پیشرفت‌های تحقیقاتی و کاربرد آنتی‌بادی‌های پروتئین فلورسنت: مروری با تمرکز بر نانوبادی‌ها

خلاصهاز زمان کشف پروتئین‌های فلورسنت (FPs)، طیف‌های فلورسانس غنی و خواص فتوشیمیایی آنها کاربردهای تحقیقاتی بیولوژیکی گسترده‌ای را ارتقا داده است. FP ها را می توان به پروتئین فلورسنت سبز (GFP) و مشتقات آن، پروتئین فلورسنت قرمز (RFP) و مشتقات آن و FP های نزدیک به مادون قرمز طبقه بندی کرد. با توسعه مداوم FPs، آنتی بادی هایی که FPs را هدف قرار می دهند، پدیدار شدند. آنتی بادی، دسته ای از ایمونوگلوبولین ها، جزء اصلی ایمنی هومورال است که به صراحت آنتی ژن ها را شناسایی و متصل می کند. آنتی بادی مونوکلونال، که از یک سلول B منشا می گیرد، به طور گسترده ای در ایمونواسی، تشخیص آزمایشگاهی و توسعه دارو استفاده شده است. نانوبادی نوع جدیدی از آنتی بادی است که به طور کامل از دامنه متغیر یک آنتی بادی زنجیره سنگین تشکیل شده است. در مقایسه با آنتی بادی‌های معمولی، این نانوبادی‌های کوچک و پایدار می‌توانند در سلول‌های زنده بیان شده و عملکردی داشته باشند. علاوه بر این، آنها می توانند به راحتی به شیارها، درزها یا اپی توپ های آنتی ژنی پنهان روی سطح هدف دسترسی داشته باشند. این بررسی مروری بر FP های مختلف، پیشرفت تحقیقات آنتی بادی های آنها، به ویژه نانوبادی ها، و کاربردهای پیشرفته نانوبادی هایی که FP ها را هدف قرار می دهند، ارائه می دهد. این بررسی برای تحقیقات بیشتر در مورد نانوجسم هایی که FP ها را هدف قرار می دهند مفید خواهد بود و باعث می شود FP ها در تحقیقات بیولوژیکی ارزشمندتر شوند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

کلمات کلیدی: پروتئین فلورسنت. انتی بادی مونوکلونال؛ نانوکسی پیشرفت تحقیق؛ کاربرد

1. معرفی

پروتئین فلورسنت (FP) رایج ترین پروتئین ابزار مورد استفاده در تحقیقات علوم زیست پزشکی است. به دنبال افزایش استفاده از FP، آنتی بادی های FP نیز ساخته شده اند. در مقایسه با آنتی بادی سنتی (شکل 1A)، آنتی بادی های زنجیره سنگین (HCAb) از شتر (شکل 1B) و گیرنده های آنتی ژن جدید ایمونوگلوبولین (IgNAR) از کوسه ها (شکل 1C) به طور طبیعی فاقد زنجیره سبک هستند. آنتی بادی تک دامنه (sdAb) یک آنتی بادی است که کاملاً از دامنه های متغیر HCAb یا IgNAR تشکیل شده است. وزن مولکولی آن 12-15 کیلو دالتون است که تقریباً 1/10 اندازه یک آنتی بادی مونوکلونال است. از این رو به آن نانو جسم نیز می گویند. نانو جسم با اندازه کوچکتر، پایداری بالا در برابر اسید و گرما، قابلیت نفوذ قوی، سهولت در مهندسی ژنتیک و بیان و میل ترکیبی بالا، در زمینه های مختلف مورد استفاده محققان علمی قرار گرفته است. این می تواند به راحتی به شیارها، درزها یا اپی توپ های آنتی ژنی پنهان روی سطح هدف دسترسی داشته باشد و بسیاری از آنتی ژن ها را تشخیص دهد که آنتی بادی های معمولی نمی توانند آنها را تشخیص دهند [1]. از این رو، نانو بادی ها به عنوان بیومولکول در ارگانیسم ها و سیستم های کشت سلولی در زیست شناسی تکاملی، کاپرون های کریستالی برای حالت ساختاری در زیست شناسی پایدار، تنظیم کننده ها یا مهارکننده های فعالیت آنزیم، معرف های ایمونوهیستوشیمیایی برای تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی، و آنتی بادی های ثانویه در بلات و ایمونوفلوئنس استفاده شده اند. -6]. نانوبادی هایی که به طور خاص FP را متصل می کنند به طور گسترده در مکان یابی درون سلولی، مطالعات مسیر سیگنال دهی درون سلولی، تصویربرداری سلول زنده و نانومواد هدفمند استفاده می شوند [7-9]. به طور خاص، نانوبادی ها نسبت به آنتی بادی های IgG سنتی در تصویربرداری با وضوح فوق العاده دارای مزایای منحصر به فردی هستند.

شکل 1. نمودارهای ساختار IgG (A)، HCAb شتر (B) و IgNAR کوسه (C). VH، منطقه متغیر زنجیره سنگین. VL، منطقه متغیر زنجیره سبک. CH/C، ناحیه ثابت زنجیره سنگین. CL، ناحیه ثابت زنجیره سبک. VHH، دامنه متغیر HCAb. VNAR، دامنه متغیر IgNAR.

2. مروری بر پروتئین های فلورسنت

2.1. کشف پروتئین های فلورسنت

لومینسانس یک پدیده رایج در بی مهرگان دریایی است. کوئلنترات ها، از جمله چتر دریایی، هیدرا، و مرجان، فلورسانس سبز را تحت اشعه ماوراء بنفش (UV) یا نور آبی منتشر می کنند، در حالی که ctenophore ها فلورسانس آبی ساطع می کنند. پروتئین فلورسنت سبز (GFP) اولین بار توسط Shimomura و همکاران در Aequorea victoria شناسایی شد. در سال 1962 [10]، و سپس در سال 1985 شبیه سازی و بیان شد [11]. خواص منحصر به فرد و ساختار پایدار GFP نوع وحشی (wtGFP) بر این اساس، محققان بسیاری را برای مطالعه آن جذب کرده است. از آن زمان، بر اساس دانش موجود و ساختار کریستالی آن، تیسن و همکارانش پروتئین‌های مختلف GFP با خواص فلورسنت متفاوت را با جهش تولید کردند و مکانیسم لومینسانس GFP را شرح دادند [12]. در رابطه با تحقیقات مربوط به GFP، سه دانشمند (شیمومورا، چالفی و تسین) جایزه نوبل شیمی سال 2008 را به دلیل کشف GFP و مشارکت برجسته آنها در کاربرد آن برنده شدند.

پروتئین فلورسنت قرمز اجدادی (RFP)، یعنی DsRed، در سال 1999 از مرجان‌های صخره‌ای غیر زیست‌تابناک شبیه‌سازی شد [13]. RFP می تواند همراه با GFP برای حل مشکلات علمی که GFP به تنهایی قادر به حل آنها نیست استفاده شود. مهمتر از همه، به دلیل پیشینه کم RFP در تصویربرداری درون سلولی، برای کاربردهای تحقیقاتی در علوم زیستی مناسب تر است [14،15]. با تلاش بسیاری از دانشمندان، گزارش شده است که طیف فلورسانس FPs کل منطقه مرئی و حتی ناحیه نزدیک به فروسرخ را پوشش می‌دهد و ابزارهای فراوانی را برای تجسم و تعیین کمیت پروتئین‌ها در سلول‌های زنده فراهم می‌کند [16]. شکل 2 توسعه FP ها را خلاصه می کند.

شکل 2. توسعه پروتئین های فلورسنت. GFP، پروتئین فلورسنت سبز؛ BFP، پروتئین فلورسنت آبی؛ EGFP، پروتئین فلورسنت سبز افزایش یافته است. YFP، پروتئین فلورسنت زرد؛ RFP، پروتئین فلورسنت قرمز؛ VHH، دامنه متغیر زنجیره سنگین. VNAR، گیرنده آنتی ژن جدید متغیر. نشانگر سبز کم رنگ نشان دهنده پیشرفت تحقیقات در مورد کاربرد GFP و نشانگر سبز زرد نشان دهنده پیشرفت تحقیقات در مورد آنتی بادی GFP است.

2.2. ساختار و ویژگی های عملکردی GFP

GFP یک FP اسیدی طبیعی، کروی و محلول است. ساختار اولیه GFP از یک مونومر متشکل از 238 باقیمانده اسید آمینه با وزن مولکولی 27-30 کیلو دالتون تشکیل شده است. ساختار کریستالی آن مرکزی را نشان می دهد که توسط 11 زنجیره ضد موازی تشکیل شده است که ساختار بشکه ای استوانه ای و محکم بسته بندی شده را تشکیل می دهد. مرکز بشکه توسط یک گروه ساطع کننده نور از 4-(p-hydroxybenzylidene){10}}ایمیدازولینون متصل به مارپیچ آن محافظت می‌شود که هر دو انتهای آن توسط بخش‌های مارپیچ کوتاه مهر و موم شده است [17،18]. بلوغ کروموفور به هیچ کوفاکتوری غیر از O2 نیاز ندارد [19]. GFP نور آبی یا نور UV را جذب می کند و فلورسانس سبز ساطع می کند که پیک تحریک اصلی 395 نانومتر، کمترین پیک تحریک در 475 نانومتر و اوج انتشار 509 نانومتر است. GFP بسیار پایدار است و به راحتی می تواند در برابر حرارت بالا مقاومت کند. تثبیت فرمالدئید یا تعبیه پارافین بر ویژگی های فلورسانس آن تأثیر نمی گذارد. از طریق بررسی عمیق ساختار و فرآیند بلوغ FP ها، محققان بیشتر و بیشتر ساختار FP ها را دوباره طراحی می کنند تا عملکردها و ویژگی های جدیدی را به آنها ارائه دهند و توسعه و کاربرد آنها را بیشتر ارتقا دهند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

2.3. مشتقات GFP

عوامل محدود کننده در کاربردهای GFP عبارتند از pH، حساسیت به یون کلرید و پایداری ضعیف در نور. اصلاحات هدفمند GFP این نقص ها را اصلاح می کند و بازده کوانتومی، روشنایی، ضریب خاموشی مولی و پایداری نور را افزایش می دهد. علاوه بر این، چندین مشتق GFP برای گسترش طیف رنگ های منتشر شده، از جمله آبی، اولترامارین، فیروزه ای و زرد ایجاد شده است.

