عصاره جفت خوک باعث افزایش سطح NAD سلولی در کراتینوسیت های اپیدرمی انسان می شود Ⅱ

بحث

بسیاری از مطالعات نشان داده اند کهکاهش NADبه دلیل افزایش سن باکاهش عملکرد بافت هاوتوسعه بیماری های مرتبط با افزایش سن و سرطان11,22. در اپیدرم، تابش اشعه ماوراء بنفش، مهم ترین عامل بیرونی پیری پوست، باعث کاهش NAD و همچنین کاهش می شود.پیری زمانی23. از آنجایی که پوست در زندگی روزمره به طور مداوم در معرض تابش اشعه ماوراء بنفش قرار می گیرد، به نظر می رسد استفاده موضعی از عوامل تقویت کننده NAD رویکرد معقولی برای جلوگیری از کاهش NAD و محافظت از پوست در برابر آسیب UV باشد. در واقع، نشان داده شده است که افزایش NAD در پوست از سرطان پوست ناشی از اشعه ماوراء بنفش و سرکوب سیستم ایمنی در موش ها جلوگیری می کند. جاکوبسون و همکاران گزارش داد که مشتقات اسید نیکوتین موضعی باعث افزایش محتوای NAD پوست و بهبود عملکرد سد می شود.

برای دریافت سیستانچ - بهترین گیاهان ضد پیری اینجا را کلیک کنید

علاوه بر این، چندین مطالعه بالینی نشان داده است که استفاده موضعی از NAM پیش‌ساز NAD را کاهش می‌دهدعلائم پیری پوست26،27. این داده‌های بالینی و in vivo از احتمال جلوگیری از افزایش سطوح NAD پشتیبانی می‌کنندآسیب پوست و تاخیر در پیری. ما همچنین قبلاً گزارش داده‌ایم که حفظ سطوح NAD کافی برای محافظت از سلول‌های اپیدرم انسانی در برابر استرس UV ضروری است. در این مطالعه، ما نشان دادیم که PPE سطوح NAD داخل سلولی را در کراتینوسیت ها افزایش می دهد. ما همچنین دریافتیم که مواد فعال آن دارای LMW کمتر از 3 کیلو دالتون هستند، که برای هر دو مدل کشت تک لایه و {2}}بعدی اپیدرم موثر است. این یافته ها نشان می دهد که مواد فعال PPE می توانند از طریق پوست جذب شوند و بنابراین کاربرد بالقوه آن به عنوان یک عامل موضعی برای افزایش سطح NAD پوست را برجسته می کند.

جدول 1. محتویات پیش ساز NAD PPE.

در پوست، کمبود NAD عملکرد مسیرهای اصلی متابولیک انرژی مانند گلیکولیز و فسفوریلاسیون اکسیداتیو را کاهش می دهد. گلیکولیز برای حفظ تعادل بین تکثیر و تمایز کراتینوسیت ضروری است. قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش سطوح NAD را کاهش می دهد و بنابراین ممکن است این عدم تعادل را تسریع کند. نسبت تمایز به تکثیر در پوست در معرض آفتاب در مقایسه با پوست محافظت شده در برابر آفتاب به شدت افزایش یافته است. تان و همکاران دریافتند که درمان FK{4}} تمایز را تسریع می‌کند و فعالیت متابولیک را در NHEKها کاهش می‌دهد، و NAM با بازگرداندن سطوح NAD سلولی، این رویدادهای ناشی از FK866- را معکوس کرد.

شکل 4. PPE موضعی فعالیت بازیابی NAD را نشان می دهد اما بر فعالیت متابولیک سلولی در RHE تأثیر نمی گذارد. (الف) تصویر شماتیک از مدل RHE. (B) PPE (2 میلی گرم در میلی لیتر) به سمت لایه شاخی RHE اعمال شد و به مدت 48 ساعت در حضور یا عدم حضور FK{3}} (5 نانومولار) انکوبه شد. سطح کل NAD بافت ها با استفاده از کیت سنجش NAD پلاس / NADH تعیین شد. (C) PPE (0، 1، 2، یا 10 میلی گرم در میلی لیتر) یا 1 درصد TX{10}} (به عنوان کنترل مثبت) در سمت لایه شاخی RHE اعمال شد و به مدت 48 ساعت انکوبه شد. . فعالیت متابولیک سلولی با استفاده از روش MTT تعیین شد. **پ<0.01, the comparison to the control.

در مطالعه حاضر، ما دریافتیم که PPE کاهش NAD ناشی از FK866- را بازیابی کرد. بنابراین، تعیین اینکه آیا PPE می تواند تمایز و تکثیر را در اپیدرم تهی شده NAD حفظ کند یا خیر، ممکن است بهتر باشد.درک آنمکانیسم ضد پیری.

