SLC37A2، یک مولکول مرتبط با فسفر در سلول های ماهیچه صاف در هوای کلسیفیه افزایش می یابد

کلسیفیکاسیون عروقیمنبع اصلی استبیماری قلب و عروقیدر بیماران مبتلا به بیماری مزمن کلیههیپر فسفاتمیمنجر به افزایش هجوم فسفر داخل سلولی می شود که منجر به افزایش سلول های استئوبلاست مانند در سلول های ماهیچه صاف عروق می شود. PiT{1}} فسفات را در سلول‌های ماهیچه صاف عروق انتقال می‌دهد. با این حال، مکانیسم کلسیفیکاسیون عروقی به طور کامل شناخته نشده است. این مطالعه مولکول‌های کاندید مربوط به فسفر غیر از PiT{3}} را بررسی کرد. ما فرض کردیم که مولکول های مربوط به فسفر متعلق بهحامل املاح(SLC) در کلسیفیکاسیون عروقی نقش دارد. در نتیجه تجزیه و تحلیل ریزآرایه DNA، ما بر روی SLC37A2 تمرکز کردیم و نشان دادیم که بیان mRNA این سلول‌ها در سلول‌های عضله صاف آئورت کلسیفیه (AoSMC) افزایش یافته است. گزارش شده است که SLC37A2 هم تبادل گلوکز-6-فسفات/فسفات و هم فسفات/فسفات را انتقال می‌دهد. تجزیه و تحلیل در شرایط آزمایشگاهی نشان داد که بیان SLC37A2 تحت تاثیر التهاب در AoSMC قرار نگرفت. بیان mRNA و پروتئین SLC37A2 در AoSMC کلسیفیه افزایش یافته است. در داخل بدن، تجزیه و تحلیل نشان داد که بیان mRNA SLC37A2 در آئورتبیماری مزمن کلیویموش‌های صحرایی با ژن‌های نشانگر استخوانی در ارتباط بودند. علاوه بر این، SLC37A2 در ناحیه کلسیفیکاسیون عروقی بیان شدموش های صحرایی بیماری مزمن کلیوی. در نتیجه نشان دادیم که SLC37A2 یکی از مولکول هایی است که با افزایش می یابدکلسیفیکاسیون عروقیin vitro و in vivo.

کلید واژه ها: SLC37A2،کلسیفیکاسیون عروقیسلول های ماهیچه صاف آئورت،بیماری مزمن کلیوی, هیپر فسفاتمی

برای دریافت عصاره طبیعی سیستانچ ارگانیک با 25% اکیناکوزید و 9% آکتئوزید برای عملکرد کلیه اینجا را کلیک کنید

خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:

https://www.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

به عنوان تعداد بیماران مبتلا بهبیماری مزمن کلیوی(CKD) افزایش می یابد، تعداد بیماراننیاز به دیالیزنیز افزایش خواهد یافت. بیشترین مرگ و میر در بیماران تحتدیالیزناشی ازبیماری های قلبی عروقیمانندنارسایی قلبی, اختلالات عروق مغزی، یا انفارکتوس میوکارد. (2) منبع اصلیبیماری قلب و عروقیکلسیفیکاسیون نابجا، () یک ناهنجاری ناشی از تشکیل و رسوب کریستال های فسفات کلسیم در بافت های نرم است. (4 6) عوامل مختلفی مانند التهاب. استرس اکسیداتیو و افزایش سطح کلسیم (Ca) و فسفر (P) پلاسما در پیشرفت کلسیفیکاسیون عروقی نقش دارند. در میان این عوامل، هیپرفسفاتمی به شدت با کلسیفیکاسیون عروقی مرتبط است. (7.8) هیپرفسفاتمی در اثر مصرف بیش از حد فسفر در حضور کاهش عملکرد کلیه ایجاد می شود. بنابراین، بیماران تحت دیالیز نیاز به محدود کردن دریافت P. (79-12) با این حال، گزارش شده است کهکلسیفیکاسیون عروقیبا شروع دیالیز در حال حاضر پیشرفت می کند. همچنین در بیماران مبتلا به CKD در مراحل اولیه هنگامی که هیپرفسفاتمی مشهود نیست، دیده شده است. (3) در نتیجه، جلوگیری از کلسیفیکاسیون عروقی در بیماران مبتلا به CKD در مراحل اولیه برای بهبود پیش آگهی زندگی مهم است.

