میکروسکوپ رسانایی یونی روبشی گلومرول زنده انسانی

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2|Mykhailo Fedoriuk1,2|النا عیسیوا1,2|اندرو شوچوک3|اولگ پالیگین1|الکساندر استاروشنکو 1،4

1گروه فیزیولوژی، کالج پزشکی ویسکانسین، میلواکی، WI، ایالات متحده آمریکا 2 گروه غشای سلولی، موسسه فیزیولوژی بوگومولتس، کیف، اوکراین3 بخش پزشکی، کالج امپریال لندن، لندن، UK4Clement J. Zablocki مرکز پزشکی VA، میلواکی، ایالات متحده آمریکا،

مکاتباتAlexander Staruschenko و Ruslan Bohovyk، گروه فیزیولوژی، کالج پزشکی ویسکانسین، 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, USA. ایمیل‌ها: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

اطلاعات بودجه وزارت امور جانبازان، شماره کمک هزینه/جایزه: I01 BX004024; موسسه ملی قلب، ریه و خون، شماره گرنت/جایزه: P01 HL116264 و R35 HL135749. انجمن فیزیولوژیک آمریکا، شماره گرنت/جایزه: جایزه ارتقای شغلی پژوهشی. موسسه ملی دیابت و گوارش وکلیهبیماری ها، شماره گرنت/جایزه: DK126720

خلاصه

آسیب پودوسیت مشخصه بیماری های گلومرولی است، مانند گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی، که معمولاً با آلبومینوری مشخص و پیشرفت آسیب شناسی کلیوی همراه است. ناهنجاری های ساختاری پودوسیت و از دست دادن آن نیز با بیماری حداقل تغییر مرتبط است و شایع تر استبیماری کلیه دیابتی. در اینجا ما برای اولین بار از روش میکروسکوپ رسانایی یونی روبشی (SICM) برای ارزیابی انسان تازه جدا شده استفاده کردیم.گلومرولتوپولوژی SICM یک فرصت منحصر به فرد برای ارزیابی فراهم می کندگلومرولپادوسیت ها و همچنین سایر بخش های ساختاری نفرون با وضوح میکروسکوپ الکترونی اما در نمونه های زنده. در اینجا کاربرد روش SICM در انسان زنده نشان داده شده استگلومرول، که اثبات اصل را برای تجزیه و تحلیل دینامیکی آینده مورفولوژی غشا و پارامترهای عملکردی مختلف در سلول های زنده ارائه می دهد.

برای عوارض جانبی سیستانچ و سیستانچ برای بیماری کلیوی کلیک کنید

1. مقدمه

گلومرولنشان دهنده یک دسته از مویرگ ها است که در قسمت ورودی نفرون قرار دارند، جایی که خون به طور انتخابی در سراسر سد فیلتراسیون گلومرولی متشکل از سلول های اندوتلیال، غشای پایه گلومرولی و پودوسیت ها فیلتر می شود. فرآیندهای اولیه و ثانویه پودوسیت‌های مجاور در هم تنیده می‌شوند و دیافراگم شکافی ایجاد می‌کنند که مویرگ‌های گلومرولی را محکم می‌پوشاند. این دیافراگم مورفولوژی پیچیده ای دارد و مانع نهایی برای تصفیه خون است که به انتخاب اندازه کمک می کند و اجازه نفوذپذیری به مولکول های کوچکتر از آلبومین را می دهد. کاهش تعداد پودوسیت‌ها و کاهش فرآیند پا در گلومرولواسکلروز فوکال سگمنتال، بیماری حداقل تغییر و نفروپاتی دیابتی گزارش شد.کلیهبیماری هایی که ممکن است زمینه ساز/تشدید پیشرفت آنها باشد. تصویربرداری با وضوح بالا از مورفولوژی سلولی در حال تبدیل شدن به یک ابزار ضروری و مفید برای مطالعه ساختارهای سلولی و نقش آنها در عملکرد سلولی و پیشرفت بیماری است. با این حال، به چندین روش پیچیده برای آماده‌سازی نمونه نیاز دارد که تجزیه و تحلیل یک نمونه زنده را غیرممکن می‌سازد. بنابراین، نیاز اساسی به توسعه ابزارهای جدید برای مطالعه تغییرات مورفولوژی سلول‌های سلولی در نمونه‌های زنده وجود دارد. حالت Hopping Probe Microscopy Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM) تکنیکی است که تصویربرداری با وضوح بالا و غیراپتیکی از سطوح سلول زنده با مورفولوژی پیچیده را امکان پذیر می کند.{4}}مزیت اصلی این روش وضوح فضایی نزدیک به چندین نانومتر است. یک محدوده طولانی Z (عمودی)، که می تواند برای نمونه های زنده با مورفولوژی پیچیده تحت شرایط فیزیولوژیکی مرتبط اعمال شود. SICM یک تکنیک تصویربرداری چندوجهی است که می تواند با سایر تکنیک های تثبیت شده، تجزیه و تحلیل همزمان و پویا مورفولوژی غشاء و پارامترهای عملکردی مختلف مانند حجم سلول، پتانسیل های غشاء، جریان های تک کانال یونی و حتی دینامیک کمپلکس های پروتئین غشایی ترکیب شود. در سلول‌های زنده.{6}} در اینجا مثالی از کاربرد SICM برای تجزیه و تحلیل مورفولوژی انسان زنده ارائه می‌کنیم.گلومرولساختار