در پاسخ به شدت فلورسانس کم wtGFP تحت تحریک نور آبی و بیان ناپایدار آن در سلول‌های پستانداران، Zhang et al. یک جایگزین اسید آمینه برای GFP (F64L و S65T)، یعنی GFP (EGFP) تقویت شده، که شدت فلورسانس آن 35-برابر [20] افزایش یافته است. EGFP با توجه به پایداری نور خوب و روشنایی بالا، متداول ترین جهش FP در منطقه نور سبز است. علاوه بر این، ویژگی‌های تاشوندگی GFP بهینه شده است و یک پوشه فوق العاده GFP (sfGFP) با قابلیت تاشو فوق العاده به دست می‌آید. sfGFP دارای شش جهش جدید شامل S30R، Y39N، N105T، Y145F، I171V و A206V است. sfGFP حتی زمانی که به صورت همجوشی با پروتئین های نامحلول بیان می شود می تواند به طور موثر تا شود و از روشنایی فلورسانس آن اطمینان حاصل کند [21]. GFPuv، شکل اصلاح شده دیگری از GFP، برای فلورسانس تحت نور UV بهینه شده است. این فلورسانس سبز روشن تری در حضور نور فرابنفش با اوج تحریک در 395 نانومتر و اوج انتشار در 509 نانومتر تولید می کند و می تواند برای تعیین دقیق محل پروتئین های مختلف درون سلولی مورد استفاده قرار گیرد [22،23]. سه جایگزینی اسید آمینه در GFPuv رخ می دهد، از جمله F99S، M153T، و V163A. این جهش‌ها بیان 18-برابر قوی‌تری GFPuv نسبت به wtGFP در E. coli ایجاد می‌کنند. ژن GFPuv یک ژن مصنوعی است که در آن پنج کدون Arg با فرکانس پایین با کدون های مناسب برای E. coli جایگزین می شوند تا از بیان موثر GFPuv اطمینان حاصل شود.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

جهش مکان‌دار Y66H پروتئین فلورسنت آبی (BFP) را با پیک تحریک در 384 نانومتر و اوج انتشار در ~445 نانومتر می‌سازد. طیف تحریک آن نزدیک به نور ماوراء بنفش است که در حین کار به سلول ها آسیب می رساند و طول موج انتشار کوتاه آن باعث ایجاد اتوفلورسانس در سلول ها می شود. Enhanced BFP (EBFP) درخشندگی ضعیفی دارد و در برابر سفیدکننده نوری و اسید مقاومت چندانی ندارد و سیگنال پس‌زمینه بالایی برای تصویربرداری سلولی دارد. سه جهش درخشان EBFP ایجاد شده اند، از جمله Azurite [24]، EBFP2 [25]، و mTagBFP [26] که عبارتند از 1.{9}}، 2.{11}}، و 3.{13} }برابر روشن تر از EBFP، به ترتیب. mTagBFP، درخشان‌ترین BFP، از جهش‌یافته‌ای از پروتئین فلورسنت قرمز (RFP) TagRFP [27]، با ضریب انقراض 52،{16}} M-1 سانتی‌متر-1 و بازده کوانتومی {{19} مشتق شده است. }}.63، که به طور قابل توجهی مقاومت آن را در برابر فوتوبلیچینگ بهبود می بخشد. جهش Y66F در wtGFP منجر به یک پروتئین فلورسنت اولترامارین با طول موج انتشار 442 نانومتر می شود [28]. با این حال، بازده کوانتومی فلورسانس کم نوع GFP-Y66F کاربرد آن در تصویربرداری را به شدت محدود می کند. جهش بیشتر GFP-Y66F با جایگزینی اسید آمینه T65Q، Y145G، H148S، و T203V منجر به پروتئین فلورسنت اولترامارین سیریوس می شود که 25 برابر روشن تر از GFP-Y66F است [29].

پروتئین فلورسنت فیروزه ای (CFP) دارای یک پیک تحریک در 449 نانومتر و یک پیک انتشار در ~482 نانومتر است، با خواص طیفی بین BFP و EGFP. مشابه BFP، یک جهش مکان‌دار Y66W برای ساختن CFP استفاده می‌شود. CFP به دلیل پایداری فوق‌العاده در عکس‌برداری، کاربردهای گسترده‌ای در تحقیقات تصویربرداری چندرنگ و محلی‌سازی دارد. به عنوان مثال، ژن کد کننده CFP برای ترجیح کدون انسان بهینه شده است و اکنون به صورت تجاری با نام تجاری AmCyan1 (Clontech) در دسترس است. علاوه بر این، چندین جهش درخشان تر از CFP (ECFP) تقویت شده وجود دارد، مانند Cerulean، mTFP (دو برابر روشن تر از Cerulean)، و فیروزه (حدود دو برابر روشن تر از ECFP) [21،30].

جهش در پروتئین فلورسنت زرد (YFP) در موتیف هسته کروموفور Y66 محدود نمی شود، اما در باقیمانده های ساختاری مجاور Y66. پیک تحریک YFP ~ 518 نانومتر است و پیک انتشار آن ~ 531 نانومتر است. در مقایسه با GFP، فلورسانس YFP به سمت طیف قرمز تغییر می‌کند، که عمدتاً به دلیل جایگزینی Thr با Tyr در موقعیت 203 است. YFP تقویت‌شده (EYFP) یکی از فلورسنت‌ترین و گسترده‌ترین بیوسنسورهای FP برای تشخیص pH درون سلولی است. غلظت یون کلرید با این حال، نسبت به یون‌های اسید و کلرید بسیار حساس است و نسبت به بسیاری از FP‌های مشتق شده از چتر دریایی، پایداری کمتری در نور دارد [31]. mCitrine و mVenus، نسخه های بهبود یافته EYFP، در حال حاضر پر استفاده ترین YFP هستند [32،33]. خواص فوتوفیزیکی GFP و مشتقات آن در جدول 1 خلاصه شده است.

جدول 1. خواص فوتوفیزیکی GFP، RFP و مشتقات آنها.

جدول 1. ادامه

2.4. مشتقات RFP

RFP یکی دیگر از FP های پرکاربرد است. DsRed یک تترامر است که در هنگام انجام همجوشی پروتئین تمایل به تشکیل مولتیمر دارد و در صورت بیان درون سلولی می تواند سمی باشد، بنابراین برای بدست آوردن مونومرها مهندسی شده است. قابل توجه ترین RFP خانواده "mFruit" است، از جمله mCherry، mBanana، mOrange، dTomato، mTangerine و mStrawberry (جدول 1)، که mCherry با جهش های K163Q و K83L ترجیح داده شده است. mCherry بلوغ سریع، خواص مونومری خوب و پایداری نور بهتر دارد، اگرچه روشنایی کمتری دارد [34]. با این حال، TagRFP در شکل مونومر آن حدود سه تا چهار برابر روشن‌تر از mCherry است، که آن را به یک RFP مونومر نسبتاً روشن تبدیل می‌کند که در حال حاضر در دسترس است [27]. mKate یک پروتئین فلورسنت دور قرمز مونومر جدید است که از یک جهش چهار جایگاهی TagRFP با اوج تحریک در 588 نانومتر و اوج انتشار در 635 نانومتر مشتق شده است که تنها 45٪ به روشنایی EGFP است. پروتئین دیمریزاسیون آن، کاتوشکا، 67 درصد به روشنایی EGFP است [35]. mKate2، جهش یافته mKate با جایگزینی اسید آمینه V38A، S165A، و K238R، تقریباً دو برابر روشنایی mKate است [36]. در مقایسه با GFP و RFP، mKate و Katushka عمق تصویربرداری بهتر و سیگنال‌های نوری غنی‌تری را برای تصویربرداری فلورسانس درون شی نشان می‌دهند [35]. از این رو، توسعه پروتئین های فلورسنت قرمز دور برای تصویربرداری زیستی in vivo ارزشمندتر است.

2.5. FP های مادون قرمز نزدیک

FP های مادون قرمز نزدیک (NIR) به عنوان برچسب های پروتئینی در برنامه های تصویربرداری بسیار مورد نیاز هستند. اکثر FP های NIR از گیرنده های نوری فیتوکروم باکتریایی (BphPs) طراحی شده اند [37]. اولین NIR FP مورد استفاده در تصویربرداری از حیوانات زنده، IFP1.4 است، یک پروتئین فلورسنت مشتق شده از BphP که با اتصال به کروموفور بیلیوردین (BV) فلورسانس می شود [38]. سپس با ترکیب DNA و جهش زایی تصادفی، یک IFP2 روشن تر ایجاد می شود.{6}} سپس [39]. اگرچه IFP1.4 و IFP2 مونومر را می توان با شکستن رابط دیمریزاسیون BphP به دست آورد، آنها همچنان تمایل به دیمر شدن در غلظت های بالا دارند. یک پروتئین فلورسنت مادون قرمز مونومر طبیعی (IFP)، mIFP، در سال 2015 طراحی شد [40]. ثابت شده است که mIFP دارای اثرات تصویربرداری صوتی در لاروها و نورون های مگس سرکه است. شچرباکووا و همکاران سه FP مونومر NIR روشن با طیف های متمایز، یعنی miRFP670، miRFP703 و miRFP709 طراحی کرد [41]. FP های NIR مشتق شده از BphP حداقل به دو حوزه PAS (Per-ARNT-Sim) و GAF (cGMP فسفودی استراز-آدنیلات سیکلاز-FhlA) نیاز دارند تا به صورت کووالانسی یک کروموفور BV را بچسبانند و همچنین دارای ساختار پیچیده "شکل از هشت گره" باشند. پیوند توپولوژیکی دامنه های GAF و PAS، که بر تا شدن آنها تأثیر می گذارد. از این رو، دسته دیگری از گیرنده های نوری باکتریایی، آلوفیکوسیانین ها (APCs)، برای مهندسی FP های NIR، مانند smURFP [42] استفاده می شود. اگرچه FPهای NIR مبتنی بر APC کوچکتر هستند، اما آنها با کارایی کمتری به BV متصل می شوند که منجر به درخشندگی قابل توجهی در سلول های پستانداران نسبت به NIR FP های مشتق شده از BphP می شود. برای غلبه بر نقایص NIR FP های مبتنی بر BphP و APC، یک NIR FP تک دامنه ای به نام miRFP670nano از سیانوباکتریوکروم (CBCR) ساخته شد که نشان دهنده اولین NIR FP مشتق شده از CBCR است که می تواند به طور کارآمدی کروموفور BV درون زا و تابش درخشان را متصل کند. سلول های پستانداران [43]. یک مزیت اساسی miRFP670nano نسبت به FP های NIR مشتق شده از BphP، پایداری بالای عکس است. miRFP670nano3 تقویت شده، با 14 جهش نسبت به miRFP670nano والدین، پایداری نوری مشابه miRFP670nano را نشان می‌دهد [44]. جدول 2 خواص فوتوفیزیکی FP های NIR را خلاصه می کند.

جدول 2. خواص فوتوفیزیکی NIR FPs.

کشف و کاربرد FPs یک ابزار تحقیقاتی قدرتمند برای زیست شناسی مدرن ارائه کرده است. امروزه، FPها به یکی از ابزارهای رایج دانشمندان برای گسترش کاربردهای خود در بسیاری از زمینه‌های تحقیقاتی، مانند تنظیم بیان ژن، برچسب‌گذاری اندام‌ها، انتقال سیگنال، غربالگری دارو، و فعل و انفعالات زیست مولکولی تبدیل شده‌اند. اکثر بردارهای شبیه سازی که FP ها را بیان می کنند تجاری شده اند و از طریق شرکت های تجاری در دسترس هستند.