که منجر به افزایش هجوم P به سلول های ماهیچه صاف عروقی (VSMC) می شود. هجوم P از طریق PiT{0}}، یک ناقل بر روی سطح غشای سلولی VSMC انجام می‌شود. PiT- عضوی از ابرخانواده حامل املاح (SLC) است که شامل یک ناقل فسفات سدیم کدگذاری شده توسط SLC20A1.04 PiT- فسفات را از غشاهای سلولی وابسته به سدیم منتقل می کند و متعاقباً به دلیل سطوح بالای p، کانی سازی ماتریکس را منتقل می کند. سطح P افزایش می‌یابد، VSMC شروع به بیان فاکتورهای رونویسی استخوان‌ساز می‌کند، مانند فاکتور رونویسی مربوط به runt 2 (Runx2) (16). علاوه بر این، بیان پروتئین های اختصاصی عضله صاف را کاهش داد. مانند پروتئین ماهیچه صاف 22-0 (SM22-0)، رخ می دهد. در نتیجه، VSMC به سلول های استئوبلاست مانند تبدیل می شود. (1718) مطالعات بالینی اخیر نشان داده است که سطوح خونی کلسیم. ذرات پروتئین (CPP)، که نشان دهنده ذرات کلوئیدی فسفات کلسیم هستند، با کاهش عملکرد کلیه افزایش می یابند. ({18}}) علاوه بر این، ارتباط با سطوح CPP و P خون گزارش شده است. 2o2i) ممکن است CpP باعث پیشرفت کلسیفیکاسیون عروقی شود.{21}})

با این حال، کلسیفیکاسیون عروقی در بیماران مبتلا به CKD در مراحل اولیه با سطح P پلاسما طبیعی مشاهده شده است. (13) علاوه بر این، mRNA PiT{2}} در همه بافت‌ها بیان می‌شود. بنابراین مولکول دیگری ممکن است عمدتاً در ناحیه کلسیفیکاسیون عروقی عمل کند. گزارش هایی وجود دارد کهالتهابکلسیفیکاسیون عروقی را تقویت می کند. عوامل التهابی مانند اینترلوکین (IL)-1B، IL-6 و فاکتور نکروز تومور آلفا (TNF-a) باعث تمایز VSMC به سلول‌های مشابه استئوبلاست (2s26) TNF-a می‌شود که کلسیفیکاسیون عروقی را القا می‌کند. از طریق مسیر cAMP، که در تمایز استئوبلاست ها نقش دارد. IllB، IL-6، و TNF-a نیز عوامل مرتبط با افزایش کلسیفیکاسیون عروقی ناشی از سطوح بالای p هستند.3233) اما. داده های فعلی مکانیسم عروقی را به طور کامل توضیح نمی دهند

کلسیفیکاسیون ناشی از این عوامل. ما فرض کردیم که ممکن است مولکول‌های مرتبط با P دیگر مانند مولکول‌های موجود در ابرخانواده SLC وجود داشته باشند که در کلسیفیکاسیون عروقی دخیل هستند. ما روی پروتئین‌های غشایی در ابرخانواده SLC متمرکز شدیم و مولکول‌های بالقوه مرتبط با P غیر از PiT{2}} را برای دخالت در کلسیفیکاسیون عروقی بررسی کردیم. علاوه بر این، ما رابطه بین مولکول‌های کاندید و کلسیفیکاسیون عروقی را در ویدئو و در داخل بدن بررسی کردیم.

مواد و روش ها

کشت سلولی سلول‌های عضلانی صاف انسانی (AoSMC) از Lonza (بازل، سوئیس) به‌دست آمدند. AoSMC طبق دستورالعمل سازنده کشت داده شد. AoSMC در یک محیط رشد (محیط پایه سلول عضلانی صاف همراه با 5٪ سرم جنین گاو (FBS)، فاکتور رشد اپیدرمی، انسولین، فاکتور رشد فیبروبلاست-B، و جنتامایسین/آمفوتریسین-B) نگهداری شد. رسانه ها یک روز در میان عوض می شدند. AoSMC در انکوباتور 5% CO مرطوب شده در دمای 37 درجه رشد داده شد و تا رسیدن به تلاقی نگهداری شد و سپس در آزمایشات مورد استفاده قرار گرفت.

کلسیفیکاسیون AoSMC همانطور که قبلا توضیح داده شد القا شد. 435) AOSMC در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco با مکمل 15% FBS و پنی سیلین-استرپتومایسین و با 2.6 میلی مولار فسفر به مدت 3، 6، 9، 12 و روز کشت داده شدند. غلظت فسفر توسط بافر NaH، PO/Na و HPO تنظیم شد. pH 7.2). سایر AoSMC ها با 2.6 میلی مولار فسفر کشت داده نشدند.

