اثرات محافظتی جوشانده جدید Wenshen Shengjing بر اختلال در سنتز تستوسترون و آپوپتوز اسپرماتوژنیک ناشی از سیکلوسپورین

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

XIAOYAN PAN، XIYAN WANG، XUENAN WANG، WANSHENG ZHANG4، ZHANXUAN SUN1، XUAN XUAN LIANG، XUE ZHANG، WENJUN LI و ZHIXIN LI

خلاصه

مطالعه حاضر با هدف بررسی اثرات محافظتی بالقوه جوشانده Wenshen Shengjing جدید (WSSJD جدید؛ از جمله Cornu Cervi Nippon Parvum، Panax ginseng، Cynomorium solarium،Cistanche deserticola، Radix Astragali، Epimedium brevicornum و Angelica Sinensis) بر اختلال در سنتز تستوسترون و آپوپتوز اسپرماتوژنیک ناشی از سیکلوسپورین در موش. در مجموع 90 موش نر بالغ کونمینگ به 6 گروه زیر تقسیم شدند: کنترل (بدون مداخله)، دی متیل سولفوکسید (DMSO؛ فقط DMSO دریافت کرد)، سیکلوسپورین A (CSA)، کلومیفن سیترات (CC؛ CsA به اضافه CC، 15 میلی گرم بر کیلوگرم). / روز)، WSSJD (CsA به علاوه WSSJD، داروی خام 12 گرم بر کیلوگرم در روز) و WSSJD جدید (CsA به علاوه WSSJD جدید، داروی خام 12 گرم در کیلوگرم در روز). تمام موش ها به مدت 30 روز از طریق گاواژ خوراکی تحت درمان قرار گرفتند. بیضه‌ها پس از آن ثابت شدند و با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شدند تا رشد اپیتلیوم منی‌ساز ارزیابی شود. تکنیک های ایمونوهیستوشیمی برای تشخیص بیان گیرنده هورمون لوتئینیزه کننده (LHR) و برش زنجیره جانبی P450 (P450scc) در سلول های لیدیگ بیضه استفاده شد. علاوه بر این، آپوپتوز سلول‌های اسپرم‌زا در بیضه‌ها با استفاده از روش برچسب‌گذاری dUTP با واسطه دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز پایانی شناسایی شد و از فلوسیتومتری برای تجزیه و تحلیل میزان بقا و آپوپتوز اولیه اسپرم در اپیدیدیم استفاده شد. در مقایسه با گروه های CsA و CC، تجویز جدید WSSJD به طور قابل توجهی سطوح تستوسترون سرم و بیان LHR و P450scc را در سلول های لیدیگ بیضه افزایش داد (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">

Cistanche deserticola

مقدمه

سیکلوسپورین A (CSA) یک عامل سرکوب‌کننده سیستم ایمنی است که به طور خاص سلول‌های T را هدف قرار می‌دهد و ترشح اینترلوکین را مهار می‌کند و به طور چشمگیری میزان موفقیت پیوند کبد، کلیه و قرنیه و همچنین میزان بقای پیوند را افزایش می‌دهد. گیرندگان (1-3). با این حال، سرکوب سیستم ایمنی ناشی از استفاده طولانی مدت از CsA به طور قابل توجهی خطر بیماری های قلبی عروقی، عفونت و تومورهای بدخیم را افزایش می دهد (4). عید و همکاران (5) گزارش کردند که غلظت و تحرک اسپرم با غلظت CsA سرم در گیرندگان پیوند کلیه مرد رابطه منفی دارد، که نشان می دهد CsA ممکن است باعث اختلال در عملکرد سیستم تولید مثل در گیرندگان مرد شود. علاوه بر این، مستند شده است که CsA ممکن است مسئول اختلال در اسپرم زایی و آسیب به سیستم تولید مثل مردان باشد (6).

مطالعات قبلی نشان داده اند که CsA با تأثیر بر بیوسنتز و ترشح تستوسترون در بیضه، سطح تستوسترون سرم را کاهش می دهد. او و همکاران (7) مشاهده کردند که موش‌های تحت درمان با 40 میلی‌گرم/کیلوگرم CsA سطوح بالاتری از هورمون لوتئینیزه‌کننده (LH) و سطوح پایین‌تر تستوسترون در سرم را نشان دادند که منجر به اختلال در رشد بیضه‌ها شد. علی و همکاران (8) گزارش کردند که درمان با CsA باعث کاهش بیان گیرنده LH (LHR) بر روی غشای سلول‌های لیدیگ شد که متعاقباً باعث کاهش سنتز و ترشح تستوسترون با واسطه LH از سلول‌های لیدیگ شد. مطالعه دیگری توسط Seethalakshmi و همکاران (9) گزارش کرد که CsA با مهار فعالیت 17 آلفا هیدروکسیلاز به طور غیرهمکاری و فعالیت {7}هیدروکسی استروئید دهیدروژناز رقابتی در طول بیوسنتز تستوسترون، سطوح تستوسترون را کاهش داد و محل اولیه مهار CsA یک چرخه قطع شده بود. تحریک مونوفسفات علاوه بر این، این گزارش نشان داد که کاهش ترشح تستوسترون ناشی از CsA در سلول‌های لیدیگ به طور مستقیم بر رشد سیستم تولید مثل مردان و حفظ توانایی تولید مثل تأثیر می‌گذارد. Seethalakshmi و همکاران (10) تستوسترون اگزوژن را به موش های تحت درمان با CsA تزریق کردند تا سطح تستوسترون درون زا را افزایش دهند. مشاهده شد که دوزهای افزایش یافته تستوسترون اگزوژن به طور قابل توجهی وزن اندام تناسلی، سطح سرمی هورمون محرک فولیکول (FSH) را ترمیم می کند و تعداد سلول های زاینده را افزایش می دهد، بنابراین نشان می دهد که اختلالات ناشی از CsA در اسپرم زایی ممکن است تا حدی توسط اگزوژن جلوگیری شود. تجویز تستوسترون (10). با این حال، مشخص شد که تستوسترون اگزوژن در ترمیم بافت آسیب دیده بیضه ناکافی است، زیرا ترشح تستوسترون و اسپرماتوژنز هنوز تحت تأثیر CsA قرار دارد، و نرخ بالای آپوپتوز در اسپرم و سلول های اسپرماتوژنیک مشاهده شد (10).

