Senescence برای تسهیل ایمنی ضد توموری، ریزمحیط سنج را از نو می کند

خلاصه

پیری سلولی شامل توقف پایدار چرخه سلولی همراه با یک برنامه ترشحی است که در برخی موارد پاکسازی ایمنی سلول های پیر را تحریک می کند. با استفاده از یک مدل سرطان کبد با صلاحیت ایمنی که در آن پیری باعث رد تومور با واسطه سلول T CD8 می‌شود، نشان می‌دهیم که پیری پروتئوم سطح سلول را نیز بازسازی می‌کند تا نحوه تشخیص سلول‌های تومور عوامل محیطی را تغییر دهد، همانطور که اینترفرون نوع II (IFN) مثال می‌زند. در مقایسه با سلول‌های در حال تکثیر، سلول‌های پیر گیرنده IFN را تنظیم مثبت می‌کنند، نسبت به IFN ریزمحیطی بیش از حد حساس می‌شوند و اثرات ماشینی ارائه‌دهنده آنتی‌ژن را قوی‌تر القا می‌کنند، همچنین در سلول‌های تومور انسانی که تحت پیری ناشی از درمان هستند، خلاصه می‌شوند. اختلال در سنجش IFN در سلول های پیر، پاکسازی با واسطه ایمنی آنها را بدون از کار انداختن حالت پیری یا برنامه ترشحی مشخصه آن، کاهش می دهد. نتایج ما نشان می‌دهد که سلول‌های پیر توانایی افزایش یافته‌ای برای ارسال و دریافت سیگنال‌های محیطی دارند و دلالت بر این دارد که هر فرآیند برای نظارت ایمنی مؤثر آنها لازم است.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

اهمیت:

کار ما تأثیر متقابل بین بازسازی بافت و برنامه‌های حسگر بافت را نشان می‌دهد که می‌توانند با پیری در سرطان‌های پیشرفته درگیر شوند تا سلول‌های تومور را برای سیستم ایمنی تطبیقی ​​قابل مشاهده‌تر نشان دهند. این جنبه جدید پیری، برهمکنش‌های پیام‌رسانی هتروتیپی متقابل را ایجاد می‌کند که می‌تواند به صورت درمانی برای تقویت ایمنی ضد تومور القا شود.

معرفی

پیری سلولی یک برنامه پاسخ به استرس است که با توقف چرخه سلولی پایدار و یک برنامه ترشحی که قادر به بازسازی محیط بافت است مشخص می شود (1). در بافت‌های طبیعی، پیری به هموستاز بافتی در طول بهبود زخم کمک می‌کند. با این حال، در بافت های پیر یا آسیب دیده، تجمع نابجای سلول های پیر می تواند باعث التهاب مزمن و کاهش ظرفیت بازسازی بافت شود (2-4). در سرطان، نشان داده شده است که پیری هم اثرات مفید و هم مضر بر روی بیولوژی بافت را واسطه می کند. از یک طرف، پیری مانعی برای تومورزایی ایجاد شده با انکوژن ایجاد می کند و به فعالیت ضد توموری برخی از درمان های سرطان کمک می کند (5، 6). از سوی دیگر، ماندگاری سلول‌های تومور پیر پس از درمان می‌تواند محیط بافتی ایجاد کند که باعث عود و متاستاز می‌شود (7، 8). زیربنای مولکولی این بروندادهای بیولوژیکی متضاد به خوبی شناخته نشده است. یکی از جنبه‌های برنامه پیری که احتمالاً به چنین بیولوژی متنوعی کمک می‌کند، فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری است (SASP؛ رجوع 9). SASP از طریق یک فرآیند بازسازی کروماتین جهانی که تکامل می یابد و توسط تنظیم کننده های کلیدی اپی ژنتیکی مانند BRD4 و فاکتورهای رونویسی پیش التهابی مانند NF-κB و C/EBP- کنترل می شود، فعال می شود (10-12). این به نوبه خود منجر به القای ژن‌هایی می‌شود که پروتئین‌های بازسازی‌کننده بافت مانند متالوپروتئینازهای ماتریکس، فاکتورهای رشد و فاکتورهای فیبرینولیتیک را رمزگذاری می‌کنند که نقش مهمی در روند بهبود زخم دارند (3، 13، 14). سایر اجزای SASP شامل کموکاین ها و سیتوکین ها هستند که می توانند ترکیب و وضعیت سلول های ایمنی را در بافت تغییر دهند و منجر به هدف گیری و پاکسازی خود سلول های پیر با واسطه ایمنی شوند (15، 16). با این وجود، تجمع نابجای سلول‌های پیر در بسیاری از زمینه‌های پاتولوژیک نشان می‌دهد که پاکسازی با واسطه ایمنی یک پیامد جهانی پیری یا SASP نیست و این احتمال را افزایش می‌دهد که مکانیسم‌های اضافی اثرات متناقض مفید و مضر پیری را در بیولوژی بافت و نظارت بر ایمنی دیکته کنند. (17-19).

مطمئناً نظارت ایمنی مرتبط با پیری می‌تواند اثرات ضد سرطانی قوی داشته باشد، اگرچه مکانیسم‌های مؤثر دقیق با نوع بافت و سلول متفاوت است (10، 15، 16، 20). در مدل‌های موش سرطان کبد (HCC)، سلول‌های تومور کبدی که برای پیری تحریک می‌شوند، توسط مکانیسم‌های وابسته به ایمنی درگیر شده توسط نوع وحشی (WT) p53 حذف می‌شوند (15). در توافق، TP53 اغلب در HCC انسان، به ویژه در تومورهای "کلاس تکثیر" که بدترین پیش آگهی را نشان می دهند، جهش یافته است (21، 22). اگرچه ایمونوتراپی و داروهای هدفمند TP{12}}به عنوان استراتژی‌های امیدوارکننده برای بهبود نتایج بیماری در حال ظهور هستند، مبنای مولکولی پاسخ و مقاومت ناشناخته باقی مانده است (23-25). بنابراین، درک مکانیسم‌هایی که توسط آن سلول‌های تومور کبدی پیر شده برای سیستم ایمنی قابل مشاهده می‌شوند، ممکن است استراتژی‌هایی را برای ایجاد ایمنی ضد توموری در HCC جهش‌یافته TP که ممکن است به سایر انواع تومور گسترش یابد، تسهیل کند.

در اینجا، ما شروع به ایجاد اصولی کردیم که تشخیص ایمنی و پاکسازی سلول‌های پیر را تعدیل می‌کنند تا مکانیسم‌های پیری عملی را شناسایی کنیم که ممکن است برای بهبود کنترل ایمنی سرطان مورد استفاده قرار گیرند. برای این منظور، ما یک مدل جدید "القای پیری" ایجاد کردیم که در آن سلول‌های سرطانی کبد را می‌توان به طور انتخابی از طریق مدولاسیون ژنتیکی p53 درون‌زا به حالت پیری تغییر داد. ما استدلال کردیم که این می‌تواند اثرات درمان‌هایی را که باعث پیری می‌شوند تقلید کند (26، 27) در حالی که از اثرات مخدوش‌کننده درمان‌های القاکننده پیری روی سلول‌های ایمنی یا سایر اجزای محیط بافت اجتناب می‌کند. با استفاده از این مدل و سپس گسترش آن به سیستم‌های دیگر، نشان می‌دهیم که، علاوه بر SASP، پیری باعث بازسازی عمده پروتئوم سطح سلولی و برنامه‌های سیگنال‌دهی می‌شود به نحوی که پیش‌بینی می‌شود اساساً نحوه حس سلول‌ها و واکنش به محیط را تغییر دهد. سیگنال‌هایی که در اینجا از طریق حساسیت بیش از حد به IFN ریزمحیطی نوع II (IFN) نمونه‌ای است. این فرآیند باعث می‌شود تا دستگاه پردازش و ارائه آنتی‌ژن در سلول‌های تومور پیرتر تنظیم شود که آنها را مستعد نظارت بر سیستم ایمنی در داخل بدن می‌کند. بنابراین، نتایج ما یک برنامه حسگر بافت سیم‌کشی شده را در سلول‌های پیر نشان می‌دهد که در هماهنگی با SASP برای تقویت پتانسیل ایمنی‌زایی آن‌ها عمل می‌کند و در نتیجه رد تومور با واسطه ایمنی را تسهیل می‌کند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

نتایج

P53-مدل تومور ایمنی قابل ترمیم برای مطالعه نظارت بر پیری

برای مطالعه اینکه چگونه پیری حالات سلولی و بافتی را برنامه‌ریزی مجدد می‌کند، از تکنیک تزریق دم به ورید هیدرودینامیکی (HTVI) (28) برای تولید یک مدل سرطان کبد قابل القای پیری که توسط یک RNA سنجاق سر کوتاه p53 (shRNA) مخصوص تومور کنترل می‌شود، استفاده کردیم. به طور خاص، سلول‌های کبدی بالغ موش‌های Bl/6 دارای قابلیت ایمنی در داخل بدن با یک ناقل SB13 ترانسپوزاز زیبایی خواب و دو ساختار ترانسپوزونی (که کد NrasG12D-IRES-rtTA و TRE-tRFP-shp53 یا «NSP» را در ژنوم ادغام می‌کنند، ترانسفکت شدند. . در این سیستم Tet-On، p53 درون‌زا در حضور داکسی‌سایکلین (Dox) از طریق فعال‌سازی shRNA القایی مرتبط با RFP (شکل 1A) سرکوب می‌شود و کنترل ژنتیکی پیری در تومورهای ایجاد شده را قادر می‌سازد. مطابق با وقوع همزمان جهش هایی که TP53 را غیرفعال می کند و مسیرهای سیگنال دهی تکثیر سلولی را فعال می کند (به عنوان مثال، آبشارهای PI3K/AKT و RAS/MAPK) در تومورهای کبدی انسان، همکاری بین RAS انکوژن و سرکوب p53 منجر به تبدیل شدن بیشتر سلول های کبدی شد. 5 تا 8 هفته پس از HTVI در موش ها تومورهایی با ویژگی های تمایز ضعیف ایجاد می شود. پروفایل رونویسی نشان داد که این تومورهای موشی شبیه کلاس "تکثیر" HCC انسانی (شکل تکمیلی S1A-S1F)، که کلاس معمولی HCC انسانی حاوی جهش TP53 است (21، 22، 29) است.

