پیری پوست یک پدیده بیولوژیکی پیچیده به دلیل کاهش فیزیولوژیکی است

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:هدف از این مطالعه بررسی اثر بازدارندگی عصاره میوه واشنگتنیا فیلیفرا بر روی آنزیم های مرتبط با پیری پوست بود. عصاره های پالپ مهار آنزیمی قابل توجهی را اعمال نکردند در حالی که عصاره دانه W.filifera فعالیت های ضد الاستاز، ضد کلاژناز و ضد تیروزیناز را نشان می دهد. تیروزیناز خفیف مهار شد در حالی که یک اثر قوی تر با توجه به مهار الاستاز و کلاژناز مشاهده شد. عصاره های الکلی نتایج بهتری نسبت به عصاره های آبی ارائه کردند. در میان آنها، عصاره متانولی نشان داد که فعالیت های مهاری برجسته آنزیمی ارزش IC5o برای الاستاز و کلاژناز قابل مقایسه و حتی بهتر از ترکیب مرجع است. حالت مهار فعال‌ترین عصاره‌ها با استفاده از آنالیز نموداری Lineweaver-Burk مورد بررسی قرار گرفت. عصاره بذر W.filifera نیز از نظر اثر محافظتی عکس با معادله منصور مورد بررسی قرار گرفت و فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره W.filifera در سلول‌های تحت استرس اکسیداتیو مورد بررسی قرار گرفت. برای ارزیابی ایمنی عصاره، اثر بر زنده ماندن سلولی سلول‌های کراتینوسیت انسانی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.سیستانچ امپراتوری از دست رفتهعصاره متانولی بهترین اثر محافظتی از عکس و فعالیت آنتی اکسیدانی را در یک سیستم سلولی بدون اثر سیتوتوکسیک ارائه داد. نتایج کلی نشان می‌دهد که عصاره‌های W.filifera منابع امیدوارکننده‌ای از ترکیبات فعال زیستی هستند که می‌توانند در تهیه‌های آرایشی و دارویی استفاده شوند.

کلید واژه ها:مهار آنزیم؛ کلاژناز؛ الاستاز؛ تیروزیناز؛ عصاره های گیاهی؛ دانه؛ پیری پوست؛ فیلیفرای واشنگتنیا

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

پیری پوست یک پدیده بیولوژیکی پیچیده است که به دلیل کاهش فیزیولوژیکی در عملکرد پوست و چندین عامل محیطی بیرونی مانند اشعه ماوراء بنفش، مواد شیمیایی و گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) است. پوست بزرگترین و در معرض ترین قسمت بدن است و قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش خورشیدی یکی از مهم ترین عوامل استرس زای خارجی است: پیری پوست ناشی از عکس و استرس اکسیداتیو. ROS ناشی از تابش UV می تواند مسیرهای مولکولی پیچیده ای را آغاز کند، از جمله فعال شدن آنزیم هایی که پروتئین های ماتریکس خارج سلولی (ECM) را در درم تجزیه می کنند و یکپارچگی پوست را تغییر می دهند [1]. یکی از ویژگی های اصلی پیری پوست در واقع از دست دادن ساختار ECM است که شامل پروتئین های متعددی از جمله کلاژن و الاستین است که همگی نقش مهمی در حفظ خاصیت ارتجاعی پوست دارند [2]. تخریب ECM عمدتاً به دلیل افزایش فعالیت آنزیم های پروتئولیتیک مانند کلاژناز و الاستاز است. مهار این فعالیت های آنزیمی توسط ترکیبات گیاهی طبیعی ممکن است یک رویکرد امیدوارکننده برای جلوگیری از پیری پوست باشد [3]. کلاژناز (EC 3.4.24.3) به خانواده متالوپروتئینازهای ماتریکس تعلق دارد و می تواند ناحیه سه مارپیچ کلاژن را تحت شرایط فیزیولوژیکی تخریب کند.کسری فلاونوئید خالص میکرونیزه 1000 میلی گرم استفاده می کندکلاژن جزء فیبری ECM و پروتئین ساختاری اصلی در پوست انسان است که از استخوان ها، تاندون ها، رباط ها و رگ های خونی پشتیبانی می کند. الاستاز (EC3.4.21.36) یک آنزیم پروتئولیتیک است که در تخریب فیزیولوژیکی الاستین، پروتئین ECM مسئول خاصیت ارتجاعی پوست نقش دارد. افزایش فعالیت الاستاز در چندین بیماری، به عنوان مثال، پسوریازیس، درماتیت، فرآیندهای التهابی و پیری زودرس پوست که ارتباط نزدیکی با ایجاد چین و چروک دارند، مشاهده شده است.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