3. پیشرفت های تحقیقاتی در مورد آنتی بادی پروتئین فلورسنت

3.1. آنتی بادی مونوکلونال که پروتئین های فلورسنت را هدف قرار می دهد

آنتی بادی نوعی ایمونوگلوبولین است که توسط لنفوسیت های B ترشح می شود. آنتی بادی های مونوکلونال از دو زنجیره سنگین و دو زنجیره سبک تشکیل شده اند که زنجیره سنگین شامل یک ناحیه متغیر (VH) و سه ناحیه ثابت (CH) و زنجیره سبک از یک منطقه متغیر (VL) و یک منطقه ثابت (CL) تشکیل شده است. ). زنجیره های سنگین به صورت کووالانسی توسط پیوندهای دی سولفیدی به هم متصل می شوند و ناحیه CL زنجیره سبک به صورت غیر کووالانسی به حوزه CH1 زنجیره سنگین متصل می شود تا یک مولکول آنتی بادی پایدار را تشکیل دهد [45]. آنتی‌بادی‌های مونوکلونال به دلیل ظرفیت اتصال گیرنده خاص خود، فعالیت‌های بیولوژیکی مختلفی مانند مسدود کردن کلاسیک، خنثی‌سازی، فعال‌سازی مکمل، کشتن سلول‌های هدف از طریق گیرنده Fc و تنظیم فعالیت ایمنی تولید می‌کنند. آنها ماکرومولکول های بیولوژیکی حیاتی هستند که به طور گسترده در سنجش ایمنی، تشخیص آزمایشگاهی و توسعه دارو استفاده می شوند. آنتی بادی های پلی کلونال مخلوطی از آنتی بادی های هتروتیپی هستند که از فرآیند پاسخ ایمنی سلول های B متعدد به دست می آیند و هر آنتی بادی اپی توپ متفاوتی از همان آنتی ژن را تشخیص می دهد [45]. در مقایسه با آنتی بادی های پلی کلونال، آنتی بادی های مونوکلونال به طور خاص یک اپی توپ روی آنتی ژن را تشخیص می دهند و احتمال کمتری دارد که با سایر پروتئین ها واکنش متقابل داشته باشند، بنابراین سیگنال های رنگ آمیزی پس زمینه پایین تولید می کنند. علاوه بر این، تکرارپذیری نتایج مربوط به آنتی بادی های مونوکلونال بیشتر از آنتی بادی های پلی کلونال در شرایط آزمایشی مشابه است.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90٪ با استفاده از یک تکنیک ساده 2-گام با استفاده از mAb FMU-GFP خالص می‌شود.5-رزین Sepharose 4B همراه. علاوه بر این، تمام پروتئین‌های هدف نوترکیب عملکردی جفت شده با GFP را می‌توان به‌راحتی و مستقیماً از سلول‌ها جدا کرد، با توجه به اپی توپ GFP. این داده‌ها نشان می‌دهند که این روش در خالص‌سازی GFP از هر روش موجود مؤثرتر است و چالش بازده و خلوص پایین در اکثر روش‌های خالص‌سازی GFP را حل می‌کند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

3.2. پروتئین های فلورسنت را هدف قرار می دهد

3.2.1. معرفی Nanobody

خواص ذاتی آنتی بادی های مونوکلونال، مانند وزن مولکولی بزرگ، ساختار پیچیده و فعالیت بیولوژیکی محدود، به طور فزاینده ای کاربردهای بیشتر آنها را محدود کرده است. بنابراین، توسعه جایگزین هایی برای آنتی بادی های مونوکلونال ضروری است. در سال 1989 وارد و همکاران. دامنه متغیری از آنتی بادی تنها با زنجیره سنگین با توانایی اتصال ضعیف به لیزوزیم تهیه کرد که علاقه زیادی به تحقیقات sdAb داشت [48]. در سال 1993، همرز کسترمن و همکاران. برای اولین بار نوع جدیدی از آنتی بادی را در سرم شتر کشف کرد که کاملاً با آنتی بادی سنتی پستانداران متفاوت است [49]. این نوع آنتی بادی به دلیل فقدان طبیعی زنجیره سبک، HCAb نامیده می شود. HCAb از CH2، CH3، ناحیه لولا و دامنه متغیر HCAb (VHH) تشکیل شده است، اما هنوز ظرفیت اتصال آنتی ژن کاملی دارد. در سال 1995، گرینبرگ و همکاران. تنها آنتی بادی هایی با زنجیره سنگین، معروف به IgNAR، در کوسه پرستار کشف کرد [50]. به دو شکل ترشحی و متصل به غشاء وجود دارد و از یک ناحیه متغیر به نام گیرنده آنتی ژن جدید متغیر (VNAR) و چندین ناحیه ثابت تشکیل شده است. متعاقباً، IgNAR در کوسه wobbegong، سگ ماهی خاردار، کوسه شاخدار و کوسه بامبو خال سفید یافت شد که مکمل مجموعه‌های sdAbs است. یک نانو جسم دارای ویژگی های وزن مولکولی کوچک، میل ترکیبی بالا، پایداری قوی، حلالیت خوب، نفوذ قوی در بافت، و تشخیص اپی توپ های آنتی ژن پنهان است. این مورد توجه بیشتری را در تشخیص بیماری، معرف های ایمنی، تشخیص پاتوژن و توسعه دارو به خود جلب کرده است [51]. با توسعه تکنیک‌های زیست‌شناسی مولکولی و بهبود فناوری آماده‌سازی آنتی‌بادی مهندسی شده ژنتیکی، نانوبادی به یک زمینه تحقیقاتی محبوب در سنجش ایمنی تبدیل شده است. شکل 3 توسعه نانو جسم تا به امروز را خلاصه می کند.

شکل 3. توسعه نانو جسم. نشانگر آبی روشن نشان دهنده پیشرفت تحقیقات روی داروهای نانوجسمی است. FDA، سازمان غذا و دارو؛ EMA، آژانس دارویی اروپا؛ NMPA، اداره ملی محصولات پزشکی؛ HCAb، آنتی بادی زنجیره سنگین؛ IgNAR، گیرنده های آنتی ژن جدید Ig. sdAb، آنتی بادی تک دامنه. VHH، دامنه متغیر HCAb. VNAR، دامنه متغیر IgNAR. PD-L1، مرگ سلولی برنامه ریزی شده 1 لیگاند 1.

3.2.2. پروتئین های فلورسنت را هدف قرار می دهد

پروتئین های فلورسنت با ارائه نشانگرهای پروتئین فلورسنت کدگذاری شده ژنی ساده، بیولوژی و بیوشیمی سلولی را تغییر داده اند. چندین عامل اتصال محکم برای اهداف تحقیقاتی و دارویی از طریق سنتز و انتخاب کتابخانه‌های داربست پروتئینی در طول توسعه موازی توسعه یافته‌اند [52]. به عنوان مثال، توسعه نانوجسمی است که با بهبود پایداری، حلالیت و عملکرد آسان‌تر انتخاب می‌شود [53]. برخلاف آنتی بادی های سنتی، این نانوبادی های کوچک و پایدار در سلول های زنده عملکردی دارند. بنابراین، نانو جسم با فعالیت اتصال ویژه به FP ابزاری قوی برای همجوشی، جداسازی و مهندسی سلولی FP در زمینه‌های مختلف تحقیقات بیولوژیکی است.

• نانوبادی های مشتق شده از Camelidae که GFP را هدف قرار می دهند

پروتئین‌های مختلف با ویژگی‌های محلی سازی درون سلولی عالی با GFP ترکیب شده‌اند و آنتی‌ژن‌های بصری برای تشخیص مستقیم پروتئین‌ها در بخش‌های مختلف درون سلولی ایجاد می‌کنند. در سال 2006، روثباوئر و همکاران. یک قطعه آنتی بادی اختصاصی GFP (cAbGFP4) را با ایمن سازی آلپاکا با GFP غربال کرد [54]. سنجش رزونانس پلاسمون سطحی (SPR) از تعامل بین cAbGFP4 و آنتی ژن GFP میل ترکیبی بالایی را نشان داد (KD=0.23.nM). علاوه بر این، نانو بادی ضد GFP با یک RFP مونومر ترکیب شد و آنتی بادی قابل مشاهده متصل به GFP را تولید کرد که برای بررسی توزیع نانوبادی ضد GFP در سلول‌های زنده استفاده می‌شود. با فیلتراسیون ژل، ایمونوبلات، و سنجش میکروسکوپ کانفوکال، نانو جسم اختصاصی GFP به طور پایدار در سلول‌های پستانداران بدون تخریب یا تجمع پروتئین قابل تشخیص که معمولاً با قطعات متغیر تک زنجیره‌ای یافت می‌شود، توزیع می‌شود. علاوه بر این، کوبالا و همکاران. کمپلکس GFP:cAbGFP4 (شکل 4A) را با کریستالوگرافی اشعه ایکس و کالریمتری تیتراسیون همدما (ITC) [55] مشخص کرد، که اساس میل ترکیبی و ویژگی بالای نانوبادی ها در اتصال پروتئین را آشکار می کند. در سال 2020، چهار نانوبادی متمایز ضد GFP به نام‌های A12، B9، D5 و E6 با استفاده از نمایش فاژ شناسایی شدند [56]. PAGE بومی و سنجش ایمنی نشان داد که این نانوبادی‌ها می‌توانند GFP را در شرایط in vitro و in vivo متصل کنند.

شکل 4. نمودار کمپلکس GFP-nanobody. (الف) cAbGFP4 (PDB:3OGO، نارنجی)؛ (B) GBP1 (PDB: 3K1K، آبی روشن)؛ (C) GBP4 (PDB: 3G9A، صورتی)؛ (D) LaG16 (PDB: 6LR7، زرد)؛ (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53، سرخابی). (F) برهم نهی ساختاری نانوبادی های بالا با کمپلکس GFP. GFP با رنگ سبز نشان داده شده است.

ترکیب پروتئین ارتباط نزدیکی با عملکرد دارد و معمولاً توسط عوامل تنظیمی کنترل می شود. اکسل و همکاران هفت بایندر اختصاصی GFP، یعنی پروتئین های متصل شونده به GFP (GBPs) 1-7 را شناسایی کرد [57]. در میان آنها، GBP1 فلورسانس GFP را 10- برابر افزایش داد، در حالی که GBP4 باعث کاهش 5- برابری فلورسانس GFP شد. از این رو، اینها به ترتیب به عنوان "افزایش دهنده" و "حداقل کننده" نامیده شدند. آنالیزهای ساختاری مجتمع GFP-nanobody (شکل 4B, C) نشان داد که این دو نانو جسم باعث ایجاد تغییرات متضاد متضادی در محیط کروموفور شدند و ویژگی‌های جذب آن را تغییر دادند [58]. علاوه بر این، 25 نانوبادی اختصاصی GFP (LaGs) با مقادیر KD از 0.5 نانومولار تا بیش از 2{31}} میکرومولار شناسایی شدند [59]. یک نانو جسم دو ظرفیتی (LaG-16-LaG-2) بالاترین میل ترکیبی را با مقدار KD 36 pM نشان داد. علاوه بر این، حداکثر شدت فلورسانس GFP زمانی که با پروتئین LaG اضافی انکوبه شد تا 60٪ افزایش یافت. ژانگ و همکاران ساختار کریستالی GFPuv کمپلکس شده با LaG16 (شکل 4D) با وضوح 1.67 Å [60] را گزارش کرد. محل اتصال LaG16 در بشکه GFP در طرف دیگر تقویت کننده GFP قرار داشت. از این رو، LaG16 و تقویت کننده GFP با یک پیوند دهنده (GS)4 ترکیب شدند. نانو جسم دو ظرفیتی دارای میل ترکیبی 0.5 نانومولار بود که امکان طراحی اتصال دهنده های پروتئین هدف با میل ترکیبی فوق العاده بالا را با دیمریزاسیون 2 نانوبادی که با اپی توپ های مختلف متصل می شوند را نشان می دهد.

