اثرات محافظتی ووگونین بر التهاب ناشی از لیپوپلی ساکارید و آپوپتوز سلول های اپیتلیال ریه و مکانیسم های احتمالی آن

مخاطبtina.xiang@wecistanche.com

خلاصه

زمینه: ووگونین (5،{1}}دی هیدروکسی-8-متوکسی فلاون) یک فلاونوئید دی هیدروکسیل طبیعی است که از ریشه Scutellaria baicalensis Georgi استخراج می شود. هدف این مقاله بررسی مکانیسم اثر ووگونین در کاهش استالتهابوآپوپتوزدر آسیب حاد ریه (ALI).

مواد و روش ها: برای ایجاد مدل آزمایشگاهی ALL از لیپوپلی ساکارید (LPS) استفاده شد. پس از درمان با ووگونین، زنده‌مانی سلولی و آپوپتوز سلول‌های A549 القا شده با LPS به ترتیب با CCK{2}}، TUNELssays و رنگ‌آمیزی دوگانه آکریدین اورانژ/اتیدیوم بروماید اندازه‌گیری شد، در حالی که محتوای سایتوکاین‌های التهابی واسترس اکسیداتیونشانگرها با استفاده از روش RT-qPCR، روش الایزا، آنالیز وسترن بلات و کیت های تجاری برآورد شدند. وسترن بلات نیز برای ارزیابی بیان پروتئین های درگیر انجام شد. پس از آن، اثر ووگونین بر دی استیلاسیون پروتئین گروه 1 با تحرک بالا (HMGB1) با واسطه sirtuin 1 (SIRT1) مورد بررسی قرار گرفت. مهارکننده SIRT1 EX527 برای ارزیابی اثرات تنظیمی ووگونین بر SIRT{9}}واسطه زدایی HMGB1 در سلول های A549 تحت تحریک LPS استفاده شد.

نتایج: LPS باعث التهاب، استرس اکسیداتیو و آپوپتوز سلول های A549 شد که توسط ووگونین لغو شد. همچنین مشخص شد که ووگونین باعث افزایش استیلاسیون HMGB1 می شود که با بیان SIRT1 تنظیم می شود. با این حال، مهارکننده SIRT1 EX527 تا حدی اثرات محافظتی ووگونین را بر التهاب و آپوپتوز سلول‌های A549 ناشی از LPS معکوس کرد.

نتیجهووگونین التهاب و آپوپتوز را در سلول‌های A549 القا شده با LPS با استیل‌زدایی HMGB1 با واسطه SIRT کاهش داد، که ممکن است نشان دهنده شناسایی مکانیسم جدیدی باشد که بوسیله آن ووگونین اثرات محافظتی بر ALI اعمال می‌کند و ایده‌هایی برای کاربرد ووگونین در تمام درمان