ریزآرایه DNA RNA کل نمونه های AoSMC کشت شده و کشت نشده با 2.6 میلی مولار فسفر استفاده شد. RNA کل 5.{3}} ug با استفاده از یک ریزآرایه DNA (Agilent Technologies، توکیو. ژاپن) آنالیز شد. SurePrint G3 Human GE 8 x 60k نسخه 2 میکروآرایه برای بررسی حدود 26،{9}} ژن استفاده شد. این نسبت با تقسیم سطح بیان AoSMC کشت شده با 2.6 میلی مولار به مدت 12 روز بر سطح بیان AoSMC غیر کشت شده با 2.6 میلی مولار P محاسبه شد.

ریزآرایه DNA

RNA کل نمونه های AoSMC کشت شده و کشت نشده با 2.6 میلی مولار فسفر استفاده شد. RNA کل 5.{3}} ug با استفاده از یک ریزآرایه DNA (Agilent Technologies، توکیو. ژاپن) آنالیز شد. SurePrint G3 Human GE 8 x 60k نسخه 2 میکروآرایه برای بررسی حدود 26،{9}} ژن استفاده شد. نسبت با تقسیم سطح بیان در AoSMC کشت شده با 2.6 میلی مولار به مدت 12 روز بر سطح بیان در AoSMC غیر کشت شده با 2.6 میلی مولار P. بیان SLC37A2 در التهاب عروقی محاسبه شد. برای القای پاسخ التهابی در AoSMC، سلول‌ها با محیط رشد کشت داده شدند تا زمانی که به تلاقی رسیدند و سپس با 1 ugmL لیپوپلی ساکارید (LPS) (LPS از اشریشیا کلی O111:B4؛ سیگما، سنت لوئیس، MO) به مدت 24 و 72 بدون تیمار شدند. 2.6 میلی‌مولار فسفر. سایر AoSMC با آنالیز واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بلادرنگ (PCR) کشت داده نشدند. RNA کل از AoSMC تحت درمان با LPS به مدت 24 و 72 ساعت و سلول هایی که با LPS تیمار نشده بودند استخراج شد. PCR زمان واقعی کمی مبتنی بر سبز SYBR با استفاده از cDNA سنتز شده و یک مجموعه پرایمر مناسب برای هر ژن هدف با سیستم PCR بلادرنگ aStepOnePlus (Applied Biosystems، FosterCity، CA) انجام شد. توالی های آغازگر به شرح زیر بودند: IL انسانی-6. انسان SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' and 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; گلیسرآلدئید{42}}فسفات دهیدروژناز (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- و 5-CTTCTGGGIGGGCAGTGATGGC{47}}. IL-6 و سطوح بیان mRNA ژن SLC37A2 پس از نرمال‌سازی بیان mRNA‌ای محاسبه شد. AoSMC کل از AoSMC کشت نشده با 2.6 میلی مولار فسفر استخراج شد و سلول های AoSMC با 2.6 میلی مولار فسفر به مدت 3، 6، 9، 12 و 14 روز کشت داده شدند و با استفاده از cDNA سنتز شده PCR Real-time انجام شد. به شرح زیر است: Runx2 انسانی، 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3'، و 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. سطوح بیان mRNA Runx2 و SLC37A2 پس از نرمال‌سازی با APPH محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات.

پروتئین کل از نمونه‌های AoSMC که تحت شرایط مشابهی که برای آنالیز بلادرنگ PCR کشت داده شده بودند، جمع‌آوری شد. این نمونه ها با استفاده از نمک تریس بافر (pH 75) همراه با 5% NP{4}} و کوکتل بازدارنده پروتئاز 1% لیز شدند. غلظت پروتئین نمونه ها با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA) اندازه گیری شد. و غلظت با وسترن بلات تنظیم شد، 10 یوگ پروتئین در ژل پلی آکریل آمید 10 درصد با استفاده از الکتروفورز ژل دودسیل سولفات سدیم-پلی آکریل آمید جدا شد. غشاء با آنتی بادی SLC37A2 (Novus Biologicals، Centennial، CO) یا آنتی بادی GAPDH (GeneTex، Irvine، CA) به عنوان آنتی بادی های اولیه، انکوبه شده با آنتی بادی کونژوگه با پراکسیداز خرگوش lgG ترب کوهی (R&D Systems، Mnnea) تحت درمان قرار گرفت. و با استفاده از Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, England) و تحلیلگر تصویر درخشان (LAS{12}} plus, FUNIFILM, Tokyo, Japan) تجسم شد. باند با استفاده از lmagel تعیین شد.

تجربی

تمام پروتکل‌های مطالعه توسط کمیته اخلاق دانشگاه هیوگو، دانشکده علوم انسانی و محیط زیست تأیید شد. موش های نر 12 هفته ای Sprague-Dawley از ژاپن SLC (Shizuoka، ژاپن) خریداری شدند. موش‌ها در چرخه تاریکی 12-روشن، 12-ساعت (09:00-21:00) نگهداری شدند و اجازه دسترسی آزاد به غذا و آب فوق‌العاده را داشتند.