جوشانده Wenshen Shengjing (WSSJD) شامل 15 داروی گیاهی است که عمدتاً شامل Cornu Cervi Nippon Parvum، Panax ginseng، Cynomorium solarium،Cistanche deserticola، Radix Astragali، Epimedium brevicorneum و Angelica Sinensis (11). نشان داده شده است که WSSJD آپوپتوز اسپرماتوژنیک ناشی از سیکلوفسفامید را کاهش می دهد (11). برای بهبود بیشتر اثر درمانی WSSJD، مطالعه حاضر WSSJD جدیدی را بر اساس مکانیسم آسیب بافت بیضه ناشی از CsA با تنظیم دوز اجزای WSSJD ایجاد کرد. مطالعات فارماکولوژیک مدرن نشان داده است که مخمل شاخ در WSSJD ممکن است به عنوان یک هورمون جنسی عمل کند (12). رادیکس Astragali ممکن است تکثیر و تامین مواد مغذی سلول های سرتولی بیضه را بهبود بخشد (13) و Panax ginseng ممکن است سطح هیپراکسید بیضه را کاهش داده و آپوپتوز اسپرماتوژنیک را مهار کند (14). داروهای ذکر شده در بالا ممکن است عملکرد کلیه را افزایش داده و رشد سلول های اسپرم زا را تقویت کنند ({8}}). در مطالعات بالینی قبلی نشان داده شده است که کلومیفن سیترات (CC) اثر درمانی بر ناباروری مردان دارد (15،16). علاوه بر این، CC با بهبود پارامترهای تستوسترون و مایع منی مرتبط است، و مکانیسم‌های محافظتی CC ممکن است مشابه مکانیسم‌های WSSJD باشد (15،16). علاوه بر این، در مطالعه‌ای توسط وانگ و همکاران (17)، از CC به عنوان کنترل درمانی برای بررسی تأثیر داروی چینی Shengjing بر اختلالات اسپرم‌زایی در موش‌ها استفاده شد. بر این اساس در مطالعه حاضر از CC به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

در مطالعه حاضر، مکانیسم زیربنایی اثر محافظتی WSSJD جدید در بافت‌های بیضه برای تعیین اثربخشی درمانی داروی اصلاح‌شده مورد بررسی قرار گرفت. توضیح مکانیسم حفاظتی ممکن است مبنایی برای استفاده از WSSJD جدید در بهبود آسیب اسپرماتوژنیک ناشی از CsA فراهم کند.

اثرات Cistanche deserticola: پیشگیریآسیب اسپرماتوژنیک

مواد و روش ها

حیوانات. در مجموع 90 موش نر کونمینگ (8-هفته؛ 35-40 گرم) توسط مؤسسه محصولات بیولوژیکی چانگچون (چانگچون، چین) ارائه شد. مطالعه حاضر با تایید کمیته اخلاق دانشگاه پزشکی جیلین (چانگچون، چین) انجام شد. موش ها در دمای 3±21 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 55 تا 65 درصد تحت یک چرخه 12 ساعته تاریکی قرار گرفتند. موش‌ها به رژیم غذایی استاندارد موش آزمایشگاهی و آب استریل دسترسی آزاد داشتند.