کلید واژه ها: آسیب حاد ریه، ووگونین، التهاب، SIRT1، داستیلاسیون HMGB1

برای دریافت اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

زمینه

آسیب حاد ریه (AL) از نظر بالینی در نتیجه حالات پاتولوژیک از جمله سپسیس، پنومونی، تروما و پانکراتیت حاد ثبت شده است [1]. اغلب در بیمارانی که در بخش مراقبت های ویژه بستری می شوند دیده می شود و میزان مرگ و میر بالایی را نشان می دهد [2]. کسانی که از ALI جان سالم به در می برند معمولا با کیفیت پایین زندگی مواجه می شوند [3]. اگرچه دستاوردهایی در درک پاتوفیزیولوژی AL حاصل شده است، اثربخشی درمانی درمان‌های فعلی محدود است، که نمی‌تواند انتظارات بیماران و خانواده‌هایشان را برآورده کند [4]. بنابراین، شناسایی درمان‌ها یا اهداف جدید برای درمان ALL ضروری است. ووگونین (5،7-دی هیدروکسی-8-متوکسی فلاون)، که ساختار آن در شکل 1A نشان داده شده است، یک فلاونوئید دی هیدروکسیل طبیعی است که از ریشه Scutellaria baicalensis Georgi [5] استخراج شده است. خواص ضد التهابی قابل توجه آن و کاربرد آن در درمان بیماری های التهابی به طور گسترده توسط تعداد زیادی از مطالعات گزارش شده است. به عنوان مثال، ووگونین به طور بالقوه ادم ریه را در موش بهبود بخشید و از ALI ناشی از لیپوپلی ساکارید (LPS) با مسدود کردن پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن p38 (MAPK) و کیناز ترمینال c-Jun NH(2) (فسفوریلاسیون INK) محافظت کرد [6] ووگونین همچنین باعث کاهش انفیلتراسیون نوتروفیل های ناشی از LPS، تولید سایتوکاین های پیش التهابی، بیان مولکول های چسبندگی و سرکوب AL القا شده با LPS در موش ها شد [7]. نتیجه درمان با ووگونین توسط مسیر NF-KB با واسطه گیرنده گاما (PPARy) فعال شده با پراکسی زوم [8]. مطالعه نوظهور نشان داد که ووگونین باعث کاهش بستن سکوم و سوراخ شدن (CLP) پروتئین گروه 1 با تحرک بالا (HMGB1) شد. تولید و التهاب وابسته به HMGB{29}، و عوارض ناشی از سپسیس و خطر آسیب ریه را کاهش داد [9]. در مدل ALI in vitro و in vivo با LPS، گزارش دیگری نشان داد که مهار HMGB1 و سایر واسطه های التهابی از طریق اولیناستاتین به وضوح تظاهرات ALI را کاهش دادند [10]. و مطالعات قبلی تأیید کردند که سلول‌های اپیتلیال ریه انسان (A549) القا شده با LPS به طور گسترده به عنوان یک مدل آزمایشگاهی برای ALI استفاده شده‌اند [{37}}]. Sirtuin 1 (SIRT1)، عامل پایین دست پروتئین کیناز فعال شده با آدنوزین مونوفسفات (AMPK)، پیشنهاد شده است که نقش مهمی در تنظیم آزادسازی آدیپونکتین ایفا کند [14]. مکمل ووگونین به طور قابل توجهی فسفوریلاسیون AMPK و بیان SIRT1 را افزایش داد، در حالی که مهار AMPK یا SIRT1 اثرات ووگونین را بر تولید یا آزادسازی آدیپونکتین کاهش داد [14]. قبلاً گزارش شده بود که استیلاسیون HMGB1 تعدیل‌شده با SIRT، آسیب حاد کلیه ناشی از سپسیس را مهار می‌کند [15].

در مطالعه حاضر، ما با هدف بررسی مکانیسم عمل ووگونین در کاهشالتهابوآپوپتوزسلول های اپیتلیال ریه انسان القا شده با LPS، که ممکن است بینش جامع تری برای درمان ALI توسط ووگونین ارائه دهد.

نتایج

اثرات ووگونین بر زنده ماندن و آپوپتوز سلول های A549 القا شده با LPS

برای مشاهده اثر ووگونین بر ALI، ابتدا حدس زدیم که آیا زنده ماندن سلول های A549 طبیعی می تواند توسط ووگونین آسیب ببیند یا خیر. همانطور که در شکل 1B نشان داده شده است، وگونین بدون دریافت هیچ درمانی هیچ آسیبی به سلول های A549 وارد نکرد، که نشان دهنده ایمنی درمان با ووگونین در سلول های A549 در غلظت های O، 5، 10، و 20 میکرومولار است. پس از تحریک LPS به مدت 24 ساعت، زنده ماندن سلول های A549 بطور قابل توجهی آسیب دید، که توسط ووگونین به روشی وابسته به غلظت خنثی شد (شکل 1C). علاوه بر این، نتایج حاصل از سنجش LDH نشان داد که افزایش قابل توجهی در فعالیت LDH در سلول‌های A549 تیمار شده با LPS پس از تجویز افزایش دوز ووگونین کاهش یافت (شکل 1D). سپس، ما اثر ووگونین را بر آپوپتوز سلول‌های A549 القا شده با LPS آزمایش کردیم. همانطور که در شکل 2A نشان داده شده است، رنگ آمیزی TUNEL نشان داد که قرار گرفتن در معرض LPS به طور چشمگیری آپوپتوز سلول های A549 را در مقایسه با گروه کنترل افزایش می دهد، که توسط ووگونین به روشی وابسته به دوز کاهش می یابد. علاوه بر این، کاهش آشکار در بیان Bcl{19}} و تنظیم مثبت در عبارات Bax، Cyto-C، و کاسپاز 3 بریده شده در گروه در معرض LPS در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد که با درمان ووگونین بازسازی شد (شکل. 2B). به طور مداوم، نتایج سنجش‌های فلورسانس دوگانه AO/EB ارائه‌شده در شکل 3 نشان می‌دهد که LPS منجر به افزایش نرخ آپوپتوز سلولی در مقایسه با گروه کنترل می‌شود، در حالی که سلول‌های EB مثبت به طور قابل‌توجهی پس از افزودن ووگونین در مقایسه با LPS کاهش یافتند. گروه بنابراین، ووگونین زنده ماندن را بازیابی می کند و آپوپتوز سلول های A549 ناشی از LPS را کاهش می دهد.