بر اساس کار قبلی (15)، ما پیش‌بینی کردیم که فعال‌سازی مجدد p53 در سیستم فوق باعث پیری و درگیر شدن ایمنی ضد توموری شود. بر این اساس، ترک Dox باعث پسرفت تومور چشمگیر در طی چند هفته شد که منجر به بقای طولانی حیوان شد (شکل 1B و C). تجزیه و تحلیل تومورها در 14 روز پس از خروج Dox، کاهش مورد انتظار shRNA p53 (همانطور که توسط گزارشگر RFP مرتبط مشاهده شد) و تجمع -گالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA{7}}gal) را بدون هیچ اثر قابل توجهی بر روی RAS-effector p-ERK (شکل 1D). به طور مشابه، افزایش فعالیت SA{11}} و پروفایل‌های رونویسی مرتبط با SASP، همراه با توقف پرولیفراتیو همزمان، در سلول‌های تومور تکثیر شده 6 تا 8 روز پس از ترمیم p53 مشاهده شد (شکل تکمیلی S2A-S2H). نکته قابل توجه، پیوند این کشت‌ها (برای حفظ خاموشی p53 روی Dox نگه‌داشته می‌شود) به موش‌های دارای سیستم ایمنی که با تغذیه Dox تغذیه می‌شوند، تومورهای ثانویه همزمان و کانونی تولید می‌کنند که با سینتیک مشابه تومورهای اولیه پس از خروج Dox پسرفت می‌کنند (شکل 1B؛ شکل تکمیلی S3A- S3E). آزمایش‌های کنترلی با استفاده از یک سیستم Tet-Off یا ترکیب یک shRNA p53 سازنده این احتمال را که Dox خود بر رفتار تومور در مدل ما داشته باشد را رد کرد (شکل تکمیلی S3F و S3G). بنابراین، این سیستم امکان القای موثر پیری در سلول‌های تومور را بدون توسل به درمان‌هایی فراهم می‌کند که می‌توانند سیستم ایمنی میزبان را نیز تغییر دهند. با توجه به انعطاف‌پذیری افزوده آن، ما از مدل پیوند ارتوتوپی (که از این به بعد "NSP" نامیده می‌شود) برای بسیاری از مطالعات مکانیکی شرح داده شده در زیر استفاده کردیم. همانطور که پیش بینی می شد، رگرسیون های تومور مشخص ذکر شده در بالا با واسطه ایمنی بودند. از این رو، تومورهای NSP که پس از پیوند به موش‌های برهنه و Rag2-/-Il2rg-/- (R2G2) با نقص ایمنی به وجود آمدند، تحت یک پاسخ سیتواستاتیک برجسته قرار گرفتند، اما نتوانستند پسروی کنند، با حیوانات R2G2 که عمیق‌ترین نقایص را نشان می‌دهند (شکل 1E-G؛ تکمیلی). شکل S3H و S3I). از آنجایی که موش‌های برهنه در ایمنی تطبیقی ​​معیوب هستند و R2G2 نیز برای جنبه‌های ایمنی ذاتی به خطر می‌افتد، این نتایج نشان می‌دهد که سیستم ایمنی تطبیقی ​​برای رگرسیون تومور کارآمد در مدل ضروری است و یک زمینه تجربی کنترل‌شده به خوبی برای کشف مبنای مکانیکی ایجاد می‌کند. این اثرات

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

پیری باعث تغییر از فرار ایمنی تومور به شناسایی ایمنی می شود

برای مشخص کردن اثرات پاراکرین سرکوب کننده تومور پیری، در مرحله بعد ریزمحیط ایمنی تومورهایی را که حاوی p{1}}سرکوب شده (به عنوان "تکثیر") و p{2}}بازیابی شده (به عنوان "پیر" شناخته می شوند، مشخص کردیم. ) سلول های تومور پس از 1 هفته از ترک Dox، زمانی که پیری ایجاد می شود، اما تومورها هنوز پسرفت نکرده اند (شکل های تکمیلی S2، S3 و S4A). ضایعات حاوی سلول‌های تومور پیر، افزایش ~1 برابری در کل سلول‌های ایمنی CD45+ را در مقایسه با کنترل‌های در حال تکثیر نشان دادند (شکل 2A؛ مراجعه به 15، 16). آنالیزهای ایمونوفنوتیپی و بافت شناسی (در روز نهم پس از ترک Dox) نشان داد که این امر شامل افزایش چشمگیر درصد لنفوسیت ها (سلول های B، سلول های CD4 T و سلول های CD8 T) و کاهش درصد Gr است. سلول‌های سرکوب‌گر/نوتروفیل‌های مشتق از میلوئید (CD11b+Gr1+Ly6Clo؛ شکل 2B؛ شکل‌های تکمیلی. S4B). اگرچه بخش ماکروفاژها به عنوان درصدی از کل جمعیت CD45 بدون تغییر باقی ماند، اعداد مطلق به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 2A و B؛ شکل تکمیلی S4C-S4E). در جمعیت سلول های T، تجمع سلول های CD8 T نشانگرهایی از تجربه آنتی ژن را نشان داد (CD{30}}، CD{31}}) و دارای جمعیت افزایش یافته ای از سلول های مؤثر بود (CD{32}}CD62L-؛ شکل 2C؛ رجوع به 30). این بازسازی کلی محیط ایمنی منجر به افزایش قابل توجهی در نسبت CD3:نوتروفیل برای تومورهای حاوی سلول های پیر شد (تصویر تکمیلی S4F)، اثراتی که با افزایش مشابه در نسبت CD3:نوتروفیل که با واکنش ایمنی در انسان مرتبط است، مطابقت دارد. تومورهای کبدی (31). بازسازی را می توان با استفاده از تصویربرداری سه بعدی پس از پاکسازی بافت تجسم کرد (شکل 2D؛ شکل تکمیلی S4G و S4H؛ ویدیوی تکمیلی S1؛ رفر 32).

شکل 1. یک مدل تومور قابل ترمیم p{1} برای مطالعه نظارت ایمنی پیری. A، تولید مدل سرطان کبد موش مبتنی بر NRAS قابل ترمیم p53- با استفاده از سیستم ترانسپوزون زیبایی خواب ارائه شده از طریق HTVI. (ایجاد شده با BioRender.com.) B، سونوگرافی نماینده HTVI و مدل های سرطان کبد تزریقی ارتوتوپی در زمان مشخص شده پس از ترمیم p53. ج، تجزیه و تحلیل بقای موش ها در مدل HTVI. D، رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)، ایمونوفلورسانس (IF) و رنگ‌آمیزی -گالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA{7}}gal) p{8}} سرکوب شد (p53 خاموش) و -بازیابی شد (p53 برای 14 روز) بخش های تومور تولید شده از مدل HTVI. نوارهای مقیاس، 5{{30}} میکرومتر. E-G، تزریق ارتوتوپی سلول های تومور NSP با ناقل GFP-لوسیفراز به کبد سویه های موش دارای نقص ایمنی و نقص ایمنی. E، تغییر اندازه تومور با سونوگرافی پس از ترمیم p53 اندازه گیری شد. R2G2، Rag{19}}موس دو ناک اوت Il2rg. داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. n بزرگتر یا مساوی 9 برای هر سویه. F، تصاویر ماکروسکوپی نماینده در 21 روز از p53 روی یا نقطه انتهایی p53 خارج از تومور. G، رنگ آمیزی IHC نماینده سلول های تومور نشاندار شده با GFP در روز 21 پس از ترمیم p53. میله های مقیاس، 100 میکرومتر. **، P <0.01; ***، P <0.001.

برای مشخص کردن انواع سلول‌های ایمنی خاص مسئول نظارت ایمنی سلول‌های تومور پیر، گروه‌های موازی از موش‌هایی که تومورهای NSP ارتوتوپی را در خود جای داده بودند تولید کردیم و تأثیر کاهش جمعیت‌های مختلف سلول‌های ایمنی را بر رگرسیون تومور پس از خروج Dox بررسی کردیم. در حالی که مسدود کردن آنتی‌بادی‌هایی که نوتروفیل‌ها/مونوسیت‌ها (Gr1)، سلول‌های کشنده طبیعی (NK) (NK1.1) و سلول‌های CD4 T (GK1.5) را هدف قرار می‌دهند، هیچ تأثیری نداشت، کاهش سلول‌های CD8 T (2.43) و ماکروفاژها (با استفاده از کلودرونات لیپوزومی). که به طور انتخابی ماکروفاژها (CD11b+F4/{12}}) را هدف قرار می‌دهد، اما سلول‌های دندریتیک کلاسیک را هدف قرار نمی‌دهد (CD11b-CD11c+MHC-II+CD{17}}؛ مراجع 33، 34) به طور قابل‌توجهی رگرسیون تومور را مختل می‌کند (شکل. 2E؛ شکل مکمل. تومورها در اوایل پس از خروج Dox (8 روز؛ شکل تکمیلی S5A و S5B) و از الگوریتم آزمایش فراوانی افتراقی Milo (35) برای ثبت تغییرات حالت سلولی در انواع سلول های ایمنی واسطه این فرآیند استفاده کرد (شکل تکمیلی S5C-S5F). با توجه به سهم آنها در رگرسیون تومور، زیرجمعیت‌های سلول T و ماکروفاژ CD8 تغییرات مشخصی را در کمیت و حالت نشان دادند. در مورد سلول های T، تومورهای در حال تکثیر (p{35}سرکوب شده) به طور قابل توجهی در حالت های CD8 T غنی شدند که بیان بالایی از هر دو نشانگر اختلال عملکرد (Tox، Tigit، Lag3، Ctla4، Pdcd1/PD1، و Cd160) و نشانگرهای فعال سازی (Prf1) را نشان دادند. ؛ شکل 2F و G؛ شکل تکمیلی S5G؛ جدول تکمیلی S1). این سلول‌های CD8 T همچنین سطوح بالایی از Tnfrsf9 را نشان دادند، نشانگری که زیرمجموعه‌های سلول T را مشخص می‌کند که ظرفیت تقویت مجدد در HCC انسان و سایر انواع سرطان را دارند (36، 37). در مقابل، در ضایعات مسن (p{51}فعال شده مجدد)، جمعیت CD8 T بسیار فعال به نظر می رسید، نشانگرهای پایینی از نشانگرهای اختلال و بیان بالای سیتوکین های موثر را نشان می داد (به عنوان مثال، Ifng، Tnf؛ جدول تکمیلی S1). بر این اساس، پروفایل رونویسی بافت‌های تومور توده‌ای، امضاهای فعال ایمنی و سیتوتوکسیک را در تومورهای پیری که تحت رگرسیون قرار می‌گیرند نشان داد (شکل تکمیلی S5H؛ رجوع 38).

شکل 2. پیری یک سوئیچ تومور فرار ایمنی به تشخیص ایمنی را تحریک می کند. A، تصاویری از رنگ‌آمیزی CD45 و GFP که سلول‌های ایمنی و سلول‌های تومور را علامت‌گذاری می‌کنند، به ترتیب در تومورهای p{4} سرکوب‌شده و p{5}}بازیابی شده (7 روز پس از ترمیم p53). درست است، کمیت مساحت رنگ‌آمیزی CD{8}} از 3 فیلد تصادفی برای هر موش محاسبه شد. هر نقطه نشان دهنده یک ماوس است. B، تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری چشم انداز ایمنی جهانی در یک مدل تومور کبدی ارتوتوپی NSP. ایمونوفنوتایپینگ تومورهای پیر 9 روز پس از خروج Dox انجام می شود، زمانی که حالت پیری به طور کامل برقرار می شود و در عین حال قبل از پسرفت تومور عظیم است. G-MDSC، سلول های سرکوبگر مشتق از میلوئید گرانولوسیتی. M-MDSC، سلول های سرکوبگر مشتق از میلوئید مونوسیتی. داده‌ها از 2 آزمایش مستقل، با n=7 در گروه در حال تکثیر و n=9 در گروه پیر گردآوری شده‌اند. توجه داشته باشید که با افزایش تعداد مطلق سلول‌های CD{18}} در ضایعات تومور NSP پیر (A)، تعداد کل انواع سلول‌های مشخص شده نیز افزایش می‌یابد. C، آنالیز فلوسیتومتری سلول های CD8 T. داده‌ها از 2 آزمایش مستقل، با n=11 در گروه‌های در حال تکثیر و n=10 در گروه‌های پیر جمع‌آوری شده‌اند. آزمایشات 9 روز پس از خروج Dox انجام شد. D، تصاویر پاکسازی بافتی از تومورهای کبدی ارتوتوپی NSP. سلول های T، نوتروفیل ها و عروق به ترتیب با رنگ آمیزی CD3، MPO و CD31 نشاندار می شوند. نمونه ها 9 روز پس از خروج داکس جمع آوری شد. E، تغییر اندازه تومور توسط اولتراسوند پس از ترمیم p53 در موش پس از تخلیه انواع سلول‌های ایمنی خاص با استفاده از آنتی‌بادی‌ها یا داروها اندازه‌گیری شد. F، نمودار تقریبی منیفولد یکنواخت و طرح ریزی (UMAP) سمت چپ سلول های T CD8 جدا شده از تومورهای P{29}}سرکوب شده در حال تکثیر (PRO) و p{3{49}}}}بازفعال شده پیر (SEN). درست، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن ژن‌های نشانگر فرسودگی سلول T در سلول‌های CD{32}} در حال تکثیر (p{33}}سرکوب شده) در مقابل تومورهای پیر (p53-بازفعال‌شده). NES، امتیاز غنی سازی نرمال. Pval، P مقدار. G، نمودار UMAP بیان ژن‌های انتخاب شده (Cd8a، Cd44، Tnfrsf9، Cd69، Tox، و Fasl) بین سلول‌های CD8 T جدا شده از پیر (p{{{0}}}فعال‌شده) و در حال تکثیر (p تومورهای {41}}سرکوب شده. H، تصاویر ایمونوفلورسانس نماینده سلول‌های CD8 T و رنگ‌آمیزی ماکروفاژ F4/{44}در تومور ارتوتوپی NSP کبد. نمونه های تومور 9 روز پس از خروج Dox جمع آوری شد. داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. همه میله های مقیاس، 100 میکرومتر. از آزمون t-test Student استفاده شد. *، P <0.05; **، P <0.01.