در سال 2014، توایر و همکاران. sfGFP را تهیه و یک شتر بالغ یک کوهانه را ایمن سازی کرد. هفت نانوبادی ضد sfGFP که سه اپی توپ (NbsfGFP01، 02، 03، 04، 06، 07 و 08) را هدف قرار می‌دهند، جدا شدند [61]. بر اساس ELISA و سنجش ایمنی بلات، این نانوبادی‌ها sfGFP را به‌عنوان آزاد یا ذوب شده با هورمون رشد شناسایی کردند. علاوه بر این، ساختار کریستالی نانو جسم NbsfGFP02 کمپلکس شده با sfGFP (شکل 4E) با وضوح 2.2 Å ایجاد شد. میل ترکیبی بین NbsfGFP02 و sfGFP با استفاده از تداخل سنجی لایه ای (BLI) 15.8 نانومولار تعیین شد. دمای ذوب برای NbsfGFP02 75.6 درجه بود [62]. از این رو، این یک نامزد آینده نگر GFP نانو جسم در برنامه هایی است که نیازمند شرایط آزمایش سخت هستند. بیشتر نانوبادی‌ها می‌توانند از طریق انتقال پلاسمید به سلول‌های یوکاریوتی، به طور کاربردی در داخل بدن بیان شوند. از این رو، نانو اجسام ابزاری عالی برای شناسایی ویژگی‌های ساختاری یا پویا در سلول‌های زنده هستند. در سال 2020، ژو و همکاران. روش جدیدی برای بیان نانوبادی های متصل شونده به GFP ساخته شده (cAbGFP4) به عنوان mRNA ژن رونویسی در شرایط آزمایشگاهی (IVT) پیشنهاد کرد که به عنوان نانوبادی-mCherry [63] نامیده می شود. mRNA با نواحی ترجمه نشده و آنالوگ های کلاهک معکوس پوشیده شده با نوکلئوتیدهای اصلاح شده شیمیایی و دم پلی (A) در شرایط آزمایشگاهی تهیه شد و برای ترانسفکشن استفاده شد. برخلاف نانوبادی بیان شده با استفاده از DNA پلاسمید، نانوبادی ضد GFP بیان شده با استفاده از mRNA IVT در عرض 3 ساعت پس از ترانسفکشن شناسایی شد و در عرض 48 ساعت تجزیه شد. بنابراین، بیان mRNA کدگذاری شده نانوبادی در سلول‌های زنده امکان تحویل کارآمد نانو جسم را فراهم می‌کند.

• نانو بادی های مشتق شده از کوسه که GFP را هدف قرار می دهند.

وی و همکاران نشان داد که کوسه های بامبو یک پاسخ ایمنی موثر در برابر ایمن سازی GFP ایجاد می کنند که با افزایش تعداد لنفوسیت ها و IgNAR های اختصاصی آنتی ژن مشخص می شود [64]. در مجموع، 7 نانوبادی ضد GFP، از جمله BsG3، 73، 8{11}}، 89، 93، 98، و 105، با میل ترکیبی تا 0.3 نانومتر، از کوسه‌های بامبو واکسینه شده جدا شدند که به این معنی است که کوسه‌های بامبو IgNAR های با میل ترکیبی بالا را تولید کنید. علاوه بر این، VNAR های دوپاراتوپیک با بالاترین میل ترکیبی به GFP (20.7 pM) ساخته شدند و ویژگی نانوبادی های ضد GFP به عنوان درون بادی در سلول های پستانداران تایید شد. این یافته ها تحقیق و پیشرفت sdAbs کوسه بامبو را برای ارائه نانو اجسام کم هزینه و با کاربری آسان برای صنعت زیست پزشکی سرعت می بخشد.

• نانو بادی هایی که سایر پروتئین های فلورسنت را هدف قرار می دهند.

ماسابی یک پروتئین فلورسنت سبز مونومر روشن است. لی و همکاران با ایمن سازی شتر با mWasabi به عنوان یک آنتی ژن، یک کتابخانه آنتی بادی از 4 × 107 ترانسفورماتور را با موفقیت ساخت و 3 نانوبادی اختصاصی mWasabi با میل ترکیبی بالا به نام‌های Nb4، Nb6 و Nb27 را غربال کرد [65]. این نانو اجسام واسبی را به تنهایی یا زمانی که با مرگ برنامه ریزی شده 1 ترکیب می شوند (PD{10}}) تشخیص دادند. در مجموع، 6 نانوبادی (LaMs) که mCherry را با ویژگی بالا هدف قرار می‌دهند، با مقادیر KD در محدوده 0.18 نانومتر تا 63 نانومتر شناسایی شدند [59]. علاوه بر این، سه نانوبادی اختصاصی iRFP (BSR1، BSR3، و BSR4) با شباهت‌های اتصال نانومولاری جدا شدند [64]. این داده‌ها نشان می‌دهند که ایمن‌سازی کوسه‌های بامبو می‌تواند نانوبادی‌هایی با میل ترکیبی بالا تولید کند. به طور کلی، توانایی نانو بادی ها برای اتصال پروتئین های سلولی و جذب پروتئین های همجوشی FP امکان کنترل دقیق فرآیندها و ساختارهای سلولی در سلول های زنده را فراهم می کند. این تله چند منظوره FP-nano آنالیزهای میکروسکوپی، بیوشیمیایی و عملکردی را با ترکیبی منحصر به فرد از همان پروتئین امکان پذیر می کند. نانوجسمی که FP ها را هدف قرار می دهند در جدول 3 خلاصه شده است.

جدول 3. خلاصه ای از نانوجسم هایی که FP ها را هدف قرار می دهند.

4. کاربردهای نانوبادی پروتئین فلورسنت

4.1. کاربردها در تشخیص پروتئین

4.1.1. تشخیص پروتئین های داخل سلولی

درک عملکرد پروتئین نیاز به محلی سازی پروتئین با وضوح بالا قابل اعتماد و کمی دارد. اگرچه استفاده از آنتی بادی ها برای برچسب زدن پروتئین های هدف در زیست شناسی مولکولی به خوبی ثابت شده است، این روش به دلیل اندازه و چند ظرفیتی آنتی بادی های معمولی محدود شده است. با توجه به اندازه کوچک نانوبادی ها، می توان از آنها به عنوان ردیاب برای تصویربرداری درون سلولی پس از بستن با مولکول های فلورسنت، آنزیم ها، پپتیدها، گیرنده ها، بیوتین و سایر داروها استفاده کرد. به عنوان مثال، نانوبادی‌ها در برابر FP در تصویربرداری میکروسکوپی با وضوح فوق‌العاده زمانی که با رنگ‌های آلی برچسب‌گذاری شدند، استفاده شدند [66،67]. سلول های Ptk2 که به طور مداوم توبولین YFP را بیان می کنند با استفاده از این روش تصویربرداری شدند و وضوح به 37 ± 269 A بهبود یافت، در حالی که تقریباً 450 A با آنتی بادی های معمولی مخالف بود.

برچسب‌گذاری با واسطه نانوجسم، روشی سریع و همه‌کاره برای برچسب‌گذاری تقریباً هر ساختار همجوشی مشتق‌شده از FP که معمولاً در دسترس است برای تصویربرداری میکروسکوپ محلی‌سازی تک مولکولی پیچیده (SMLM) ارائه می‌کند. به طور خاص، SMLM دو رنگ می‌تواند مکان‌یابی درون سلولی هر ساختار ترکیبی عملکردی GFP و RFP را هنگامی که نانوبادی‌ها علیه GFP و RFP به طور همزمان استفاده می‌شوند، بررسی کند [68]. بنابراین، بسیاری از مشکلات بیولوژیکی را می توان به سرعت با استفاده از تصویربرداری SMLM دو رنگ برطرف کرد. آریوتی و همکاران یک رویکرد مدولار برای برچسب‌گذاری پروتئین مبتنی بر آنزیم پیشنهاد کرد که امکان بهبود سرعت و نمونه‌برداری را برای تجزیه و تحلیل توزیع پروتئین درون سلولی به وضوح EM فراهم می‌کند [7]. با طراحی GBP4 به طور مستقیم بر روی برچسب آسکوربات پراکسیداز سویا (APEX) اصلاح شده، نشان داده شد که APEX می تواند به هر پروتئین نشاندار شده با GFP مورد علاقه هدایت شود. همجوشی APEX-GBP4 محلی‌سازی پروتئین با وضوح بالا قابل‌توجهی را در زیر دامنه‌های اندامک فراهم می‌کند و زمان مشخص کردن توزیع‌های پروتئین درون سلولی را به طور قابل‌توجهی کوتاه می‌کند. علاوه بر این، وضوح EM پروتئین های نشاندار شده با GFP را که در سطوح درون زا بیان می شوند، اجازه می دهد.

یک جعبه ابزار از پلاسمیدهای کدکننده نانو جسم خاص FP تولید و در ماژول های کاربردی ترکیب شد. این جعبه ابزار تجسم و دستکاری مسیرهای سیگنال دهی درون سلولی را در سلول های زنده امکان پذیر می کند و به طور قابل توجهی کاربردهای آن را در داخل بدن گسترش می دهد [9]. اینها شامل حسگرهای فلورسنت برای تجسم دینامیکی Ca{3}}، H+، و ATP/ADP، و ماژول‌های الیگومری یا هترودیمری هستند که امکان جذب پروتئین یا جداسازی و شناسایی مکان‌های تماس غشایی بین اندامک‌ها را فراهم می‌کنند. در سال 2017، هرس و همکاران. از پپتید نافذ سلولی (CPP) برای انتقال آنتی بادی ها به طور مستقیم به سلول ها برای برچسب گذاری ایمنی و دستکاری آنتی ژن استفاده کرد [69]. سیستمی که از میل ترکیبی بالای CPP غنی از آرژنین حلقوی نسبت به RNA در هسته استفاده می‌کرد، ساخته شد. با پیوند CPP حلقوی غنی از آرژنین به نانو جسم GFP، مکان یابی مجدد GFP در هسته را می توان مستقیماً در سلول ها مشاهده کرد (شکل 5A). بنابراین، این سیستم تجسم شده را می توان برای ردیابی محل پروتئین و مقایسه کارایی CPP های مختلف به صورت کمی مورد استفاده قرار داد.

تکنیک انتقال انرژی تشدید فلورسانس (FRET) به طور گسترده در تحقیقات علوم زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرد، زیرا امکان تشخیص پویای مولکول‌های سیگنال‌دهنده را در شرایط فیزیولوژیکی در سلول‌های زنده فراهم می‌کند. به دلیل حساسیت و ویژگی استثنایی آن، تجزیه و تحلیل مبتنی بر انتقال انرژی رزونانس فورستر (TR-FRET) با زمان حل شده در تحقیقات زیست پزشکی به طور فزاینده ای محبوب می شود. روش TR-FRET مبتنی بر نانوجسم امکان کمی سازی آسان پروتئین های فلورسنت (همجوشی) در لیزها را با حساسیت بسیار بالاتر نسبت به بازخوانی های شدت فلورسانس معمولی فراهم می کند [70].