اثرات ووگونین بر التهاب و استرس اکسیداتیو سلول های A549 القا شده با LPS

برای کشف توانایی های ضد التهابی و آنتی اکسیدانی ووگونین در ALI،التهابواسترس اکسیداتیوسلول‌های A549 ناشی از LPS که با وگونین درمان شده بودند، به ترتیب شناسایی شدند. همانطور که در شکل 4A-C مشاهده می شود، سطوح mRNA سیتوکین های التهابی (TNF-، IL{5}}، و IL{6}}) اندازه گیری شده با RT-qPCR به میزان قابل توجهی با تحریک LPS افزایش یافت، در حالی که ووگونین درمان منجر به کاهش بیان آنها شد. به طور مداوم، نتایج ELISA نشان داد که القای LPS منجر به افزایش قابل توجهی در محتوای TNF-، IL{9}} و IL{10}} در مقایسه با گروه درمان نشده، که پس از درمان با ووگونین به دوز کاهش یافت، منجر شد (شکل . 4D-F). نکته مهم، سیکلواکسیژناز-2(Cox{15}}) و فاکتور فسفو هسته ای (NF)-KB p65 (p-NF-KB p65)، که نشانگرهای مرتبط با التهاب هستند، توسط LPS کاهش یافتند. تنظیم مثبت توسط ووگونین (شکل 4G). علاوه بر این، LPS منجر به کاهش فعالیت SOD و GSH-Px و افزایش محتوای MDA و ROS شد که توسط ووگونین معکوس شد (شکل 4H-K). در مجموع، ووگونین التهاب و استرس اکسیداتیو سلول های A549 القا شده با LPS را کاهش می دهد.

تنظیم ووگونین در SIRT{0}}دی استیلاسیون HMGB1 با واسطه

برای تایید حدس و گمان ما مبنی بر اینکه ووگونین اثرات محافظتی بر آسیب سلولی A549 ناشی از LPS توسط SIRT1-واسطه زدایی HMGB1 اعمال می‌کند، ما وسترن بلات را برای تشخیص سطوح پروتئین عوامل درگیر انجام دادیم. بدیهی است که LPS بیان SIRT1 را سرکوب کرد و انتقال HMGB1 از هسته به سیتوپلاسم را همراه با استیلاسیون HMGB1 ترویج کرد. با این حال، این روند با قرار گرفتن در معرض وگونین با سلول های A549 القا شده با LPS معکوس شد (شکل 5). بنابراین، درمان با ووگونین، استیل‌زدایی HMGB1 با واسطه SIRT را در سلول‌های A549 القا شده با LPS تنظیم می‌کند.