اخیرا Aioi و همکاران. نشان داد که استفاده موضعی از PPE تا حد زیادی چین و چروک صورت را کاهش داده و آبرسانی پوست را بهبود می بخشد. آزمایش بالینی قبلی ما نشان داد که استفاده موضعی از کرم PPE منجر به بهبود قابل توجهی در آن شدپارامترهای ضد پیری پوست، مانندچین و چروک,آبرسانی به پوست, افتادگی، و کیسه چشم (داده های منتشر نشده). یافته های این مطالعه ممکن است به درک مکانیسم زمینه ای کمک کند که توسط آن PPE چین و چروک ها را کاهش می دهد و آبرسانی پوست را بهبود می بخشد. گزارش قبلی نشان داد که سطح کل NAD درون سلولی با بیان اجزای ماتریکس خارج سلولی، مانند پروکلاژن و الاستین، در فبروبلاست‌های پوست انسان همبستگی مثبت دارد. درمان فیبروبلاست ها با PPE منجر به افزایش تولید کلاژن نوع I17 می شود. همراه با این حقایق، PPE ممکن است با افزایش محتوای NAD در فیبروبلاست ها، تولید کلاژن را تقویت کند، که ممکن است منجر به کاهش چین و چروک های پوستی شود که در آزمایشات بالینی مشاهده شده است. هیدراتاسیون پوست ارتباط نزدیکی با عملکرد مانع لایه اپیدرمی دارد. چندین مطالعه نشان داده اند که NAD یک عامل کمکی ضروری برای حفظ عملکرد مانع پوست است. مینگ و همکاران نشان داد که دی استیلاز وابسته به NAD SIRT1 بیان فیلاگرین را تنظیم می کند، که نقش مهمی را به عنوان یک پروتئین پیش ساز عوامل مرطوب کننده طبیعی در یکپارچگی سد پوست ایفا می کند. علاوه بر این، یک مطالعه بالینی نشان داد که استفاده موضعی از یک عامل تقویت کننده NAD به طور قابل توجهی از دست دادن آب ترانس اپیدرمی، همراه با افزایش ضخامت لایه شاخی پوست در پوست آسیب دیده را کاهش داد. این گزارش‌ها نشان می‌دهند که PPE ممکن است عملکرد مانع پوست را با افزایش سطوح NAD سلولی در اپیدرم افزایش دهد، که احتمالاً منجر به بهبود آبرسانی پوست می‌شود که در آزمایش‌های بالینی ذکر شده است.

در سال های اخیر، تقویت کننده های NAD در افزایش اثرات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی مفید هستند. در مدل‌های موش دیابتی و سپتیک، تجویز NR بطور قابل توجهی التهاب مغز ناشی از رژیم غذایی پرچرب را کاهش داد و به ترتیب از استرس اکسیداتیو اندوتلیال ناشی از لیپوپلی‌ساکارید جلوگیری کرد. مشابه NR، مکمل NMN در موش های مسن نشان داده شده است که نمایه بیان mRNA پیش التهابی را در واحد عصبی عروقی معکوس می کند و با کاهش استرس اکسیداتیو عملکرد قلبی عروقی را بهبود می بخشد34،35. علاوه بر این، یک کارآزمایی بالینی در مردان مسن نشان داد که NR خوراکی باعث کاهش سطح سیتوکین های التهابی در گردش می شود. روی هم رفته، این مطالعات in vivo و بالینی از این ایده حمایت می‌کنند که استفاده از عوامل تقویت‌کننده NAD اثرات آنتی‌اکسیدانی و ضد التهابی را ارائه می‌کند. افزایش فعالیت SIRT به عنوان یکی از مکانیسم های قابل قبولی پیشنهاد شده است که بوسیله آن این تقویت کننده های NAD اثرات ضد التهابی و آنتی اکسیدانی را اعمال می کنند. PPE دارای اثرات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی است. با این حال، اکتشاف مکانیکی نسبتا محدود تا به امروز انجام شده است. مطالعه حاضر حداقل توضیحی جزئی از اثرات PPE ارائه می دهد.