تغییرات در محفظه ماکروفاژها شواهد بیشتری ارائه کرد که پیری سلول های تومور باعث ایجاد یک سوئیچ فرار ایمنی به نظارت می شود. از این رو، scRNA-seq، ایمونوفنوتایپینگ، و بافت شناسی نشان داد که فنوتیپ های ماکروفاژ مرتبط با تومور از F4/8{15}}در حال انتقال هستند. حالات CD11chi (خوشه 8)، از جمله جمعیت‌های سرکوب‌کننده PD-L{9}} (ویژگی تومورهای HCC انسانی با پیش‌آگهی ضعیف؛ مراجع 39، 40) تا F4/80hi. حالات CD11c- (خوشه 0)، که با بیان بالای امضای ژن ارائه آنتی ژن تعریف می شود (شکل های تکمیلی S5E-S5J و S6A و S6B؛ جدول تکمیلی S1). توجه داشته باشید، این F4/80hi مرتبط با پیری. ماکروفاژهای CD11c- به ویژه به درمان کلودرونات لیپوزومی حساس بودند (شکل تکمیلی S6C-S6E)، که همچنین منجر به کاهش قابل توجهی در بخش سلول‌های CD8 فعال اما نه CD4 T (شکل تکمیلی S6F و S6G) شد که نشان‌دهنده CD8 است. پاسخ ایمنی وابسته به T شامل همکاری با ماکروفاژها. بر این اساس، تجزیه و تحلیل‌های بافت‌شناسی تأیید کرد که تجمع سلول‌های CD8 T و ماکروفاژهای F4/{34} اغلب به دنبال القای پیری در تومورها غنی‌سازی می‌شوند (شکل 2H؛ شکل تکمیلی S4D). در مجموع، این تجزیه و تحلیل‌های بیولوژیکی و مولکولی از مدلی پشتیبانی می‌کنند که در آن پیری سلول‌های تومور باعث تغییر ناگهانی از فرار ایمنی به نظارت ایمنی با واسطه تغییرات در ماکروفاژها و وضعیت‌های سلول T CD8 می‌شود که منجر به مصونیت ضد توموری تولیدی و در نهایت رد تومور می‌شود.

پیری برنامه های حسگر بافت و چشم انداز سطح سلولی را بازسازی می کند

ما در مرحله بعد شروع به استفاده از مدل فوق برای درک مکانیسم‌های مولکولی مسئول نمایان کردن سلول‌های تومور پیر برای سیستم ایمنی کردیم. القای سنس شامل یک برنامه بازسازی کروماتین است که ژن های تکثیر کننده را خاموش می کند و بسیاری از ژن های کد کننده فاکتورهای SASP را فعال می کند، که برنامه دوم تا حد زیادی به خواننده تقویت کننده BRD4 وابسته است (10). بنابراین ما آزمایش‌های پروفایل رونویسی را روی سلول‌های NSP تحت شرایط تکثیر (p{2}}سرکوب شده) در مقابل پیری (p{3}} ترمیم شده) در غیاب و حضور JQ1 انجام دادیم، دارویی که عملکرد BRD4 را مهار می‌کند (جدول تکمیلی S2). ). مطابق با انتظارات، ترمیم p53 به طور چشمگیری بیان ژن های تکثیر کننده را کاهش داد و بیان فاکتورهای شناخته شده SASP را القا کرد (شکل 3A؛ شکل تکمیلی S7A؛ مرجع 7)، از جمله چندین سایتوکین شناخته شده برای تحریک سلول های T (Cxcl16، Il18). ) یا فعال سازی و استخدام ماکروفاژ (Csf2، کدکننده پروتئین GM-CSF) یا قبلاً به پیری مرتبط شده است (Igfbp7، Igfbp3، Pdgfa). همانطور که از کار قبلی پیش‌بینی می‌شد (10)، بسیاری از رونوشت‌های کدگذاری SASP تنظیم‌شده (تقریباً 65%) وابسته به BRD{20}}بودند (شکل تکمیلی S7B). به طور مشابه، طیف وسیعی از فاکتورهای رشد و تعدیل‌کننده‌های ایمنی از سلول‌های پیر ترشح می‌شوند، همانطور که با سنجش سیتوکین‌های چندگانه، از جمله سلول‌های T و جاذب‌های ماکروفاژ CCL5، CXCL9، و GMCSF، و همچنین فاکتور بازسازی عروق VEGF (شکل تکمیلی) ارزیابی شد. S7C). بنابراین، پیری در سلول‌های تومور P{26} بازسازی‌شده NSP با یک SASP قوی همراه است که با بازسازی مشخص اکوسیستم ایمنی که در بالا مشخص شد، مطابقت دارد.

به طور شگفت انگیزی، بررسی محلی سازی درون سلولی برای ژن های بیان شده متفاوت (DEG) نشان داد که سلول های تومور پیر نه تنها بیان عوامل SASP ترشح شده ("خارج سلولی" EC) خود را افزایش دادند، بلکه تغییرات عمده ای را در سطح بیان رونوشت های کد کننده پروتئین های سطحی نشان دادند. ("غشاء پلاسما"، PM؛ شکل 3B). در واقع، 25 درصد از کل DEG های تنظیم شده به سمت بالا، پروتئین های PM را کدگذاری می کنند، غنی سازی قابل توجهی که از توزیع تصادفی منحرف می شود (15 درصد؛ شکل 3B). PM-DEGهای پویا به انتقال سیگنالینگ پروتئین تیروزین کیناز (Nrp1، Egfr)، فعالیت گیرنده سیتوکین (Ifngr1)، گیرنده‌های ماتریکس خارج سلولی (Itgb3، Cd44) و انتقال‌دهنده‌های یون (Slc12a1، Slc24a3، Slc24a3) مرتبط بودند. Cd44، Vcam1، و Itgb3)، نشان می‌دهد که سلول‌های پیر ممکن است توانایی بهبود یافته‌ای برای تعامل و حس کردن محیط خود داشته باشند (شکل 3C؛ شکل تکمیلی S7D؛ رجوع به 41-43). جالب توجه است، افزایش مرتبط با پیری در بیان بسیاری از این پروتئین‌های PM توسط JQ1 کمرنگ شد، و نشان می‌دهد که القای آنها ممکن است بخشی از برنامه بازسازی کروماتین گسترده‌تر همراه با SASP باشد (شکل 3D؛ رجوع به 10). شایان ذکر است، تغییرات عمیق در رونویسی ژن‌های کدکننده پروتئین‌های PM نیز در سلول‌های تومور دارای کمبود p{25}NSP تحت درمان با ترکیب داروی القاکننده پیری ترامتینیب و پالبوسیکلیب رخ داد (شکل تکمیلی S7E، پانل بالا؛ جدول تکمیلی S2). رجوع 20) و در یک سری از 13 رده ژنتیکی متنوع TP53 WT و TP{32}} جهش یافته سرطان انسان مشتق شده از سرطان های کبد، سینه، ریه و روده بزرگ ناشی از پیری توسط محرک های مختلف (شکل 3E؛ شکل تکمیلی. S7F؛ رجوع به 44). این به ویژه برای PM-DEG های تنظیم شده (اما نه تنظیم شده) قوی بود، که یادآور اثرات مشاهده شده برای فاکتورهای EC SASP است (شکل 3E؛ شکل تکمیلی S7E، پانل پایین). بنابراین، بیان تغییر آشکار پروتئین‌های سطح سلولی که در مدل خود مشاهده کردیم فراتر از پیری القا شده از p{40} است و ممکن است نشانه‌ای از حالت پیری باشد.

شکل 3. پیری برنامه های حسگر بافت و چشم انداز سطح سلول را بازسازی می کند. A، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن (Reactome) داده‌های RNA-seq از سلول‌های تومور کبدی NSP در حال تکثیر (PRO، P53 خاموش) در مقابل پیری (SEN، p53 به مدت 8 روز). NES، امتیاز غنی سازی نرمال شده. B، محلی‌سازی درون سلولی DEGs (P < 0.05؛ تغییر برابری > 2) در همه ژن‌های شناسایی‌شده [رونوشت‌ها در هر کیلوباز میلیون (TPM) > 1] از RNA-seq. C، تجزیه و تحلیل هستی شناسی ژن (GO) از DEG های کد کننده پروتئین های PM تنظیم شده در سلول های پیر. TM، گذرنده. D، تجزیه و تحلیل ترانسکریپتومی تمام DEG ها (تکثیر در مقابل پیری) در حضور یا عدم حضور درمان JQ1. خوشه C1 (قرمز) حاوی ژن‌های خاص پیری حساس به JQ1 و خوشه C4 (به رنگ آبی) حاوی ژن‌های اختصاصی تکثیر حساس به JQ1 است. E، متاآنالیز مجموعه داده‌های RNA-seq از SENECopedia با انجام محلی‌سازی درون سلولی DEGs (همان شکل 2D) و آزمایش دقیق فیشر برای بررسی غنی‌سازی نسبی EC/PM-DEGهای تنظیم‌شده و کاهش‌یافته منحرف از توزیع تصادفی. همچنین به شکل تکمیلی S7E و S7F مراجعه کنید. F، تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی (MS) پروتئوم غنی شده با PM در سلول های در حال تکثیر و پیری. سطح پروتئین به میانگین بیان پروتئین همه نمونه ها نرمال می شود. نمونه‌های شاهد نمونه‌های بدون برچسب بیوتین هستند که به عنوان پس‌زمینه عمل می‌کنند. جعبه های قرمز و آبی به ترتیب نشان دهنده پروتئین های غنی شده در سلول های پیر و در حال تکثیر هستند. n=6 برای هر دو گروه آزمایشی پیر و در حال تکثیر، و n=3 و 4، به ترتیب، برای کنترل آنها. G، توزیع پروتئین‌های PM مشروح‌شده GeneCards تنظیم‌شده و تنظیم‌شده با مشخصات MS. NC، بدون تغییر H، نمودار آتشفشانی از پروتئین‌های PM مشروح‌شده با GeneCards که توسط MS نمایه شده‌اند.