تنظیم مهارکننده SIRT1 EX527 بر روی رفتارهای سلولی سلول های A549 القا شده با LPS تیمار شده با ووگونین

برای بررسی نقش SIRT1 در مکانیسم زمینه‌ای که توسط آن وگونین بر التهاب و آپوپتوز سلول‌های A549 القا شده با LPS تأثیر می‌گذارد، از EX527، یک مهارکننده SIRT1، برای درمان سلول‌های A549 القا شده با LPS به مدت 24 ساعت استفاده کردیم. همانطور که در شکل 6 الف نشان داده شده است، افزودن EX527 بیان SIRT1 را کاهش داد، مانع از انتقال هسته سیتوپلاسمی HMGB1 و تحریک استیلاسیون HMGB1 در مقایسه با گروه LPS به علاوه ووگونین شد. بررسی‌های بیشتر CCK-8 و LDH نشان داد که EX527 به اثر ترمیمی ووگونین روی زنده‌مانی سلول‌های A549 القا شده با LPS آسیب رسانده است (شکل 6B). علاوه بر این، اثرات ووگونین بر بیان Bcl{19}}، Bax، Cyto-C و بیان کاسپاز 3 بریده شده تا حدی توسط EX527 در سلول‌های A549 القا شده با LPS کاهش یافت (شکل 6C). در نهایت، روند تغییرات عوامل التهابی (TNF-، IL{27}} و IL{28}})، پروتئین های مرتبط با التهاب (Cox{30}} و p-NF-kB p65)، و نشانگرهای استرس اکسیداتیو (SOD، GSH-Px، و MDA) در سلول‌های A549 القا شده با LPS که با ووگونین و EX527 درمان شده بودند، نشان دادند که EX527 به اثرات مهاری ووگونین بر التهاب و استرس اکسیداتیو در سلول‌های A549 القا شده با LPS آسیب می‌زند. 7A-K). بنابراین، مهارکننده SIRT1 EX527 اثرات محافظتی ووگونین را بر روی فنوتیپ‌های بدخیم سلول‌های A549 القا شده با LPS معکوس می‌کند.

بحث

در حال حاضر، بسیاری از کارشناسان ووگونین را به عنوان یک عامل قوی برای درمان بیماری های التهابی می شناسند. اثربخشی آن در کاهش پاسخ‌های التهابی به سرکوب NF-kB و فعال‌سازی مسیرهای سیگنال دهی مرتبط با فاکتور 2 (Nrf2) اریتروئید [16] نسبت داده می‌شود. جالب توجه است، گزارش‌های قبلی اثر ضد التهابی را با واسطه بیان iNOS و Cox{6}} یا فعال‌سازی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)/ERK/Nrf2 مسیرهای سیگنالینگ مرتبط می‌دانستند [5،17]. مطابق با یافته های قبلی که هیچ اثری از ووگونین بر روی زنده ماندن سلول های غضروفی نشان نمی دهد، ما عملاً هیچ اثر سیتوتوکسیک قابل توجهی از ووگونین روی سلول های طبیعی A549 پیدا نکردیم، که از کاوش بیشتر ما در مکانیسم اساسی که توسط آن ووگونین بر مدل سلولی ALI در شرایط آزمایشگاهی تأثیر می گذارد حمایت می کند [17]. استرس اکسیداتیو و التهاب دو علامت اصلی در پاتوژنز AL هستند، و بنابراین ما تغییرات در شاخص های استرس اکسیداتیو و سایتوکاین های التهابی را در درمان با ووگونین شناسایی کردیم [18]. به طور جالب توجه، التهاب و استرس اکسیداتیو هر دو با قرار گرفتن در معرض ووگونین در مدل سلولی A549 تحت درمان با LPS کاهش یافتند، همانطور که توسط محاصره آزادسازی فاکتورهای التهابی و افزایش تولید SOD و GSH-Px، و همچنین کاهش تولید MDA پس از مشاهده می‌شود. درمان با ووگونین HMGB1 به عنوان یک پروتئین بسیار حفاظت شده ظاهر می شود که برای اولین بار برای تعدیل سپسیس در یک مدل موش شناسایی شد[19]. هدف قرار دادن HMGB1 به عنوان یک گزینه درمانی بالقوه برای درمان سپسیس در نظر گرفته شد، زیرا بیمارانی که به صورت پاسخ‌های التهابی طولانی‌مدت تظاهر می‌کردند، مرتباً سطوح بالای HMGB1 را نشان می‌دادند [10]. گزارش‌ها و بررسی‌های اخیر توجه زیادی به اثرات درمانی HMGB1 بر بیماری‌های التهابی، محدود به سپسیس ندارد. به عنوان مثال، قبلاً نشان داده شده بود که مهار HMGB1 توسط اولیناستاتین آسیب ALI ناشی از LPS را در موش بهبود می بخشد [10،20]. پس از آزاد شدن از مونوسیت ها/ماکروفاژهای فعال، HMGB1 به عنوان یک عامل پیش التهابی از طریق محرک های مختلف عمل می کرد [20]. سیگنال‌های التهابی مانند LPS می‌توانند انتقال مرتبط با استیلاسیون HMGB1 را از هسته به سیتوپلاسم تحریک کنند [21]. در اینجا، این یافته که انتقال HMGB1 از هسته به سیتوپلاسم بر اثر تحریک LPS با درمان ووگونین خنثی شد، به طور غیرمستقیم روشن کرد که التهاب سلول‌های A549 که توسط LPS ایجاد می‌شود، به‌شدت توسط ووگونین مانع شده است.

