; O'Brien، NM; Kerry, JP ارزیابی پتانسیل آنتی اکسیدانی عصاره دانه انگور و توت خرس در گوشت خوک خام و پخته. علم گوشت 2007، 76، 604-610. [CrossRef][PubMed]

17. مکینیک، IG; اسکروزا، دی. لیوبنکوف، آی. کاتالینیچ، وی. Šimat، V. متابولیت های فنولیک با پتانسیل آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی از گیاهان و ادویه های مدیترانه ای استفاده می شود. Foods 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. محد آزمون، ن.ا. Gallego، MG; سگویا، اف. عبدالله، س. شعرانی، س.م. آلماجانو، MP مطالعه خواص عصاره برگ خرس به عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی در غذاهای مدل. آنتی اکسیدان ها 2016، 5، 11.[CrossRef] [PubMed]

19. Pegg, RB; آماروویچ، آر. Naczk، M. فعالیت آنتی اکسیدانی پلی فنولیک ها از عصاره برگ خرس (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) در سیستم های گوشتی. در ترکیبات فنلی در غذاها و محصولات بهداشتی طبیعی؛ شهیدی، ف.، هو، سی تی، ویرایش. انجمن شیمی آمریکا: واشنگتن، دی سی، ایالات متحده آمریکا، 2005; صفحات 67-82.[CrossRef]

20. ورونا، م. بلاسکو، اس. بسریل، آر. نرین، سی. فروش، ای. Asensio، E. نشانگرهای آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی توسط UPLC®-ESI-Q-TOF-MSE یک بسته بندی فعال چند لایه جدید بر اساس Arctostaphylos uva-ursi. Talanta2019، 196، 498-509. [CrossRef]

21. مایر، م. اولبرمن، آل. رنر، ام. Weidner, E. غربالگری گیاهان دارویی اروپایی بر روی محتوای تانن آنها - عوامل دباغی بالقوه جدید برای صنعت چرم. کشت صنعتی تولید 2017، 99، 19-26. [CrossRef]

22. بوروس، بی. جاکابووا، س. مادراسز، تی. مولنار، آر. گالامبوس، بی. کیلار، اف. فلینگر، آ. Farkas, A. ValidatedHPLC روش برای کمی سازی همزمان برژنین، آربوتین و اسید گالیک در برگ گونه های مختلف Bergenia. کروماتوگرافی 2014، 77، 1129-1135. [CrossRef]

23. میاو لینگ، سی. Chur-Min, C. تعیین همزمان HPLC عامل سفید کننده آبدوست در یک محصول آرایشی. جی فارم. بیومد. مقعدی 2003، 33، 617-626. [CrossRef]

24. Parejo، I. ویلادومت، اف. باستیدا، جی. Codina, C. یک مرحله استخراج منفرد در تجزیه و تحلیل کمی برگ‌های خرس آربوتینین (Arctostaphylos uva-ursi) توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا. فیتوشیمی. Anal.2001, 12, 336-339. [CrossRef]

25. قدرت. گیاهان جهان آنلاین. در دسترس آنلاین: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (در 29 آوریل 2020 قابل دسترسی است).

26. سلیم، ع. هریس، CS; عاصم، م. کوئریر، ا. مارتینو، ال. حداد، ص. روش آرناسون، JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD برای تعیین خصوصیات Ericaceae دارویی مورد استفاده توسط Eeyou IstcheeCree First Nations. فیتوشیمی. مقعدی 2010، 21، 328-339. [CrossRef] [PubMed]

27. استفانسکو، BE; سابو، ک. موکان، ع. Crisan، G. ترکیبات فنلی از پنج گونه Ericaceae برگ و فراهمی زیستی مرتبط و مزایای سلامتی آنها. Molecules 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. اوندا، ی. Mochida، K. بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان با استفاده از تکنیک‌های توالی‌یابی با توان بالا. Curr. ژنوم 2016، 17، 358-367. [CrossRef] [PubMed]

29. ایانیچلی، ج. گوارینیلو، جی. Tossib، VE; Regalado، JJ; دی سیاچیوآ، ال. ون بارن، سی ام. Pitta Álvarez, SI; Escandón, AS "اثر پلی پلوئید" در پرورش گونه های معطر و دارویی. علمی هورتیک. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. لیچ، آی جی; تنوع اندازه ژنوم لیچ، AR و تکامل در گیاهان زمینی تنوع ژنوم درون گیاهی جلد 2، ساختار فیزیکی، رفتار و تکامل ژنوم های گیاهی. Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J., Wendel, JF, Eds.; Springer: وین، اتریش، 2013; صص 307-322. [CrossRef]

31. Bennett, MD; لیچ، IJ مقادیر DNA هسته‌ای در گل‌دانگان - پیشرفت، مشکلات و چشم‌اندازها. Ann. ربات 2005، 95، 45-90. [CrossRef]

32. Gregory, TR (Ed.) The Evolution of the Genome; الزویر: سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا، 2005.