شکل 5. کاربردهای نانوبادی پروتئین فلورسنت. (الف) تجسم تعاملات پروتئین-پروتئین. نانوبادی ضد GFP (Nb) متصل به پپتیدهای نافذ سلولی (CPPs) می تواند به هسته سلول نفوذ کند. اگر پروتئین برچسب‌گذاری‌شده با GFP با پروتئین برچسب‌گذاری‌شده با RFP تعامل نداشته باشد، فقط پروتئین برچسب‌گذاری‌شده با GFP مجدداً از طریق Nb-CPP در هسته قرار می‌گیرد و یک رنگ سبز نشان می‌دهد. با این حال، اگر این دو پروتئین با هم تعامل داشته باشند، هر دو پروتئین دوباره به هسته تبدیل می شوند و رنگ زرد نشان می دهند. (B) نانو جسم GFP برچسب‌گذاری انتخابی پروتئین‌های وزیکولی تازه اگزوسیتوز شده را امکان‌پذیر می‌سازد. مرحله 1: پروتئین وزیکول به GFP جفت می شود و با یک نانوبادی غیر فلورسنت (NbGFP) انکوبه می شود، که منجر به غیرقابل دسترس بودن GFP با نانوبادی متصل به فلورسانس (NbGFP*) می شود. مراحل 2 و 3: پس از تحریک اگزوسیتوز سلولی، پروتئین وزیکول جدید در معرض غشای پلاسمایی قرار می گیرد و می تواند توسط NbGFP* برچسب گذاری شود. (C) تصویر شماتیک از تخریب شده. تخریب انتخابی پروتئین از طریق مسیر یوبیکوئیتین انجام می شود که توسط مجموعه ای پیچیده از آنزیم ها انجام می شود. پروتئین F-box (FBP) در SKP1-CUL1-کمپلکس‌های لیگاز پروتئین جعبه F (SCFs) با نانو جسم ضد GFP (Nb) ترکیب می‌شود تا پروتئین همجوشی GFP را تشخیص دهد، و آنزیم مزدوج یوبیکوئیتین (E2) به طور کووالانسی چندین مولکول یوبیکوئیتین را به پروتئین هدف پیوند می دهد. متعاقباً، پروتئین پلی یوبی کوئیتین شده توسط پروتئازوم تجزیه می شود. (د) شرح شماتیک BiCAP. پروتئین HER با قطعات N ترمینال (GFP1) یا C ترمینال (GFP2) از GFP ذوب می شود. هنگامی که دو همجوشی یک دایمر تشکیل می دهند، GFP دوباره تا می شود و فلورسانس می شود. سپس دایمر HER و پروتئین‌های برهم‌کنش آن با استفاده از یک نانو جسم GFP غنی‌سازی می‌شوند که توانایی اتصال به قطعات GFP را ندارد و بنابراین جداسازی دایمر را ممکن می‌سازد. (E) سیستم رونویسی وابسته به GFP. دامنه اتصال به DNA (DBD) و دامنه فعال سازی (AD) به ترتیب با نانو جسم GFP 1 (Nb1) و GFP nanobody 2 (Nb2) ترکیب می شوند. در حضور GFP، DBD-Nb1 و AD-Nb2 می توانند ژن گزارشگر توالی فعال کننده بالادستی (UAS) را فعال کنند که منجر به تنظیم مثبت ژن های هدف می شود. (F) شناسایی پروتئین های نشاندار شده با GFP بر روی نانوساختارهای DNA. نانوساختارهای DNA با دو محل اتصال به رزین مغناطیسی متصل می‌شوند، با جفت‌سازی مکمل با GFP Nanobody (Nb) متصل می‌شوند و سپس با پروتئین‌های نشاندار شده با GFP انکوبه می‌شوند. از این رو، پروتئین های نشاندار شده با GFP را می توان با دقت به نانوساختارها متصل کرد.

شکل 5. ادامه

4.1.2. تشخیص پروتئین روی سطح سلول

نمایش سطح باکتریایی یک فناوری امیدوارکننده برای تولید پروتئین های لنگر سلولی و طراحی کاتالیزورهای سلول کامل است. اگرچه از پروتئین های غشای بیرونی مختلف برای نمایش سطح استفاده می شود، هیچ روش ساده، جهانی و سازگار با توان بالا برای ارزیابی و توسعه سیستم های نمایش سطحی در دسترس نیست. علاوه بر این، تمایز بین پروتئین های درون سلولی و پروتئین های نمایش داده شده در سطح چالش برانگیز است. وندل و همکاران یک سیستم تشخیص نمایش سطحی مبتنی بر فلورسانس را با ادغام GFP-nanobody به لنگرهای غشای بیرونی ساختند [71]. دو پروتئین غشای خارجی که معمولاً استفاده می‌شوند به عنوان لنگر انتخاب شدند: پروتئین غشای خارجی A (OmpA) و انتقال‌دهنده خودکار (C-IgAP). از این رو، دو ماژول نمایشگر مختلف با ترکیب OmpA یا C-IgAP با نانوبادی‌های مخصوص GFP ساخته می‌شوند که با افزودن GFP خالص‌شده به صورت خارجی تجسم می‌شوند. اگرچه خود GFP می‌تواند روی سطح سلول نمایش داده شود، اما این روش جدید از مشکل مثبت کاذب جلوگیری می‌کند، زیرا تنها در صورتی که GFP به نانو جسم ارائه‌شده در سطح سلول متصل شود، سلول‌ها سیگنال فلورسنت تولید می‌کنند. این روش با بسیاری از روش‌های تشخیص فلورسانس، از جمله تشخیص فلورسانس کل سلولی در صفحه، فلورسانس درون ژل، میکروسکوپ و فلوسیتومتری سازگار است. این روش نمایش سطحی ارزان و خوانا به نشان دادن مکانیسم انتقال پروتئین ها بر روی سطح سلول های زنده کمک می کند و امکان توسعه منطقی سیستم های نمایش سطح باکتری و بیوکاتالیست های قوی کل سلولی را در آینده فراهم می کند.

آزادسازی انتقال دهنده های عصبی به اگزوسیتوز، اندوسیتوز و تشکیل وزیکول های همجوشی جدید نیاز دارد. آنچه برای پروتئین های وزیکول پس از اگزوسیتوز رخ می دهد، هنگامی که روی غشای پلاسما باقی می مانند، به خوبی درک نشده است. این پروتئین ها اغلب به بخش های GFP حساس به pH (فلورین) کونژوگه می شوند. از آنجایی که تصویربرداری از pHluorin معمولاً توسط پراش نقاط چندین برابر بزرگتر از وزیکول ها محدود می شود، استفاده از نانوبادی های ضد GFP برای برچسب گذاری انتخابی وزیکول های اگزوسیتوز شده ارزشمند است [72]. با پیوند دادن نانوبادی‌های ضد GFP به فلوروفورهای شیمیایی مناسب برای تصویربرداری با وضوح فوق‌العاده، می‌توان اندازه و شدت پروتئین‌های نشان‌دار شده با pHluorin را تحت شرایط مختلف به روش‌هایی که با pHluorin به تنهایی امکان‌پذیر نیست، شناسایی کرد. با تحریک اگزوسیتوز، پروتئین های وزیکول جدید در معرض غشای پلاسما قرار می گیرند و سپس نانوبادی های نشاندار شده با فلورسنت با pHluorin متصل می شوند (شکل 5B). بنابراین، تشخیص pHluorin مبتنی بر نانوجسم ابزاری امیدوارکننده برای مطالعه رویدادهای پس از اگزوسیتوز در نورون‌ها است.

4.2. کاربردها در تخریب هدفمند مولکول های پروتئین

در مقایسه با ویرایش ژن و تداخل RNA، دستکاری مستقیم مولکول های زیستی در سطح پروتئین مسیر کارآمدتری برای مطالعات عملکرد پروتئین، غلبه بر محدودیت هایی مانند اثرات بالقوه خارج از هدف، غیرفعال سازی ژن، و از دست دادن عملکرد فنوتیپی ژن ضروری است. تخریب هدفمند پروتئین در حال حاضر یک استراتژی تحقیقاتی اصلی برای دستیابی به از دست دادن عملکرد و پروتئولیز پروتئین های مورد نظر است. تجزیه‌کننده پروتئین مبتنی بر نانو جسم می‌تواند به تجزیه سریع و تنظیم برگشت‌پذیر پروتئین‌های مورد نظر کمک کند. کاوسینوس و همکاران یک روش تخریب پروتئین برای تخلیه مستقیم و سریع پروتئین‌های همجوشی GFP هدف در هر سیستم یوکاریوتی ایجاد کرد [73]. به طور خلاصه، برای از بین بردن پروتئین فیوژن GFP، یک نانو جسم ضد GFP به پروتئین F-box (FBP) در مجتمع های لیگاز SKP1-CUL1-پروتئین F-box (SCF) E3 ذوب می شود. برای تشخیص پروتئین فیوژن GFP. آنزیم مزدوج یوبیکوئیتین (E2) به طور کووالانسی چندین مولکول یوبیکوئیتین را به پروتئین همجوشی GFP هدف پیوند می دهد. متعاقباً، کمپلکس SCF پروتئین پلی‌بی‌کوئیتینه‌شده را تخریب می‌کند. بنابراین، حذف پروتئین هدف به راحتی قابل نظارت است (شکل 5C). این تکنیک که پروتئین فلورسنت سبز تخریب شده (deGradFP) نامیده می شود، برای تخریب GFP و همجوشی های آن در سلول های پستانداران، جنین گورخرماهی [74] و گیاهان [75] استفاده شده است.

4.3. کاربردها در سیستم تصفیه میل ترکیبی دو مولکولی

در سال 2016، کروچر و همکاران. یک سیستم تصفیه میل ترکیبی دو مولکولی (BiCAP) را توسعه داد که می تواند به طور موثر گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (HER) دایمر (همولوگ و هترولوگ) را از مونومر تشخیص دهد [76]. در این سیستم، دو قطعه مکمل از یک مولکول FP با دو پروتئین HER (HER1، HER2، یا HER3) ترکیب می‌شوند. این دو قطعه را نمی توان به طور خود به خود در پروتئین های فلورسنت فعال جمع کرد. با این حال، فرض کنید دو پروتئین HER با یکدیگر تعامل دارند. در آن صورت، دو قطعه از نظر مکانی به یکدیگر نزدیک و مکمل یکدیگر خواهند بود و آنها را به یک پروتئین فلورسنت کامل و فعال بازسازی می‌کنند (شکل 5D). دایمر HER و پروتئین‌های برهم‌کنش آن را می‌توان با استفاده از یک نانو جسم GFP، که هیچ تمایلی به قطعات GFP نداشت، غنی‌سازی کرد، بنابراین جداسازی و غنی‌سازی دایمر را ممکن می‌سازد. با تجزیه و تحلیل پروتئین های شناسایی شده، مشخص شد که سه دایمر (HER2:HER2، HER2:HER3، و HER1:HER2) دارای پروتئین های متقابل مشترک و برهم کنش خاص خود هستند. FAM59A، پروتئینی که به طور خاص با دایمر HER1:HER3 برهمکنش می‌کند، واسطه فعال‌سازی مسیر کیناز تنظیم‌شده با سیگنال خارج سلولی است و هدف جدیدی برای درمان سرطان سینه فراهم می‌کند.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

4.4. کاربرد در سایر مناطق

تشخيص زودهنگام آزمايشگاهي بيماري و پايش اثرات درماني يكي از مشكلات عمده در تشخيص بيماري است. یک ماده حاجب ایده آل باید نفوذ بافتی خوب، میل آنتی ژنی بالا و قابلیت پاکسازی سریع با حداقل آسیب به بافت های طبیعی داشته باشد. نانو اجسام این پتانسیل را به عنوان عوامل تصویربرداری ایده آل دارند که می توانند از رگ های خونی عبور کرده و وارد بافت ها برای تصویربرداری و کاربردهای درمانی بهتر شوند.

