ترانس کریپتومیکس تک سلولی، فعل و انفعالات سلول-سلول فیلتر کلیه را پس از آسیب اولیه و انتخابی پودوسیت آشکار می کند.
Jul 01, 2024
بیماری های مزمن کلیه (CKDs)هنوز 700 میلیون نفر را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار می دهدخاصفیج درمان هاکمبود دارند.1 بسیاریبیماری های کلیوی منشا می گیرندnگلومرول،فیواحد اندازه گیری کلیه گلومرول متشکل از (i) پودوسیت ها، سلول های پست میتوتیک تخصصی با فرآیندهای مفصلی در پا هستند که با تشکیل دیافراگم های شکاف و پیچیده شدن اطراف مویرگ های گلومرولی، به هم متصل می شوند. (ب) سلول های اندوتلیال، که در مقابل پودوسیت ها روی یک غشای پایه گلومرولی مشترک (GBM) قرار دارند. (iii) سلول های مزانژیال، که ماتریکسی را تشکیل می دهند که پشتیبانی ساختاری برای گلومرول فراهم می کند. و (IV) سلول های اپیتلیال جداری (PECs)، که کپسول بومن را پوشانده اند.2 آسیب پودوسیت، به ویژه، منجر به بسیاری از بیماری های کلیوی بسیار شایع و پیشرونده، از جمله بیماری کلیوی دیابتی (DKD)، گلومرولواسکلروزیس سگمنتال کانونی (FSGS) و سندرم نفروتیک (هم ایدیوپاتیک و هم ژنتیکی) می شود. الگوی متعارف آسیب منجر به از بین رفتن فرآیندهای بین انگشتی پا می شود که به عنوان پاکسازی فرآیند پا شناخته می شود، که در اثر بازآرایی اسکلت سلولی اکتین ایجاد می شود. این محو شدن منجر به اختلال در دیافراگم شکاف، مانع فیزیکی که به عنوان یکفیlter، به دنبال آن جدا شدن یا مرگ سلول های بدن.3,4 از سوی دیگر، علاوه بر پودوسیت های دست نخورده، تشکیل و نگهداری ازگلومرولیفیسد ltrationنیاز دارندارتباط درون گلومرولی، به شدت توسط یک سری مکانیسم های سیگنال دهی اتوکرین و پاراکرین کنترل می شود. به عنوان مثال، فاکتور رشد اندوتلیال عروقی A (VEGFA) یک سیگنال پیش از بقا برای سلول های اندوتلیال ترشح شده توسط سلول های پادوسیت است، و فاکتور رشد مشتق شده از پلاکت B (PDGFB) یک سیگنال پیش از بقا برای سلول های مزانژیال ترشح شده توسط سلول های اندوتلیال است.5 اختلال در این فعل و انفعالات سلول-سلول اغلب در بسیاری از بیماری های گلومرولی، از جمله FSGS و DKD مشاهده می شود.6 بنابراین، شناسایی اولین تغییرات مخرب در گلومرول ممکن است اهداف جدید و فرصتی برای بهینه سازی موفقیت درمانی برایدرمان بیماری های کلیوی.
گیاهان جدید برایدرمان بیماری های کلیوی
با پشتیبانی موسسه ملی دیابت و بیماری های گوارشی و کلیوی NIH، DK103658، DK099465، و DK095045 (AG). ارتباطات درون گلومرولی، به شدت توسط یک سری مکانیسم های سیگنال دهی اتوکرین و پاراکرین کنترل می شود. به عنوان مثال، فاکتور رشد اندوتلیال عروقی A (VEGFA) یک سیگنال برای بقای سلولهای اندوتلیال ترشح شده توسط سلولهای پادوسیت است، و فاکتور رشد مشتق شده از پلاکت B (PDGFB) سیگنالی برای بقای سلولهای مزانژیال ترشح شده توسط سلولهای اندوتلیال است.5 اختلال در این سلولها فعل و انفعالات سلولی اغلب در بسیاری از بیماری های گلومرولی، از جمله FSGS و DKD مشاهده می شود.
توالی یابی RNA تک سلولی (scRNAseq) توانایی مطالعه انواع سلول های منفرد از بافت های پیچیده و حالات سلولی را پس از اختلالات خاص متحول کرده است. مطالعات اخیر scRNAseq در کلیه، بینشی را در مورد پروفایل های رونویسی انواع سلول های کلیه در موش های سالم فراهم کرده است. نمونه های انسانی و همچنین در برخی از حالت های بیماری، از جمله DKD و نفریت لوپوس. 9e12 با این حال، مطالعات دقیق در مورد وضعیت سلول های گلومرولی توسط تعداد کمی از سلول های موجود برای تجزیه و تحلیل محدود شده است. علاوه بر این، اولین تغییرات نوع خاص سلولی که در تمام سلولهای گلومرولی در آسیب سلولی رخ میدهد، پایش نشدهاند و هنوز تعریف نشدهاند.