جیره های آزمایشی شامل یک رژیم غذایی کنترل P (1.{1}}% P، 0.6Ca، 20% پروتئین)، یک رژیم غذایی آدنین (0.75.% آدنین) است. , 1.0% P, 0.6%Ca, 2.5% protein), a low-P (LP) diet (0.2% P,{21}} 0.6% کلسیم، 10% پروتئین) و رژیم غذایی با فسفر بالا (HP) (1.0% P، 0.6% Ca، 10% پروتئین) بر اساس رژیم AIN93-G (شرقی مخمر، توکیو، ژاپن) با کازئین به‌عنوان منبع پروتئین.=23) به مدت یک هفته با یک رژیم غذایی استاندارد MF (مخمر شرقی) تغذیه شدند تا سازگار شوند. در 13 هفتگی، موش‌ها به 2 گروه تقسیم شدند: گروه کنترل (n=5) و گروه CKD ناشی از آدنین (n= 18). گروه کنترل رژیم غذایی P را به مدت 6 هفته دریافت کردند. . گروه CKD ناشی از آدنین رژیم غذایی آدنین را برای حدود 3 هفته دریافت کرد و سپس به 2 زیر گروه تقسیم شد: گروه CKD-LP (n=8) یا گروه CKDHP (n=10). موش های گروه CKD-LP و گروه CKD-HP به ترتیب رژیم LP و رژیم HP را به مدت 3 هفته دریافت کردند، در طول دوره آزمایش، میزان غذای دریافتی روزانه ثبت شد. در طول رژیم غذایی آدنین، نمونه‌های خونی از ورید دم بین ساعت 10:{46}} صبح تا 11:00 یک بار در هفته تا هفته دوم و پس از آن هر 2 روز یک بار برای نظارت بر سطوح پلاسمایی جمع‌آوری شد. در طول رژیم LP یا رژیم HP، نمونه خون یک بار در هفته جمع آوری شد. نمونه های ادرار جمع آوری شد و حجم ادرار هر هفته یک بار ثبت شد. موش ها با استفاده از ایزوفلوران (صنایع شیمیایی خالص Wako. اوزاکا ژاپن) و لاپاراتومی با بیهوشی قربانی شدند. نمونه های خون گرفته شده از ورید اجوف تحتانی و آئورت سینه ای شکمی برای تجزیه و تحلیل جمع آوری شد.

بیان SLC37A2 در آئورت.

تقریباً یک سوم از آئورت سینه‌ای شکمی جمع‌آوری‌شده برای تجسم کلسیفیکاسیون و انجام رنگ‌آمیزی ایمنی مورد استفاده قرار گرفت. آئورت در پارافین جاسازی شد و بخش‌های 4-ام بریده شد. برش ها با استفاده از روش Von Kossa برای کیت کلسیم (Polysciences. Warrington, PA) طبق دستورالعمل سازنده رنگ آمیزی شدند. تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی با مقاطع سریال انجام شد. مقاطع با آنتی بادی SLC37A2 به مدت یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شدند و سپس با هیستوفین ساده رنگ موش رت MAX-POMULTI (Nichirei Biosciences، توکیو، ژاپن) به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق تحت درمان قرار گرفتند. پس از آن، بخش ها با کیت DABsubstrate (Nichirei) درمان شدند.

RNA کل از بقیه آئورت سینه ای شکمی منجمد استخراج شد. Real-time PCR با استفاده از cDNA سنتز شده انجام شد. توالی پرایمر به شرح زیر بود: استئوپنتین موش صحرایی، 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' و 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' و. SLC37A2 موش صحرایی، 5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' و 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. سطوح بیان mRNA استئوپانتین و mRNA SLC37A2 پس از نرمال‌سازی با GAPDH محاسبه شد.

تحلیل آماری.

داده ها به صورت میانگین + SE ارائه می شوند. تفاوت بین گروه ها با استفاده از آزمون t مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در آزمایش‌های AoSMC کلسیفیه‌شده با فسفات، تفاوت‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه و به دنبال روش دانت مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. در آزمایش‌های مدل CKD، تفاوت‌ها با استفاده از آزمون K ruskal-Wallis و سپس با روش Steel-Dwass مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ضرایب همبستگی (rs) با استفاده از آزمون رتبه ضریب همبستگی اسپیرمن تعیین شد. برای تمام تست ها مقادیر p دو طرفه<0.05 were considered statistically significant.