33. Hoang، PN; شوبرت، وی. میستر، ا. فوکس، جی. Shubert, I. تنوع در اندازه ژنوم، حجم سلول و هسته، تعداد کروموزوم و جایگاه rDNA در بین علفهای هرز اردک. علمی نسخه 2019، 9، 3234. [CrossRef]

34. نایت، کالیفرنیا; مولیناری، ن. پتروف، DA فرضیه محدودیت ژنوم بزرگ: تکامل، اکولوژی، و فنوتیپ. ان ربات 2005، 95، 177-190. [CrossRef]

35. پلیسر، جی. هیدالگو، او. دادسورث، اس. تنوع اندازه ژنوم لیچ، IJ و تأثیر آن بر تکامل گیاهان خشکی Genes 2018, 9, 88. [CrossRef]

36. Carev، I. Rušˇci´c، M. Skoˇcibuši´c، M. ماراویچ، ا. سیلجاک-یاکولف، اس. Politico، O. خصوصیات فیتوشیمیایی و سیتوژنتیکی Centaurea solstitialis (Asteraceae) از کرواسی. شیمی. تنوع زیستی 2017, 14, e1600213.[CrossRef]

37. کول، آی بی; کائو، جی. آلن، RA; Saxena، PK؛ Murch، SJ مقایسه Scutellaria baicalensis، Scutellarialateriflora و Scutellaria racemosa: اندازه ژنوم، پتانسیل آنتی اکسیدانی و فیتوشیمی. Planta Med. 2008،74، 474-481. [CrossRef]

38. کاروالیو، YGS; ویتورینو، ال سی؛ د سوزا، UJB; Bessa، LA روندهای اخیر در تحقیق در مورد تنوع ژنتیکی گیاهان: پیامدهایی برای حفاظت. Diversity 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. وی، اس. یانگ، دبلیو. وانگ، ایکس. Hou، Y. تنوع ژنتیکی بالا در یک گیاه دارویی در حال انقراض، Saussureainvolucrata (Saussurea، Asteraceae)، در کوه‌های Tianshan غربی، چین. حفظ کنید. ژنت. 2017، 18،1435–1447. [CrossRef]

40. چانگ، YJ; کائو، YF; ژانگ، جی.ام. تیان، ال.ام. دونگ، XG; ژانگ، ی. چی، دی. Zhang، XS مطالعه بر روی تنوع کلروپلاست DNA گلابی کشت شده و وحشی (Pyrus L.) در شمال چین. درخت ژنت. Genomes 2017, 13, 44.[CrossRef]

41. پارجو، آی. ویلادومت، اف. باستیدا، جی. Codina، C. تنوع محتوای آربوتین در جمعیت‌های مختلف وحشی Arctostaphylos uva-ursi در کاتالونیا، اسپانیا. J. Herbs Spices Med. گیاهان 2002، 9، 329-333. [CrossRef]

42. سوننشاین، م. Tegtmeier، M. آزمایشات در مورد اهلی کردن توت خرس (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). جی. مد. گیاهان ادویه جات 2012، 17، 124-128.

43. Chen, HY; لین، YC؛ Hsieh, CL ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره آبی برخی از گیاهان دارویی منتخب. مواد شیمیایی مواد غذایی 2008، 104، 1418-1424. [CrossRef]

44. دل واله، جی سی; Buide، ML; کاسیمیرو-سوریگر، آی. Whittall، JB; Narbona، E. در مورد تجمع فلاونوئیدها در بخش‌های مختلف گیاه: الگوهای تنوع در افراد و جمعیت‌ها در کمپیون ساحلی (Silene littorea). جلو. علوم گیاهی 2015، 6، 939. [CrossRef]