برای اعتبار بخشیدن به بازسازی جهانی فاکتورهای PM در پیری در سطح پروتئین، ما پروتئومیک سطحی را روی سلول‌های تومور تکثیر شونده و پیر NSP انجام دادیم، با استفاده از روش غنی‌سازی برچسب‌گذاری بیوتین، که در آن پروتئین‌های سطح سلول با بیوتین غیرقابل نفوذ غشایی برچسب‌گذاری شدند. خالص شد، و تحت طیف سنجی جرمی قرار گرفت (شکل 3F؛ شکل تکمیلی S7G؛ رجوع 45). یک همبستگی قوی بین تکرارهای بیولوژیکی تحت هر شرایط مشاهده شد (شکل تکمیلی S7H)، با پروتئین‌های شناسایی‌شده برای پروتئین‌های PM مشروح شده تا 60 درصد پس از القای پیری ناشی از p{8} غنی‌سازی می‌شوند. از 887 پروتئینی که به صورت تکراری شناسایی شدند، بیش از 50 درصد به صورت متفاوت بیان شدند. بیشتر پروتئین‌های بیان‌شده به‌خوبی با جهت‌گیری مشاهده‌شده در داده‌های پروفایل رونویسی ما همبستگی دارند، اگرچه برخی از آنها بدون تغییر متناظر در سطوح رونوشت به‌طور متفاوت بیان شدند (شکل تکمیلی S7I).

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

پروتئین‌های سطح سلولی مشروح شناسایی‌شده توسط طیف‌سنجی جرمی پس از القای پیری، شامل چندین مورد مرتبط با پیری (مانند CD44 و VCAM1)، فاکتورهای رشد مختلف و گیرنده‌های سیتوکین (مانند EGFR، ICAM1، و IFNGR1) و سایر عوامل کمتر مشخص شده بودند (شکل 3F-H؛ شکل تکمیلی S7J و S7K). نکته قابل توجه، مجموعه پروتئین‌های غنی‌شده با سطح سلول شناسایی‌شده در مدل ما، همپوشانی محدودی با پروتئین‌های شناسایی‌شده در فیبروبلاست‌های انسانی که تحت پیری ناشی از انکوژن هستند، نشان داد (46)، که نشان‌دهنده ناهمگونی بین انواع سلول‌ها یا محرک‌های پیری است. صرف نظر از این، این نتایج نشان می‌دهد که سلول‌های پیر علاوه بر سیم‌کشی مجدد در برنامه ترشحی خود، تغییرات عمیقی در محتوا و فراوانی پروتئین‌های سطح سلولی را تجربه می‌کنند و نشان می‌دهند که سلول‌های پیر ویژگی‌های متمایز حسگر ریزمحیطی را به دست می‌آورند که ممکن است بر وضعیت و سرنوشت آنها در داخل بدن تأثیر بگذارد. .

سلول های پیر برای تشخیص IFNg و تقویت سیگنال IFNg آماده شده اند

برای شناسایی مسیرهایی که ممکن است عملکردی بر نحوه حس سلول‌های پیری محیط خود تأثیر بگذارند، مجموعه داده‌های رونویسی و پروتئومی را برای تغییرات مرتبط با پیری مرتبط با ایمنی ضد تومور استخراج کردیم. جالب توجه است، تجزیه و تحلیل هستی شناسی ژن (GO) نشان داد که پاسخ اینترفرون گاما نوع II (IFN ) (47) در میان 5 مسیر مشروح اصلی غنی شده در طول پیری و وابسته به برنامه های تقویت کننده خاص وضعیت سلولی (یعنی JQ{3}}حساس است) است. یعنی "C1" شکل 3D؛ شکل تکمیلی S8A). در میان رونوشت‌های تغییریافته، چندین تنظیم‌کننده مثبت سیگنال‌دهی IFN، از جمله زیرواحد گیرنده IFN IFNGR1 (یکی از پروتئین‌های به‌طور قابل‌توجهی تنظیم‌شده از داده‌های پروتئومی ما) و چندین اثرگذار اینترفرون (Irf1، Irf7، و Irf9؛ مراجع 47،4) را ذکر کردیم. ؛ شکل 4A-C؛ شکل تکمیلی S8B و S8C). علاوه بر این ژن‌های حساس به تنظیم مثبت Brd، رونوشت‌هایی که تنظیم‌کننده‌های منفی سیگنال‌دهی IFN (Ptpn2، Socs1 و Socs3) را کد می‌کنند، به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافت (شکل 4C؛ رجوع‌های 49، 50). تغییرات مشابهی در سلول‌های تومور NSP تحت درمان با محرک‌های مختلف پیری (شکل 4C؛ شکل تکمیلی S8D-S8G) و به طور گسترده‌تر، در یک پانل متشکل از 13 سرطان سینه، ریه، کبد و کولون انسانی مشاهده شد. خطوط سلولی که باعث پیری می شوند (شکل 4D؛ رفر. 44). بنابراین، تغییرات در بیان اجزای سیگنالینگ IFN نوع II یک ویژگی کلی سلول های پیر، مستقل از نوع سلول، ژنوتیپ سلولی، گونه و ماهیت القا کننده پیری است. افزایش همزمان فاکتورهای سیگنالینگ IFN و کاهش تنظیم‌کننده‌های منفی ما را به این فرضیه سوق داد که سلول‌های پیر می‌توانند IFN را در محیط خود حس کنند. برای آزمایش مستقیم این فرضیه، سلول‌های NSP در حال تکثیر و پیری را با IFN نوترکیب درمان کردیم و آنالیزهای بلات‌بندی فعال‌سازی سیگنالینگ JAK-STAT را انجام دادیم. اگرچه IFN به طور چشمگیری سطوح پایه STAT1 را در هر دو حالت افزایش داد، سلول های پیر بدون توجه به محرک پیری، STAT1 فسفریله بیشتری را انباشته کردند (شکل 4E؛ شکل تکمیلی S8H). علاوه بر این، ما همچنین افزایش سطح JAK1 فسفریله شده را در سلول‌های پیر ترمیم‌شده با p{38} یافتیم که از یافته‌های ما در مورد مسیر سیگنالینگ JAK-STAT فعال‌تر در سلول‌های پیری که IFN را حس می‌کنند حمایت می‌کند (شکل تکمیلی S8I). همانطور که از تجزیه و تحلیل رونویسی پیش بینی می شود، پیری همچنین باعث کاهش پروتئین PTPN2 (51)، صرف نظر از وجود IFN برون زا (شکل 4E) شد. بنابراین، سلول های پیر به طور موثرتری سیگنالینگ IFN را در پاسخ به غلظت محدود IFN در محیط فعال می کنند.

پیری و EC IFNg با همکاری یکدیگر ماشین آلات پردازش و ارائه آنتی ژن را تنظیم می کنند

برای درک بهتر سهم عملکردی سنجش IFN در برنامه پیری، در مرحله بعد، حالات فنوتیپی و رونویسی سلول‌های تومور NSP در حال تکثیر و بازسازی‌شده سلول‌های تومور NSP پیر تیمار شده با IFN نوترکیب را در سطوح پایین (50 pg/mL) مقایسه کردیم. دوز بالاتر (1 نانوگرم در میلی لیتر). اگرچه افزودن IFN اگزوژن به سلول های تومور در حال تکثیر یا پیر تأثیر ناچیزی بر زنده ماندن، تکثیر یا بیان ژن SASP هر نوع سلولی در دوزهای آزمایش شده داشت (شکل 5A؛ شکل تکمیلی S9A-S9D)، تغییرات مشخصی در بیان ژن مسیر IFN مرتبط با حالت پیری مشاهده شد. به طور خاص، خوشه‌بندی تحت نظارت «امضای پاسخ IFN» در میان سلول‌های در حال تکثیر و پیری، سه ماژول DEG را نشان داد: (i) ژن‌هایی که در طول پیری بدون در نظر گرفتن IFN (از جمله تنظیم‌کننده‌های منفی فوق‌الذکر) کاهش می‌یابند. (ب) ژن هایی که در طول پیری بدون توجه به IFN تنظیم می شوند. و جالب اینکه (iii) مجموعه قابل توجهی از DEG ها که به طور مشترک توسط ترکیب پیری و IFN القا می شوند (شکل 5B). بنابراین، پیری باعث تغییرات کمی و کیفی در پاسخ رونویسی به IFN می شود. یکی از خروجی های به خوبی تثبیت شده حساسیت سلول های تنظیم کننده سیگنال دهی IFN به نظارت تطبیقی ​​ایمنی، افزایش ظرفیت برای ارائه آنتی ژن با واسطه مولکول های MHC کلاس I است (MHC-I؛ مراجعه به 47، 52). در واقع، بسیاری از ژن‌هایی که در سلول‌های پیر (ژن‌های کلاس II) تنظیم می‌شوند یا در حضور IFN اگزوژن (ژن‌های کلاس iii) فوق القا می‌شوند، شامل اجزای دستگاه ارائه آنتی‌ژن می‌شوند. از جمله ژن‌های القا شده در طول پیری (ژن‌های کلاس II) Tap1، ناقل‌های مرتبط با پردازش آنتی ژن، و Psme1، یک فاکتور پروتئازوم مرتبط با پردازش آنتی‌ژن بودند (53). آنهایی که به IFN اگزوژن (ژن‌های کلاس III) حساس بودند شامل Nlrc5، یک فعال‌کننده رونویسی ژن‌های MHC-I بود (54). ضریب مونتاژ MHC-I Tapbp. و زیرواحد MHC-I B2m. دو ژن کلاس III دیگر اجزای ایمونوپروتئازوم (Psmb8 و Psmb9) بودند که عملکرد آنها می تواند مجموعه پپتیدهای ارائه شده را در صورت بیان بیش از حد تغییر دهد و با بهبود پاسخ تومور به محاصره ایست بازرسی ایمنی همراه است (55). این خروجی تقویت‌شده IFN در سلول‌های پیر با RT-qPCR تأیید شد و در سطوح حتی بالاتر IFN اگزوژن حفظ شد (شکل 5C؛ جدول تکمیلی S3). مطابق با فرآیند چند عاملی که در بالا توضیح داده شد، این اثر در سلول‌های تومور در حال تکثیر مشاهده نشد، حتی آنهایی که cDNA IFNGR1 را بیش از حد بیان می‌کنند و/یا با IFN درمان شده‌اند (شکل تکمیلی S10A-S10D).

شکل 4. سلول های پیر برای حس کردن و تقویت سیگنال IFN آماده شده اند. A و B، سطح IFNGR1 بر روی سلول‌های در حال تکثیر و پیری که با طیف‌سنجی جرمی (A) پروفایل شده و با فلوسیتومتری (B) تأیید شده‌اند. AU یک واحد دلخواه است. داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. n=6 برای هر دو گروه در حال تکثیر و پیری. ج، تجزیه و تحلیل ترانویسی ژن‌های انتخاب‌شده تنظیم‌کننده سیگنال‌دهی IFN از داده‌های RNA-seq از 3 رده سلولی مستقل P{5} (NSP، NSM2 و NSP5) که p53 را به همراه سلول‌های NSP تحت درمان با دو محرک پیری دیگر بازیابی می‌کنند. SEN/PRO، پیری/تکثیر شونده؛ T + P، ترامتینیب به علاوه پالبوسیکلیب. D، بیان mRNA ژن‌های انتخاب شده درگیر در سیگنال‌دهی IFN در رده‌های سلولی انسانی که باعث پیری می‌شوند. معالجه: علی، علیسرطب; Eto، etoposide; عدد نشان دهنده طول درمان (روز) است. داده ها از مجموعه داده های عمومی SENECopedia (44) به دست آمده است. E، Top، تجزیه و تحلیل ایمونوبلات سلول های NSP تحت محرک های مختلف پیری در حضور یا عدم حضور IFN (1 نانوگرم در میلی لیتر). پایین، کمی کردن شدت سیگنال از immunoblot. p-STAT1، phospho-STAT1 (Tyr701).