علاوه بر این، یکی از تغییرات عمده مرتبط با چین و چروک در افراد مسن، پیدایش لکه های پرپیگمانته است که به عنوان لنتیگوی پیری یا لکه های پیری نیز شناخته می شود. آنها به دلیل فعالیت آنزیم دیگری به نام تیروزیناز مرتبط با پیری مستقیماً با رنگدانه ناهموار مرتبط هستند. تیروزیناز (EC 1.14.18.1) آنزیم محدود کننده سرعت در متابولیسم ملانین است. این هیدروکسیلاسیون L-تیروزین را به 3،{8}}دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA) کاتالیز می کند و به دنبال آن اکسیداسیون L-DOPA به دوپاکینون انجام می شود. پلیمریزاسیون اکسیداتیو مشتقات دوپاکینون باعث ایجاد ملانین می شود [5]. سنتز رنگدانه های ملانین یک فرآیند فیزیولوژیکی است که با جذب اشعه ماوراء بنفش خورشید نقش مهمی در جلوگیری از آسیب پوستی ناشی از اشعه ماوراء بنفش دارد. علیرغم مزایای آن، تولید بیش از حد یا تجمع غیرطبیعی ملانین باعث ایجاد مشکلات پوستی مانند لکه‌های سنی معمولی می‌شود. از آنجایی که پوست نمایان‌ترین عضو بدن است، بروز زودرس چین و چروک و پرپیگمانتاسیون نیز می‌تواند باعث ناراحتی عاطفی برای برخی افراد شود.

بنابراین، مهارکننده‌های تمام آنزیم‌های توصیف‌شده در بالا ممکن است ترکیبات مهم فزاینده‌ای را در لوازم آرایشی و داروها برای جلوگیری از پیری پوست نشان دهند [6]. محصولات گیاهی طبیعی می توانند منبع امیدوار کننده ای از ترکیبات زیست فعال باشند. عصاره‌ها دارای عملکردهای مفید متعددی مانند مهار آنزیم‌های مرتبط با پیری و ظرفیت از بین بردن رادیکال‌های آزاد هستند.

در کار قبلی ما ظرفیت آنتی اکسیدانی و چندین فعالیت بیولوژیکی عصاره دانه W.filifera را شرح دادیم [7]. واشنگتن filifera (Lindl.) H. Wendl.، که معمولا به عنوان نخل بادبزن کالیفرنیا یا نخل بادبزن بیابانی شناخته می شود، یک درخت نخل همیشه سبز بومی جنوب کالیفرنیا، آریزونا، مکزیک و مناطق بیابانی است.اوتفلاوونوئیداین نخل با ارتفاع 15-20 متر خرما تولید نمی کند اما میوه های خوراکی شیرین و خوش طعمی دارد. این توت ها دارای یک دانه قهوه ای بسیار بزرگ هستند که توسط یک خمیر نازک احاطه شده است (شکل 1). W.filifera در مورد استفاده از آن به عنوان منبع بالقوه الیاف سلولزی جدید [8] و ارزش غذایی میوه های آن [9] مورد مطالعه قرار گرفته است. ترکیب فنلی و فعالیت آنتی اکسیدانی اندام های هوایی نیز گزارش شده است [10]. در مطالعه قبلی خود، فعالیت آنتی اکسیدانی خوب W را گزارش کردیم.ویتامین C پوریتانسعصاره دانه فیلیفرا، که به نظر می رسد منبعی از مولکول های فنلی و فلاونوئیدی باشد[7]. همین عصاره ها اثر مهاری بر روی آنزیم های گزانتین اکسیداز و کولین استراز، که به ترتیب نشان دهنده آنزیم های کلیدی در درمان نقرس و بیماری آلزایمر هستند، اعمال کردند.