آماده سازی WSSJD. 15 جزء طب چینی WSSJD، از جمله Cornu Cervi Nippon Parvum، Panax ginseng، Cynomorium Solarium،Cistanche deserticola، Radix Astragali، Epimedium brevicornum و Angelica Sinensis (11)، از Tongrentang (پکن، چین) خریداری شدند. این مواد بر اساس روش سنتی جوشانده دارویی چینی جوشانده می شدند (18). به طور خلاصه، مواد طبق دستور وزن شده و در مجموع 250 میلی لیتر آب مقطر برای غوطه ور شدن گیاهان به آن اضافه شد. گیاهان به مدت 30 دقیقه خیس شدند و سپس حرارت داده شدند. ابتدا گیاهان را به مدت 10 دقیقه می جوشانند و سپس حرارت را به مدت 20 دقیقه کم می کنند تا بجوشد. پس از 30 دقیقه حرارت دادن، جوشانده مایع از گیاهان جدا شد و سپس با 200 میلی لیتر آب مقطر در دمای 80 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه دیگر جوشانده شد. این فرآیند تکرار شد و حجم نهایی مایع جوشانده از طریق 4-5 لایه گاز فیلتر شد. مایع نیز از گیاهان به جوشانده فیلتر شده فشرده شد. سپس جوشانده را در دمای 80 درجه سانتیگراد در حمام آب به مدت 7-6 ساعت حرارت دادند تا غلظت آن به 2 گرم داروی خام در میلی لیتر برسد و جوشانده قبل از مصرف در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. WSSJD جدید بر اساس فرمول WSSJD با تنظیمات جزئی در دوزهای Panax ginseng، Cynomorium solarium، Radix Astragali و Epimedium brevicornum تهیه شد. روش جوشانده مانند روش WSSJD بود. WSSJD جدید شامل موارد زیر است: جینسنگ Panax، 6 گرم. سولاریوم سینوموریوم 9 گرم; رادیکس Astragali، 12 گرم; Epimedium brevicornum، 6 گرم؛ Cornu Cervi Nippon Parvum، 1 گرم؛Cistanche deserticola9 گرم; گلپر سیننسیس، 6 گرم; دانه ساقه شیر مایه صاف، 9 گرم; Rhizoma Dioscoreae، 15 گرم؛ سر بزرگ Atractylodes Rhizome، 6 گرم; Ligusticum wallichii، 3 گرم؛ Radix Paeoniae Alba، 6 گرم؛ دارچین کاسیا، 1 گرم؛ Costustoot، 1.5 گرم، و Fructus Foeniculi، 3 گرم.

غلظت عصاره های دارویی خام به شرح زیر تعیین شد: وزن ماده خام/حجم نهایی. این روش محاسبه به طور گسترده در مطالعه طب سنتی چینی (19-21) استفاده می شود. تجویز دارو. موش ها به طور تصادفی به 6 گروه (هر گروه 15 موش) تقسیم شدند و به صورت داخل معده دارو تجویز شدند. گروه ها به شرح زیر بودند: کنترل (نرمال سالین). دی متیل سولفوکسید (DMSO)؛ CsA; CC; WSSJD; و WSSJD جدید. موش‌های گروه‌های CsA، CC، WSSJD و WSSJD جدید به‌صورت داخل صفاقی (IP) با 15 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روز CsA (شرکت داروسازی شانشی پاوردون، داتونگ، چین) به مدت 30 روز، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تزریق شدند (8). ). موش‌های گروه کنترل و DMSO تحت تزریق داخل صفاقی روزانه با حجم مساوی از نرمال سالین یا حلال DMSO، در طول دوره آزمایشی 30-روزه قرار گرفتند. غلظت DMSO رقیق شده در نرمال سالین 25/3 درصد (v/v) بود. گروه CC با 21.6 mg/kg/day CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, China) همانطور که قبلاً توضیح داده شد (13) تجویز شد که در 3.25 درصد (v/v) DMSO (pH{14}) نیز رقیق شده بود. }.2). موش‌های گروه‌های WSSJD و WSSJD جدید به ترتیب با 12 گرم داروی خام/کیلوگرم در روز WSSJD و WSSJD جدید تجویز شدند.رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E). بیضه‌های موش برداشت و بلافاصله در 4 درصد پارافورمالدئید (pH{1}}.2) در دمای اتاق به مدت 24 ساعت تثبیت شدند، سپس آب‌گیری با اتانول، تیمار زایلن برای حذف اتانول، جاسازی موم و برش‌گیری انجام شد. مقاطع بافت شناسی (5 میکرومتر) با استفاده از میکروتوم چرخشی به دست آمد. اینها برای رنگ آمیزی H&E به اسلایدهای شیشه ای چسبانده شدند. برش های بیضه با استفاده از میکروسکوپ هیستوپاتولوژیک برجسته برای ارزیابی توسعه لوله های اسپرم ساز و به دست آوردن داده های هیستومتری مشاهده شد. توسعه لوله های اسپرم ساز با استفاده از سیستم امتیازدهی جانسن ارزیابی شد (22).

الایزا. در روز 3{2}} درمان، موش‌ها با 10 درصد هیدرات کلرال (شرکت معرف شیمیایی Shanghai Guoyao, Ltd) با غلظت 0.004 میلی‌لیتر بر گرم وزن بدن قبل از اتانازی با CO2 بیهوش شدند. خون تنه برداشت شد و سرم جدا شد و در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. به طور خلاصه، خون در لوله‌های 1.5 میلی‌لیتری جمع‌آوری شد و در دمای 4 درجه سانتیگراد یک شبه نگهداری شد. سپس لوله در 1300 xg در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 6 دقیقه سانتریفیوژ شد و سرم جمع آوری شد. کیت های ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) برای تعیین محتوای سرمی تستوسترون (cat. No. EIA-2380) و LH (cat. No. EIA{14}} استفاده شد. ) طبق پروتکل سازنده. چگالی نوری (OD) با استفاده از یک میکروپلیت خوان مدل 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) و سطوح تستوسترون و LH بر اساس منحنی استاندارد تعیین شد.