علائم بیماری سیستانش-کلیه

2. مواد و روش ها

برای آزمایش، ما از بخشی از ناحیه قشر مغز انسان پیوند دور انداخته شده استفاده کردیمکلیهتشریح و در محلول نگهداری ویسکانسین ذخیره می شود و سپس در محلول نمک فیزیولوژیکی اکسیژن دار (PSS) انکوبه می شود. 12 گلومرول های کلیوی با استفاده از تکنیک جداسازی ارتعاشی همانطور که قبلاً توضیح داده شد، جداسازی شدند.کلیه ها. برای انجام تصویربرداری SICM، انسان تازه ایزوله شدهگلومرولبه سطح شیشه ای پلی ال-لیزین که در محفظه سلولی پر شده با محلول PSS قرار داده شده است، متصل شدند. نمونه ها به صورت دستی در جهات xy در زیر میکروسکوپ نوری معکوس Nikon TE{3}}U (Nikon Instruments) قرار گرفتند. برای کاوشگر پرش، نانوپیپت های شیشه ای بوروسیلیکات تصویربرداری SICM با مقاومت تقریباً 100 MΩ، که مربوط به قطر نوک تخمینی در حدود 120 نانومتر است، استفاده شد. نانوپیپت ها با کششگر افقی شعله ور/قهوه ای P{6}} (Sutter Instruments, Novato, CA) کشیده شدند. نانوپیپت ها با همان محلول PSS مورد استفاده برای حمام پر شدند و با یک محرک پیزوالکتریک در جهت z قرار گرفتند. جریان یونی که از نانوپیپت ها عبور می کند با تقویت کننده پچ-گیره Axopatch 700B (Axon Instruments) در حالت گیره ولتاژ اندازه گیری شد و توسط کنترل کننده جهانی اصلاح شده سفارشی (ICAPPIC Ltd، انگلستان)، که به طور همزمان موقعیت نمونه و پیپت را کنترل می کرد، نظارت شد. 6 همه آزمایش‌ها در دمای اتاق ({13}} درجه) انجام شد. برای تصویربرداری از ساختارهای پیچیده پیچیده مانند فرآیندهای پاهای پودوسیت درگلومرولما از حالت بک استپ/پرش SICM استفاده کردیم که بیشترین کاربرد را برای تصویربرداری از توپوگرافی سلول‌های زنده با وضوح بالا دارد. نمونه. سپس، نانوپیپت در امتداد محور z به سطح نمونه نزدیک می شود تا زمانی که سطح جریان اندازه گیری شده به نقطه تنظیم از پیش تعیین شده مربوط به ~ 1.{5}} درصد -1.2 درصد از جریان مرجع کاهش یابد. در این لحظه، رویکرد خاتمه می یابد، مختصات XYZ محرک های پیزو XY و Z به عنوان مختصات سطح نمونه برای اولین نقطه تصویربرداری ثبت می شود و پیپت از سطح خارج می شود. سپس این روش در هر نقطه تصویربرداری در امتداد محور xy که با وضوح از پیش تعیین شده و محدوده ناحیه اسکن تعیین شده است، تکرار می شود. برای شکل 1B، محدوده اسکن و وضوح تصویر به ترتیب 30 میکرومتر × 30 میکرومتر و 512 پیکسل × 512 پیکسل، و برای شکل 1C به ترتیب 5 میکرومتر × 5 میکرومتر و 480 پیکسل × 480 پیکسل بود. داده های توپوگرافی خام SICM و پس پردازش تصویر با استفاده از نرم افزار تجزیه و تحلیل میکروسکوپ SICM ImageViewer (ICAPPIC Ltd، UK) انجام شد.