هدف از این کار گسترش خصوصیات این گیاه و ارزیابی پتانسیل استفاده از عصاره های آن به عنوان یک عامل ضد پیری بود. بنابراین، عصاره خمیر و دانه به دلیل فعالیت های بازدارنده آنها نسبت به فعالیت الاستاز، کلاژناز و تیروزیناز مورد بررسی قرار گرفت، زیرا آنها آنزیم های هدف کلیدی برای پیشگیری و درمان پیری پوست را نشان می دهند. علاوه بر این، عصاره‌های W.filifera که بهترین فعالیت‌های امیدوارکننده را نشان می‌دهند برای سمیت سلولی در شرایط آزمایشگاهی، فعالیت آنتی‌اکسیدانی سلولی و اثرات محافظتی از عکس مورد بررسی قرار گرفتند.

2. نتایج و بحث

2.1. مهار آنزیم

پالپ و عصاره بذر W. filifera ابتدا در غلظت 50 ug/mL مورد آزمایش قرار گرفتند.سیستانچهتمام عصاره های پالپ مهار آنزیمی قابل توجهی را اعمال نکردند (داده ها نشان داده نشده است). فعالیت های بازدارندگی آنزیمی عصاره دانه محاسبه و به صورت نیمه حداکثر غلظت بازدارنده بیان شد (همچنین). جدول 1 مقادیر ICso بدست آمده از عصاره بذر را در مقایسه با بازدارنده های استاندارد به منظور ارزیابی قدرت بازدارندگی نمونه ها نشان می دهد. همانطور که مشاهده شد، تمام عصاره ها به طور ضعیفی فعالیت تیروزیناز را با مقادیر ICso بالاتر از مقادیر استاندارد کوجیک اسید مهار می کنند. مهار بهتری در برابر فعالیت های الاستاز و کلاژناز مشاهده شد و عصاره های اتانولی (EEG و EES) و متانولی (MEG و MES) بهترین اثرات را داشتند. فعالیت مهاری این نمونه ها در برابر الاستاز مشابه بود. مقادیر ICso از 10.75 تا 19.75 میکروگرم در میلی لیتر متغیر بود و با کنترل مثبت (اولئانولیک اسید؛ ICso=11.75 میکروگرم در میلی لیتر) قابل مقایسه بود.

در عوض، فعالیت کلاژناز به شدت توسط عصاره ها مهار شد، که قدرت بالاتری نسبت به گالات اپی گالوکاتچین استاندارد نشان داد، ICso تا سه برابر کمتر از کنترل مثبت بود. با توجه به اینکه عصاره‌ها مخلوطی از چندین ترکیب بودند، غلظت تک مولکول‌های فعال حتی کمتر از مقدار IC50 بود، بنابراین عصاره‌ها را به منابع امیدوارکننده‌تر ترکیبات بازدارنده تبدیل کرد.

2.2. تجزیه و تحلیل جنبشی توسط Lineweaver-Burk Plot

ما توجه خود را بر روی عصاره های اتانولی و متانولی متمرکز کردیم تا نحوه مهار این آنزیم ها را بررسی کنیم زیرا آنها تأثیر بهتری در برابر فعالیت های الاستاز و کلاژناز داشتند. سینتیک بازداری با نمودار متقابل دوگانه Lineweaver-Burk تعیین شد. سنجش ها با افزایش غلظت سوبسترای مربوطه در غیاب و حضور عصاره ها در غلظت های مختلف انجام شد.

جدول 2 نشان می دهد که EEG و EES به عنوان مهارکننده های غیررقابتی در برابر الاستاز عمل می کنند. در واقع، آنالیز سینتیکی این عصاره ها خانواده ای از خطوط موازی را برای افزایش غلظت عصاره ایجاد کرد (شکل 2A,B). ثابت تعادل (Krs) از ترسیم مجدد وقفه ها (1/Vmax) در مقابل غلظت بازدارنده محاسبه شد که به ترتیب برای EEG و EES مقدار 3.91 و 8.89 میکروگرم در میلی لیتر به دست آمد. نحوه مهار عصاره های متانولی در واقع نشان داد که این عصاره ها به عنوان یک بازدارنده غیررقابتی عمل می کنند. در واقع، با افزایش غلظت عصاره ها، خانواده ای از خطوط مستقیم با شیب های مختلف که همگی روی آبسیسا متقاطع بودند، پیدا شد (شکل 2C,D). این تجزیه و تحلیل نشان می دهد که عصاره ها می توانند نه تنها به کمپلکس آنزیم-سوبسترا بلکه به آنزیم آزاد نیز متصل شوند. ثابت‌های تعادل برای اتصال با آنزیم آزاد (Kj) و با کمپلکس آنزیم- بستر (Kis) یا از شیب (Km/Vmax) یا مقادیر 1/Vmax (تقاطع y) در مقابل غلظت بازدارنده به‌دست آمدند. به ترتیب.در نهایت، رفتار جنبشی کلاژناز در غلظت های مختلف عصاره ها در شکل 3 الف-د نشان داده شده است. همه عصاره ها به عنوان مهارکننده های غیررقابتی با مقادیر Krs در محدوده 7.04 میکروگرم در میلی لیتر 58-13 (جدول 2) عمل کردند.