فرسایش پودوسیت از طریق حذف القایی خاص پودوسیت یک پروتئین درون زا ضروری، CTCF، منجر به بیماری کلیوی پروتئینوری پیشرونده و CKD می شود. از لحاظ تاریخی، مدل های موش CKD با القای آسیب کلیوی توسط سموم اگزوژن یا مداخلات جراحی، سیستم های غیربهینه که کمتر از آنها هستند، تولید شده اند. خلاصه کردن تغییرات مکانیکی متوالی حذف CTCF، یک مولکول درونزای ضروری، منجر به از دست دادن سریع سلولهای بدن، آلبومینوری پیشرونده شدید، تغییرات متابولیسم مواد معدنی استخوان، نارسایی کلیه و مرگ زودرس میشود. مدل حذف القایی CTCF اختصاصی پودوسیت (iCTCFpod / ) فرصت منحصر به فردی را برای مطالعه فراهم میکند. تغییرات در فعل و انفعالات سلول-سلول داخل گلومرولی در نتیجه آسیب ناشی از پودوسیت. بیان Podocyte CTCF در اولین نقطه زمانی، در 1 هفته از القای Cre با واسطه داکسی سایکلین در iCTCFpod / موش غیرقابل تشخیص است. 13 از دست دادن قابل توجه و پیشرونده پودوسیت، همانطور که با تجزیه و تحلیل بافت شناسی اندازه گیری می شود، در 2 هفته پس از القای Cre شروع می شود. در مطالعه کنونی، تجزیه و تحلیل دقیقی در 1-نقطه زمانی هفته انجام شد تا اولین تغییرات در فعل و انفعالات سلول-سلول درون گلومرولی که در اثر آسیب سلولی که در نهایت منجر به CKD میشود، شناسایی شود.
مواد و روش ها
مراقبت از حیوانات
این مطالعه توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات در بیمارستان بریگهام و زنان، دانشکده پزشکی هاروارد تایید شد. تمام مطالعات حیوانی مطابق با دستورالعملهایی که توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات در بیمارستان زنان و بریگهام، دانشکده پزشکی هاروارد ایجاد و تأیید شده است، انجام شد. موشهای iCrepod-Ctcfwt/fl همانطور که قبلاً توضیح داده شد13 تولید شدند و برای تولید موشهای iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) و iCrepod-Ctcfwt/wt [نوع وحشی (WT)] همخون شدند. در این مطالعه از هر دو موش نر و ماده استفاده شد. داکسی سایکلین (4 گرم در لیتر) (Sigma D9891) به طور مداوم در آب آشامیدنی حاوی ساکارز (50 گرم در لیتر) (VWR BDH0308) به موش iCTCFfl/fL (تولید iCTCFpod / موش) و موش WT همزاد (6 تا 8) تجویز شد. هفتگی در شروع استفاده از داکسی سایکلین) برای تحریک بیان Cre به طور خاص در پودوسیت ها.
غنی سازی گلومرولی از کل کلیه
موشهای iCTCFpod / و WT پس از 1 هفته درمان با داکسیسایکلین قربانی شدند و کلیهها به سرعت تشریح و با محلول نمک متعادل هنکس سرد شسته شدند (کاتالوگ شماره 14170112، Thermo Scientific، Waltham, MA). پس از برداشتن کپسول های کلیه، گلومرول ها در دمای 4 درجه سانتیگراد با استفاده از روش الک14 با الک های 180- میلی متر، 75- میلی متر و 53- میلی متر غنی شدند. بخشهای غنیشده با گلومرولی جمعآوریشده از غربال 53- میلیمتری با محلول نمک متعادل هنکس یخسرد شسته و روی یخ قرار گرفتند.
تهیه سوسپانسیون های تک سلولی
آماده سازی کتابخانه و توالی یابی تک سلولی
سلولهای منفرد از طریق پلتفرم تک سلولی 10 کرومیوم 30 با استفاده از کیتهای کتابخانه تک سلولی 30 کرومیوم، مهره ژل و کیت چیپ (10 ژنومیکس، Pleas anton، CA)، به دنبال پروتکل سازنده پردازش شدند. به طور خلاصه، 10،{5}} سلول به هر کانال یک تراشه اضافه شد تا به دانههای ژل در امولسیون در ابزار کروم تقسیم شود، سپس لیز سلولی و رونویسی معکوس بارکد RNA در قطرات انجام شد. شکست امولسیون با تقویت، تکه تکه شدن و افزودن آداپتور و شاخص نمونه دنبال شد. کتابخانهها با هم ترکیب شدند و در Illumina HiSeq توالیبندی شدند.