FP ها نه تنها سلول ها و فرآیندهای بیولوژیکی را روشن می کنند، بلکه به دلیل عدم ارتباط آشکار آنها با شبکه های پروتئین میزبان متعدد، داربست های عالی می سازند. استفاده از GBPs و GFP به عنوان یک داربست برای هدایت تشکیل کمپلکس فعال بیولوژیکی، تانگ و همکاران. یک کتابخانه از فاکتورهای رونویسی ترکیبی ایجاد کرد که به طور انحصاری بیان ژن را در حضور GFP و مشتقات آن کنترل می کند [77]. تولید GFP بیان ژن های اختصاصی سلول را کنترل می کند (شکل 5E) و اختلال عملکرد شبکیه و مغز موش را ارتقا می دهد. علاوه بر این، سویه‌های موش‌های تراریخته و گورخرماهی GFP برای دستیابی به رونویسی وابسته به GFP برای نظارت فتوژنتیک مدارهای عصبی اصلاح می‌شوند. این کار موقعیت GFP را به عنوان یک داربست همه کاره ایجاد می کند و دری را برای دستکاری انتخابی سلول های مختلف برچسب گذاری شده با GFP در سویه های تراریخته باز می کند. بر این اساس، سایر محصولات درون سلولی را نیز می توان به عنوان داربست های اختصاصی سلولی در موجودات چند سلولی توسعه داد.

نانوساختارهای DNA به ابزاری ضروری و موثر برای مطالعه فعالیت آنزیم ها و عملکرد پروتئین تبدیل شده اند. با این حال، توسعه استراتژی‌های جهانی برای تشکیل کمپلکس‌های پروتئینی روی نانوساختارهای DNA دشوار است. یکی از مشکلات، اتصال پروتئین های مورد علاقه به نانوساختارهای DNA است. سامسه و همکاران یک رویکرد جدید برای نشان‌گذاری نانوساختارهای DNA پیشنهاد کرد [78]. با عملکرد آنها با یک نانو جسم GFP، توانایی اتصال پروتئین را می توان دقیقاً کنترل کرد (شکل 5F). در مقایسه با آپتامرهای DNA اختصاصی GFP، نانوبادی ها ویژگی، پایداری و میل ترکیبی بالاتری نسبت به GFP نشان می دهند. بنابراین، استفاده از نانوساختارهای DNA به عنوان یک داربست قابل برنامه ریزی در تحقیقات بیولوژیکی با اتصال نانوساختارهای DNA با FP هایی که معمولا در سلول ها، زیست شناسی رشد و بیوشیمی پروتئین یافت می شوند، به طور چشمگیری ساده شده است.

5. بحث در مورد چشم انداز آینده

در مقایسه با آنتی‌بادی‌های سنتی، نانوبادی‌ها خواص فیزیکی و شیمیایی بهتری دارند و بیان و غربال‌گری آسان‌تر هستند. ساختار نانو بادی ها بسیار ساده تر از آنتی بادی های معمولی است. آنها توسط یک ژن رمزگذاری می شوند و می توانند به راحتی توسط میکروارگانیسم ها تولید شوند و به طور قابل توجهی هزینه تولید را کاهش می دهند. اگرچه نانو بادی ها پیشرفتی را برای تحقیقات آنتی بادی فراهم می کنند، اما برخی از مشکلات هنوز باید حل شوند. از یک طرف، آنها دارای معایب عملکرد نامناسب و هزینه بالای ایمن سازی حیوانات هستند. علاوه بر این، از آنجایی که HCAb و IgNAR در مونوسیت‌های خون محیطی فراوان هستند، نانوبادی‌هایی که آنتی‌ژن‌های FP را هدف قرار می‌دهند معمولاً از کتابخانه‌های ایمنی کامل Camelidae یا کوسه‌ها بررسی می‌شوند. با بلوغ ساخت و ساز کتابخانه و فناوری‌های توسعه نانو جسم، غربالگری نانوبادی‌های خاص FP از کتابخانه‌های مصنوعی جهت جدیدی است که بر ناراحتی ایمن‌سازی حیوانات غلبه می‌کند، دوره آزمایشی را کوتاه می‌کند و هزینه را به میزان قابل توجهی کاهش می‌دهد. از سوی دیگر، اگرچه غربالگری و بیان نانوبادی ها نسبتاً ساده است، به دست آوردن نانوبادی های FP با مقادیر کاربرد بالقوه فرآیند بسیار پیچیده ای است. غربالگری کتابخانه‌های نانوبادی فاژی نمی‌تواند از مثبت کاذب ناشی از اتصال سطح فاژ رشته‌ای با آنتی‌ژن جلوگیری کند، در حالی که ظرفیت کوچک کتابخانه‌های نانوبادی مخمر و باکتریایی یکی دیگر از مشکلات دشوار غربال‌گری نانوبادی است.

کاربرد نانو اجسام در برابر FP در آینده به افزایش خود ادامه خواهد داد. (1) با توسعه فن آوری آنتی بادی درون سلولی، شناسایی مولکول های درون سلولی در سلول های زنده قابل دسترسی شده است. نانوبادی ها از این نظر دارای مزایای منحصر به فردی هستند، به این صورت که (1) نانو جسم کوچک است و راندمان ورود به سلول بسیار بالاتر از آنتی بادی های سنتی است. و (ب) نانو جسم می تواند در سلول های زنده بیان شده و عملکردی داشته باشد. (2) Nanobody Bispecific نوعی آنتی بادی اصلاح شده مصنوعی است که می تواند به طور اختصاصی دو آنتی ژن مختلف را به طور همزمان متصل کند. می توان آن را به راحتی از نانو بادی های تک ظرفیتی ساخت و در میکروارگانیسم ها بیان کرد. از این رو، نانوبادی‌ها در برابر FP، چشم‌انداز کاربردی گسترده‌ای را برای توسعه نانوبادی دوگانه ارائه می‌کنند.

6. نتیجه گیری

این مقاله به بررسی منشأ، ساختار و خواص FP ها می پردازد. آنتی‌بادی‌های مونوکلونال و نانوبادی‌هایی که FPs و کاربردهای آن‌ها را هدف قرار می‌دهند نیز خلاصه شده‌اند. اگرچه آنتی‌بادی‌ها ابزار ارزشمندی برای نمایش اجزای بیولوژیکی در سلول‌های بی‌حرکت هستند، استفاده از آنتی‌بادی‌های سنتی در سلول‌های زنده به دلیل تا کردن و مونتاژ ناکارآمد زنجیره‌های سنگین و سبک متغیر آنها محدود شده است. میکرو تزریق مستقیم آنتی بادی ها روش اولیه مورد استفاده در کاربردهای داخل سلولی آنتی بادی است که از نظر فنی چالش برانگیز و برای سلول ها استرس زا است. آنتی بادی های تک دامنه ای مشتق از شتر یا کوسه، آنتی ژن ها را از طریق حوزه های متغیر زنجیره های سنگین خود تشخیص می دهند. این نانو اجسام کوچک و پایدار می توانند در سلول های زنده بیان شده و عملکردی داشته باشند. بنابراین، تولید نانو بادی هایی که FP ها را هدف قرار می دهند، آنها را در تحقیقات بیولوژیکی ارزشمندتر می کند.

منابع

1. Muyldermans، S. Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies. آنو. کشیش بیوشیم. 2013، 82، 775-797. [CrossRef] [PubMed]

2. حلما، ج. کاردوسو، ام سی; مایلدرمنز، اس. Leonhardt, H. نانو بادی ها و باندهای نوترکیب در زیست شناسی سلولی. J. Cell Biol. 2015، 209، 633-644. [CrossRef] [PubMed]

3. آشور، ج. اشمیت، فی. هانکه، ال. کرگنولینی، جی. کاوالاری، م. آلتنبورگ، آ. بروور، آر. اینگرام، جی. کفاش، سی. بیان درون سلولی Ploegh، HL آنتی‌بادی‌های تک دامنه‌ای شتر خاص برای نوکلئوپروتئین ویروس آنفولانزا، ویژگی‌های متمایز محلی‌سازی هسته‌ای آن را آشکار می‌کند. جی. ویرول. 2015، 89، 2792-2800. [CrossRef] [PubMed]

4. منگلیک، ع. Kobilka، BK; Steyaert، J. Nanobodies برای مطالعه ساختار و عملکرد گیرنده پروتئین G. آنو. کشیش فارماکول. سموم 2017، 57، 19-37. [CrossRef]

5. هارمانسا، س. هامارات اوغلو، ف. افولتر، م. گسترش Caussinus، E. Dpp برای رشد دیسک بال میانی و نه جانبی مورد نیاز است. طبیعت 2015، 527، 317-322. [CrossRef]

6. یاماگاتا، م. Sanes، JR Reporter - نانوبادی (RANbodies) به عنوان معرف های ایمونوهیستوشیمی همه کاره، کوچک و حساس. Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا 2018، 115، 2126–2131. [CrossRef]

7. آریوتی، ن. هال، TE؛ رائه، ج. فرگوسن، سی. مک ماهون، K.-A.; مارتل، ن. وب، RE; وب، RI; Teasdale، RD; پارتون، تشخیص مدولار RG پروتئین های نشاندار شده با GFP برای غربالگری سریع توسط میکروسکوپ الکترونی در سلول ها و موجودات. توسعه دهنده Cell 2015, 35, 513-525. [CrossRef]

8. فروهولز، اس. فاسلر، اف. کولوکیسا اوغلو، Ü. Pimpl, P. Nanobody باعث قفل کردن VSR ها، بارگذاری مجدد لیگاند در Golgi را نشان می دهد. نات. اشتراک. 2018, 9, 643. [CrossRef]

9. Prole، DL; Taylor, CW یک جعبه ابزار کدگذاری شده ژنتیکی از نانوبادی های عامل دار در برابر پروتئین های فلورسنت برای تجسم و دستکاری سیگنال های درون سلولی. BMC Biol. 2019، 17، 41. [CrossRef]

10. شیمومورا، او. جانسون، FH; Saiga، Y. استخراج، خالص سازی و خواص Aequorin، یک پروتئین بیولومینسانس از Hydromedusan درخشان، Aequorea. جی. سلول. Comp. فیزیول. 1962، 59، 223-239. [CrossRef]