PPE حاوی پروتئین های محرک رشد سلولی فراوانی مانند لامینین، سیتوکین ها و فاکتورهای رشد است. مطالعات اخیر، از جمله ما، سطوح NAD سلولی را با رشد سلولی در کراتینوسیت‌های اپیدرم مرتبط دانسته‌اند. از این رو، ما حدس زدیم که برخی از این پروتئین ها ممکن است به افزایش محتوای NAD کمک کنند. با این حال، برخلاف انتظارات ما، متوجه شدیم که بخشی حاوی مولکول‌های با وزن مولکولی کم کمتر از 3 کیلو دالتون باعث تولید NAD در کراتینوسیت‌ها می‌شود. جالب توجه است که تقسیم بخش PPE با استفاده از HPLC نشان داد که تولید NAD فقط در کسر 3 مشاهده می شود. ما همچنین دریافتیم که پیش سازهای NAD، مانند NMN، NR، و NAM، در این بخش وجود دارند، که نشان می دهد که آنها می توانند اثر را توضیح دهند. PPE در تولید NAD، حداقل تا حدی. با این حال، از آنجایی که هر یک از اجزای موجود در PPE در غلظت‌های بسیار پایین شناسایی شد، به نظر می‌رسد توضیح این که این ترکیبات به تنهایی مسئول توانایی PPE برای ارتقای محتوای NAD در کراتینوسیت‌ها هستند، دشوار است. گزارش های اخیر نشان داده اند که اشکال کاهش یافته این پیش سازهای NAD، NRH و NMNH، توانایی بیشتری در تولید NAD نسبت به NR و NMN37-40 دارند. اگرچه تجزیه و تحلیل های بیشتری برای تعیین اینکه آیا PPE حاوی NRH و NMNH است نیاز است، توانایی تقویت NAD PPE مشاهده شده در این مطالعه ممکن است به چندین تقویت کننده NAD، از جمله NMN، NR، NMNH، NRH و دیگر پیش سازهای ناشناخته NAD نسبت داده شود.

مواد و روش ها

درجه حرارت در یک خشک کن، وزن با تعادل دقیق اندازه گیری شد. محتوای جامد خشک PPE 10.98 میلی گرم بر میلی لیتر بود.

کشت های سلولی.

NHEKs (نوزاد/مرد، Termo Fisher Scientifc، Waltham، MA، USA) در محیط EpiLife™ حاوی 60 میکرومولار کلسیم حاوی مکمل رشد کراتینوسیت انسانی (هر دو از Termo Fisher Scientifc) در دمای 37 درجه در یک جو مرطوب با 5 درصد CO2 کشت شدند. . محیط کشت هر روز به طور متناوب تغییر می کرد تا زمانی که کشت تقریباً به 50 درصد تلاقی برسد و پس از آن هر روز تغییر می کرد. سلول ها زمانی که به 80 تا 90 درصد تلاقی رسیدند عبور داده شدند. NHEK ها فراتر از پاساژ 5 استفاده نشدند.

سنجش کمی و بازیابی NAD

مقدار NAD با استفاده از NAD plus /NADH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. به طور خلاصه، 1.0× 105 NHEK در صفحات 12-چاه کاشته شد. پس از 24 ساعت، سلول ها با PPE در گزینه های مختلف کنسانتره (0، 0.25، 0.5 و 1 میلی گرم در میلی لیتر) تیمار شدند و به مدت 1 تا 24 ساعت در حضور یا عدم حضور 5 کشت داده شدند. nM FK{15}} (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA). سلول ها با بافر استخراج NAD پلاس / NADH عرضه شده لیز شدند و با استفاده از یک دستگاه فیلتر گریز از مرکز Ultracel{17}} K (Merck، دارمشتات، آلمان) فوق فیلتر شدند. برای محاسبه غلظت NADH، نیمی از فیلترها در دمای 60 درجه به مدت 60 دقیقه انکوبه شدند تا NAD plus تجزیه شود. تمامی فیلترها به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه تحت واکنش آنزیمی قرار گرفتند. سپس جذب نمونه ها در طول موج 450 نانومتر با استفاده از صفحه خوان Infinite 200 Pro (Tecan، Männedorf، سوئیس) اندازه گیری شد. محتوای NAD پلاس با کم کردن محتوای NADH از کل محتوای NAD محاسبه شد. سطوح NAD به علاوه / NADH به غلظت پروتئین مربوطه تعیین شده با استفاده از سنجش پروتئین BCA پیرس (Thermo Fisher Scientific) نرمال شد.

با 300 میکرولیتر از محلول 1 میلی گرم در میلی لیتر MTT (Thermo Fisher Scientific) در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 به مدت 3 ساعت. پس از سه بار شستشو با PBS، فورمازان نفوذ شده در NHEKs با 200 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید در دمای اتاق به مدت 2 ساعت استخراج شد. جذب نوری در 560 نانومتر با استفاده از صفحه خوان Infnite 200 Pro (Tecan) تعیین شد.

اولترافیلتراسیون PPE PPE (500 میکرولیتر) روی دستگاه فلتر گریز از مرکز Ultracel{1}K (Merck Millipore) اعمال شد و در 16100×g در دمای 4 درجه به مدت 60 دقیقه سانتریفیوژ شد. فیلترها به عنوان یک کسر LMW از PPE استفاده شدند. برای بازیابی باقیمانده‌های روی فیلتر، دستگاه‌های فیلتر به صورت وارونه در یک لوله سانتریفیوژ جدید قرار داده شدند و در 1000×g در دمای 4 درجه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. باقیمانده ها با 500 میکرولیتر سالین بافر فسفات (PBS) بازسازی شدند و به عنوان یک بخش HMW از PPE استفاده شدند.