ایمونوهیستوشیمی. بافت بیضه به مدت 24 ساعت در فرمالدئید 4 درصد در دمای اتاق تثبیت شد و در پارافین جاسازی شد. بخش‌های پارافین به بخش‌های 5 میکرومتری بریده و سپس موم‌زدایی شدند. بازیابی آنتی ژن با انکوباسیون مقاطع در 0 انجام شد.0بافر سیترات 1 مولار (pH=6.0) در دمای 95‑98 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه. سپس بخش ها با آلبومین سرم گاوی 5 درصد (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany; A3675) در دمای اتاق به مدت 1 ساعت مسدود شدند. پس از مسدود شدن، بخش‌ها با آنتی‌بادی‌های پلی کلونال خرگوش علیه LHR (شماره گربه L6792؛ Sigma-Aldrich؛ Merck KGaA؛ 1:200) یا برش زنجیره جانبی P450 (P450scc؛ cat. no. ab75497؛ Abcam, Cambridge؛ cat. no. ab75497, Abcam, Cambridge) انکوبه شدند. ؛ 1:200) در 4 درجه سانتیگراد یک شب در تاریکی. روش کمپلکس استرپتاویدین-بیوتین (SABC) برای تشخیص بیان LHR و P450scc با استفاده از کیت SABC (SA2010؛ Boster Biological Technology، Pleasanton، CA، USA)، طبق پروتکل سازنده استفاده شد. برای بافت های جدا شده از موش های کنترل منفی، آنتی بادی اولیه با PBS جایگزین شد. سلول های لیدیگ با رنگ آمیزی زرد یا قهوه ای روی غشاء یا پلاسما به عنوان سلول های LHR مثبت در نظر گرفته شدند. از هر نمونه پنج اسلاید و پنج میدان در نواحی بافت لیدیگ به‌طور تصادفی انتخاب و در زیر میکروسکوپ فلورسانس (بزرگ‌نمایی، x400) مورد ارزیابی قرار گرفت. میانگین OD سلول های مثبت در نواحی بافت لیدیگ با استفاده از نرم افزار Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA) به دست آمد. بیان LHR و P450scc با مقادیر OD متناسب بود، با مقادیر بالاتر OD بیانگر بیان پروتئین بالاتر است.

سنجش ترانسفراز دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز (TdT) با واسطه dUTP nick-end labeling (TUNEL). بیضه موش ها تشریح شد، در موم جاسازی شد و برش داده شد. بر اساس پروتکل سازنده، مقاطع (ضخامت 5- میکرومتر) با استفاده از کیت سنجش TUNEL (MK1024؛ Boster Biological Technology) رنگ‌آمیزی شدند. به‌طور خلاصه، بافت‌های بیضه از گروه‌های شاهد (نرمال سالین)، DMSO، CsA، CC، WSSJD و WSSJD جدید با استفاده از رقت 1:100 آنتی‌بادی دیگوکسین نشاندار شده با بیوتین به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد رنگ‌آمیزی شدند. بافت اپیتلیال بین بافتی موش رنگ آمیزی شده (ارائه شده در کیت) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد و نمونه های انکوبه شده با PBS به جای آنتی بادی دیگوکسین نشاندار شده با بیوتین به عنوان کنترل منفی مورد استفاده قرار گرفتند. فرکانس سلول‌های TUNEL مثبت که رنگ‌آمیزی هسته‌ای سبز را نشان می‌دهند با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری ارزیابی شد. در مجموع 10 میدان تصادفی تحت بزرگنمایی بالا (x400) ارزیابی شد و سلول های مثبت شمارش شدند. میانگین تعداد سلول های مثبت در هر میدان محاسبه شد.

رنگ آمیزی پروپیدیوم یدید (PI) یا Annexin V-فلورسئین ایزوتیوسیانات (FITC) و آنالیز فلوسیتومتری. اپیدیدیم دم در فداکاری زیر برداشت شد و اپیدرم با تیغه بریده شد تا اسپرم از اپیدیدیم در 2 میلی لیتر PBS در دمای 37 درجه سانتیگراد آزاد شود تا سوسپانسیون اپیدیدیم به دست آید. سپس سوسپانسیون ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند تا اسپرم ها بتوانند خارج شوند. تجمعات اسپرم دور ریخته شد و نمونه‌های اسپرم باقی‌مانده جدا شده و مجدداً در PBS معلق شدند تا غلظت 106 سلول در میلی‌لیتر بدست آید. آپوپتوز اسپرم با استفاده از کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China)، طبق پروتکل سازنده آنالیز شد. به طور خلاصه، 1 میلی لیتر از سوسپانسیون اسپرم با 10 میکرولیتر PI یا با 500 میکرولیتر بافر اتصال و 5 میکرولیتر Annexin V-FITC در تاریکی به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شد. سلول ها بلافاصله توسط فلوسیتومتری Epics XL (Beckman Coulter, Inc.) و با استفاده از سیستم TetraONE™ (6915050؛ Beckman Coulter, Inc.) آنالیز شدند. سلول‌ها در مراحل اولیه آپوپتوز با رنگ‌آمیزی Annexin V مثبت و سلول‌های نکروزه با رنگ‌آمیزی PI مثبت شناسایی شدند.

