AKT فعال شده با پیش شرطی، تحمل عصبی را در برابر ایسکمی از طریق مسیر MDM2-p53 کنترل می کند.

خلاصه

یکی از مهم ترین مکانیسم های محافظت عصبی با واسطه پیش شرطی، کاهش آپوپتوز سلولی است که باعث ایجاد تحمل مغزی پس از ایسکمی آسیب رسان بعدی می شود. در این زمینه، مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT ضد آپوپتوز نقش کلیدی در تنظیم تمایز سلولی و بقا دارد.

برای کلیک کنید تا پودر توبولوزا cistancheمحافظت عصبی

شناخته شده است که AKT فعال بیان دو دقیقه موش را افزایش می دهد-2 (MDM2)، یک E{2}}لیگاز یوبیکوئیتین که p53 را برای افزایش بقای سلول های سرطانی بی ثبات می کند. در نورون‌ها، اخیراً نشان دادیم که برهم‌کنش MDM2-p53 با پیش‌شرطی‌سازی دارویی، بر اساس تحریک زیر سمی گیرنده گلوتامات NMDA، که از آپوپتوز عصبی ناشی از ایسکمی جلوگیری می‌کند، تقویت می‌شود.

با این حال، اینکه آیا این مکانیسم به تحمل نورون در طول پیش شرط ایسکمیک (IPC) کمک می کند ناشناخته است. در اینجا، ما نشان می‌دهیم که IPC باعث فسفوریلاسیون AKT با واسطه PI3K در Ser473 شد، که به نوبه خود MDM2 را در Ser166 فسفریله کرد. این فسفوریلاسیون باعث تثبیت هسته ای MDM2 می شود که منجر به بی ثباتی p53 می شود، بنابراین از آپوپتوز عصبی بر اثر توهین ایسکمیک جلوگیری می کند. مهار مسیر PI3K/AKT با ورتماننین یا با خاموش کردن AKT باعث تجمع MDM2 سیتوزولی شد و محافظت عصبی ناشی از IPC را لغو کرد.

بنابراین، IPC فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT را افزایش می‌دهد و با کنترل برهم‌کنش MDM2-p53، تحمل عصبی را ارتقا می‌دهد. یافته‌های ما یک مسیر مکانیکی جدید درگیر در محافظت عصبی ناشی از IPC از طریق مدولاسیون سیگنال‌دهی AKT ارائه می‌کند، که نشان می‌دهد AKT یک هدف درمانی بالقوه در برابر آسیب ایسکمیک است. کلمات کلیدی: AKT; MDM2; p53; PI3K; تحمل ایسکمیک؛ پیش شرطی کردن

1. معرفی

در انسان، وجود حمله ایسکمیک گذرا (TIA) به عنوان یک حالت پیش شرطی درون زا با مزایای پیامدهای عملکردی در بیماران سکته مغزی آشکار شده است [1-3]. محافظت عصبی درون زا ناشی از یک محرک ایسکمیک کوتاه و ساب سمی، که به عنوان پیش شرط ایسکمیک (IPC) شناخته می شود، به عنوان یک استراتژی در زمینه نوظهور محافظت عصبی در برابر آسیب ایسکمیک در نظر گرفته می شود [4-6].

شواهد نشان می دهد که محافظت عصبی ارتقا یافته با IPC به رونویسی، ترجمه و مکانیسم های پس از ترجمه بستگی دارد که عملکرد پروتئین های کلیدی را پس از ایسکمی تغییر می دهد [6-11]. با این حال، مکانیسم درگیر در تحمل ایسکمیک ناشی از IPC (IT) به طور کامل در مغز انسان روشن نشده است [12،13].