11. پراشر، د. مک کان، RO; Cormier، MJ کلونینگ و بیان cDNA کد کننده برای aequorin، یک پروتئین بیولومینسانس متصل به کلسیم. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 1985، 126، 1259-1268. [CrossRef]

12. هیم، آر. پراشر، دی سی; جهش های طول موج Tsien، RY و اتوکسیداسیون پس از ترجمه پروتئین فلورسنت سبز. Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا 1994، 91، 12501-12504. [CrossRef]

13. ماتز، م. فرادکوف، اف. لباس، YA; ساویتسکی، آ. Zaraisky، AG; مارکلوف، ام ال. لوکیانوف، SA پروتئین‌های فلورسنت از گونه‌های آنتوزوآ غیرزیست‌تابی. نات. بیوتکنول. 1999، 17، 969-973. [CrossRef]

14. پارک، ن. آهنگ، جی. جونگ، اس. Tran، TT; Ko، HW; Kim, EY Vaccinia-related kinase 3 (VRK3) دوره و دامنه شبانه روزی را با تأثیر بر محلی سازی درون سلولی پروتئین های ساعت در سلول های پستانداران تنظیم می کند. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 2017، 487، 320-326. [CrossRef]

15. ژائو، دی. شو، سی. لین، اس. شی، س. لی، کیو. لیو، ام. کای، ایکس. مسیر سیگنالینگ Lin, Y. Notch رگ زایی را از طریق سلول اندوتلیال در مدل سه بعدی کشت مشترک تنظیم می کند. جی. سلول. فیزیول. 2016، 232، 1548-1558. [CrossRef]

16. رودریگز، EA; کمپبل، RE; لین، جی. لین، MZ؛ میاواکی، ا. پالمر، AE; شو، ایکس. ژانگ، جی. Tsien، RY جعبه ابزار در حال رشد و درخشان پروتئین های فلورسنت و فوتواکتیو. Trends Biochem. علمی 2017، 42، 111-129. [CrossRef]

17. یانگ، اف. ماس، ال جی؛ Phillips, GN, Jr. ساختار مولکولی پروتئین فلورسنت سبز. نات. بیوتکنول. 1996، 14، 1246-1251. [CrossRef]

18. اورمو، م. Cubitt، AB; کالیو، ک. گراس، لس آنجلس; Tsien، RY؛ رمینگتون، ساختار بلوری SJ از پروتئین فلورسنت سبز Aequorea victoria. علوم 1996، 273، 1392–1395. [CrossRef]

19. رید، بی جی; Flynn، تشکیل کروموفور GC در پروتئین فلورسنت سبز. Biochemistry 1997، 36، 6786-6791. [CrossRef]

20. ژانگ، جی. گورتو، وی. Kain، SR یک پروتئین فلورسنت سبز پیشرفته به تشخیص حساس انتقال ژن در سلول های پستانداران اجازه می دهد. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 1996، 227، 707-711. [CrossRef]

21. Pédelacq, J.-D.; کابانتوس، اس. تران، تی. ترویلیگر، تی. والدو، مهندسی GS و خصوصیات یک پروتئین فلورسنت سبز ابرپوشه. نات. بیوتکنول. 2006، 24، 79-88. [CrossRef] [PubMed]

22. کرامری، ا. Whitehorn، EA؛ تیت، ای. Stemmer، WP پروتئین فلورسنت سبز را با تکامل مولکولی با استفاده از ترکیب DNA بهبود داد. نات. بیوتکنول. 1996، 14، 315-319. [CrossRef] [PubMed]

23. میورا، اچ. اینوکو، اچ. اینو، آی. تاناکا، م. ساتو، م. Ohtsuka، M. استراتژی شبیه سازی ساده با استفاده از ژن GFPuv به عنوان شاخص مثبت/منفی. مقعدی بیوشیمی. 2011، 416، 237-239. [CrossRef] [PubMed]

24. منا، م. Treynor، TP; مایو، اس ال. پروتئین های فلورسنت Daugherty، PS Blue با روشنایی و پایداری نوری افزایش یافته از یک کتابخانه هدفمند ساختاری. نات. بیوتکنول. 2006، 24، 1569-1571. [CrossRef] [PubMed]

25. آی، ح. شانر، ن. چنگ، ز. Tsien، RY؛ کمپبل، RE اکتشاف ساختارهای کروموفور جدید منجر به شناسایی پروتئین های فلورسنت آبی بهبود یافته می شود. Biochemistry 2007، 46، 5904-5910. [CrossRef]

26. Subach, OM; گاندوروف، IS; یوشیمورا، م. سوباخ، FV; ژانگ، جی. گرونوالد، دی. سوسلوا، EA؛ چوداکوف، دی.م. Verkhusha، VV تبدیل پروتئین فلورسنت قرمز به یک پروب آبی روشن. شیمی. Biol. 2008، 15، 1116-1124. [CrossRef]

27. مرزلیاک، ای. گودهارت، جی. شچربو، دی. Bulina، ME; شچگلوف، ع. فرادکوف، اف. گاینتسوا، ا. لوکیانوف، ک. لوکیانوف، اس. گادلا، تی. و همکاران پروتئین فلورسنت قرمز مونومر روشن با طول عمر فلورسانس طولانی. نات. Methods 2007, 4, 555-557. [CrossRef]

28. Cubitt, AB; هیم، آر. آدامز، اس آر. Boyd، AE; گراس، لس آنجلس; Tsien، RY درک، بهبود و استفاده از پروتئین های فلورسنت سبز. Trends Biochem. علمی 1995، 20، 448-455. [CrossRef]

29. توموسوگی، دبلیو. ماتسودا، تی. تانی، تی. نموتو، تی. کوترا، آی. سایتو، ک. هوریکاوا، ک. Nagai، T. یک پروتئین فلورسنت اولترامارین با افزایش پایداری نوری و عدم حساسیت pH. نات. Methods 2009, 6, 351-353. [CrossRef]

30. گودهارت، ج. ون ویرن، ال. هینک، MA; Vischer، NOE; جالینک، ک. Gadella، TWJ انواع پروتئین فلورسنت فیروزه ای روشن با غربالگری طول عمر فلورسانس شناسایی شدند. نات. Methods 2010, 7, 137-139. [CrossRef]

31. روز، RN; دیویدسون، MW پالت پروتئین فلورسنت: ابزارهایی برای تصویربرداری سلولی. شیمی. Soc. Rev. 2009, 38, 2887-2921. [CrossRef]

32. گریسبک، او. بیرد، جی اس. کمپبل، RE; Zacharias، DA; Tsien، RY کاهش حساسیت محیطی پروتئین فلورسنت زرد. جی. بیول. شیمی. 2001، 276، 29188-29194. [CrossRef]

33. ناگای، ت. ایباتا، ک. پارک، ES؛ کوبوتا، م. میکوشیبا، ک. Miyawaki، A. گونه ای از پروتئین فلورسنت زرد با بلوغ سریع و کارآمد برای کاربردهای سلولی-بیولوژیکی. نات. بیوتکنول. 2002، 20، 87-90. [CrossRef]

34. شانر، NC; کمپبل، RE; Steinbach، PA; Giepmans، BN; پالمر، AE; Tsien، RY پروتئین‌های فلورسنت قرمز، نارنجی و زرد مونومر را بهبود بخشید که از Discosoma sp. پروتئین فلورسنت قرمز نات. بیوتکنول. 2004، 22، 1567-1572. [CrossRef]

35. شچربو، د. مرزلیاک، ای.ام. چپورنیخ، تلویزیون؛ فرادکوف، اف. Ermakova، GV; سولوویوا، EA; لوکیانوف، کا. بوگدانوا، EA؛ Zaraisky، AG; لوکیانوف، اس. و همکاران پروتئین فلورسنت بسیار قرمز روشن برای تصویربرداری از کل بدن. نات. Methods 2007, 4, 741-746. [CrossRef]

36. شچربو، د. مورفی، CS; Ermakova، GV; سولوویوا، EA; چپورنیخ، تلویزیون؛ شچگلوف، ع. ورخوشا، وی. پلتنف، وی. Hazelwood، KL; Roche، PM; و همکاران برچسب های فلورسنت قرمز دور برای تصویربرداری پروتئین در بافت های زنده. بیوشیمی. J. 2009, 418, 567-574. [CrossRef]

37. Oliinyk، OS; چرنوف، KG; ورخوشا، فیتوکروم های باکتریایی VV، سیانوباکتریوکروم ها و آلوفیکوسیانین ها به عنوان منبع پروب های فلورسنت مادون قرمز نزدیک. بین المللی جی. مول. علمی 2017، 18، 1691. [CrossRef]

38. شو، ایکس. رویانت، ا. لین، MZ؛ آگیلرا، TA; لو رام، وی. Steinbach، PA; بیان پستانداران Tsien، RY از پروتئین های فلورسنت مادون قرمز مهندسی شده از یک فیتوکروم باکتریایی. Science 2009, 324, 804-807. [CrossRef]

39. یو، دی. گوستافسون، WC; هان، سی. لافائی، سی. Noirclerc-Savoye، M. Ge، W.-P. تایر، دی. هوانگ، اچ. کورنبرگ، سل؛ رویانت، ا. و همکاران یک پروتئین فلورسنت مادون قرمز مونومر بهبود یافته برای تصویربرداری از مغز عصبی و تومور. نات. اشتراک. 2014, 5, 3626. [CrossRef]

40. یو، دی. بیرد، MA; آلن، جی آر. هاو، ES; کلاسن، نماینده مجلس؛ رید، ا. ماخیجانی، ک. آهنگ، ی. لیو، اس. مورتی، ز. و همکاران یک پروتئین فلورسنت مادون قرمز مونومر طبیعی برای برچسب زدن پروتئین در داخل بدن. نات. Methods 2015, 12, 763-765. [CrossRef]

41. شچرباکووا، دی.م. بالابان، م. املیانوف، AV; برنوویتز، ام. گوا، پی. پروتئین های فلورسنت مونومری نزدیک به مادون قرمز Verkusha، VV Bright به عنوان برچسب ها و حسگرهای زیستی برای تصویربرداری چند مقیاسی. نات. اشتراک. 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. رودریگز، EA; Tran، GN; گراس، لس آنجلس; کریسپ، جی ال. شو، ایکس. لین، جی. Tsien، RY یک پروتئین فلورسنت قرمز دور از یک فیکوبیلیپروتئین سیانوباکتری تکامل یافته است. نات. Methods 2016, 13, 763-769. [CrossRef] [PubMed]

43. Oliinyk، OS; Shemetov، AA; پلتنف، اس. شچرباکووا، دی.م. Verkusha، VV کوچکترین پروتئین فلورسنت مادون قرمز نزدیک از سیانوباکتریوکروم به عنوان یک برچسب همه کاره برای چندگانه سازی طیفی تکامل یافته است. نات. اشتراک. 2019، 10، 279. [CrossRef]

44. Oliinyk، OS; بالابان، م. کلارک، سی ال. کری، ای. پلتنف، اس. نیمرجان، ا. Verkhusha، VV پروتئین نزدیک به مادون قرمز تک دامنه ای، داربستی برای نانوبادی های فلورسنت وابسته به آنتی ژن فراهم می کند. نات. Methods 2022, 19, 740-750. [CrossRef] [PubMed]