در کار قبلی ما، عصاره های الکلی دانه های W. filifera را با استفاده از HPLC-DAD-ESI/MS تجزیه و تحلیل کردیم. تاکید کردیم که ترکیبات فنلی اصلی این عصاره ها از فلاوان-3-اول [7] تشکیل شده است. در این میان، پروسیانیدین های نوع B، ترکیبات اصلی عصاره بذر W.filifera بودند. یک رابطه مثبت بین درجه پلیمریزاسیون پروسیانیدین و ظرفیت پروسیانیدین ها برای مهار الاستاز در مقاله قبلی مشاهده شد [11،12]. علاوه بر این، فعالیت مهاری علیه الاستاز و کلاژناز توسط برخی از ترکیبات پروسیانیدین گزارش شده است [13،14]. عمل سینرژیک این ترکیبات می تواند به توضیح مهار قابل توجه عصاره متانولی W.filifera علیه هر دو آنزیم کمک کند.

2.3. فاکتور محافظت در برابر آفتاب

فعالیت محافظت از نور برای ترکیبات با کاربرد احتمالی پوست بسیار مهم است، بنابراین ما فاکتور محافظت از آفتاب (SP) عصاره های خود را تعیین کردیم. SPF توانایی یک ماده برای جذب اشعه ماوراء بنفش را نشان می دهد و از پوست در برابر اثرات سمی ناشی از چنین اشعه ای محافظت می کند. لوازم آرایشی گیاهی پتانسیل بالایی در جذب اشعه ماوراء بنفش دارند زیرا عصاره های گیاهی حاوی پلی فنول هایی مانند فلاونوئیدها یا کاروتنوئیدها هستند. این ترکیبات با داشتن حلقه‌های معطر می‌توانند اشعه ماوراء بنفش را جذب کنند و بنابراین می‌توانند به عنوان یک فیلتر خورشید عمل کنند. از آنجایی که عصاره الکلی دانه W.filifera حاوی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی [7] است، اثرات محافظتی از عکس این عصاره ها مورد ارزیابی قرار گرفت. همانطور که در جدول 3 نشان داده شده است، تمام عصاره های مورد تجزیه و تحلیل، در غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر، مقادیر SPF از 1.52 تا 3.35 را نشان دادند. مشخص شد که عصاره متانولی دارای بهترین اثرات محافظتی در برابر عکس است. اشعه ماوراء بنفش مسئول بیماری های پوستی است و باعث ایجاد فرآیندهایی می شود که منجر به پیری پوست، استرس اکسیداتیو و ایجاد چین و چروک می شود. بنابراین کاهش جذب این تابش به صورت غیرمستقیم باعث افزایش فعالیت آنتی اکسیدانی و مهار آنزیم های مرتبط با پیری می شود.

2.4. زنده ماندن سلولی و سطح ROS داخل سلولی

از آنجایی که استرس اکسیداتیو یک عامل کلیدی در ایجاد آسیب ناشی از پیری و افزایش سن است، ما همچنین بررسی کردیم که آیا عصاره W. filifera از تولید ROS ناشی از HO در یک سیستم سلولی جلوگیری می‌کند یا خیر. در مقاله قبلی، فعالیت های آنتی اکسیدانی عصاره بذر را با استفاده از روش اسپکتروفتومتری (آزمایش ABTS) شرح دادیم[7]. نمونه ها منبع خوبی از ترکیبات فنلی با خواص آنتی اکسیدانی هستند و MEG بهترین فعالیت را نشان می دهد. از آنجایی که این عصاره دارای بهترین فعالیت آنتی اکسیدانی و همچنین پتانسیل بالایی بود، با توجه به فعالیت های بازدارنده در برابر آنزیم آزمایش شده (کولین استراز، گزانتین اکسیداز و آنزیم های پیری ارائه شده در اینجا)، تصمیم گرفتیم ظرفیت آنتی اکسیدانی MEG را در یک مدل سلولی تایید کنیم.