توسعه رویکردهای تجربی جدید برای درک محافظت عصبی با واسطه IPC، ابزاری قدرتمند برای رمزگشایی مکانیسم‌های درون‌زای زیربنایی IT مغز [6] است، که پتانسیل پرده‌برداری از اهداف درمانی جدید با هدف به حداقل رساندن آسیب مغزی در بیماران سکته مغزی را دارد. در دو دهه گذشته، مرگ سلول عصبی آپوپتوز خود را به عنوان یک مکانیسم ضروری درگیر در آسیب ایسکمیک مغزی قرار داده است [14-16]. از این نظر، پروتئین کیناز B یا AKT، یک سرین/ترئونین کیناز که نیاز به یک فسفوئینوزیتید کیناز عملکردی (PI3K) برای فعال شدن دارد، به عنوان یک هدف ضروری برای درمان های محافظت کننده عصبی پس از ایسکمی در نظر گرفته شده است [17،18].

اخیراً، ما نشان دادیم که مهار مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT باعث افزایش حساسیت عصبی به سمیت تحریکی می شود [19]. AKT در یک شبکه سیگنالینگ ضد آپوپتوتیک پیچیده [20] درگیر است، که اجزای آن بسته به نوع بافت ممکن است در مکان های مختلف درون سلولی وجود داشته باشد [21،22]. در قلب، AKT در محافظت از قلب با پیش شرطی سازی نقش دارد [23].

شواهد همچنین نشان می دهد که AKT فسفریله باعث بقای نورون ها در شروع ایسکمی مغزی می شود [24]. اگرچه فعال‌سازی AKT ممکن است به القای IT در مغز کمک کند [25]، مکانیسم دقیقی که شامل فعال‌سازی با واسطه IPC آن می‌شود، مبهم باقی می‌ماند. در سلول‌های تومور، فعال شدن مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT منجر به فسفوریلاسیون MDM2 در Ser166/186 می‌شود که جابجایی هسته‌ای MDM2 را ترویج می‌کند [26،27] و فعالیت ubiquitination آن را افزایش می‌دهد [28].

در هسته، MDM2 به p53 متصل می شود و یوبی کوئیتیناسیون آن و تخریب پروتئازومی بعدی را ترویج می کند، که عملکرد p53 را مهار می کند [29]. در شرایط استرس، p53 همچنین می‌تواند باعث بروز بیش از حد MDM2 شود که برعکس فعال‌سازی p53 را در یک حلقه بازخورد منفی سرکوب می‌کند [30]. مهار PI3K از فعال شدن AKT [31] و فسفوریلاسیون MDM2 در قلب از پیش شرطی شده جلوگیری می کند [32].

در این زمینه، ما قبلاً دریافتیم که پیش‌تنظیم کردن مغز در داخل بدن، حجم انفارکتوس را پس از انسداد گذرا شریان مغزی میانی (tMCAO) با افزایش بیان سطح پروتئین MDM2 کاهش می‌دهد. در نتیجه، کمپلکس MDM2-p53 فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ p53/PUMA/caspase{5}} ناشی از ایسکمی را در نورون‌های اولیه قشر مغز کاهش داد [33].

در اینجا، ما نقش مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT را در تحمل عصبی با واسطه IPC در برابر آسیب ایسکمیک بعدی، و همچنین مکانیسم زیربنایی بررسی می‌کنیم، و عمدتاً بر پیوند بالقوه بین فعال‌سازی AKT و کمپلکس MDM2-p53 تمرکز می‌کنیم. .

2. نتایج

2.1. محافظت عصبی ارتقا یافته با IPC

با فسفوریلاسیون AKT در Ser473، فسفوریلاسیون MDM2 در Ser166، و بی‌ثباتی p53 واسطه می‌شود. در اینجا، ما نقش بالقوه AKT را در محافظت عصبی با واسطه IPC به عنوان یک نامزد برای درگیر شدن در مسیر MDM2-p53 بررسی کردیم.

اول، ما تایید کردیم که ایسکمی باعث فعال‌سازی AKT در نورون‌ها می‌شود، همانطور که فسفوریلاسیون AKT در Ser473 نشان می‌دهد. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، OGD کوتاه مدت (20 دقیقه) به طور قابل توجهی بیان p(Ser473)AKT و MDM2 را القا کرد، در حالی که سطح پروتئین AKT بدون تغییر باقی ماند (شکل S1A). با این حال، فسفوریلاسیون AKT هنگامی که نورون ها در معرض OGD طولانی مدت (90 دقیقه) قرار گرفتند، مشاهده نشد. علاوه بر این، سطح پروتئین MDM2 کمتر بود، که با بیان بالاتر پروتئین p53 مطابق شکل 1A است.