واکنش زنجیره ای هیبریداسیون
همه واکنشهای زنجیرهای هیبریداسیون (HCR) v3 (پروب، سنجاق سر، و بافر) از Molecular Technologies (Pasadena، CA) خریداری شدند. بخش های نازکی از بافت (1{19}} متر) در 24-صفحات کف شیشه ای چاهی (شماره کاتالوگ 82050-898، VWR، Radnor، PA) با پوشش 1:5 نصب شد{{38} } رقت (3-aminopropyl)triethoxysilane (شماره کاتالوگ 440140، Sigma-Aldrich). محلول های زیر به بافت اضافه شد: فرمالین 10% (شماره کاتالوگ 100503- 120، VWR) به مدت 15 دقیقه، دو شستشو 1 PBS (شماره کاتالوگ AM9625، Thermo Fisher Scientific)، یخ سرد 70% EtOH در 20 C به مدت 2 ساعت (تا یک شب)، سه شستشوی 5 سیترات سدیم نمکی با 0.2% Tween{21}} (SSCT) (شماره کاتالوگ 15557044، Thermo Fisher Scientific)، بافر هیبریداسیون (Molecular Technologies) به مدت 10 دقیقه، کاوشگر در بافر هیبریداسیون یک شبه، چهار شستشو بافر شستشو (Molecular Technologies) به مدت 15 دقیقه، سه شستشو 5 SSCT، بافر تقویت (Molecular Technologies) به مدت 10 دقیقه و سه شستشو 15 دقیقه با 5 SSCT (1:10،{31). }} DAPI، شماره کاتالوگ TCA2412-5MG، VWR) در شستشوی دوم. گیره های سر در یک شب در بافر تقویت حرارت دناتوره شدند. نمونه ها در 5 SSCT ذخیره و تصویربرداری شدند. تصویربرداری روی یک دیسک کانفوکال در حال چرخش (Yokogawa W1 در Nikon Eclipse Ti) که با نرمافزار NIS-elements AR کار میکند، انجام شد. تجزیه و تحلیل و پردازش تصویر بر روی نرم افزار ImageJ Fiji نسخه 2.1.0/1.53c (NIH, Bethesda, MD؛ http://imagej.nih.gov/ij) انجام شد.
پردازش داده ها و کنترل کیفیت
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >75 درصد از سلول های طبقه بندی شده به عنوان دوتایی با اطمینان بالا از تجزیه و تحلیل بیشتر حذف شدند. سلولهای باقیمانده طبقهبندی شده به عنوان دوتایی با اطمینان بالا نیز از تجزیه و تحلیل بیشتر حذف شدند. تجزیه و تحلیل شامل کاهش تعداد سلول ها برای توضیح این تفاوت بود. به عنوان مثال، اگر تعداد سلولهای WT کمتری در یک نوع سلول خاص وجود داشته باشد، یک نمونه تصادفی از سلولهای iCTCF برابر با تعداد سلولهای WT برای تجزیه و تحلیل بیان افتراقی استفاده میشود.
خوشه بندی بدون نظارت و کاهش ابعاد
تنظیمات پیشفرض در بسته Seurat R 16 نسخه 3.{2}} برای عادیسازی (NormalizeData) تعداد بیان ژن، شناسایی ژنهای متغیر (FindVariableGenes)، یافتن لنگرهای یکپارچهسازی (FindIntegrationAnchors) و یکپارچهسازی نمونهها (IntegrateData) استفاده شد. . تغییرات ناخواسته به دلیل تعداد UMI و نسبت نقشه برداری خوانده شده به ژن های میتوکندری (ScaleData) رخ داده است. کاهش ابعاد با استفاده از تجزیه و تحلیل مؤلفه های اصلی (RunPCA) روی ژن های بسیار متغیر انجام شد. تابع PCElbowPlot() برای تشخیص اجزای اصلی برای تجزیه و تحلیل بیشتر استفاده شد. برای خوشهبندی همه سلولها، 40 مؤلفه اصلی اول به اندازه کافی همه واریانس را دربرگرفتند. خوشه های مولکولی متمایز با استفاده از پارامترهای پیش فرض (FindClusters) و وضوح 0.4 (FindNeighbors) شناسایی شدند. داده ها پس از زیرمجموعه کردن سلول های گلومرولی، همانطور که در بالا توضیح داده شد، پردازش و مقیاس بندی شدند. در مجموع 30 مؤلفه اصلی برای خوشه بندی پایین دست با وضوح 0.3 (FindNeighbors) استفاده شد.