تحلیل آماری. تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS 13.{1}} (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) انجام شد و به عنوان میانگین به علاوه یا ± انحراف معیار بیان شد. تفاوت‌های بین گروه‌ها از نظر معنی‌داری با استفاده از تحلیل واریانس یک‌طرفه و پس از آن آزمون تعقیبی توکی مورد ارزیابی قرار گرفت. پ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche deserticola

نتایج

اثرات WSSJD جدید بر توسعه لوله های اسپرم ساز بیضه. برای بررسی اثر محافظتی بالقوه WSSJD جدید بر توسعه لوله‌های منی‌ساز بیضه موش، مورفولوژی بیضه‌های موش رنگ‌آمیزی H&E در زیر میکروسکوپ نوری مقایسه شد. لوله‌های منی‌ساز موش‌های گروه‌های CsA و CC انقباض حاشیه لوله، کاهش قطر لوله‌ها و کاهش لایه‌های اپیتلیوم اسپرم‌ساز بیضه را در مقایسه با گروه شاهد نشان دادند. علاوه بر این، سلول های اسپرماتوژن آرایش نامنظم نشان دادند، تعداد سلول های اسپرم زا کاهش یافت و تعداد کمی از اسپرم های بالغ در لومن قابل مشاهده بود (شکل 1). در موش های گروه های DMSO، WSSJD و WSSJD جدید، لایه های بیشتری از اپیتلیوم اسپرم ساز بیضه قابل مشاهده بود و حاشیه لوله اسپرم ساز بدون انقباض یا فروپاشی یکپارچه شد (شکل 1). نمرات جانسن بین گروه DMSO و گروه کنترل یا بین گروه های CC و DMSO تفاوت معنی داری نداشت. با این حال، امتیاز جانسن در گروه CsA و گروه WSSJD در مقایسه با گروه کنترل به طور قابل توجهی کاهش یافت و نمرات گروه های WSSJD و WSSJD جدید در مقایسه با گروه CC یا CsA به طور قابل توجهی افزایش یافت (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">

اثرات WSSJD جدید بر تستوسترون و LH سرم. سطح تستوسترون و LH در سرم متعاقبا اندازه گیری شد. سطح سرمی تستوسترون و LH پس از تجویز DMSO بی‌تأثیر بود. در مقابل، تستوسترون سرم به طور قابل توجهی کاهش یافت، و LH به طور قابل توجهی در موش های تحت درمان با CsA نسبت به گروه کنترل افزایش یافت (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">

اثرات WSSJD جدید بر بیان LHR و P450scc. بیان P450scc و LHR در سلول های لیدیگ بیضه توسط ایمونوهیستوشیمی ارزیابی شد (شکل 3 و 4). در گروه کنترل، LHR بر روی غشای خارجی سلول های لیدیگ بین لوله های اسپرم ساز بیان شد (شکل 3A)، و P450cc در سیتوپلاسم سلول های لیدیگ بیضه بیان شد (شکل 4A). تیمار DMSO تأثیر معنی‌داری بر بیان LHR و P450scc نداشت. در مقابل، تیمار CsA به طور قابل توجهی بیان LHR و P450scc را در مقایسه با موش‌های کنترل کاهش داد (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">

تأثیر WSSJD جدید بر آپوپتوز سلولی اسپرماتوژنیک. آپوپتوز سلول‌های اسپرم‌زا در بیضه‌های موش با استفاده از روش TUNEL آنالیز شد. هسته سلول های آپوپتوز اساساً در اسپرماتوگونی و اسپرماتوسیت های اولیه مشاهده شد (شکل 5A). اسپرماتوگونی ها بزرگتر از اسپرماتوسیت ها هستند و نزدیک به غشای پایه قرار دارند (23). تیمار DMSO تأثیر معنی داری بر تعداد سلول های اسپرماتوژن آپوپتوز در بیضه ها نداشت. در مقابل، تیمار با CsA به طور قابل توجهی تعداد سلول های اسپرماتوژن آپوپتوز را در مقایسه با گروه شاهد و DMSO افزایش داد (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">

اثرات WSSJD جدید بر بقا و آپوپتوز اولیه اسپرم. برای تأیید اثرات محافظتی WSSJD جدید در برابر آپوپتوز اسپرم ناشی از CsA، بقا و آپوپتوز اولیه اسپرم در اپیدیدیم تعیین شد. اسپرم اپیدیدیم با PI یا Annexin V رنگ آمیزی شد و با فلوسیتومتری آنالیز شد (شکل 6 و 7). به دنبال نتایج فوق الذکر، تیمار CsA به طور قابل توجهی درصد اسپرم زنده را کاهش داد و درصد اسپرم آپوپتوز زودرس را به طور قابل توجهی افزایش داد (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">

بحث

قبلاً مستند شده بود که استفاده طولانی مدت از CsA به عنوان یک عامل سرکوب کننده ایمنی بر ظرفیت تولید مثل تأثیر می گذارد (6). Xu (24) گزارش داد که مورفولوژی و حیات اسپرم در بیماران تحت درمان با CsA به طور قابل توجهی کمتر از گروه درمان نشده بود، همانطور که در نمونه های مایع منی 26 گیرنده پیوند کلیه تحت درمان با دوزهای مختلف CsA و 12 داوطلب سالم مشاهده شد. همچنین مشاهده شد که نرخ تغییر شکل سر اسپرم در دریافت‌کنندگان تحت درمان با CsA به طور قابل‌توجهی بالاتر بود (24). این نتایج نشان داد که CsA اثر وابسته به دوز بر پارامترهای مایع منی دارد. بنابراین، مطالعات برای شناسایی عوامل دارویی جدید که قادر به کاهش آسیب بیضه ناشی از CsA و بهبود توانایی تولید مثل مردان پس از پیوند عضو هستند، ضروری است.

