کوچک اما قدرتمند - اگزوزوم ها، پیام رسان های بین سلولی جدید در تخریب عصبی قسمت 1

خلاصه ساده:

اگزوزوم ها نانوذرات بیولوژیکی هستند که اخیراً به عنوان پیام رسان بین سلولی شناخته شده اند. آنها حاوی محموله ای از لیپیدها، پروتئین ها و RNA هستند. آنها می توانند محتوای خود را نه تنها به سلول های مجاور بلکه به سلول های دور منتقل کنند.

اگزوزوم ها ابزار ارتباطی بین سلولی تازه کشف شده ای هستند که می توانند وزیکول های کوچک و ظریف را به سلول های اطراف آزاد کنند و برخی از پروتئین ها، مواد سیگنال دهنده و سایر مواد را به سلول های اطراف برسانند. این مواد می توانند به سلول ها کمک کنند تا حالت خود را تغییر دهند و حتی بر رشد، تکامل، متابولیسم و ​​سایر جنبه های دیگر سلول ها تأثیر بگذارند. در سال های اخیر، مطالعات نشان داده اند که اگزوزوم ها نقش مهمی در عملکرد مغز انسان، به ویژه در حفظ و بهبود حافظه دارند.

اول، اگزوزوم ها می توانند انتقال سیگنال بین نورون ها را تقویت کنند. انتقال اطلاعات بین نورون ها یکی از شرایط لازم برای عملکرد طبیعی سیستم عصبی است و اگزوزوم ها نقش پیام رسان را ایفا می کنند که می توانند انتقال اطلاعات بین نورون ها را روان تر کرده و در نتیجه شناخت و حافظه مغز را بهبود بخشند.

دوم، اگزوزوم ها همچنین می توانند متابولیسم نورون ها را تنظیم کنند. در فرآیند تولید و رهاسازی اگزوزوم‌های نورون‌ها، تعداد زیادی فرآیند متابولیک درگیر می‌شود که باعث تعادل و تنظیم متابولیسم سلولی می‌شود. این فرآیندها نه تنها می توانند توانایی نورون ها را افزایش دهند، بلکه به حذف ضایعات متابولیک و مولکول های مضر و حفظ سلامت سلول های مغز کمک می کنند.

در نهایت، اگزوزوم ها همچنین می توانند به نورون ها در ترمیم آسیب کمک کنند. بسیاری از پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک که توسط اگزوزوم‌ها حمل می‌شوند برای رشد، ترمیم و بازسازی سلول مفید هستند و می‌توانند باعث ترمیم و بازسازی سلول‌های عصبی شوند و در نتیجه توانایی بقای سلول‌های مغزی را بهبود بخشند و مراکز حافظه و توانایی‌های شناختی را تقویت کنند.

به طور خلاصه، رابطه نزدیکی بین اگزوزوم ها و حافظه وجود دارد. با شروع رژیم غذایی می توانیم حافظه کودکان را تغییر دهیم. هدایت فعال ساختار رژیم غذایی کودکان و خوردن بیشتر غذاهای غنی از مواد مفید مانند اسیدهای چرب، پروتئین ها و ویتامین ها می تواند تولید و آزادسازی اگزوزوم ها را تقویت کند و در نتیجه به کودکان کمک کند تا توانایی های یادگیری و حافظه خود را بهبود بخشند. همچنین می‌توان برخی بازی‌ها و تمرین‌های تمرین مغزی را برای کودکان فراهم کرد تا تفکر آنها را به چالش بکشد و تمرین دهد، پتانسیل اگزوزوم‌ها را تحریک کند و نقش بهتری ایفا کند. مشاهده می شود که ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانچ می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد زیرا سیستانچ یک ماده دارویی سنتی چینی با اثرات منحصر به فرد بسیاری است که یکی از آنها بهبود حافظه است. اثر سیستانچ از ترکیبات فعال مختلفی که شامل تانیک اسید، پلی ساکاریدها، گلیکوزیدهای فلاونوئید و غیره است، ناشی می شود.

برای بهبود حافظه کوتاه مدت، روی دانستن کلیک کنید

این توانایی منحصر به فرد آنها را قادر می سازد تا فیزیولوژی سلول های گیرنده را تعدیل کنند. در مغز، اگزوزوم ها در بیماری های عصبی مانند بیماری آلزایمر بیماری پارکینسون و اسکلروز جانبی آمیوتروفیک نقش دارند.