طبقه بندی نوع سلول
ژنهای غنیشده با خوشه یا نشانگر با استفاده از آزمون مجموع رتبهای Wilcoxon (FindAllMarkers) برای بیان افتراقی ژنها در سلولهای خوشهای در مقابل همه سلولهای دیگر و انتخاب ژنهایی که از مقدار P تنظیمشده (نرخ کشف نادرست) برش {{1} عبور میکنند، محاسبه شدند. }}.05 به عنوان نماینده خوشه. هویت خوشهای با مقایسه ژنهای مبتنی بر داده با فهرستی از ژنهای انتخابشده توسط ادبیات برای انواع سلولهای بالغ کلیه تعیین شد.
تجزیه و تحلیل بیان ژن دیفرانسیل
تجزیه و تحلیل بیان دیفرانسیل زوجی در Seurat (FindMarkers) با آستانه تغییر log fold تنظیم شده روی {{0}}.01 و پارامترهای پیشفرض برای تجزیه و تحلیل بیان دیفرانسیل بین iCTCFpod / و سلولهای WT در یک خوشه خاص استفاده شد. در FindMarkers، ident.1 روی iCTCFpod / سلولهای clusterspecific و ident.2 روی سلولهای WT مربوط به خوشه تنظیم شد. ژنهای با P <0.05 معنیدار در نظر گرفته شدند.
تجزیه و تحلیل بیش از حد
تجزیه و تحلیل بازنمایی بیش از حد برای تعیین اینکه آیا هر یک از عملکردها یا فرآیندهای بیولوژیکی شناخته شده بیش از حد نشان داده شده یا غنی شده است یا خیر در لیست(های) ژنهای بیان شده متفاوت است یا خیر. پارامترهای پیشفرض به استثنای ont Z BP، pvaluecutoff Z 0.25 و qvaluecutoff Z 0.25 استفاده شد. سپس از پکیج R (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot، آخرین دسترسی در 30 آگوست 2021) استفاده شد، بهویژه تابع emapplot، برای تجسم نتایج غنیسازی با رسم عبارتهای غنیسازی برتر.
تجزیه و تحلیل گیرنده لیگاند
iTALK19 برای نقشهبرداری گیرندهها به لیگاندهایی که به طور متفاوت در iCTCFpod/podocytes بیان میشوند، استفاده شد. به طور خاص، rawParse برای محاسبه میانگین بیان هر ژن، با استفاده از داده های مقیاس شده از Seurat استفاده شد. FindLR با استفاده از میانگین شمارش نوع داده Z برای شناسایی جفت لیگاند و گیرنده استفاده شد. جفت لیگاند و گیرنده مورد علاقه با استفاده از پارامترهای پیشفرض LRPlot رسم شد. ضخامت خطوط بیانگر میانگین نسبی لیگاند و اندازه نوک پیکان بیانگر میانگین نسبی گیرنده است.
تجزیه و تحلیل NicheNet
بسته R NicheNet20 برای پیشبینی فعل و انفعالات گیرنده لیگاندری که ممکن است باعث تغییرات بیان ژن در نوع سلول مورد نظر شود، استفاده شد. همه خوشه های پودوسیت و همه خوشه های اندوتلیال برای این تجزیه و تحلیل ترکیب شدند. همه پارامترهای پیشفرض به استثنای تعیین آستانهی برش پایینتر از 0.11 برای آمادهسازی_لیگان_هدف{5}}تجسم استفاده شد. پردازش تصویر HCR و کمی سازی تصاویر با استفاده از نرم افزار ImageJ2 (NIH، Bethesda، MD؛ http://imagej.nih.gov/ij) پردازش شدند. برای فایلهای ImageJ، نسخه 2.1.0/1.53c استفاده شد (http://imagej.net/ Contributors (آخرین دسترسی در 2 آگوست 2020). فایلهای خام ND2 با استفاده از روش Rolling Ball در پسزمینه کسر شدند (غلتاندن Z 50 پشته کشویی) سپس میانگین شدت تصاویر پشته Z نمایش داده شد و کانال های تصویر به طور جداگانه تقسیم شدند و نسخه 3.1.5 CellProfiler (موسسه گسترده MIT و هاروارد، کمبریج، MA) 21 برای تقسیم بندی سلولی بر اساس شدت فلورسانس استفاده شد. از کانال DAPI و برای اندازه گیری شدت فلورسانس یکپارچه در بقیه کانال ها، چهار WT و چهار موش iCTCF برای تجزیه و تحلیل آماری از 40 تصویر انجام شد.
خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:
ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com
واتساپ/تلفن:+86 15292862950
خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
برای دریافت عصاره طبیعی سیستانچ ارگانیک با 25% اکیناکوزید و 9% آکتئوزید برای عملکرد کلیه اینجا را کلیک کنید