همچنین مطابق با تغییرات بیان ژن که در بالا توضیح داده شد، سلول‌های تومور پیر به‌طور قوی‌تری MHC-I را در پاسخ به سطوح پایین IFN اگزوژن در مقایسه با همتایان در حال تکثیر، تنظیم مثبت‌تر کردند. از این رو، در حالی که سطوح سطح سلولی MHC-I هر دو سلول در حال تکثیر و پیری در ابتدا پایین بود و توسط IFN اگزوژن القا می شد، سلول های پیر افزایش قابل توجهی در بیان پروتئین MHC-I نشان دادند (شکل 5D). هم افزایی مشابهی برای بیان سطح سلولی HLA (یکسان با MHC-I در موش) در سلول‌های سرطانی انسان از کبد و سایر انواع سرطان‌هایی که با Butlin باعث پیری می‌شوند مشاهده شد، که برنامه پیری وابسته به ap{7}}را درگیر می‌کند (56) یا trametinib/palbociclib که ترجیحاً سلول های تومور را با یک مسیر MAPK فعال شده هدف قرار می دهد (شکل تکمیلی S11A-S11D؛ رجوع به 20). نکته قابل توجه، اثرات ترکیبی درمان دارویی و IFN بر بیان HLA نیاز به القای پیری داشت و در سلول‌های تومور کبدی که به دلیل جهش خود به خود یا مهندسی شده p53 (غیر پاسخگو به طرح کلی) یا مسیر MAPK بیش فعال نشده (غیر پاسخگو) پیر نشدند، رخ نداد. به trametinib/palbociclib). علاوه بر این، حتی اگر مسیرهای پاسخ IFN نوع I و II شامل اجزای همپوشانی هستند، درمان IFN اگزوژن نمی‌تواند جایگزین IFN در تولید القای قوی MHC-I در سلول‌های پیر و یا القای بسیار متفاوت بین سلول‌های در حال تکثیر و پیری در مدل ترمیم p53 ما شود. شکل تکمیلی S11E و S11F). این داده‌ها نشان می‌دهد که سلول‌های موش و انسان که باعث پیری می‌شوند، در حضور مقادیر محدود IFN، ظرفیت بیشتری برای پردازش و نمایش آنتی‌ژن به دست می‌آورند.

سلول های تومور پیر مسیر سیگنال دهی IFNg را در داخل بدن بیش فعال می کنند

برای تعیین پیامدهای in vivo سیم‌کشی مجدد سیگنال‌دهی IFN شناسایی‌شده در سلول‌های پیر، در مرحله بعد سیستم گزارشگر سنجش IFN (IGS) را برای تجسم مستقیم فعال‌سازی سیگنال‌دهی IFN درون سلولی در زمان واقعی تطبیق دادیم (57). این گزارشگر متشکل از یک سری توالی‌های فعال شده با IFN است که ویژگی IFN نوع II را نسبت به سیگنال‌های دیگر دارد (57)، و به دنبال آن یک توالی cDNA کدکننده پروتئین فلورسنت ZsGreen1 است و به یک ترانس ژن RFP به طور اساسی برای تجسم سلول‌های ترانسدود شده مرتبط است. شکل 6A). سلول‌های تومور NSP که این ساختار را بیان می‌کنند RFP مثبت بودند و پس از درمان با IFN در شرایط آزمایشگاهی، افزایش وابسته به دوز را در سیگنال ZsGreen1 نشان دادند که پس از القای p53 یا پس از درمان با داروهای القاکننده پیری افزایش یافت (شکل 6B؛ شکل تکمیلی S12A و S12B). .

ما در مرحله بعد از این سیستم برای نظارت بر فعالیت سیگنالینگ پس از القای پیری در تومورها استفاده کردیم. سلول‌های تومور منتقل‌شده توسط گزارشگر (روی Dox) که RFP سازنده را بیان می‌کنند به کبد گیرندگان سیژنیک تغذیه‌شده با Dox تزریق شد، و پس از تظاهر تومور، Dox برای القای بیان p53 و ایجاد پیری مانند بالا برداشته شد (شکل‌های 1 و 2 را ببینید). تومورهای پسرفته 9 روز پس از خروج Dox برای تصویربرداری سه بعدی از فعالیت گزارشگر و ارزیابی موازی سیگنال دهی IFN در مقایسه با گروه کنترل در حال تکثیر (از موش های نگهداری شده در Dox) جدا شدند. همانطور که در شکل 6C نشان داده شده است، سلول های تومور در حال تکثیر بیان گزارشگر کمی، اگر وجود داشته باشد، نشان می دهند، در حالی که سلول های توموری که در شرایط in vivo پیر می شوند، سیگنال ZsGreen1 برجسته تری را نشان می دهند (شکل 6C و D؛ ویدئوی تکمیلی S2). این اثر با افزایش خاصی در سطوح پروتئین IFN (اما نه IFN نوع I) در عصاره های بافت تومور همزمان بود (شکل 6E؛ شکل تکمیلی S12C).

برای آزمایش اینکه آیا ترکیب تغییر یافته سلول‌های ایمنی در تومورهای پیر (شکل 2؛ شکل‌های تکمیلی S5-S6) به سیگنال تقویت‌شده گزارشگر IGS کمک می‌کند یا خیر، ما سنجش‌های هم‌کشتی آزمایشگاهی را انجام دادیم که اجازه قرار گرفتن سلول‌های تومور پیر یا در حال تکثیر را می‌دهد. تعداد مساوی سلول های CD8 T فعال شده، که ما از طریق داده های scRNA-seq به عنوان منبع سلولی غالب IFN در داخل بدن شناسایی کردیم (شکل 6F-H). سلول های پیر هنوز افزایش قابل توجهی در سیگنال ZsGreen1 در مقایسه با کنترل های در حال تکثیر نشان دادند (شکل 6I). مطابق با یک فعال سازی سیگنالینگ غیر سلولی مستقل، IFN در محیط های شرطی شده از سلول های تومور NSP تحت شرایط تکثیر یا پیری شناسایی نشد (شکل تکمیلی S12D)، با این حال IFN به راحتی در کشت همزمان با سلول های CD8 T شناسایی شد، اثری که با افزودن ماکروفاژها و همراه با افزایش MHC کلاس I بر روی سلول‌های پیر و همچنین افزایش فعال‌سازی سلول‌های CD8 T افزایش یافته است (شکل تکمیلی S12E-S12J). در مجموع، این داده‌ها از مدلی پشتیبانی می‌کنند که به موجب آن فعل و انفعالات هتروتیپی بین سلول‌های تومور پیر و سلول‌های ایمنی، تومور را به IFN اگزوژن حساس می‌کند و منجر به افزایش ارائه آنتی‌ژن و نظارت کارآمد ایمنی می‌شود.

شکل 5. Senescence و EC IFN برای تنظیم مثبت ماشین آلات پردازش و ارائه آنتی ژن همکاری می کنند. A و B، بیان mRNA ژن ها در سلول های NSP در حال تکثیر و پیری در شرایط آزمایشگاهی در حضور یا عدم حضور IFN (50 pg/mL). سطح mRNA به میانگین بیان ژن در همه نمونه ها نرمال می شود. A، فاکتورهای SASP کدگذاری DEG در مدل ما. B، ژن های پاسخ IFN از پایگاه داده امضای Hallmark. C، RT-qPCR ژن‌های مسیر ارائه آنتی‌ژن انتخابی در سلول‌های در حال تکثیر و پیری تحت تیمار با غلظت کم (۵۰ ​​pg/mL) یا بالا (۱ng/mL) IFN. نمونه ها از 2 تکرار بیولوژیکی هستند. D، سطح MHC-I سلولهای در حال تکثیر و پیری تحت درمان با IFN به مدت 24 ساعت با فلوسایتومتری اندازه گیری شد. MFI، شدت فلورسانس متوسط. داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند.

شکل 6. پیری سیگنال دهی هتروتیپی با واسطه IFN را از سلول های ایمنی فعال به سلول های تومور افزایش می دهد. یک تصویر گرافیکی از گزارشگر IGS. (ایجاد شده با BioRender.com.) B، نمودار فلوسیتومتری نماینده سمت چپ، سیگنال‌های ZsGreen1 را در سلول‌های NSP در حال تکثیر و پیر تیمار شده با 1 نانوگرم بر میلی‌لیتر IFN اندازه‌گیری می‌کند. درست است، کمی کردن درصد سلول‌های مثبت ZsGreen1-در درمان IFN. MFI، شدت فلورسانس متوسط. C و D، تصویربرداری سه بعدی نماینده تومورهای پاکسازی شده با بافت از رده سلولی NSP کبدی تزریق شده به صورت ارتوتوپی که گزارشگر IGS (C) را بیان می کند. تعیین کمیت 3 میدان به طور تصادفی انتخاب شده از تومور کبدی هر موش (D). n=5 و n=3 به ترتیب برای گروه های در حال تکثیر و پیر (9 روز پس از ترمیم p53). نوارهای مقیاس، 100 میکرومتر. E، بالا، سنجش آرایه مهره های سیتومتری برای سطح IFN از نمونه های لیز بافت تومور در داخل بدن (7 روز پس از ترمیم p53). در پایین، رونوشت‌های ژن‌های مشخص شده از RNA-seq نمونه‌های توده‌ای تومورهای تولید شده توسط HTVI (PRO، p53 خاموش؛ SEN، ترمیم p53 به مدت 12 روز). TPM، رونوشت در هر کیلو باز میلیون. خوشه Ifna/b اشاره شده حاوی 14 زیرگروه Ifna و 1 ژن Ifnb است. F و G، بیان Ifng در سلول‌های ایمنی نفوذگر به تومور که توسط scRNA-seq در مدل قابل پیوند NSP نمایه شده‌اند (مانند شکل 2، نمونه‌ای که در روز 8 پس از ترمیم p53 جمع‌آوری شد). H، تقریب منیفولد یکنواخت و نمودار طرح ریزی بیان Havcr2 (که TIM3 را کد می کند) و Ifng در سلول های CD8 T که از ضایعات تومور در حال تکثیر (P) و پیر (S) برداشت شده اند. پانل بالایی از شکل 2F (سمت چپ) برای نشان دادن سلول های مربوط به هر شرایط تکرار شده است. I، تعیین کمیت شدت ZsGreen1 سلول‌های تومور NSP در آزمایش هم‌کشت سلول تومور OT-I و سلول تومور بیان‌کننده SIINFEKL (نسبت اثر به هدف، 5:1) پس از 20 ساعت هم‌کشت. سیگنال اندازه گیری شده توسط فلوسیتومتری. T + P، ترامتینیب به علاوه پالبوسیکلیب. جزئیات تجربی را در شکل تکمیلی S12E ببینید. داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. از آزمون t Student دو طرفه استفاده شد. *، P <0.05; **، P <0.01; ***، P <0.001.

سیگنال دهی IFNg در سلول های تومور پیر برای نظارت ایمنی ضروری است

نتایج ما حاکی از آن است که پاکسازی سلول‌های تومور NSP با واسطه ایمنی شامل اثرات ترکیبی SASP است که برای تحریک جذب سلول‌های ایمنی شناخته شده است (10، 20، 58)، همراه با ظرفیت سلول‌های پیر برای افزایش حس و پاسخ به سیگنال های EC، همانطور که در اینجا با IFN نشان داده شده است. برای آزمایش سهم برنامه سنجش IFN مرتبط با پیری در نظارت ایمنی سلول‌های تومور پیر، بررسی کردیم که چگونه اختلال در IFNGR در سلول‌های تومور یا کاهش IFN در میزبان، بر پاکسازی سلول‌های تومور NSP پس از القای پیری تأثیر می‌گذارد. . در واقع، رگرسیون تومور (اما نه پیری فی نفسه؛ شکل تکمیلی S13A-S13D) پس از ناک اوت (KO) IFNGR1 (شکل 7A و B؛ شکل تکمیلی. S14A-S14C) مختل شد، اثری که حتی بیشتر برای تومورهای دست نخورده IFNGR به موش های Ifng-/- پیوند شده اند (شکل 7C و D) و با از دست دادن سطحی MHC-I در سلول های تومور مرتبط هستند (شکل تکمیلی S14D و S14E).