افزایش وابسته به زمان بیان Mdm2 پس از OGD (شکل 1B) تایید می کند که ایسکمی تحت حاد ممکن است برای ایجاد مکانیسم هایی مهم باشد که از تثبیت p53 بعد از OGD جلوگیری می کند، همانطور که قبلا توضیح داده شد [33]. ما از OGD کوتاه (20 دقیقه) و به دنبال آن 2 ساعت اکسیژن‌رسانی مجدد به عنوان مدل IPC استفاده کردیم (شکل S1B) [33]. بنابراین، ما عصاره های عصبی جمع آوری شده در 4 ساعت از اکسیژن رسانی مجدد پس از OGD (OGD / R) یا پس از OGD قبل از پروتکل IPC (IPC به علاوه OGD / R) تجزیه و تحلیل. به موازات آن، نورون ها در تنظیمات نرموکسی (Nx) یا پیش شرطی سازی (IPC) انکوبه شدند (شکل S1B).

همانطور که در شکل 1C و شکل S1C نشان داده شده است، IPC باعث فعال شدن اولیه AKT شد، همانطور که با فسفوریلاسیون در Ser473 [35]، و به دنبال آن تثبیت پروتئین MDM2 و فسفوریلاسیون در Ser166 آشکار شد. IPC همچنین از تثبیت p53 ناشی از OGD/R جلوگیری کرد (شکل 1C). جالب توجه است، تصاویر ایمونوفلورسانس نشان داده شده در شکل 1D نشان داد که IPC باعث افزایش فسفوریلاسیون AKT در Ser473 در نورون‌ها می‌شود، که عمدتاً در هسته تجمع می‌یابند، و تثبیت p53 را پس از OGD/R (IPC به علاوه OGD/R) در مقایسه با نورون‌های غیر از پیش شرط‌شده کاهش می‌دهد. /R).

در نتیجه، IPC از آپوپتوز عصبی و فعال‌سازی کاسپاز{0} ناشی از OGD/R، همانطور که به ترتیب با فلوسیتومتری (شکل S1D) و سنجش فلورومتری (شکل S1E) اندازه‌گیری شد، جلوگیری کرد. برای تأیید نقش p53 در محافظت عصبی با واسطه IPC، ما از نورون‌هایی استفاده کردیم که پروتئین p53 (نوع وحشی؛ wt) را بیان می‌کنند یا نه (ناکاوت؛ ko). نتایج ما نشان می‌دهد که نورون‌های فاقد p53 (شکل S1F) نسبت به نورون‌های p53 wt در برابر آپوپتوز ناشی از OGD مقاوم‌تر بودند.

علاوه بر این، سطوح آپوپتوز در نورون‌های p53KO مشابه آنهایی بود که در نورون‌های wt از پیش شرطی‌شده (IPC به علاوه OGD/R) مشاهده شد (شکل S1G)، بنابراین نقش کلیدی بی‌ثباتی p53 در محافظت عصبی با واسطه IPC را تأیید می‌کند [33]. نتایج ما نشان می‌دهد که IPC از طریق مکانیسمی که شامل فسفوریلاسیون AKT در Ser473، تثبیت MDM2 و فسفوریلاسیون در Ser166 و بی‌ثباتی p53 است، محافظت عصبی را در برابر یک توهین ایسکمیک القا می‌کند.

2.2. IPC فسفوریلاسیون MDM2 را در Ser166 از طریق مسیر PI3K/AKT آغاز می کند

مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT در IT عصبی هم در شرایط آزمایشگاهی [36] و هم در داخل بدن [37] درگیر است. با این حال، نقش فعال‌سازی مسیر PI3K/AKT با واسطه IPC در تنظیم مجموعه MDM2-p53 ناشناخته باقی مانده است. برای روشن شدن این موضوع، نورون‌ها با مهارکننده غیرقابل برگشت و خاص مسیر PI3K/AKT، ورتمانین [19] انکوبه شدند.