پیشنهاد شده است که SIRT1 نقش مهمی در فرآیندهای بیولوژیکی مختلف ایفا کند [22]. بسته به اهداف دی استیلاسیون آن، تغییرات در فعالیت SIRT1 انتظار می رود با استرس اکسیداتیو و التهاب مرتبط باشد [23]. HMGB1 اخیراً به عنوان یک هدف استیلاسیون SIRT1 شناخته شده است [20]. شواهد قابل توجهی نشان می‌دهد که SIRT{7}}داستیلاسیون تعدیل‌شده HMGB1 التهاب را کاهش داده، عملکرد کلیوی را بازسازی کرده و زمان بقای موش‌های مبتلا به آسیب حاد کلیه مرتبط با سپسیس را طولانی‌تر می‌کند [15]. در یک مطالعه تجربی آسیب مغزی تروماتیک، اسید چرب چند غیراشباع امگا با تعدیل پلاریزاسیون میکروگلیا از طریق SIRT{12}}داستیلاسیون تعدیل‌شده مسیر HMGB1/NF-KB، التهاب را کاهش داد [24]. علاوه بر این، اسید اولئانولیک مدل موش را از خونریزی زیر عنکبوتیه توسط SIRT{16}مدولاسیون استیلاسیون HMGB1 [25] جلوگیری کرد. مهار NLRP3/NF-kB توسط Aloin از طریق فعال‌سازی SIRT1، ALI را در موش‌ها ضعیف کرد [26]. کامفرول با تنظیم سیگنال دهی SIRT1/HMGB1/NF-KB، آسیب ریه ناشی از ایسکمی خونرسانی مجدد را از طریق ضد التهاب و استرس آنتی اکسیداتیو بهبود بخشید. به عنوان یک مولکول مهم در پایین دست HMGB1، NF-kB یک مسیر سیگنال دهی اصلی است که در تنظیم واسطه های التهابی با فعال کردن ژن های عامل پیش التهابی و آزادسازی تعداد زیادی از عوامل التهابی، از جمله TNF-، IL{34}} و TNF نقش دارد. -a[28,29]. علاوه بر این، NF-KBcan همچنین از طریق تنظیم تولید ROS و تأثیر بر سطوح SOD، MDA و GSH-Px در فرآیند استرس اکسیداتیو شرکت می کند [30]. در مطالعه حاضر، کاهش بیان p-NF-kB p65 پس از افزودن ووگونین مشاهده شد که توسط مهارکننده SIRT1، EX527 بازسازی شد. علاوه بر این، ما دریافتیم که HMGB1 استیله شده توسط ووگونین با بیان SIRT1 فعال همراه است، که منجر به گمانه زنی ما شد که ووگونین ممکن است اثرات محافظتی بر التهاب ناشی از LPS سلول های A549 توسط SIRT{50}}واسطه زدایی HMGB1 اعمال کند. استفاده از EX527 در آزمایش‌های زیر بیشتر نشان داد که مهار SIRTl اثرات محافظتی ووگونین را بر التهاب سلول‌های A549 ناشی از LPS معکوس می‌کند.