ریزمحیط خاص بیضه باعث تقویت اسپرماتوژنز می شود و در نتیجه اختلال در ساختار و عملکرد بیضه ممکن است منجر به توقف اسپرماتوژنیک شود (25). Monteiro و همکاران (26) موش های ویستار را با CsA با دوز 15 میلی گرم بر کیلوگرم در روز به مدت 56 روز تحت درمان قرار دادند و نسبت حجمی افزایش یافته بافت همبند و کاهش نسبت حجمی سلول های لیدیگ را در موش های تحت درمان با CsA مشاهده کردند. همچنین مشاهده شد که CsA باعث انحطاط اپیتلیوم منی ساز و در نتیجه واکوئل شدن سلول سرتولی، اسپرماتیدهای گرد و کشیده غیرطبیعی و تجمع سیتوپلاسم باقیمانده در مرز اپیتلیوم مجاور لومن می شود (26). در مطالعه حاضر، موش‌های کونمینگ روزانه 15 میلی‌گرم بر کیلوگرم CsA به مدت 30 روز تحت درمان قرار گرفتند که منجر به انقباض و کاهش قطر لوله‌های اسپرم‌ساز، کاهش لایه‌های اپیتلیوم منی‌ساز، اختلال در آرایش سلول‌های اسپرم‌ساز و کاهش بالغ می‌شود. اسپرم در لومن و کاهش قابل توجهی نمره جانسن.

علاوه بر این، درمان با درمان CsA به شدت به ساختار بیضه آسیب رساند. مطالعه حاضر همچنین اثرات محافظتی WSSJD جدید، به عنوان یک داروی جدید چینی، بر روی بیضه موش‌های تحت درمان با CsA را ارزیابی کرد. مشاهده شد که لایه‌های اپیتلیال اسپرم‌ساز بیضه و آرایش سلول‌های اسپرم‌ساز پس از درمان با WSSJD جدید ترمیم شدند. علاوه بر این، موش‌های گروه جدید WSSJD لوله‌های منی‌ساز یکپارچه را بدون انقباض یا فروپاشی به نمایش گذاشتند و در مقایسه با موش‌های تحت درمان با CsA امتیاز جانسن به‌طور قابل‌توجهی بالاتری داشتند. این نتایج نشان می دهد که WSSJD به طور قابل توجهی آسیب بیضه ناشی از CsA را ترمیم می کند، که نشان می دهد این ترکیب دارویی گیاهی ممکن است یک درمان موثر در پیشگیری از آسیب بیضه ناشی از CsA باشد. اینکه آیا این ترمیم سلولی وابسته به طاقچه در داخل اپیتلیوم است یا نه، یک سوال مهم است که باید در مطالعات آینده بررسی شود.

محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-بیضه نقش مهمی در تنظیم فعالیت تناسلی دارد (27). رشد و عملکرد اندام های تناسلی مردانه توسط هورمون های هیپوتالاموس و غدد هیپوفیز تنظیم می شود (28). کروگر و همکاران (29) موش‌های Sprague Dawley را با 25 mg/kg/day CsA یا 40 mg/kg/day CsA به مدت 6 روز تحت درمان قرار دادند و مشاهده کردند که سطوح سرمی LH و FSH تا {8}} برابر افزایش یافت، در حالی که بیان P450scc در گروه کنترل به 30 درصد کاهش یافت. علاوه بر این، سطح تستوسترون سرم به طور قابل توجهی در موش های تحت درمان با CsA کاهش یافت که منجر به اختلال در اسپرماتوژنز شد (29). در مطالعه حاضر نشان داده شد که تیمار CsA به طور قابل توجهی بیان LHR را در سلول های لیدیگ کاهش داد. اگرچه LH سرم افزایش یافته بود، کاهش بیان LHR ممکن است باعث اختلال در بازیابی بیوسنتز تستوسترون با واسطه LH و کاهش بیان P450scc، به عنوان آنزیم محدود کننده سرعت بیوسنتز تستوسترون شود (30)، بنابراین بر بیوسنتز تستوسترون توسط سلول های لیدیگ تأثیر می گذارد. ترکیبات جدید در WSSJD جدید، مانند شاخ شاخ، اثراتی مشابه هورمون های جنسی نشان می دهند (12)، که ممکن است سطح تستوسترون سرم را بهبود بخشد و سطح LH سرم را کاهش دهد، بنابراین بیان LHR و p450scc را در سلول های لیدیگ افزایش می دهد. قابل ذکر است، نتایج حاضر نشان داد که WSSJD جدید بیوسنتز و ترشح تستوسترون را در سلول‌های لیدیگ برای ترویج اسپرم‌زایی تحریک می‌کند.