ابتدا اثرات عصاره W.filifera بر زنده ماندن سلولی در سلول های HaCaT بررسی شد. رده سلولی کراتینوسیت انسانی جاودانه HaCaT به طور گسترده به عنوان مدلی برای مطالعه هموستاز اپیدرمی استفاده شده است [15]. به منظور تعیین ایمنی این عصاره، سلول ها با غلظت های مختلف نمونه به مدت 24 ساعت تیمار شدند و با استفاده از آزمون MTT مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان می‌دهد که عصاره در سلول‌های HaCaT سیتوتوکسیک نبوده و تنها کاهش اندکی (80 درصد زنده ماندن) در غلظت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر مشاهده شد (شکل 4). از آنجایی که زنده ماندن تا 50 ug/mL (قابلیت زنده ماندن 96 درصد) تحت تأثیر قرار نگرفت، تصمیم گرفتیم آزمایشات سلولی بیشتری را با استفاده از غلظت این عصاره انجام دهیم. ما سطوح ROS را در سلول‌ها قبل و بعد از استرس اکسیداتیو و بعد از درمان با MEG ارزیابی کردیم. این مطالعه با استفاده از دی استات 21,7'-دی کلروفلورسئین (DCFH-DA) انجام شد که به راحتی از طریق غشای سلولی منتشر می شود و توسط استرازهای درون زا به DCFH هیدرولیز می شود. افزایش سریع DCF نشان دهنده اکسیداسیون DCFH توسط ROSهای ​​داخل سلولی است. H2O2. همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است، انکوباسیون H2O2 به طور قابل توجهی تشکیل ROS را در سلول های HaCaT افزایش داد، اما تیمار با عصاره قادر به مهار تولید H2O{17}}به روش دوز-پاسخ بود. بنابراین، این نتایج سنجش های آنتی اکسیدانی را تایید می کند و نشان می دهد که MEG ممکن است تشکیل ROS را در سلول ها نیز کاهش دهد.

عصاره متانولی آنالیز شده در این مقاله خواص آنتی اکسیدانی بالایی را نشان داد. ترکیب فنلی این عصاره شامل فلاوان{0}}ال بود و پروسیانیدین‌های نوع B ترکیبات اصلی فنلی بودند [7]. گزارش شده است که پروسیانیدین ها، گروهی از بیوفلاونوئیدهای پلی فنولیک، طیف وسیعی از خواص بیولوژیکی، دارویی و شیمیایی محافظتی را در برابر رادیکال های آزاد اکسیژن از خود نشان می دهند [16،17]. مطالعه قبلی نشان داده است که فعالیت ضد رادیکال پروسیانیدین ها در غلظت های بالا قوی است [18]. علاوه بر این، عصاره های پروآنتوسیانیدین در مقایسه با آنتی اکسیدان ویتامین C و Trolox [19]، رادیکال های سوپراکسید رادیکال رادیکال ها را از بین می برند.

3. مواد و روشها

3.1.مواد شیمیایی

تمام معرف های شیمیایی به عنوان محصولات تجاری خالص از شرکت شیمیایی سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) به دست آمدند، مگر اینکه در غیر این صورت مشخص شده باشد، و بدون خالص سازی بیشتر مورد استفاده قرار گرفتند.

3.2. آماده سازی نمونه گیاه

میوه‌های W.filifera در تونس در مناطق Gabes (G) و Sousse (S) جمع‌آوری شدند و مواد گیاهی طبق روشی که قبلاً توضیح داده شد آماده شدند. خمیر و دانه ها به طور جداگانه لیوفیلیز شدند و سپس مواد گیاهی (25 گرم) در 100 میلی لیتر آب (AE، عصاره آبی)، اتانول (E، عصاره اتانولی)، یا متانول (ME، عصاره متانولی) به مدت 72 ساعت در اتاق استخراج شدند. درجه حرارت، در هم زدن مداوم. پس از فیلتراسیون و سانتریفیوژ با سرعت 10،{5}} دور در دقیقه، عصاره های آبی لیوفیلیزه شدند، در حالی که عصاره های اتانولی و متانولی به دست آمده در خلاء با استفاده از اواپراتور چرخشی برای تجزیه و تحلیل بیشتر تغلیظ شدند. قدرت های خشک شده (1 میلی گرم در میلی لیتر) قبل از استفاده در DMSO حل شد.