دقیقه: در 100 درصد حلال A از 0 تا 10 دقیقه، سپس یک گرادیان خطی از 0 درصد B در 10 دقیقه تا 95 درصد B در 30 دقیقه نگه دارید. مواد شوینده هر 2 دقیقه در لوله‌های نمونه جمع‌آوری و با استفاده از تبخیرگر گریز از مرکز CVE{8}} (EYELA، توکیو، ژاپن) خشک شدند. باقی مانده ها با 100 میکرولیتر PBS بازسازی شدند و قبل از استفاده از روش بازیابی NAD از طریق یک غشای 0.22 میکرومتر فیلتر شدند.

تجزیه و تحلیل پیش سازهای NAD.

NMN، NR، و NAM با رقت ایزوتوپی LC-MS/MS شناسایی و تعیین شد. آنالیزها با استفاده از سیستم ACQUITY UPLC H-Class همراه با طیف‌سنج جرمی چهار قطبی میکرو سه‌گانه TQS (واترز، میلفورد، MA، ایالات متحده آمریکا) با یونیزاسیون الکترواسپری که در حالت یون مثبت عمل می‌کرد، انجام شد. یک ستون Capcell Pak ADME HR (2 میکرومتر، 2.1×100 میلی‌متر، سودا اوزاکا، اوزاکا، ژاپن) برای جداسازی هر نمونه استفاده شد. فازهای متحرک A-B آب- متانول (حاوی {{10}}.1 درصد اسید فرمیک و 10 میلی مولار فرمت آمونیوم) بود. شرایط گرادیان به شرح زیر بود: 0-0.5 دقیقه (99 درصد A)، 0.5-3 دقیقه (99-60 درصد A)، 3-5 دقیقه (60-2 درصد A) و 5-7 دقیقه (2 درصد A). سرعت جریان 0.2 میلی لیتر در دقیقه بود. ولتاژ مویرگی 0.75 کیلو ولت، دمای منبع 150 درجه و دمای تخلیه 500 درجه بود. جریان گاز مخروطی 50 لیتر در ساعت و جریان گاز جداسازی 1100 لیتر در ساعت بود. برای تعیین کمیت هر پیش‌ساز NAD، NAM{33}}C6 در غلظت 78 نانومولار به عنوان استاندارد داخلی به نمونه‌ها اضافه شد. یون‌ها با استفاده از نظارت بر واکنش چندگانه (MRM) با انتقال‌های زیر بررسی شدند: m/z 335→123 برای NMN، m/z 255→123 برای NR، m/z 123→80 برای NAM، و m/z 129→85 برای NAM{44}}C6. NMN از مخمر شرقی (توکیو، ژاپن) خریداری شد. NR و NAM{46}}C6 از Merck (دارمشتات، آلمان) به دست آمد. NAM از Wako Pure Chemical Industries (اوزاکا، ژاپن) خریداری شد.

RHE. مدل in vitro RHE EpiDerm™ (EPI-200) از MatTek (اشلند، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد و در محیط EPI{1}}ASY (MatTek) در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 کشت شد. صد میکرولیتر PPE (1، 2 و 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) یا 1 درصد TX{9}} به سمت لایه شاخی RHE اعمال شد. RHE به مدت 48 ساعت در محیط EPI{11}}ASY در حضور یا عدم حضور FK866 (5 نانومولار) انکوبه شد. پس از انکوباسیون، RHE سه بار با PBS شسته شد. برای سنجش بازیابی NAD، کل سطوح NAD در RHE با استفاده از NAD plus /NADH Assay Kit-WST اندازه‌گیری شد. برای سنجش فعالیت متابولیک سلولی، RHE به یک صفحه چاهی منتقل شد و با 300 میکرولیتر محلول 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر MTT (Thermo Fisher Scientific) در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 به مدت 3 ساعت انکوبه شد. پس از سه بار شستشو با PBS، فورمازان نفوذ شده در RHE با 2 میلی لیتر دی متیل سولفوکساید در دمای اتاق به مدت 2 ساعت استخراج شد. جذب نوری در 560 نانومتر با استفاده از صفحه خوان Infnite 200 Pro (Tecan) تعیین شد. جذب با 1 درصد TX{27}} RHE تیمار شده به عنوان کنترل مثبت برای سنجش فعالیت متابولیک سلولی استفاده شد.

تحلیل آماری. داده ها به عنوان میانگین ± خطای استاندارد میانگین حداقل سه آزمایش مستقل ارائه شده است. تمامی تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار EZR نسخه 1.55 (سایتاما مدیکال) انجام شد

منابع

Appl. 11، 101-109 (2021).

بیشتر بخواهید:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950