استرس اکسیداتیو ناشی از CSA و آسیب بیضه باعث دیسپلازی اسپرم و سلول های اسپرماتوژن می شود (31). گزارش شده است که درمان طولانی مدت CsA به سیستم آنتی اکسیدانی در بافت های بیضه حیوانات آسیب می رساند و منجر به کاهش سطوح گلوتاتیون، گلوتاتیون پراکسیداز و سطح پراکسید هیدروژن و افزایش سطح دی آلدئید مالونیک در بیضه ها می شود (31). بنابراین، سطوح بیش از حد گونه های اکسیژن فعال در بافت های بیضه را نمی توان حذف کرد، که منجر به پراکسیداسیون لیپیدهای غشای اسپرم، آسیب DNA و کاهش حیات اسپرم می شود. در مطالعه حاضر مشاهده شد که تیمار CsA به طور قابل توجهی شکستگی DNA و سرعت آپوپتوز سلول های اسپرم زا را در لوله های اسپرم ساز افزایش داد. میزان بقای اسپرم در اپیدیدیم نیز کاهش یافته است، در حالی که درصد اسپرم آپوپتوز زودرس افزایش یافته است که نشان می دهد فعالیت اسپرم زایی بیضه ها به طور قابل توجهی آسیب دیده است. Türk و همکاران (32) مستند کردند که اثر محافظتی اسید الاژیک بر آسیب بیضه ناشی از CsA با استرس اکسیداتیو در موش‌های صحرایی نر مرتبط است. WSSJD جدید مورد استفاده در مطالعه حاضر حاوی اجزای مختلف آنتی اکسیدانی از جمله داروی گیاهی جینسنگ است که قبلاً نشان داده شده بود که سطح هایپراکسید را در بیضه ها کاهش می دهد (14).

در مطالعه حاضر، اثرات WSSJD جدید بر اختلالات ناشی از CsA در سنتز تستوسترون و آپوپتوز اسپرماتوژنیک مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد که WSSJD جدید به طور قابل‌توجهی نرخ آپوپتوز سلول‌های اسپرماتوژن و اسپرم را کاهش داد و در نتیجه آسیب به منی‌فرم بیضه را ترمیم کرد. اپیتلیوم مورفولوژی لوله های اسپرم ساز بیضه و آپوپتوز سلول های اسپرماتوژن و اسپرم با استفاده از هیستوشیمی و فلوسیتومتری بررسی شد. اگرچه توزیع چرخه سلولی و تولید روزانه اسپرم مورد بررسی قرار نگرفت، اما تمرکز مطالعات آینده توسط گروه ما خواهد بود.

WSSJD به طور قابل توجهی سطح تستوسترون را در بیضه ها افزایش داد و آپوپتوز سلول های اسپرم زا و اسپرم را کاهش داد، که به طور موثر آسیب بیضه ناشی از CsA را ترمیم کرد. این نتایج نشان می دهد که WSSJD جدید ممکن است یک عامل دارویی مفید در درمان و پیشگیری از آسیب بیضه ناشی از CsA باشد.

Cistanche deserticola roorts کامل

منابع

1. Pedersen M و Seetharam A: عفونت های پس از پیوند کبد ارتوتوپی. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360، 2014.

2. Vora GK و Ciolino JB: واکنش آلوگرافت قرنیه همراه با التهاب غیر چشمی. رقم J Ophthalmol 20: 29-31، 2014.

3. De Pasquale C، Veroux M، Indelicato L، Sinagra N، Giaquinta A، Fornaro M، Veroux P و Pistorio ML: جنبه های آسیب شناختی روانی پیوند کلیه: اثربخشی یک تیم چند رشته ای. World J Transplant 4: 267-275، 2014.

4. El-Gowelli HM و El-Mas MM: مدولاسیون مرکزی فشار خون بالا ناشی از سیکلوسپورین. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361، 2015.

5. EidMM، عبدالحمید IA، SobhMA و el-SaiedMA: ارزیابی ویژگی های حرکتی اسپرم در گیرندگان پیوند کلیه نابارور با استفاده از تجزیه و تحلیل کامپیوتری. Int J Androl 19: 338-344، 1996.

6. زهرا ع، غلامرضا ن، فرخی ف، و شالیزار جلالی ع: تضعیف اختلالات اسپرم و سمیت جنینی ناشی از سیکلوسپورین توسط عصاره آبی میوه crataegus monogyna. سلول J 15: 198-205، 2013.

7. He Z، Qiu J، LiJ، Zhao D، Chen G و Chen L: اثرات طولانی مدت تبدیل از سیکلوسپورین به راپامایسین بر عملکرد و مورفولوژی بیضه در مدل پیوند موش صحرایی. Transplant Proc 45: 763-769، 2013.

8. AliRB، KlouzA، Boubaker S، LakhalM و BelkahiaC: مدل حیوانی سمیت بیضه توسط سیکلوسپورین: ارزیابی و حفاظت. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246، 2009.

9. Seethalakshmi L، Flores C، Malhotra RK، Pallas JD، Tharakan D، Khauli RB و Menon M: مکانیسم اثر سیکلوسپورین در مهار بیوسنتز تستوسترون توسط سلول های لیدیگ موش صحرایی در شرایط آزمایشگاهی. پیوند 53: 190-195، 1992.

10. SeethalakshmiL، FloresC، CarboniAA و Menon M: حفظ کمی اسپرماتوژنز در موش های تحت درمان با سیکلوسپورین با تجویز اگزوژن تستوسترون پروپیونات. J Androl 11: 491-497، 1990.

11. Pan XY، Wang XY، Wang XN، Sun ZX، Wang D، Wang X، Yang YY و Li ZX: اثرات "جوشانده Wenshen Shengjing" بر آپوپتوز سلول اسپرماتوژنیک ناشی از سیکلوفسفامید و دی متیلاسیون هیستون H3K9. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86، 2014 (به چینی).

12. Xu ZH، Li SF، Wang JY، Zhou R و Tian SJ: استخراج هورمون جنسی از مخمل شاخ با CO2 فوق بحرانی. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003، 2007 (به چینی).