3.3. مهار آنزیمی

نتایج تمام سنجش هایی که در زیر توضیح داده شده است به عنوان درصدی از کنترل خالی بیان شد. غلظت عصاره‌ها که منجر به مهار 50 درصدی فعالیت آنزیم (ICso) می‌شود با درونیابی منحنی‌های دوز-پاسخ تعیین شد. مدل بازدارندگی با انجام سنجش در غلظت‌های مختلف سوبسترا و عدم حضور و حضور عصاره‌ها در غلظت‌های مختلف تعیین شد. داده های سینتیک با استفاده از نمودار Lineweaver-Burk تجزیه و تحلیل شد. داده‌های حاصل از سنجش فعالیت با اسپکتروفتومتر Ultrospec 2100 (Biochrom Ltd., Cambridge, UK) ثبت شد.

3.3.1. سنجش مهار تیروزیناز

مهار فعالیت تیروزیناز توسط عصاره W.filifera با استفاده از 3،4-دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA) به عنوان سوبسترا تعیین شد [2{9}}]. مخلوط واکنش حاوی 25 میلی مولار بافر فسفات (pH 6.8)، تیروزیناز قارچ (100 واحد بر میلی لیتر، غلظت نهایی)، با یا بدون محلول عصاره گیاهی بود. سپس L-DOPA (0.5 میلی مولار) به مخلوط اضافه شد و فعالیت با افزایش جذب در طول موج 492 نانومتر، حاصل از تشکیل محصول دوپاکروم تعیین شد. محدوده غلظت عصاره مورد استفاده برای سنجش مهار تیروزیناز قارچ 0-0.3 میلی گرم در میلی لیتر بود. در سنجش‌هایی که بدون عصاره‌های گیاهی انجام شد، DMSO به عنوان شاهد بلانک به مخلوط واکنش اضافه شد. اسید کوجیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

3.3.2. سنجش مهار الاستاز

مهار الاستاز با نظارت بر آزادسازی p-nitroaniline در طول برش سوبسترا N-succ-(Ala){4}}nitroanilide (SANA) توسط عمل آنزیم با روش توصیف شده مورد سنجش قرار گرفت [21]، با تغییرات جزئی سنجش در بافر 0.1 M Tris-HCl (pH8.{10}}) انجام شد. الاستاز پانکراس خوک (3.3 میکروگرم بر میلی لیتر) با یا بدون عصاره به مدت 20 دقیقه انکوبه شد و پس از تلقیح، بستر (1.6 میلی مولار) اضافه شد و فعالیت آنزیم در 410 نانومتر بررسی شد. کنترل با DMSO انجام شد، در حالی که اسید اولئانولیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

3.3.3. سنجش مهار کلاژناز

کلاژناز از کلستریدیوم هیستولیتیکوم در بافر Tricine {{0}} تهیه شد.05 M، pH 7.5، حاوی 0}}.4 M NaCl و 0.01 M CaClz، و انکوبه شد (1 U / میلی لیتر) با نمونه های آزمایشی در غلظت های مختلف به مدت 15 دقیقه. سوبسترای مصنوعی N-(3-[2-Fury]]-acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA)، که در همان محلول بافر تهیه شده بود، سپس برای شروع واکنش اضافه شد. با غلظت نهایی 0.8 میلی مولار). جذب در 340 نانومتر کنترل شد [21]. کنترل با DMSO انجام شد، در حالی که اپی گالوکاتچین گالات به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

3.4. تعیین ضریب محافظت در برابر نور خورشید

فاکتور محافظت در برابر آفتاب عصاره W. filifera با استفاده از روش جذب اشعه ماوراء بنفش، بر اساس روش توصیف شده توسط منصور و همکاران تعیین شد. (1986) [22]. میزان جذب عصاره‌ها (1/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) در محدوده 290-320 نانومتر با افزایش 5 نانومتر اندازه‌گیری شد و در هر نقطه سه اندازه‌گیری انجام شد. SPF با استفاده از معادله منصور محاسبه شد: که در آن CF=ضریب تصحیح(10); EE(A)= اثر اریتموژنیک تابش با طول موج λ;I(）{11}} طیف شدت خورشیدی. مقادیر جذب اسپکتروفتومتری Abs(λ{12}} در طول موج λ. مقادیر EE（A）×I（A） ثابت هستند. آنها توسط Sayre و همکاران تعیین شدند. (1979) [23] و در جدول 4 نشان داده شده است.