نتیجه

در نتیجه، ما نشان دادیم که ووگونین التهاب، استرس اکسیداتیو و آپوپتوز مدل سلولی ALI ناشی از LPS را کاهش می‌دهد. به نظر می‌رسد که این مکانیسم عمل به دلیل تنظیم استیل‌زدایی HMGB1 با واسطه SIRT است که توسط ووگونین ایجاد می‌شود. این یافته‌ها ممکن است مکانیسم جدیدی را شناسایی کنند که از طریق آن ووگونین اثرات محافظتی بر ALI اعمال می‌کند و مبنایی تجربی برای کاربرد ووگونین در درمان بالینی ALI فراهم می‌کند.

مواد و روش ها

کشت سلولی و داروها

Human lung epithelial cells(A549) were purchased from the Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology at the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) and cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Paisley, UK) containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco, Paisley, UK), 100 U/ml penicillin, and 100 g/ml streptomycin at 37 ℃ with 5% CO. The cells were collected after 10 μg/mL LPS（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）stimulation for 24 h. Wogonin (purity>99 درصد، جدا شده از Scutellaria baicalensis Georgi، از Biotic Chemical (تایپه، تایوان) خریداری شد. در دی متیل سولفوکسید (DMSO) حل شد، در -20 درجه سانتیگراد ذخیره شد و توسط DMEM رقیق شد. مهارکننده SIRT1 EX527 (10 میکرومولار). MedChemExpress، شانگهای، چین) برای درمان سلول ها به مدت 24 ساعت قبل از تجویز طبق مطالعه قبلی استفاده شد [31].

سنجش کیت شمارش سلولی-8 (CCK-8).

پس از تحریک LPS به مدت 24 ساعت و غلظت‌های مختلف قرار گرفتن در معرض ووگونین برای 4 ساعت دیگر، سلول‌ها در یک صفحه چاه کاشته شدند و با افزودن 10 میکرولیتر معرف CCK (Dojindo) سنجش زنده‌مانی سلولی انجام شد. ، کوماموتو، ژاپن) در هر چاه در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت. جذب در 450 نانومتر با استفاده از دستگاه میکروپلیت خوان (Bio-Rad Laboratories, Inc.) بررسی شد.

سنجش آزادسازی لاکتات دهیدروژناز (LDH).

مایع رویی سلول تیمار شده با وگونین در 96-صفحه های کشت چاهی کاشته شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه با 5 درصد CO انکوبه شد، قبل از اینکه 100 میکرولیتر از محلول کیت تشخیص سمیت سلولی LDH (Roche Diagnostics، فرانسه) به هر یک اضافه شود. 15 دقیقه بعد، مایع رویی سلول رقیق شد و مقدار چگالی نوری در 450 نانومتر بررسی شد.

روش رنگ‌آمیزی TUNEL با واسطه ترمینال-دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز (TUNEL) برای ارزیابی آپوپتوز سلول‌های A549 القا شده با LPS با یا بدون درمان ووگونین توسط کیت سنجش آپوپتوز TUNEL Colorimetric (Beyotime، شانگهای، چین) بر اساس عملیات انجام شد. دستورالعمل ها پس از شستشوی بافر فسفات سالین (PBS) دو بار و تثبیت با 4 درصد پارافورمالدئید به مدت 0.5 ساعت، 0.3 درصد پراکسید هیدروژن در PBS برای انکوبه کردن سلول‌ها به مدت 20 دقیقه دیگر در دمای اتاق استفاده شد. سپس سلول ها با دی آمینو بنزن (DAB) به مدت 10 دقیقه تیمار شدند و به مدت 30 ثانیه توسط هماتوکسیلین (Solarbio، پکن، چین) رنگ آمیزی شدند. سلول های آپوپتوز مثبت توسط میکروسکوپ فلورسانس (شرکت المپوس) مشاهده شدند و میزان آپوپتوز توسط نرم افزار Image-J (NIH، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) تعیین شد.