مطابق با سهم شناخته شده سیگنال دهی IFN و سلول های تومور MHC-I در درگیری CD8+ (59)، تومورهایی که فاقد IFNGR1 هستند یا در گیرندگان Ifng-/- ایجاد شده اند، حاوی سلول های CD8 T کمتری نسبت به همتایان WT خود در هر دو هستند. حالات در حال تکثیر و پیری (شکل تکمیلی S14F) در حالی که هنوز نفوذ سیستم ایمنی قوی شامل ماکروفاژهای فراوان را القا می کند (شکل 7E و F؛ شکل تکمیلی S14G). صرف نظر از این، اختلال در فنوتیپ نظارت بر پیری صرفاً نتیجه این کاهش سلول‌های CD8 T نبود. سنجش هم‌فرهنگی که قرار گرفتن در معرض یکنواخت سلول‌های تومور IFNGR1 KO و WT را با سلول‌های CD8 T و ماکروفاژها فراهم می‌کند، همچنان کشتن وابسته به IFNGR سلول‌های تومور پیر را نشان می‌دهد (شکل تکمیلی S15A-S15E) - وابستگی که به حضور هر دو T نیاز دارد. سلول ها و ماکروفاژها و در سلول های تومور در حال تکثیر تحت شرایط مشابه مشاهده نشد. در مجموع، این داده‌ها نشان می‌دهند که توانایی افزایش یافته سلول‌های پیر برای درک IFN ریزمحیطی در هماهنگی با به‌کارگیری سلول‌های ایمنی تحریک‌شده با SASP عمل می‌کند تا تعاملات هتروتیپی متقابل بین سلول‌های تومور، ماکروفاژها، و سلول‌های T فعال شده را تقویت کند که ارائه آنتی‌ژن و نظارت ایمنی را بهبود می‌بخشد. ، منجر به پسرفت تومور قوی می شود.

بحث

با استفاده از یک مدل تومور موش که در آن فرار ایمنی سرطان در مقابل نظارت بر پیری تحت کنترل شدید ژنتیکی است، ما نشان می‌دهیم که چگونه سلول‌های پیر توانایی خود را برای ارسال و دریافت سیگنال‌های محیطی به طور چشمگیری تغییر می‌دهند (شکل S16 تکمیلی). مطابق با برنامه های شناخته شده پیری، القای پیری مبتنی بر p53- منجر به خاموش شدن ژن های تکثیری شد و SASP را القا کرد. با این حال، ما همچنین تأثیر عمیقی بر بیان ژن برای پروتئین‌های PM مشاهده کردیم، از جمله طیفی از گیرنده‌های فاکتور رشد و گیرنده‌های سیتوکین که پیش‌بینی می‌شود به شدت نحوه واکنش سلول‌های پیر به سیگنال‌های محیطی را تغییر دهند. نکته مهم، اگرچه ما از یک مدل سرطان کبد به عنوان سیستم آزمایشی اولیه خود استفاده کردیم، سیم‌کشی مجدد مشابهی در بیان حسگرهای سطح سلولی و برنامه‌های ژنی حساس‌کننده به سیگنال‌های محیطی در طیف وسیعی از سلول‌های تومور موش و انسان که با القای پیری درمان شده بودند مشاهده شد. عوامل، دلالت بر این دارد که برنامه حسی تغییر یافته یک مشخصه کلی از حالت پیری است.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

یکی از مسیرهای حسی برجسته که در سلول های پیر تغییر یافته است، سیگنال دهی IFN نوع II است. در مدل سرطان کبد ما و در تمام حالات پیری که بررسی کردیم، پیری با تغییرات رونویسی درونی سلولی و بیان پروتئینی همراه است که پیش‌بینی می‌شود سیگنال‌دهی از IFN برون‌زا را افزایش دهد. در واقع، سلول‌های پیر در پاسخ به IFN در شرایط in vitro و in vivo، مؤثرترهای IFN را قوی‌تر فعال می‌کنند، و هر دو مسیر مؤثر IFN و IFN در محیط برای پاکسازی کارآمد سلول‌های تومور پیر با واسطه سلول T CD8 مورد نیاز هستند. اگرچه تجزیه و تحلیل مسیر رونوشت‌های سلولی پیر همواره سیگنال‌دهی IFN نوع II را به عنوان یک ویژگی غنی‌شده شناسایی می‌کند، همپوشانی‌های بین اجزای سیگنال‌دهی نوع I و II و این واقعیت که IFN معمولاً به عنوان یک عامل SASP شناسایی نمی‌شود، سؤالات مکانیکی در مورد سیگنال‌دهی IFN نوع II در پیری ایجاد کرده است. تا حد زیادی ناشناخته مطالعات ما نشان می‌دهد که چنین غنی‌سازی در امضاهای سیگنال‌دهی IFN سلول‌های پیر نشان‌دهنده ظرفیت افزایش یافته برای سنجش IFN است که خروجی آن در داخل بدن برجسته‌ترین است.

شکل 7. سیگنال دهی IFN در سلول های تومور پیر برای نظارت ایمنی ضروری است. A، Ifngr1 KO سلول‌های NSP در حال تکثیر و پیری که توسط فلوسیتومتری تأیید شده است. B، فنوتیپ رگرسیون تومور Ifngr1 KO یا سلول‌های تومور ترانسفکت‌شده با sgRNA به صورت ارتوتوپی به موش‌های Bl/6N پس از ترمیم p53 تزریق شد. یک sgRNA کنترل که یک بیابان ژن واقع در Chr8 (Ctrl KO) را هدف قرار می دهد به عنوان یک کنترل عمل می کند. C، فنوتیپ رگرسیون تومور سلول‌های تومور NSP والدینی که به صورت ارتوتوپی به موش‌های WT یا Ifng KO پس از ترمیم p53 تزریق می‌شوند. D، تصاویر ماکروسکوپی نماینده تومور در روز 21 پس از ترمیم p53 از C. E، تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری فراوانی CD45 در تومور از گروه‌های مشخص شده جمع‌آوری شد. F، ایمونوفلورسانس نماینده در p{{1{18}}}}سرکوب شده (تکثیر) و p{11}}ترمیم شده (پیر، 7 روز پس از ترمیم p53) تومور از میزبان مشخص شده. سلول های تومور NSP برای تجسم با یک وکتور بیان کننده GFP ترانسدود شدند. نوارهای مقیاس، 50 میکرومتر. داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. از آزمون t Student دو طرفه استفاده شد. **، P <0.01; ***، P <0.001.

شاید تثبیت‌شده‌ترین خروجی سیگنال‌دهی IFN نوع II شامل توانایی آن برای القای دستگاه ارائه آنتی‌ژن باشد. در واقع، IFN بیان سطح سلولی MHC-I (یا HLA در سلول های انسانی) را در مدل ما تحت شرایط تکثیر و پیری القا کرد. با این حال، تنظیم دخل و تصرف MHC-I ناشی از IFN در سلول های پیر بارزتر بود، اثری که با افزایش بیان ناقل مرتبط با پردازش آنتی ژن، سایر عوامل پردازش آنتی ژن، و اجزای ساختاری MHC-I مرتبط بود. حساسیت مفرط مشابهی به IFN در القای MHC-I/HLA در رده های سلولی سرطان ریه و کبد انسان مشاهده شد که باعث پیری می شوند. این نتایج نشان می‌دهد که برنامه پیری می‌تواند نمایش آنتی‌ژن را در سلول‌های غیر ایمنی افزایش دهد و در نتیجه نظارت بر ایمنی تومور را تسهیل کند. نتایج ما از مدلی پشتیبانی می‌کند که به موجب آن تأثیر نهایی سلول‌های پیر بر زیست‌شناسی بافت توسط اثرات ترکیبی نحوه ارسال و دریافت سیگنال‌های محیطی تعیین می‌شود. سلول‌های پیر نه تنها SASP را القا می‌کنند، که باعث بازسازی بافت می‌شود و حالت سلولی و ترکیب سلول‌های ایمنی در محیط را تغییر می‌دهد، بلکه به‌طور چشمگیری سطح خود را تغییر می‌دهند، که منجر به توانایی تفاضلی در حس عوامل محیطی می‌شود که در اینجا با IFN مثال می‌شود. مهمتر از همه، اختلال در سیگنال دهی IFN هیچ تاثیری بر القای پیری یا SASP در سیستم ما نداشت، اما رگرسیون های بعدی تومور را مختل کرد، که نشان می دهد حسگر محیطی تغییر یافته در هماهنگی با SASP برای تعیین خروجی نهایی برنامه پیری عمل می کند - در این مورد، نظارت ایمنی به نظر می رسد این اثرات بخشی از یک برنامه هماهنگ اپی ژنتیکی باشد، زیرا هم برنامه SASP و هم برنامه های سنجش وابستگی برجسته ای به فاکتور بازسازی کروماتین BRD4 نشان می دهند.

اگرچه مکانیسم نظارت ایمنی در مدل ما به اثرات مشارکتی سلول‌های CD8 T و جمعیت ماکروفاژ بستگی دارد که منعکس‌کننده گذار از یک ریزمحیط تومور "سرماً ایمنی" به یک ریزمحیط تومور "ایمنی داغ" است، سایر انواع سلول‌های ایمنی ذاتی یا سازگار ممکن است تشخیص دهند. و سلول‌های پیر را در زمینه‌های مختلف پاک می‌کنند، یا، به‌طور جایگزین، نظارت ایمنی ممکن است اصلاً رخ ندهد (18، 19). بدون شک، برخی از این تمایزات منعکس کننده ناهمگونی در ترشح فاکتور SASP هستند (13، 14)، اگرچه نتایج ما این احتمال را افزایش می‌دهد که میزان و ماهیت تغییر حس محیطی ممکن است بر نحوه تأثیر سلول‌های پیر بر زیست‌شناسی بافت نیز تأثیر بگذارد. اگرچه حذف سنجش IFN (از طریق Ifngr1 KO) و حذف MHC-I (B2M KO) در سلول‌های تومور پیر، نظارت ایمنی آنها را در داخل بدن مختل کرد، اما به طور کامل رگرسیون تومور را پس از القای پیری لغو نکرد، که نشان می‌دهد که سنجش IFN در سلول‌های پیر. تنها مسیری نیست که به پسرفت تومور کمک می کند. صرف نظر از این، این واقعیت که سلول‌های پیر می‌توانند به سیگنال‌های محیطی واکنش متفاوتی نشان دهند، نشان می‌دهد که حالت مولکولی نهایی آن‌ها در بافت‌ها با کشت سلولی متفاوت خواهد بود، و نیاز به توصیف بهتر فرآیند در داخل بدن را برجسته می‌کند.