45. مارتینز-کادناس، سی. لوپز، اس. ریباس، جی. فلورس، سی. گارسیا، او. سویا، آ. اسمیت-زوبیاگا، آی.؛ ایبارولا-ویلابا، م. پینو یانس، ام. گردآزابال، ج. و همکاران انتخاب تصفیه همزمان روی آلل اجدادی MC1R و انتخاب مثبت روی آلل خطر ملانوما v60l در جنوب اروپا. Mol. Biol. تکامل. 2013، 30، 2654-2665. [CrossRef]

46. ​​جاکائولا، ال. Hohtola، A. اثر عرض جغرافیایی بر بیوسنتز فلاونوئیدها در گیاهان. محیط سلول گیاهی 2010، 33،1239-1247. [CrossRef] 47. مارتز، اف. پلتولا، آر. فونتانا، اس. دووال، RE; جولکونن-تیتو، آر. استارک، اس. اثر عرض و ارتفاع بر ترپنوئید و ترکیب فنلی محلول سوزن های درخت عرعر (Juniperus communis) و ارزیابی فعالیت ضد باکتریایی آنها در ناحیه شمالی. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2009، 57، 9575-9584. [CrossRef]

48. یانگ، بی. ژنگ، جی. لاکسونن، او. Tahvonen، R. Kallio, H. اثرات عرض جغرافیایی و شرایط آب و هوایی بر ترکیبات فنلی در ارقام مویز (Ribes spp.). جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2013، 61، 3517-3532. [CrossRef][PubMed]

49. Lätti، AK; جااکولا، ال. ریهینن، KR; Kainulainen، PS آنتوسیانین و تنوع فلاونول در توت های بوگبیل (Vaccinium uliginosum L.) در فنلاند. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2010، 58، 427-433. [CrossRef] [PubMed]

50. Lätti، AK; ریهینن، KR; Kainulainen، PS تجزیه و تحلیل تنوع آنتوسیانین در جمعیت های وحشی زغال اخته (Vaccinium myrtillus L.) در فنلاند. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2008، 56، 190-196. [CrossRef]

51. مونشاین، م. ایگلسیاس، جی. کونرت، او. بوکار، F. فیتوشیمی هدر (Calluna vulgaris (L.) Hull) و تغییرات ارتفاعی آن. فیتوشیمی. Rev. 2010, 9, 205-215. [CrossRef]

52. پری، NB; برگس، ای جی. رودریگز گویتیان، MA; رومرو فرانکو، آر. لوپز مسکورا، ای. اسمالفیلد، بی ام؛ جویس، NI; Littlejohn، RP Sesquiterpene lactones در Arnica montana: Helenalin و dihydrohelenalinchemotypes در اسپانیا. Planta Med. 2009، 75، 660-666. [CrossRef] [PubMed]

53. Abdala-Roberts, L. آسمان، اس. برنی-میر، ی. Terán، JC; کوولو، اف. گلازر، جی. Moreira, X. عوامل بیوتیک و غیر زیستی مرتبط با تنوع ارتفاعی در صفات گیاهی و گیاهخواری در گونه غالب بلوط. جی. بات. 2016، 103، 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. بنتلی، ج. مور، جی پی؛ Farrant، JM Metabolomics به عنوان مکملی برای فیلوژنتیک برای ارزیابی مرزهای درون گونه ای در درختچه دارویی مقاوم به خشکی Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae). Phytochemistry 2019، 159، 127-136. [CrossRef] [PubMed]

55. سیلجاک-یاکولف، س. پوستهیجا، ف. Šoli´c، EM; بوگونیک، اف. موراتوویچ، ای. باشیک، ن. کاتریس، او. براون، CSTowards یک پایگاه داده اندازه ژنوم و تعداد کروموزوم فلور بالکان: مقادیر C در 343 گونه با مقادیر جدید برای 252. Adv. علمی Lett. 2010، 3، 190-213. [CrossRef]

56. گاریدو، جی ال. Alcantara، JM; ری، پی جی. مدرانو، م. گویتیان، جی. کاستلانوس، ام سی؛ باستیدا، جی.ام. Jaime, R.; Herrera, CM ساختار ژنتیکی جغرافیایی کلمبین های ایبری (ژن. Aquilegia). سیستم گیاهی تکامل. 2017,303, 1145–1160. [CrossRef

57. لیستل، دی. پوشلود، پی. رایش، سی. فیلوژئوگرافی یک بازمانده سنگ سخت در علفزارهای خشک اروپا. PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

58. اولالده، م. هران، ا. اسپینل، اس. Goicoechea، P. phylogeography بلوط سفید در شبه جزیره ایبری. Ecol. مدیریت 2002، 156، 89-102. [CrossRef]