13. Zhao LP، Xu Z، Zhang M، Sun HC و Tang F: اثرات Fructus Lycii و Radix astragali بر عملکرد سلول های سرتولی در بیضه موش صحرایی. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86، 2007 (به زبان چینی).

14. Xu L، Liu XH و Zhang L: اثرات جین سنوزیدهای کل بر NO، NOS و ظرفیت کل آنتی اکسیژن در بیضه موش. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508، 2006 (به زبان چینی).

15. Patel DP، Brant WO، Myers JB، Presson AP، Johnstone EB، Dorais JA، Aston KI، Carrell DT و Hotaling JM: ایمنی و اثربخشی کلومیفن سیترات در مردان هیپرآندروژنیک و نابارور. Int J Impot Res 27: 221-224، 2015.

16. ElSheikh MG، Hosny MB، Elshenoufy A، Elghamrawi H، Fayad A و عبدالرحمن S: ترکیبی از ویتامین E و کلومیفن سیترات در درمان بیماران مبتلا به اولیگوی ایدیوپاتیک به عنوان آزواسپرمی: یک کارآزمایی آینده نگر، تصادفی. Andrology 3: 864-867، 2015.

17. Wang R، Xu L، Zhang WX، Wu YF، Shi JH و Zhang YX: Shengjing Granule: یک داروی چینی موثر برای اختلالات اسپرماتوژنیک در موش. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049، 2008 (به زبان چینی).

18. Fan BT: China Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (به زبان چینی).

19. Zhang J، Li H، Lu L، Yan L، Yang X، Shi Z و LiD: فرمول Yiqi و Yangyin آسیب به سیستم خونساز ناشی از تابش کل بدن را بهبود می بخشد. J Radiat Res 58: 1-7، 2017.

20. Minami M، Konishi T، Jiang Z، Arai T و Makino T: اثر Shin'iseihaito بر واکنش آلرژیک موش ناشی از حساسیت بینی. J Tradit Complement Med 6: 252-256، 2015.

21. Rong R، Li RR، Hou YB، Li J، Ding JX، Zhang CB و Yang Y: جوشانده Mahuang-xixin-fuzi عفونت ویروس آنفولانزا را در موش‌های سندرم کمبود کلیه یانگ کاهش می‌دهد. J Ethnopharmacol 192: 217-224، 2016.

22. جانسن SG: شمارش امتیاز بیوپسی بیضه - روشی برای ثبت اسپرماتوژنز در بیضه های انسانی: مقادیر طبیعی و نتایج در 335 مرد هیپوگنادال. Hormones 1: 2-25، 1970.

23. Mays-Hoopes LL، Bolen J، Riggs AD، و Singer-Sam J: آماده سازی اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت ها، و اسپرماتیدهای گرد برای تجزیه و تحلیل بیان ژن با استفاده از مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس. Biol Reprod 53: 1003-1011، 1995.

24. Xu LG: تأثیر سیکلوسپورین A بر پارامترهای مایع منی بیماران پس از پیوند کلیه. J Clin Urol 20: 603-605، 2005.

25. Pintus E، Ros-Santaella JL و Garde JJ: فراتر از اندازه بیضه: ارتباط بین اسپرم زایی و صفات اسپرم در یک پستاندار مولد فصلی. PLoS One 10: e0139240، 2015.

26. Monteiro JC، Predes FS، Matta SL و Dolder H: انفوزیون Heteropterys aphrodisiaca اثرات جانبی سیکلوسپورین A را بر روی بیضه کاهش می دهد. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817، 2008.

27. Oseko F، Note S، Morikawa K، Endo J، Taniguchi A و Imura H: تأثیر هیپرپرولاکتینمی مزمن ناشی از سولپیراید بر محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-بیضه در مردان عادی. Fertil Steril 44: 106-111، 1985.

28. Wisniewski P، Romano RM، Kizys MM، Oliveira KC، Kasamatsu T، Giannocco G، Chiamolera MI، Dias-da-Silva MR، و Romano MA: قرار گرفتن در معرض بزرگسالان با بیسفنول A (BPA) در موش های صحرایی Wistar کیفیت اسپرم را با اختلال کاهش می دهد. از محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-بیضه. Toxicology 329: 1-9، 2015.

29. Krueger BA، Trakshel GM، Sluss PM و Maines MD: کاهش گیرنده‌های هورمون زردآلو با واسطه سیکلوسپورین و بیوسنتز هم در بیضه‌های موش: مکانیزم ممکن برای کاهش تستوسترون سرم. غدد درون ریز 129: 2647-2654، 1991.

30. Nolan CJ و Payne AH: ژنوتیپ در جایگاه P450scc تفاوت در میزان پروتئین P450scc و حداکثر تولید تستوسترون در سلول های لیدیگ موش را تعیین می کند. Mol Endocrinol 4: 1459-1464، 1990.

31. Türk G، Ateşşahin A، Sönmez M، Yüce A و Ceribaşi AO: لیکوپن در برابر سمیت بیضه ناشی از سیکلوسپورین A در موش صحرایی محافظت می کند. Theriogenology 67: 778-785، 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A, and Ateşşahin A: تضعیف آسیب های بیضه و اسپرماتوزویال ناشی از سیکلوسپورین A مرتبط با استرس اکسیداتیو توسط اسید الاژیک. Int Immunopharmacol 10: 177-182، 2010.