نتایج ما ممکن است به توضیح اثرات متناقض زیست‌شناسی پیری در فیزیولوژی و بیماری کمک کند و پیامدهایی برای استفاده مؤثر از درمان‌های تعدیل‌کننده پیری داشته باشد. به عنوان مثال، در مدل ما، تفاوت بین پاکسازی و ماندگاری سلول‌های پیر تومور، حداقل تا حدی، با حضور IFN محیطی و یکپارچگی سیگنال‌دهی IFN نوع II در سلول‌های پیر مشخص شد. این نشان می‌دهد که تغییر در توانایی سلول‌های پیر برای جذب و درک سلول‌های ایمنی ترشح‌کننده IFN یا سایر انواع سلول‌های ایمنی می‌تواند عمیقاً بر پاکسازی سلول‌های پیر تأثیر بگذارد، به طوری که کاهش IFN محیطی یا کاهش سیگنال‌دهی IFN نوع II می‌تواند تداوم سلول‌های پیر را در بافت‌ها فعال کند. در زمینه سرطان، درمان‌هایی که پیری سلول‌های تومور را القا می‌کنند - یک برنامه سیتواستاتیک - می‌توانند باعث رگرسیون تومور با واسطه ایمنی شوند یا تومورها را نسبت به محاصره ایست بازرسی ایمنی دوباره حساس کنند، اما اینها نتایج جهانی نیستند. به این ترتیب، ناهمگنی در SASP (که می‌تواند بین انواع سلول‌های تومور و محرک‌های پیری متفاوت باشد) یا حس‌کردن و خروجی IFN [شاید تحت‌تاثیر حذف یا جهش مسیر IFN یا اجزای HLA (60) یا مکانیسم‌های رونویسی برگشت‌پذیر که در اینجا کشف شده است] ممکن است تأثیر بگذارد. اثربخشی چنین درمان هایی در بیماران. مطابق با این مفهوم، القای مبتنی بر درمان پروفایل‌های خاص SASP، پیامدهای بیمار را در زیر گروهی از بیماران مبتلا به سرطان تخمدان پیش‌بینی می‌کند (61). در مقابل، استراتژی‌هایی برای تقویت نظارت ایمنی سلول‌های پیر با افزایش حساسیت آنها به IFN (مثلاً با مهارکننده‌های PTPN2) ممکن است به برنامه‌ریزی خروجی به سمت رد سلول تومور کمک کند. ما تصور می‌کنیم که بررسی این و سایر برنامه‌های بازسازی و سنجش بافت در بیوپسی‌های تومور قبل و بعد از درمان (به عنوان مثال، از طریق پروفایل‌های رونویسی یا پروتئومیک) ممکن است نشانگرهای زیستی پاسخ جدید و/یا استراتژی‌های ترکیبی را برای بهبود مدیریت بالینی سرطان نشان دهد.

منابع

1. Di Micco R, Krizhanovsky V, Baker D, d'Adda di Fagagna F. پیری سلولی در پیری: از مکانیسم ها تا فرصت های درمانی. Nat Rev Mol Cell Biol 2021؛ 22:75-95.

2. Munoz-Espin D، Serrano M. پیری سلولی: از فیزیولوژی تا آسیب شناسی. Nat Rev Mol Cell Biol 2014؛ 15:482-96.

3. Demaria M, Ohtani N, Youssef SA, Rodier F, Toussaint W, Mitchell JR, et al. نقش اساسی سلول های پیر در بهبود بهینه زخم از طریق ترشح PDGF-AA. Dev Cell 2014؛ 31:722-33.

4. Xu M، Pirtskhalava T، Farr JN، Weigand BM، Palmer AK، Weivoda MM، و همکاران. سنولیتیک ها عملکرد فیزیکی را بهبود می بخشند و طول عمر را در سنین بالا افزایش می دهند. Nat Med 2018؛ 24:1246-56.

5. Serrano M، Lin AW، McCurrach ME، Beach D، Lowe SW. Ras انکوژنیک پیری زودرس سلولی مرتبط با تجمع p53 و p16INK4a را تحریک می کند. سلول 1997؛ 88:593-602.

6. Ewald JA، Desotelle JA، Wilding G، Jarrard DF. پیری ناشی از درمان در سرطان J Natl Cancer Inst 2010؛ 102: 1536-46.

7. Coppe JP، Desprez PY، Ktolica A، Campisi J. فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری: سمت تاریک سرکوب تومور. Annu Rev Pathol 2010؛ 5:99-118.

8. Demaria M، O'Leary MN، Chang J، Shao L، Liu S، Alimirah F، و همکاران. پیری سلولی باعث افزایش اثرات نامطلوب شیمی درمانی و عود سرطان می شود. Cancer Discov 2017؛ 7:165-76.

9. Coppe JP، Patil CK، Rodier F، Sun Y، Munoz DP، Goldstein J، و همکاران. فنوتیپ‌های ترشحی مرتبط با پیری، عملکردهای غیرخودران سلولی RAS انکوژن و سرکوب‌کننده تومور p53 را نشان می‌دهند. PLoS Biol 2008؛ 6:2853-68.

10. Tasdemir N, Banito A, Roe JS, Alonso-Curbelo D, Camiolo M, Tschaharganeh DF, et al. BRD4 بازسازی تقویت کننده را به نظارت ایمنی پیری متصل می کند. Cancer Discov 2016؛ 6:612-29.

11. Chien Y، Scuoppo C، Wang X، Fang X، Balgley B، Bolden JE، و همکاران. کنترل فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری توسط NF-kappaB باعث افزایش پیری و افزایش حساسیت شیمیایی می‌شود. Genes Dev 2011؛ ​​25:2125-36.

12. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LC, Douma S, van Doorn R, Desmet CJ, et al. پیری ناشی از انکوژن که توسط یک شبکه التهابی وابسته به اینترلوکین منتقل می شود. سلول 2008؛ 133: 1019-31.

13. Basisty N، Kale A، Jeon OH، Kuehnemann C، Payne T، Rao C، و همکاران. اطلس پروتئومی از ترشحات مرتبط با پیری برای توسعه نشانگرهای زیستی پیری. PLoS Biol 2020؛ 18:e3000599.

14. Hernandez-Segura A، de Jong TV، Melov S، Guryev V، Campisi J، Demaria M. پنهان کردن ناهمگنی رونویسی در سلول های پیر. Curr Biol 2017؛ 27:2652-60.

15. Xue W، Zender L، Miething C، Dickins RA، Hernando E، Krizhanovsky V، و همکاران. پیری و پاکسازی تومور با ترمیم p53 در کارسینوم های کبد موش تحریک می شود. طبیعت 2007؛ 445:656-60.

16. Kang TW، Yevsa T، Woller N، Hoenicke L، Wuestefeld T، Dauch D، و همکاران. نظارت بر پیری سلول‌های کبدی پیش بدخیم رشد سرطان کبد را محدود می‌کند. طبیعت 2011؛ ​​479:547-51.

17. Ovadya Y، Landsberger T، Leins H، Vadai E، Gal H، Biran A، و همکاران. اختلال در نظارت ایمنی باعث تسریع تجمع سلول های پیر و پیری می شود. Nat Commun 2018; 9:5435.

18. Lujambio A. پاک کردن، یا پاک نکردن (سلول های پیر)؟ مساله این است. Bioessays 2016؛ 38 Suppl 1: S56-64. 19. دی میتری D، Toso A، Chen JJ، Sarti M، Pinton S، Jost TR، و همکاران. سلول های میلوئیدی Gr{7}} نفوذ کننده تومور با پیری در سرطان مخالفت می کنند. طبیعت 2014؛ 515: 134-7.

20. Ruscetti M, Leibold J, Bott MJ, Fennell M, Kulick A, Salgado NR, et al. سمیت سلولی با واسطه سلول NK به کنترل تومور توسط ترکیب داروی سیتواستاتیک کمک می کند. علوم 2018؛ 362: 1416-22.

21. Llovet JM، Kelley RK، Villanueva A، Singal AG، Pikarsky E، Roayaie S، و همکاران. کارسینوم سلولهای کبد. Nat Rev Dis Primers 2021; 7:6.

22. Chiang DY، Villanueva A، Hoshida Y، Peix J، Newell P، Minguez B، و همکاران. دستاوردهای کانونی VEGFA و طبقه بندی مولکولی کارسینوم کبدی. Cancer Res 2008؛ 68: 6779-88.

23. Llovet JM، Castet F، Heikenwalder M، Maini MK، Mazzaferro V، Pinato DJ، و همکاران. ایمونوتراپی برای سرطان کبد Nat Rev Clin Oncol 2022؛ 19:151-72.

24. Sangro B، Sarobe P، Hervas-Stubbs S، Melero I. پیشرفت در ایمونوتراپی برای سرطان کبد. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2021؛ 18:525-43.

25. لوین ای جی. هدف قرار دادن پروتئین P53 برای درمان سرطان: تأثیر ترجمه ای تحقیق P53 Cancer Res 2022؛ 82:362-4.

26. Xiao Y، Chen J، Zhou H، Zeng X، Ruan Z، Pu Z، و همکاران. ترکیب مونوتراپی mRNA p53 با محاصره ایست بازرسی ایمنی، ریزمحیط ایمنی را برای درمان موثر سرطان برنامه ریزی مجدد می کند. Nat Commun 2022؛ 13:758.

27. Demir O، Barros EP، Offutt TL، Rosenfeld M، Amaro RE. نمای یکپارچه از پویایی، عملکرد و فعال سازی مجدد p53. Curr Opin Struct Biol 2021؛ 67:187-94.

28. سودا تی، لیو دی. تحویل ژن هیدرودینامیکی: اصول و کاربردهای آن. Mol Ther 2007؛ 15:2063-9.

29. Hoshida Y، Nijman SM، Kobayashi M، Chan JA، Brunet JP، Chiang DY، و همکاران. تجزیه و تحلیل ترانسکریپتوم یکپارچه زیرمجموعه های مولکولی مشترک سرطان کبدی انسان را نشان می دهد. Cancer Res 2009؛ 69: 7385-92.

30. Kaech SM, Hemby S, Kersh E, Ahmed R. پروفایل مولکولی و عملکردی تمایز سلول های CD8 T حافظه. Cell 2002؛ 111:837-51.

31. Bruix J، Cheng AL، Meinhardt G، Nakajima K، De Sanctis Y، Llovet J. عوامل پیش آگهی و پیش بینی کننده سود سورافنیب در بیماران مبتلا به سرطان کبد: تجزیه و تحلیل دو مطالعه فاز III. جی هپاتول 2017؛ 67: 999-1008.

32. Adrover JM، Aroca-Crevillen A، Crainiciuc G، Ostos F، Rojas-Vega Y، Rubio-Ponce A، و همکاران. "خلع سلاح" برنامه ریزی شده پروتئوم نوتروفیل، میزان التهاب را کاهش می دهد. Nat Immunol 2020؛ 21: 135-44.

33. Zeisberger SM, Odermatt B, Marty C, Zehnder-Fjallman AH, Ballmer-Hofer K, Schwendener RA. کاهش ماکروفاژهای مرتبط با تومور با واسطه کلودرونات-لیپوزوم: یک رویکرد درمانی ضد رگ زایی جدید و بسیار موثر Br J Cancer 2006؛ 95:272-81.

34. De Simone G، Andreata F، Bleriot C، Fumagalli V، Laura C، Garcia-Manteiga JM، و همکاران. شناسایی یک زیر مجموعه سلول کوپفر که قادر به برگرداندن اختلال عملکرد سلول T ناشی از پرایمینگ سلولی کبدی است. مصونیت 2021؛ 54: 2089-100.

35. Dann E, Henderson NC, Teichmann SA, Morgan MD, Marioni JC. آزمایش فراوانی دیفرانسیل روی داده‌های تک سلولی با استفاده از نمودارهای k نزدیک‌ترین همسایه. Nat Biotechnol 2022؛ 40:245-53.

36. Kim HD، Park S، Jeong S، Lee YJ، Lee H، Kim CG، و همکاران. 4-1BB وضعیت فعال سازی متمایز سلول های T CD8(+) نفوذگر تومور را در کارسینوم کبدی مشخص می کند. کبد شناسی 2020؛ 71:955-71.