رنگ آمیزی دوگانه آکریدین نارنجی/اتیدیوم بروماید

سنجش فلورسانس مضاعف آکریدین نارنجی/اتیدیوم بروماید (AO/EB) برای ارزیابی تغییر آپوپتوز سلولی انجام شد. به طور خلاصه، سلول‌های A549 روی ورقه‌های شیشه‌ای در 24-صفحات چاهی رشد کردند. سلول ها به مدت 24 ساعت با محیط بدون سرم انکوبه شدند و سپس با LPS و غلظت های مختلف ووگونین در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. سلول ها با PBS شسته شدند و با محلول مخلوط 5 میکرولیتر AO/EB (100 میکروگرم در میلی لیتر AO و 100 میکروگرم بر میلی لیتر EB مخلوط شده در PBS، علاءالدین، چین) در عرض 3 دقیقه عرضه شدند. سلول ها مشاهده شدند و در طول موج تحریک 510 نانومتر زیر میکروسکوپ فلورسانس (شرکت المپوس) عکس گرفتند.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

پروتئین‌ها از سلول‌های A549 با استفاده از بافر لیز RIPA (بیوتیم، شانگهای، چین) استخراج شدند و غلظت پروتئین‌ها توسط کیت سنجش پروتئین بیسینکونیک اسید (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) اندازه‌گیری شد. پس از آن، الکتروفورز ژل دودسیل سولفات سدیم-پلی آکریل آمید 10 درصد (SDS-PAGE) برای جداسازی پروتئین های ug انجام شد و پروتئین ها سپس به غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) منتقل شدند. سپس این غشاها توسط شیر بدون چربی مسدود شده و سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد یک شبه با آنتی بادی های اولیه انکوبه شدند. پس از آن، آنتی بادی ثانویه کونژوگه با HRP برای انکوبه غشاها به مدت 1.5 ساعت در دمای اتاق استفاده شد. در نهایت، باندها توسط یک کیت شیمی‌تابی (ECL) تقویت‌شده (Amersham Biosciences، باکینگهام‌شر، انگلستان) مشاهده شدند، در حالی که شدت باند با استفاده از نرم‌افزار Image-J (NIH، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) بررسی شد. GAPDH به عنوان یک مرجع داخلی در نظر گرفته شد.

رونویسی معکوس-کمی PCR (RT-gPCR)

سلول های A549 برای استخراج RNA کل در 1 میلی لیتر معرف TRIZol (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) لیز شدند. پس از جمع آوری RNA کل، رونویسی معکوس برای سنتز DNA مکمل (cDNA) توسط کیت معرف RT PrimeScript (Takara Bio, Inc.) انجام شد. شرایط به شرح زیر بود: 50 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه، 85 درجه سانتیگراد برای 5 ثانیه، و نگهداری در 4 درجه SYBR Premix Ex Taq TM (TaKaRa، ژاپن) برای تنظیم شرایط واکنش PCR و سیستم واکنش بر اساس پیشنهادات سازنده استفاده شد. یک ابزار ABI 7500 (AB-4351107؛ Applied Biosystems؛ Thermo Fisher Scientific, Inc.) برای qPCR استفاده شد. شرایط ترموسایکلینگ زیر مورد استفاده قرار گرفت: دناتوراسیون اولیه در 95 درجه به مدت 10 دقیقه. به دنبال آن 40 چرخه دناتوراسیون در 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه و بازپخت در 60 درجه به مدت 1 دقیقه. و تمدید نهایی 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد. GAPDH به عنوان کنترل عادی بیان ژن نسبی پذیرفته شد. محاسبه بیان ژن نسبی با روش 2-AAct انجام شد.

سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA)

سطوح سلولی اینترلوکین-6(IL-6)، IL-1 و فاکتور نکروز تومور (TNF-) در مایع رویی سلول با استفاده از کیت الایزا IL{5}} اندازه‌گیری شد. کیت IL{6}} الایزا و کیت TNF- ELISA بر اساس پیشنهادات سازنده (شانگهای شی تانگ بیوتکنولوژی، شانگهای، چین).

تشخیص استرس اکسیداتیو

برای تشخیص استرس اکسیداتیو، فعالیت نشانگرهای استرس اکسیداتیو شامل مالون دی آلدئید (MDA)، گونه‌های اکسیژن فعال (ROS)، گلوتاتیون پراکسیداز (GSH-Px) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) طبق دستورالعمل‌های سازنده (نانجینگ جیانچنگ بیوتکنولوژی) شناسایی شدند. موسسه، چین).