همانطور که در شکل 2A نشان داده شده است، ورتمانین فسفوریلاسیون AKT (Ser473) تقویت شده IPC و بی ثباتی p53 را لغو کرد، همانطور که در شکل 1D نشان داده شده است. این نتایج نشان می‌دهد که ارتباط مستقیمی بین فعال‌سازی AKT و مهار آپوپتوز عصبی با واسطه p{5} (شکل S1D) و فعال‌سازی کاسپاز{7}} (شکل S1E) القا شده پس از OGD/R وجود دارد. تنظیم کننده اصلی تثبیت p53، MDM2، هدف AKT [26] است که MDM2 را در Ser166 و Ser186 فسفریله می کند [26]. مهار PI3K با ورتماننین از فسفوریلاسیون هر دو (Ser473)AKT و (Ser166)MDM2 ناشی از IPC جلوگیری کرد (شکل 2B).

فسفوریلاسیون خاص MDM2 با واسطه Akt در Ser166 القا شده توسط IPC با استفاده از یک RNA مداخله گر کوچک (siRNA) که به طور خاص در برابر پروتئین AKT1 (siAkt) طراحی شده است، که به شدت در نورون های قشر مغز بیان می شود و فعالیت آن برای بقای نورون ها پس از ایسکمی ضروری است، تایید شد. 38]. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، siAkt سطح کل پروتئین AKT و p(Ser473)AKT را در روز 3 پس از ترانسفکشن، هم در سلول های HEK{8}T (شکل 3A) و هم در نورون های قشر مغز (شکل 3B) کاهش داد.

علاوه بر این، ناک داون AKT (siAkt) از فسفوریلاسیون (Ser166) MDM2 جلوگیری کرد (شکل 3B). این نتایج نشان می‌دهد که مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT فعال‌شده با IPC، فسفوریلاسیون MDM2 را در Ser166 ترویج می‌کند، که ممکن است مسئول تثبیت MDM2 و در نتیجه بی‌ثبات‌سازی p53 پس از آسیب ایسکمیک باشد.

2.3. AKT فعال شده با IPC باعث تثبیت پروتئین MDM2 هسته ای پس از ایسکمی می شود

فعال شدن AKT در انتقال هسته ای MDM2 در سلول های تومور نقش داشته است [26]. با توجه به ارتباط تثبیت MDM2 هسته ای برای بقای عصبی پس از ایسکمی [34] و به طور خاص، نقش محافظت کننده عصبی آن در IPC [33]، تصمیم گرفتیم ارتباط مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT را در تنظیم محلی سازی درون سلولی MDM2 بررسی کنیم. پروتئین

بنابراین، سلول‌های عصبی یا HEK-293T با پروتئین برچسب‌گذاری شده با MDM انسانی (MDM2-GFP) ترانسفکت شدند. لکه های نماینده سلول های HEK{3}T ترانسفکت شده و تصاویر از نورون هایی که پروتئین MDM2 انسانی را به صورت نابجا بیان می کنند پس از چهار شرایط آزمایشی مختلف (Nx، IPC، OGD/R، و IPC به اضافه OGD/R) در شکل 4A و شکل S1H نشان داده شده است. ، به ترتیب.

بیان نابجای MDM2- GFP تأیید کرد که IPC تجمع هسته‌ای MDM2 را در مقایسه با نورون‌های ایسکمیک غیرپیش‌شرطی (OGD/R) یا نورموکسیک (Nx) (شکل 4A, B)، که با کمی‌سازی نسبت فلورسانس هسته‌ای/سیتوزولی نشان می‌دهد، افزایش می‌دهد. (شکل S2B) و شدت فلورسانس هسته ای MDM2-GFP (شکل S2C).