59. Barrett, SCH تأثیرات کلونالیته بر تولید مثل جنسی گیاهان. Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا 2015، 112،8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. اسکویرا، م. فالگورا، وی. گالیگو، جی. پیرو، اس. Almajano، MP اثر عصاره Perilla frutescens بر پایداری اکسیداتیو امولسیون های غذایی مدل. آنتی اکسیدان ها 2014، 3، 38-54. [CrossRef] [PubMed]

61. پاسکال، ا. کویرانتس-پینه، آر. فرناندو، آل. الکسوپولو، ای. Segura-Carretero، A. ترکیب فنلی و فعالیت آنتی اکسیدانی برگ کناف. کشت صنعتی تولید 2015، 78، 116-123. [CrossRef]

62. پلیسر، ج. گارناتجه، تی. مولرو، جی. پوستهیجا، ف. سیلجاک-یاکولف، اس. Vallès، J. منشاء، و تکامل گونه های درمنه آمریکای جنوبی (Asteraceae). شواهدی از فیلوژنی مولکولی، DNA ریبوزومی و داده‌های اندازه‌گیری ژنومی. اوست جی. بات. 2010، 58، 605-616. [CrossRef]

63. Doležel, J. تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری محتوای DNA هسته ای در گیاهان عالی. فیتوشیمی. مقعدی 1991، 2،143-154. [CrossRef]

64. دویل، جی جی; Doyle, JL یک روش سریع جداسازی DNA برای مقادیر کمی از بافت برگ تازه. فیتوشیمی. Bull.Bot. Soc. صبح. 1987، 19، 11-15.

65. ویتالس، دی. Feliner، GN; والس، جی. گارناتجه، تی. فیرات، م. Álvarez، I. یک محدودیت جدید از جنس مدیترانه ای Anacyclus (Anthemideae، Asteraceae) بر اساس نشانگرهای DNA هسته ای و پلاستید. Phytotaxa 2018، 349، 1-17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: یک ویرایشگر و برنامه تجزیه و تحلیل توالی بیولوژیکی کاربرپسند برای Windows95/98/NT. علائم اسیدهای نوکلئیک سر. 1999، 41، 95-98.

67. تامپسون، جی دی; هیگینز، دی جی; Gibson، TJ CLUSTAL W: بهبود حساسیت تراز چند دنباله پیشرونده از طریق وزن‌دهی دنباله، جریمه‌های شکاف خاص موقعیت، و انتخاب ماتریس وزن. Nucleic Acids Res. 1994، 22، 4673-4680. [CrossRef]

68. رزاس، ج. فرر-ماتا، آ. سانچز-دلباریو، جی سی. گیرائو ریکو، اس. لیبرادو، پی. Ramos-Onsins، SE؛ Sánchez-Gracia، A. DnaSP 6: تجزیه و تحلیل چند شکلی توالی DNA مجموعه داده های بزرگ. مول. Biol. Evol.2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, Version 1.2; گروه علوم زیستی، دانشگاه آرهوس: آرهوس، دانمارک، 2009؛ در دسترس آنلاین: http://www.aubot.dk/FastGap{4}}home.htm (در 1 ژوئیه 2019 قابل دسترسی است).

70. کلمنت، م. پوسادا، DCKA؛ کراندال، KA TCS: یک برنامه کامپیوتری برای تخمین شجره نامه ژن.Mol. Ecol. 2000، 9، 1657-1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Leigh, JW; Bryant, D. Popart: نرم افزار با ویژگی های کامل برای ساخت شبکه هاپلوتیپ. روش ها Ecol. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. شروع به کار با فرمانده R: یک رابط کاربری گرافیکی با آمار پایه برای RJ Stat. Softw.2005, 14, 1-42. [CrossRef]

73. اوکسانن، ج. بلانشت، FG; کینت، آر. لژاندر، پ. اوهارا، RB; سیمپسون، جی ال. سولیموس، پی. استیونز، ام.؛ واگنر، اچ. وگان: بسته اکولوژی جامعه. بسته R نسخه 1.{2}}. 2010. موجود آنلاین:http://CRAN.R-project.org/package=vegan (در 19 سپتامبر 2010 قابل دسترسی است).74. Malinowska، H. برگزیده های توت خرس (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) از جمعیت های طبیعی در لهستان. Acta Soc. ربات پول 1995، 64، 91-96. [CrossRef]