تحلیل آماری

همه داده ها به صورت میانگین ± انحراف استاندارد (SD) حداقل سه آزمایش مستقل نشان داده شد. برای مقایسه بین چند گروه، آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) با آزمون تعقیبی توکی و بین دو گروه با آزمون تی استودنت انجام شد. پ<0.05 was="" deemed="" as="" statistically="">

اختصارات

AL: آسیب حاد ریه. LPS: لیپوپلی ساکارید؛ HMGB1: جعبه گروه 1پروتئین با تحرک بالا؛ PPARy. گیرنده گامای فعال شده با تکثیر پراکسی زوم؛ MAPK: پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن. JNK: C-Jun NH(2) - ترمینال کیناز. CLP: بستن و سوراخ کردن ساکال. DMEM: محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco. DMSO: دی متیل سولفوکسید. CCK-8:کیت شمارش سلول-8؛ LDH: لاکتات دهیدروژناز. تونل: برچسب گذاری انتهایی با واسطه ترانسفراز-دئوکسی نوکلئوتیدیل. PBS: نمک بافر فسفات. DAB: دی آمینو بنزن؛ AO/EB: پرتقال آکریدین/اتیدیوم بروماید. BCA: بیسینکونیک اسید؛ SDS-PAGE: الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید. PVDF: پلی وینیلیدین دی فلوراید. ECL: لومینسانس شیمیایی افزایش یافته. cDNA: DNA مکمل. ELSA: سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم. IL: اینترلوکین. TNF-a: فاکتور نکروز تومور-a. MDA: مالون دی آلدئید. GSH-Px گلوتاتیون پراکسیداز. SOD: سوپراکسید دیسموتاز. SD: انحراف استاندارد. ANOVA: تجزیه و تحلیل واریانس. کاکس{21}}: سیکلواکسیژناز-2; Nrf2: فاکتور هسته ای اریتروئید 2-مربوط به فاکتور 2. ROS: گونه های فعال اکسیژن.

منابع

1. Mokra D، Kosutova P. نشانگرهای زیستی در آسیب حاد ریه. Respir Physiol Neurobiol. 2015؛ 209:52-8.

2. هیز ام، کرلی جی، انصاری بی، لافی جی جی. بررسی بالینی: درمان‌های سلول‌های بنیادی برای آسیب حاد ریه/سندرم دیسترس تنفسی حاد - امید یا هیاهو؟ Crit Care. 2012؛ 16 (2): 205.

3. Angus DC، Clermont G، Linde-Zwirble WT، Musthafa AA، Dremsizov TT، Lidicker J، و همکاران. هزینه های مراقبت های بهداشتی و پیامدهای طولانی مدت پس از سندرم زجر تنفسی حاد: آزمایش فاز III اکسید نیتریک استنشاقی. Crit Care Med. 2006؛ 34 (12): 2883-90.

4. Hu JT، Lai J، Zhou W، Chen XF، Zhang C، Pan YP، و همکاران. هیپوترمی آسیب حاد ریه ناشی از LPS را در مدل های موش از طریق مسیر TLR2/MyD88 کاهش داد. Exp Lung Res. 2018؛ 44 (8-9): 397-404.

5. Chi YS، Lim H، Park H، Kim HP. اثرات ووگونین، یک فلاون گیاهی از ریشه Scutellaria، بر التهاب پوست: تنظیم درون تنی بیان ژن مرتبط با التهاب. بیوشیم فارماکول. 2003؛ 66 (7): 1271-8.

6. Wei CY، Sun HL، Yang ML، Yang CP، Chen LY، Li YC، و همکاران. اثر محافظتی ووگونین بر آسیب حاد ریه ناشی از اندوتوکسین از طریق کاهش MAPK p38 و فسفوریلاسیون JNK. سم محیطی 2017؛ 32 (2): 397-403.

7. Yeh YC، Yang CP، Lee SS، Horng CT، Chen HY، Cho TH، و همکاران. آسیب حاد ریه ناشی از لیپوپلی ساکارید توسط ووگونین در موش از طریق کاهش فسفوریلاسیون Akt و فعال سازی RhoA مهار می شود. J Pharmacol.2016؛ 68 (2): 257-63.