3.5. کشت سلولی و سطوح ROS داخل سلولی

رده سلولی کراتینوسیت پوست انسان HaCaT در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (FBS, Gibco, NY, USA) و 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین در دمای 37 درجه در یک فضای مرطوب با 5 کشت داده شد. درصد CO2. زنده ماندن سلول توسط رنگ سنجی 3-(4){8}}dimethylthiazol-2-yl){10}} شناسایی شد.{11}}دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) به عنوان قبلاً شرح داده شد، با اصلاحات جزئی [24]. پس از 24 ساعت انکوباسیون با MEG در غلظت‌های مختلف ({14}} ug/mL)، سلول‌ها با محلول MTT به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه برچسب‌گذاری شدند. رسوبات فرمازان بنفش حاصل در DMSO حل شد و جذب هر چاهک در طول موج 560 نانومتر با استفاده از دستگاه میکروپلیت خوان با مرجع 630 نانومتر تعیین شد.

سطوح ROS سلولی با روش DCFH-DA [25] تعیین شد. سلول های HaCaT با غلظت های مختلف MEG ({2}} ug/mL) به مدت 24 ساعت تیمار شدند. سپس سلول ها با DCFH-DA (10 میکرومولار) در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، 1 میلی‌مولار HzO2 به چاهک‌ها اضافه شد و شدت فلورسانس DCF بلافاصله با استفاده از صفحه‌خوان فلورسنت در طول موج تحریک 485 نانومتر و طول موج انتشار 530 نانومتر اندازه‌گیری شد و در فواصل 55 دقیقه به مدت 50 دقیقه قرائت شد. دقیقه

3.6. تجزیه و تحلیل داده ها

همه آزمایش ها در سه تکرار انجام شد و داده ها به صورت میانگین 士 انحراف استاندارد (SD) بیان شد. تفاوت های آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism نسخه 8 (San Diego, CA, USA) ارزیابی شد. مقایسه بین گروه ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و سپس آزمون مقایسه چندگانه توکی انجام شد. Ap-value کمتر از 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

4. نتیجه گیری

در نتیجه، ما برای اولین بار گزارش می دهیم که عصاره دانه W.filifera در مهار آنزیم های کلیدی دخیل در پیری پوست موثر است. پیری طبیعی یا "ذاتی" یک پدیده فیزیولوژیکی است که در نتیجه گذر زمان در تمام بافت های انسان رخ می دهد. با این حال، پوست همچنین در معرض عوامل استرس زای خارجی است که عامل اصلی پیری زودرس پوست هستند. پیری "خارجی" عمدتاً به آسیب ناشی از اشعه ماوراء بنفش به بافت همبند پوست مربوط می شود. اشعه ماوراء بنفش باعث استرس اکسیداتیو می شود که مسئول فعال شدن آنزیم های تخریب کننده ECM و ظاهر چین و چروک و لکه های پیری است. این نسخه خطی اهمیتی را که بذر W.filifera می تواند در این زمینه داشته باشد گزارش می کند. همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است، عصاره ها می توانند در پیشگیری از پیری زودرس عمل کنند و به طور همزمان در چندین جبهه عمل کنند.

اول، عصاره ها می توانند در ابتدای فرآیند از طریق اثرات محافظت کننده نور خود عمل کنند و بنابراین، جذب اشعه UV را کاهش دهند. سپس، آنها اثر آنتی اکسیدانی خوبی با عصاره متانولی نشان دادند و از تشکیل ROS در یک سیستم سلولی، بدون سمیت سلولی جلوگیری کردند. در نهایت، تمام عصاره‌ها، به‌ویژه نمونه‌های متانولی، می‌توانند کلاژناز، الاستاز و تیروزیناز را مهار کنند. به طور کلی، نتایج به‌دست‌آمده نشان می‌دهد که W.filifera می‌تواند منبعی از مولکول‌های فعال زیستی باشد و آزمایش‌های بیشتر را به منظور جداسازی تک اجزای فعال مسئول فعالیت‌های مشاهده‌شده تشویق کند.

این مقاله از Plants 2021, 10, 151 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/plants10010151 https://www.mdpi.com/journal/plants