شکل 1 کاربرد تصویربرداری میکروسکوپ هدایت یونی روبشی. الف، انسان تازه منزویگلومرولبه سطح شیشه پلی لیزین متصل شده است. در سمت چپ یک میکروپیپت نشان داده شده است که برای انجام تصویربرداری SICM به سطح گلومرول نزدیک می شود. B، نمونه ای از اجزای سد فیلتراسیون گلومرول، از جمله رگ های تحت پوشش فرآیندهای پادوسیت و پا، که توسط SICM تجسم شده است. 45 دقیقه برای اسکن منطقه کل (30 × 30 میکرومتر، وضوح 512 × 512 پیکسل، تغییر محور z 15 میکرومتر). C، دیدگاه گسترده در مورد معماری فرآیندهای پا ثانویه پودوسیت انسان که توسط SICM با وضوح بالا نشان داده شده است. 12 دقیقه برای اسکن منطقه کل (رزولوشن 5 × 5 میکرومتر، وضوح 480 × 480 پیکسل، تغییر محور z 3 میکرومتر). نوارهای مقیاس نشان داده شده است

3. نتایج و بحث

کیفیت تصویر SICM با SEM قابل مقایسه است و امکان بررسی دقیق آن را فراهم می کندگلومرولساختار سطحی، از جمله رگ‌های خونی و پودوسیت‌ها، و معماری فرآیندهای ثانویه پا.4 در مطالعه قبلی، ما از تصویربرداری SICM برای تخمین تغییرات ساختاری پاتولوژیک در فرآیندهای پاهای پودوسیت در موش‌های نفروپاتی دیابتی نوع 2 (T2DN) استفاده کردیم. تجزیه و تحلیل مقایسه ای از معماری سه بعدی سد فیلتراسیون podocyte در موش های غیر دیابتی و T2DN انجام داد. داده‌های ما حاکی از از دست دادن قابل‌توجه فرآیندهای پای پودوسیت در گلومرول‌های T2DN بود که ارزیابی دقیقی را برای تغییرات هیستوپاتولوژیک رخ داده در نفروپاتی دیابتی که زمینه‌ساز نفرینوری و آلبومینوری در این موش‌ها است، نشان داد. ساختار سطحی بعدی گلومرول انسانی تازه جدا شده و زنده. گلومرول های کلیوی انسان ساختارهای کروی با قطر حدود 300 میکرومتر 16 هستند. بنابراین، نوک پیپت باید با دقت به بالای منطقه مورد نظر نزدیک شود. راه‌اندازی SICM ما دارای یک محور z 25 میکرومتر و محدوده اسکنر محور xy 30 × 30 میکرومتر است که به ما امکان می‌دهد تصویری با وضوح بالا از بخش بزرگی از دستگاه به دست آوریم.گلومرولسطح زمان اکتساب به شدت به محدوده اسکن، وضوح و اندازه نوک الکترود پرش بستگی دارد. برای تصویربرداری سلول زنده در ساختارهای پیچیده مانند گلومرول تازه جدا شده، زمان اسکن از 10 تا 50 دقیقه در هر فریم متغیر است (برای جزئیات بیشتر به شکل افسانه مراجعه کنید). اثر تجمعی وضوح بالا، ناحیه اسکن بزرگ، و نوسانات تصادفی در سیستم‌های زنده ممکن است منجر به مصنوعات تصویربرداری شود که به‌عنوان جابجایی افقی و عمودی بین چرخه‌های تغییر موقعیت پیپت امیدوارکننده نمایش داده می‌شوند. توجه داشته باشید که در هندسه‌های پیچیده با تغییرات ناگهانی در مکان‌های سطح، هم زمان اکتساب و هم مصنوعات تصویربرداری، مانند پیکسل‌های تیره یا بد، می‌توانند افزایش پیدا کنند. تصویر توپوگرافی SICM (شکل 1A) مویرگ های گلومرولی را نشان می دهد که توسط فرآیندهای پادوسیت اولیه و ثانویه به وضوح قابل مشاهده است. SICM امکان به دست آوردن تصاویر نمونه با محدوده های مختلف اسکن در مقیاس نانومتری را فراهم می کند و سطح تفکیک پذیری کافی را حفظ می کند. 17 شکل 1B معماری فرآیندهای ثانویه پاهای سلولی انسان را نشان می دهد که توسط SICM با وضوح بالا نشان داده شده است. تجزیه و تحلیل بیشتر از چنین تصاویر توپوگرافی را می توان برای مطالعه تغییرات مورفولوژیکی فرآیندهای پا پودوسیت تحت شرایط پاتولوژیک و در پاسخ به کاربردهای مختلف دارو مورد استفاده قرار داد.