2.4. IPC برهمکنش p(Ser473)AKT و MDM2 را تقویت می کند، که تثبیت MDM2 را در هسته افزایش می دهد و آپوپتوز عصبی ناشی از ایسکمی را کاهش می دهد.

به دنبال نشان دادن نقش فعال‌سازی مسیر PI3K/AKT با IPC در تثبیت هسته‌ای MDM2، ما بیشتر بررسی کردیم که آیا p(Ser473)AKT و MDM2 درون هسته برهم‌کنش دارند (شکل 6A). رسوب ایمنی MDM2 از عصاره های پروتئین هسته ای و به دنبال آن ایمونوبلات در برابر MDM2 و p(Ser473)AKT، نشان داد که IPC برهمکنش بین p(Ser473)AKT و MDM2 را پس از OGD/R ترویج می کند، بنابراین از تثبیت p53 هسته ای ناشی از OGD/R جلوگیری می کند. همانطور که در ورودی هسته نشان داده شده است (شکل 6A).

در نهایت، ما اثر مضر اختلال مسیر PI3K/AKT بر آپوپتوز عصبی را مطالعه کردیم (شکل 6B). مهار AKT با اثر محافظتی IPC قبل از OGD مقابله کرد، که نقش محافظت کننده عصبی AKT-MDM2 را در زمینه IT تأیید می کند. بنابراین، نتایج ما نشان می‌دهد که IPC فسفوریلاسیون و فعال‌سازی AKT را القا می‌کند، که فسفوریلاسیون MDM2 را در Ser166 و جابه‌جایی هسته‌ای، جایی که با p(Ser473)AKT تعامل می‌کند، ترویج می‌کند. این مکانیسم ممکن است به افزایش تثبیت هسته ای MDM2 کمک کند، که نقش اساسی در تحمل ایسکمیک ناشی از IPC دارد.

سیستانچ چگونه از نورون ها محافظت می کند؟

شواهدی وجود دارد که نشان می دهد سیستانچ ممکن است با کاهش آپوپتوز (مرگ برنامه ریزی شده سلولی) و ارتقاء بقای نورون ها از نورون ها محافظت کند. آپوپتوز یک فرآیند طبیعی است که در بدن برای از بین بردن سلول های آسیب دیده یا ناخواسته اتفاق می افتد، اما زمانی که بیش از حد یا نامناسب اتفاق بیفتد می تواند مضر باشد. سیستانچ در مطالعات آزمایشگاهی، آپوپتوز را مهار می کند و این اثر ممکن است به محافظت از نورون ها در برابر آسیب کمک کند.

علاوه بر این، سیستانچ حاوی تعدادی ترکیبات فعال زیستی است که نشان داده شده است که اثرات محافظتی عصبی دارند. به عنوان مثال، حاوی اکیناکوزید است که نشان داده شده است که از نورون ها در برابر استرس اکسیداتیو و التهاب محافظت می کند. همچنین حاوی اکتئوزید است که خواص ضد التهابی و آنتی اکسیدانی دارد.

ادامه دارد...

امیلیا باریو 1، †، ربکا وسینو 1،2، †، ایرنه سانچز-موران 1، کریستینا رودریگز 1،2،3، آلبرتو سوارز-پیندادو 1، خوان پی. بولانوس 1،2،3،4، آنجلس آلمه 2،3 و ماریا دلگادو-استبان 1،2،3،*

1 موسسه زیست شناسی عملکردی و ژنومیک، دانشگاه سالامانکا، CSIC، 37007 سالامانکا، اسپانیا. emibg7@gmail.com (EB)؛ rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (ع-ص)؛ jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 موسسه تحقیقات زیست پزشکی سالامانکا، بیمارستان دانشگاهی سالامانکا، دانشگاه سالامانکا، CSIC، 37007 سالامانکا، اسپانیا

3 گروه بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی، دانشگاه سالامانکا، 37007 سالامانکا، اسپانیا 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spain مکاتبات: {{{5} ; تلفن: پلاس 34-923-29-4908