37. Li Y، Wang Z، Jiang W، Zeng H، Liu Z، Lin Z، و همکاران. سلول های TNFRSF9(+) CD8(+) نفوذ کننده تومور، زیرمجموعه های مختلف کارسینوم سلول کلیوی سلول شفاف را با پیش آگهی و پاسخ ایمونوتراپی تعریف می کنند. Oncoimmunology 2020؛ 9:1838141.

38. Bindea G، Mlecnik B، Tosolini M، Kirilovsky A، Waldner M، Obenauf AC، و همکاران. پویایی فضایی-زمانی سلول های ایمنی داخل توموری چشم انداز ایمنی را در سرطان انسان نشان می دهد. مصونیت 2013؛ 39:782-95.

39. Kuang DM، Zhao Q، Peng C، Xu J، Zhang JP، Wu C، و همکاران. مونوسیت‌های فعال در استرومای اطراف تومور کارسینوم کبدی، امتیاز ایمنی و پیشرفت بیماری را از طریق PD-L1 تقویت می‌کنند. J Exp Med 2009؛ 206:1327-37.

40. Lu LG، Zhou ZL، Wang XY، Liu BY، Lu JY، Liu S، و همکاران. بلوک PD-L1 خواص ضد توموری ذاتی ماکروفاژهای گلیکولیتیک را در کارسینوم کبدی آزاد می کند. روده 2022؛ 71:2551-60.

41. Milanovic M، Fan DNY، Belenki D، Dabritz JHM، Zhao Z، Yu Y، و همکاران. برنامه ریزی مجدد مرتبط با پیری، ساقه سرطان را تقویت می کند. Nature 2018؛ 553:96-100.

42. یوسف H، Czupalla CJ، Lee D، Chen MB، Burke AN، Zera KA، و همکاران. خون سالخورده فعالیت پیش ساز عصبی هیپوکامپ را مختل می کند و میکروگلیا را از طریق سلول اندوتلیال مغز VCAM1 فعال می کند. Nat Med 2019؛ 25:988-1000.

43. Rapisarda V، Borghesan M، Miguela V، Encheva V، Snijders AP، Lujambio A، و همکاران. اینتگرین بتا 3 با فعال کردن مسیر TGF-بتا پیری سلولی را تنظیم می کند. Cell Rep 2017؛ 18:2480-93.

44. Jochems F, Thijssen B, De Conti G, Jansen R, Pogacar Z, Groot K, et al. سرطان SENESCopedia: ترسیم پیری سلول های سرطانی. Cell Rep 2021; 36:109441.

45. Perna F, Berman SH, Soni RK, Mansilla-Soto J, Eyquem J, Hamie M, et al. ادغام پروتئومیکس و ترانس کریپتومیکس برای درمان سیستماتیک گیرنده آنتی ژن کایمریک ترکیبی AML. سلول سرطانی 2017؛ 32:506-19.

46. ​​Hoare M، Ito Y، Kang TW، Weeks MP، Matheson NJ، Patten DA، و همکاران. NOTCH1 باعث تغییر بین دو ترشح مجزا در طول پیری می شود. Nat Cell Biol 2016؛ 18:979-92.

47. Castro F، Cardoso AP، Goncalves RM، Serre K، Oliveira MJ. اینترفرون گاما در تقاطع نظارت یا فرار ایمنی تومور. Front Immunol 2018; 9:847.

48. پلاتانیاس ال سی. مکانیسم های سیگنالینگ نوع I و نوع II با واسطه اینترفرون. Nat Rev Immunol 2005؛ 5:375-86.

49. Manguso RT, Pope HW, Zimmer MD, Brown FD, Yates KB, Miller BC, et al. غربالگری CRISPR در داخل بدن، Ptpn2 را به عنوان یک هدف ایمونوتراپی سرطان شناسایی می کند. Nature 2017؛ 547:413-8.

50. Song MM، Shuai K. سرکوبگر سیگنال دهی سیتوکین (SOCS) 1 و SOCS3 اما نه پروتئین های SOCS2 فعالیت های ضد ویروسی و ضد تکثیر با واسطه اینترفرون را مهار می کند. J Biol Chem 1998؛ 273: 35056-62.

51. Kleppe M, Soulier J, Asnafi V, Mentens N, Hornakova T, Knoops L, et al. PTPN2 به طور منفی JAK1 انکوژن را در لوسمی لنفوبلاستیک حاد سلول T تنظیم می کند. خون 2011؛ ​​117: 7090-8.

52. Zhou F. مکانیسم های مولکولی IFN-گاما برای تنظیم کردن پردازش و ارائه آنتی ژن کلاس I MHC. Int Rev Immunol 2009؛ 28:239-60.

53. مک کارتی ام کی، وینبرگ جی بی. ایمونوپروتئازوم و عفونت ویروسی: تنظیم کننده پیچیده التهاب. Front Microbiol 2015; 6:21.

54. یوشیهاما اس، ویجایان اس، صدیق تی، کوبایاشی کی اس. NLRC5/CITA: نقش کلیدی در نظارت بر ایمنی سرطان. روند سرطان 2017؛ 3:28-38.

55. Kalaora S، Lee JS، Barnea E، Levy R، Greenberg P، Alon M، و همکاران. بیان ایمونوپروتئازوم با پیش آگهی و پاسخ بهتر به درمان های ایمن در ملانوما همراه است. Nat Commun 2020; 11:896.

56. Efeyan A، Ortega-Molina A، Velasco-Miguel S، Herranz D، Vassilev LT، Serrano M. القای پیری وابسته به p{3}} توسط آنتاگونیست MDM2 nutlin-3 در سلول های فیبروبلاست موش اصل و نسب. Cancer Res 2007؛ 67:7350-7.

57. Hoekstra ME، Bornes L، Dijkgraaf FE، Philips D، Pardieck IN، Toebes M، و همکاران. مدولاسیون از راه دور سلول های تومور اطراف توسط IFNgamma ترشح شده توسط سلول T CD8 (+). Nat Cancer 2020؛ 1:291-301.

58. Ruscetti M, Morris JPt, Mezzadra R, Russell J, Leibold J, Romesser PB, et al. بازسازی عروقی ناشی از پیری، آسیب‌پذیری‌های درمانی را در سرطان پانکراس ایجاد می‌کند. سلول 2020؛ 181:424-41.

59. Dighe AS, Richards E, Old LJ, Schreiber RD. افزایش رشد in vivo و مقاومت در برابر رد سلول های تومور که گیرنده های گاما IFN منفی غالب را بیان می کنند. مصونیت 1994؛ 1:447-56.

60. Gao J، Shi LZ، Zhao H، Chen J، Xiong L، He Q، و همکاران. از دست دادن ژن های مسیر گاما IFN در سلول های تومور به عنوان مکانیسم مقاومت در برابر درمان ضد CTLA{2}}. سلول 2016؛ 167:397-404.

61. Paffenholz SV، Salvagno C، Ho YJ، Limjoco M، Baslan T، Tian S، و همکاران. القای پیری پاسخ به شیمی درمانی و ایمونوتراپی را در مدل های پیش بالینی سرطان تخمدان دیکته می کند. Proc Natl Acad Sci USA 2022;119:e2117754119.

62. Shao DD، Xue W، Krall EB، Bhutkar A، Piccioni F، Wang X، و همکاران. KRAS و YAP1 برای تنظیم EMT و بقای تومور همگرا می شوند. سلول 2014؛ 158:171-84.

63. ژو سی، کیم کی، وانگ ایکس، بارتولوم آ، سالومائو ام، دونجیوانی پی، و همکاران. فعال شدن Notch هپاتوسیت باعث ایجاد فیبروز کبدی در استئاتوهپاتیت غیر الکلی می شود. Sci Transl Med 2018؛ 10:eaat0344.

64. Susaki EA، Tainaka K، Perrin D، Yukinaga H، Kuno A، Ueda HR. پروتکل های پیشرفته CUBIC برای پاکسازی و تصویربرداری کل مغز و کل بدن. Nat Protoc 2015؛ 10:1709-27.

65. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: یک صاف کننده انعطاف پذیر برای داده های توالی Illumina. بیوانفورماتیک 2014؛ 30:2114-20. 66. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: تراز کننده فوق سریع جهانی RNA-seq. بیوانفورماتیک 2013؛ 29:15-21.

67. Anders S، Pyl PT، Huber W. HTSeq-یک چارچوب پایتون برای کار با داده های توالی یابی با توان عملیاتی بالا. بیوانفورماتیک 2015؛ 31:166-9.

68. Love MI، Huber W، Anders S. برآورد تعدیل شده تغییر برابر و پراکندگی برای داده های RNA-seq با DESeq2. Genome Biol 2014؛ 15:550.

69. Chen EY، Tan CM، Kou Y، Duan Q، Wang Z، Meirelles GV، و همکاران. Enrichr: ابزار تجزیه و تحلیل غنی سازی لیست ژن HTML5 تعاملی و مشارکتی. BMC Bioinf 2013؛ 14:128.

70. فروتن ام، بووا دی دی، لیو آر، هوران کی، کرسونز جی، دیویس ام جی. امتیاز دهی تک نمونه از فنوتیپ های مولکولی. BMC Bioinf 2018؛ 19:404.

71. Binder JX، Pletscher-Frankild S، Tsafou K، Stolte C، O'Donoghue SI، Schneider R، و همکاران. محفظه ها: وحدت و تجسم شواهد محلی سازی درون سلولی پروتئین. پایگاه داده (آکسفورد) 2014؛ 2014: bau012.

72. شبکه تحقیقاتی اطلس ژنوم سرطان. توصیف ژنومی جامع و یکپارچه کارسینوم کبدی سلول 2017; 169:1327-41.

73. Colaprico A, Silva TC, Olsen C, Garofano L, Cava C, Garolini D, et al. TCGAbiolinks: یک بسته R/Bioconductor برای تجزیه و تحلیل یکپارچه داده های TCGA. Nucleic Acids Res 2016؛ 44: e71.

74. Hanzelmann S، Castelo R، Guinney J. GSVA: تجزیه و تحلیل تنوع مجموعه ژن برای داده های ریزآرایه و RNA-seq. BMC Bioinf 2013؛ 14:7.

75. Bankhead P، Loughrey MB، Fernandez JA، Dombrowski Y، McArt DG، Dunne PD، و همکاران. QuPath: نرم افزار منبع باز برای تجزیه و تحلیل تصویر آسیب شناسی دیجیتال. Sci Rep 2017; 7:16878.

76. Bernstein NJ، Fong NL، Lam I، Roy MA، Hendrickson DG، Kelley DR. انفرادی: شناسایی دوگانه در RNA-Seq تک سلولی از طریق یادگیری عمیق نیمه نظارت شده. Cell Syst 2020؛ 11:95-101.

77. Satija R، Farrell JA، Gennert D، Schier AF، Regev A. بازسازی فضایی داده های بیان ژن تک سلولی. Nat Biotechnol 2015؛ 33:495-502.

78. McInnes L، Healy J، Melville J. UMAP: تقریب منیفولد یکنواخت و طرح ریزی برای کاهش ابعاد. arXiv: 1802.03426 [پیش چاپ]. 2018. موجود در: https://doi.org/10.48550/arXiv.1802.03426.

79. Traag VA، Waltman L، Van Eck NJ. از Louvain تا Leiden: تضمین جوامع به خوبی مرتبط. Sci Rep 2019; 9:5233.

80. Korsunsky I، Millard N، Fan J، Slowikowski K، Zhang F، Wei K، و همکاران. ادغام سریع، حساس و دقیق داده های تک سلولی با هارمونی. Nat Methods 2019؛ 16:1289-96.