کاربرد تکنیک SICM برای بررسی ساختار سطحی سه بعدی نمونه های بافت نرم از جملهگلومرولو سلول های پودوسیت، در ابتدا توسط Nakajima و همکاران معرفی شد. نویسندگان استفاده کردندکلیهبرش هایی برای مقایسه این تکنیک با SEM معمولی. در اینجا، ما این مطالعات را به گلومرول انسانی زنده گسترش دادیم. با استفاده از این رویکرد، ما پتانسیل بزرگ تکنیک SICM را برای بررسی سریع و قابل اعتماد آن آشکار کردیمگلومرولسد فیلتراسیون یکی از مزایای بزرگ SICM (علاوه بر استفاده از نمونه های زنده) این است که به چندین روش آماده سازی نمونه که معمولاً برای تصویربرداری میکروسکوپی EM مورد نیاز است، از جمله آبگیری و محلول تثبیت، نیاز ندارد. بنابراین، SICM اجازه می دهد تا از انقباض نمونه های مشاهده شده با EM جلوگیری شود، که ممکن است به ابعاد واقعی گمراه کننده منجر شود. نکته مهم، SICM بلادرنگ بر روی گلومرول‌های تازه جدا شده همچنین امکان آزمایش پویایی حرکت فرآیندهای پا را در پاسخ به قرار گرفتن در معرض حاد با داروهای مورد علاقه فراهم می‌کند. در نهایت، از پیپت SICM می توان برای انجام ضبط وصله گیره جریان های تک کانال استفاده کرد. برای این منظور، پس از بازسازی نقشه توپوگرافی، نرم افزار اکتساب (ICAPPIC Ltd، انگلستان) اجازه ترمز کنترل شده شیشه SICM را داد. کاوشگر پرش روی سطح محفظه، مقاومت میکروالکترود را در برابر شرایط پچ گیره کاهش می دهد (7 تا 12 MΩ) و آن را برای ضبط تک کانالی در همان آزمایش مناسب می کند. SICM امکان انتخاب محل دقیق الکترود پچ گیره بر روی سطح سلول را بر اساس داده های توپوگرافی با یک رویکرد عمودی به خوبی کنترل شده با دقت نانومتری فراهم می کند که منجر به تشکیل آسان یک گیگازیل تماسی با غشای سلولی به نام Smart Patch می شود.

به طور خلاصه، روش توصیف شده در اینجا پتانسیل بسیار خوبی برای مطالعات گلومرول ها و سایر بخش های نفرون تازه جدا شده دارد. علاوه بر این، نشان می دهد که می توان از انسان استفاده کردکلیهنمونه هایی بدون آماده سازی دقیق برای ارزیابی تغییرات مورفولوژیکی در مطالعه پاتولوژی ها.

سیستانچ برای بیماری کلیوی

سپاسگزاریها

تحقیقات در آزمایشگاه نویسندگان توسط دپارتمان امور جانبازان I01 BX004024، موسسه ملی قلب، ریه و خون R35 HL135749 و P01 HL116264، موسسه ملی دیابت و گوارش وکلیهبیماری‌های R01 DK126720 و جایزه ارتقای شغلی انجمن تحقیقات فیزیولوژیک آمریکا.

تضاد منافع

دکتر اندرو شوچوک سهامدار است و هزینه های مشاوره را از شرکت ICAPPIC دریافت می کند.

مشارکت های نویسنده

روسلان بوهویک: مفهوم سازی (برابر)؛ مدیریت داده (سرب)؛ تحلیل رسمی (سرب)؛ پیش نویس نوشتاری-اصل (برابر)؛ نگارش-بررسی و ویرایش (برابر). Mykhailo Fedoriuk: مدیریت داده (پشتیبانی)؛ تحلیل رسمی (حمایت کننده)؛ نگارش-بررسی و ویرایش (برابر). النا ایساوا: مفهوم سازی (حمایت کننده)؛ مدیریت داده (پشتیبانی)؛ تحلیل رسمی (حمایت کننده)؛ نوشتن-پیش نویس اصلی (پشتیبانی). نگارش-بررسی و ویرایش (برابر). اندرو شوچوک: مفهوم سازی (حمایت کننده)؛ نرم افزار (پشتیبانی)؛ نوشتن پیش نویس اصلی (پشتیبانی)؛ نگارش-بررسی و ویرایش (برابر). اولگ پالیگین: مفهوم سازی (برابر)؛ تحلیل رسمی (حمایت کننده)؛ روش شناسی (حمایت کننده)؛ مدیریت پروژه (پشتیبانی)؛ نوشتن-پیش نویس اصلی (پشتیبانی)؛ نگارش-بررسی و ویرایش (برابر). الکساندر استاروشنکو: مفهوم سازی (سرب)؛ مدیریت پروژه (سرب)؛ منابع (سرب)؛ نظارت (سرب)؛ پیش نویس نوشتاری-اصل (برابر)؛ نگارش-بررسی و ویرایش (برابر).

بیانیه در دسترس بودن داده ها

داده‌هایی که یافته‌های این مطالعه را پشتیبانی می‌کنند، در صورت درخواست معقول از نویسنده مسئول در دسترس هستند.