45. تیلر، KE; Tessier، PM در طراحی آنتی بادی پیشرفت می کند. آنو. کشیش بیومد. مهندس 2015، 17، 191-216. [CrossRef]

46. ​​جنگیو-آندو، ک. میتانی، S. 1020 تولید و شناسایی یک آنتی بادی مونوکلونال علیه پروتئین فلورسنت سبز (GFP). نوروسک. Res. 1997, 28, S122. [CrossRef]

47. ژوانگ، آر. ژانگ، ی. ژانگ، آر. آهنگ، سی. یانگ، ک. یانگ، آ. جین، ب. خالص سازی پروتئین های همجوشی GFP با خلوص و بازده بالا توسط کروماتوگرافی ستون میل ترکیبی با آنتی بادی مونوکلونال. پروتئین Expr. Purif. 2008، 59، 138-143. [CrossRef]

48. بخش، ES; گوسو، دی. گریفیث، AD; جونز، PT; Winter, G. فعالیت های اتصال مجموعه ای از حوزه های متغیر ایمونوگلوبولین منفرد ترشح شده از اشرشیاکلی. طبیعت 1989، 341، 544-546. [CrossRef]

49. همرز-کاسترمن، سی. عطارهوش، تی. مایلدرمنز، اس. رابینسون، جی. همرز، سی. سونگا، EB; بندیمن، ن. Hammers, R. آنتی بادی های طبیعی بدون زنجیره سبک. طبیعت 1993، 363، 446-448. [CrossRef]

50. گرینبرگ، ع. آویلا، دی. هیوز، ام. هیوز، ا. مک‌کینی، EC؛ Flajnik، MF یک خانواده ژن گیرنده آنتی ژن جدید که تحت بازآرایی و تنوع جسمی گسترده در کوسه ها قرار می گیرد. نات. سلول بیول. 1995، 374، 168-173. [CrossRef]

51. دی مایر، تی. مایلدرمنز، اس. Depicker، A. محصولات مبتنی بر Nanobody به عنوان ابزار تحقیق و تشخیص. روند بیوتکنول. 2014، 32، 263-270. [CrossRef]

Curr. نظر. بیوتکنول. [CrossRef]

53. Muyldermans، S. بارال، تی. Retamozzo، VC; دی باتسلیه، پی. د گنست، ای. کین، جی. لئونهارت، اچ. مگز، اس. نگوین، وی. رویتس، اچ. و همکاران ایمونوگلوبولین های شتر و فناوری نانوبادی. وتر ایمونول. ایمونوپاتول. 2009، 128، 178-183. [CrossRef]

54. روثباوئر، یو. ذوالقدر، ک. تیلیب، س. نواک، د. شرمله، ال. گاهل، ع. بکمن، ن. کنراث، ک. مایلدرمنز، اس. کاردوسو، ام سی; و همکاران هدف گیری و ردیابی آنتی ژن ها در سلول های زنده با نانوبادی های فلورسنت نات. Methods 2006, 3, 887-889. [CrossRef]

55. کوبالا، م.ح. کوتون، او. الکساندروف، ک. کالینز، BM تجزیه و تحلیل ساختاری و ترمودینامیکی GFP: مجتمع GFP-nanobody. پروتئین Sci. 2010، 19، 2389-2401. [CrossRef]

56. نیش، ز. کائو، دی. Qiu, J. توسعه و تولید نانو بادی ها به طور خاص در برابر پروتئین فلورسانس سبز. Appl. میکروبیول. بیوتکنول. 2020، 104، 4837–4848. [CrossRef]

57. کیرشوفر، ا. حلما، ج. اشمیدتالز، ک. فریر، سی. کوی، اس. کارچر، ا. پلیس، م. مایلدرمنز، اس. Casas-Delucchi، CS; کاردوسو، ام سی; و همکاران تعدیل ویژگی های پروتئین در سلول های زنده با استفاده از نانو اجسام. نات. ساختار. مول. Biol. 2009، 17، 133-138. [CrossRef]

58. روثباوئر، یو. ذوالقدر، ک. مایلدرمنز، اس. Schepers، A. کاردوسو، ام سی; Leonhardt, H. یک نانو تله همه کاره برای مطالعات بیوشیمیایی و عملکردی با پروتئین های همجوشی فلورسنت. مول. سلول. پروتئوم 2008، 7، 282-289. [CrossRef]

59. فریدی، ص. لی، ی. کیگان، اس. تامپسون، MK; نودلمن، آی. Scheid، JF; افینگر، م. Nussenzweig، MC; فنیو، دی. Chait، BT; و همکاران خط لوله ای قوی برای تولید سریع مجموعه های همه کاره نانو جسم. نات. Methods 2014, 11, 1253-1260. [CrossRef]

60. ژانگ، ز. وانگ، ی. دینگ، ی. هاتوری، M. مهندسی مبتنی بر ساختار ترکیبات نانوبادی ضد GFP به عنوان معرف‌هایی با میل ترکیبی فوق‌العاده برای خالص‌سازی. علمی جمهوری 2020، 10، 6239. [CrossRef]

61. توایر، ا. العکلا، س. زرکاوی، م. Abbady، AQ خصوصیات نانو بادی شتر خاص برای پروتئین های همجوشی GFP سوپر پوشه. مول. Biol. 2014، 41، 6887-6898. [CrossRef] [PubMed]

62. ژونگ، پی. وانگ، ز. چنگ، اس. ژانگ، ی. جیانگ، اچ. لیو، آر. Ding, Y. بینش ساختاری در مورد دو نانوبادی مجزا که اپی توپ یکسانی از پروتئین فلورسنت سبز را تشخیص می دهند. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 2021، 565، 57-63. [CrossRef] [PubMed]

63. ژو، ایکس. هائو، آر. چن، سی. سو، ز. ژائو، ال. لو، ز. Xie, W. تحویل سریع نانو اجسام/VHHs به سلول‌های زنده از طریق بیان mRNA‌های رونویسی شده آزمایشگاهی. مول. Ther.-روش ها کلین. توسعه دهنده 2020، 17، 401–408. [CrossRef] [PubMed]

64. وی، ال. وانگ، ام. شیانگ، اچ. جیانگ، ی. گونگ، جی. سو، دی. ال آزاد، مار; دونگ، اچ. فنگ، ال. وو، جی. و همکاران کوسه بامبو به عنوان یک مدل حیوانی کوچک برای تولید آنتی بادی تک دامنه. جلو. Bioeng. بیوتکنول. 2021, 9, 792111. [CrossRef]

65. لی، س. شان، اچ. وانگ، تی. ژنگ، ایکس. شی، م. چن، بی. لو، اچ. ژانگ، ی. ژائو، اس. Hua, Z. تولید نانوبادی‌های اتصال دهنده پروتئین فلورسنت mWasabi. مقعدی بیوشیمی. 2020, 608, 113875. [CrossRef]

66. ریس، ج. کاپلان، سی. پلاتونوا، ای. اقلدی، ح.م. Ewers, H. یک روش ساده و همه کاره برای میکروسکوپ با وضوح فوق العاده مبتنی بر GFP از طریق نانو بادی ها. نات. Methods 2012, 9, 582-584. [CrossRef]

67. بگین، ا. Gettemans، J. Nanobody Technology: یک ابزار همه کاره برای تصویربرداری میکروسکوپی، تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین-پروتئین، و اکتشاف عملکرد پروتئین. جلو. ایمونول. 2017, 8, 771. [CrossRef]

68. پلاتونوا، ای. Winterflood، CM; جونمن، ا. آلبرشت، دی. فایکس، جی. Ewers, H. میکروسکوپ تک مولکولی از مولکول‌های برچسب‌گذاری شده با مشتقات GFP یا RFP در سلول‌های پستانداران با استفاده از باندهای نانوجسمی. Methods 2015، 88، 89-97. [CrossRef]

69. هرس، HD; شوماخر، دی. اشنایدر، اف. لودویگ، AK; مان، FA; فیلیز، م. کسپر، M.-A. رینکه، اس. کراوز، ای. لئونهارت، اچ. و همکاران نانوبادی‌های نفوذپذیر سلولی برای نشان‌بندی هدفمند ایمنی و دستکاری آنتی‌ژن در سلول‌های زنده نات. شیمی. 2017، 9، 762-771. [CrossRef]

70. پین، NC; Mazitschek، R. Titans: Nanobodies به عنوان ابزارهای قدرتمند برای توسعه سنجش TR-FRET. مقعدی Sens. 2022, 2, e202200020. [CrossRef]

71. وندل، س. فیشر، EC; مارتینز، وی. سپالا، اس. Nørholm, MHH A nanobody: پلت فرم باکتری GFP که نمایش عملکرد آنزیمی و کمی سازی آسان ظرفیت نمایش را امکان پذیر می کند. میکروب. Cell Factories 2016, 15, 71. [CrossRef]

72. Seitz، KJ; نانوبادی‌های Rizzoli و SO GFP مولکول‌های pHluorin را که اخیراً اگزوسیتوز شده‌اند را نشان می‌دهند. علمی نسخه 2019، 9، 7773. [CrossRef]

73. کاوسینوس، ای. کانکا، او. Affolter، M. ناک اوت پروتئین فیوژن فلورسنت با واسطه نانوبادی ضد GFP. نات. ساختار. مول. Biol. 2011، 19، 117-121. [CrossRef]

74. شین، YJ; پارک، اسکی؛ یونگ، YJ; نا کیم، ی. کیم، KS؛ پارک، اوکی؛ Kwon، S.-H. جئون، SH; ترینه، لس آنجلس؛ فریزر، اس. و همکاران کمپلکس E{3}}یوبیکوئیتین لیگاز هدف‌دار نانوجسم، پروتئین‌های هسته‌ای را تجزیه می‌کند. علمی Rep. 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. بودیش، بی. پفورت، آی. سورج، ای. Conrad، U. Nanobody-directed Specific Proteines Degradation Proteasome 26S-Proteasome in Plants. جلو. علوم گیاهی 2018، 9، 130. [CrossRef]

76. کروچر، DR; ایکونومو، م. هاستینگز، جی اف. کندی، اس پی; هان، JZR; شیرر، RF; مک کنا، جی. وان، آ. لاو، جی. آپاریسیو، اس. و همکاران خالص سازی میل ترکیبی دو مولکولی (BiCAP) برهمکنش های پروتئینی خاص دایمر را برای دیمرهای ERBB2 نشان می دهد. علمی علامت. 2016, 9, 436. [CrossRef]

77. تانگ، JC; Szikra، T. کوزوروویتسکی، ی. تکسیرا، م. ساباتینی، BL; روسکا، بی. Cepko، CL یک سیستم مبتنی بر نانو جسم با استفاده از پروتئین های فلورسنت به عنوان داربست برای دستکاری ژن خاص سلولی. سلول 2013، 154، 928-939. [CrossRef]

78. Sommese، RF; حریادی، RF; کیم، ک. لیو، ام. Tyska، MJ; Sivaramakrishnan، S. الگوبرداری از مجتمع های پروتئینی روی نانوساختارهای DNA با استفاده از یک نانو جسم GFP. پروتئین Sci. 2016، 25، 2089–2094. [CrossRef]