چکیده:

اگزوزوم های با منشاء آندوزومی یک دسته از وزیکول های خارج سلولی هستند که در ارتباطات بین سلولی مهم هستند. اگزوزوم ها توسط تمام سلول های بدن ما آزاد می شوند و محموله آنها از لیپیدها، پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک ردپایی منعکس کننده منشأ والدین آنها است.

محموله اگزوزومی قدرت تعدیل فیزیولوژی سلول های گیرنده را در مجاورت سلول ها یا سلول های آزاد کننده در فاصله دارد. استفاده از پتانسیل اگزوزوم ها به خلوص آماده سازی اگزوزوم بستگی دارد.

از این رو، روش‌های زیادی برای جداسازی توسعه یافته‌اند و ما خلاصه‌ای از چندین روش را ارائه می‌کنیم. علیرغم انزوا تحمیل شده توسط سد خونی مغز، سلول های CNS از تأثیرات نفوذی اگزوزومی مصون نیستند. هم نورون‌ها و هم اگزوزوم‌های گلیار آزاد می‌شوند، اغلب به شیوه‌ای وابسته به فعالیت.

شرح مختصری از اگزوزوم های آزاد شده توسط سلول های مختلف در مغز و نقش آنها در حفظ هموستاز CNS ارائه شده است. مشخصه چندین بیماری نورودژنراتیو تجمع توده های پروتئینی است. مطالعات اخیر نقش ارتباط‌دهنده بین سلولی اگزوزوم‌ها را در گسترش پروتئین‌های تا شده نادرست نشان می‌دهند که باعث انتشار پاتولوژی می‌شود.

در این بررسی، ما نقش بالقوه اگزوزوم‌ها را در پیشرفت بیماری آلزایمر، بیماری پارکینسون و اسکلروز جانبی آمیوتروفیک مورد بحث قرار می‌دهیم.

درک کمک های اگزوزوم ها در پاتوژنز تخریب عصبی، زمینه را برای استفاده از اگزوزوم ها به عنوان عوامل درمانی برای رساندن دارو به مغز باز می کند، زیرا اگزوزوم ها از سد خونی مغزی عبور می کنند.

کلمات کلیدی: اگزوزوم ها نورون ها سلول های گلیال؛ سیستم عصبی مرکزی (CNS)؛ بیماری های عصبی؛ بیماری آلزایمر؛ بیماری پارکینسون؛ اسکلروز جانبی آمیوتروفیک

1. مقدمه و دیدگاه تاریخی

ارتباطات بین سلولی برای رشد جنینی، بازسازی/جایگزینی اپیتلیوم، گامتوژنز و حفظ هموستاز بسیار مورد توجه است.

چندین مکانیسم ارتباط سلولی مانند اندوسیتوز/اگزوسیتوز و بلعیده شدن حباب های سیتوپلاسمی بیرون زده با استفاده از مطالعات فراساختاری و بیوشیمیایی شناسایی شدند [1-3]. بازیکن دیگری، وزیکول‌های خارج سلولی، شناسایی شد، اما نقش آن‌ها در ارتباطات بین سلولی بلافاصله قدردانی نشد [4].

وزیکول‌های خارج سلولی به‌طور ناگهانی در طی تحقیقاتی در مورد آزادسازی آنزیم‌های مرتبط با غشای پلاسمایی، اکتو-ATPase و اکتو{2}}نوکلئوتیداز در محیط کشت سلولی کشف شدند. در سال 1981، همکاران Tramsand رده های سلولی نرمال و نئوپلاستیک با منشاء موش و انسان را در محیطی عاری از سرم کشت دادند زیرا سرم دارای فعالیت کاتالیزوری ATPase و{5}نوکلئوتیداز شناخته شده بود.

پس از حذف سلول‌های شناور و باقی مانده‌ها، محیط تهویه‌شده با سرعت 310 × گرم به مدت 90 دقیقه در روتور Spinco Ti{3}} سانتریفیوژ شد و گلوله‌ها در زیر میکروسکوپ الکترونی مورد بررسی قرار گرفتند. دو جمعیت از وزیکول های پوشیده شده با غشای خارج سلولی کشف شد، یکی با قطر متوسط ​​بین 500 و 1000 نانومتر و دومین جمعیت کوچکتر با قطر ~40 نانومتر.

این وزیکول‌ها که در ابتدا توسط نویسندگان به‌عنوان «وزیکول لایه‌برداری شده» توصیف شد، حاوی فعالیت آنزیمی 50-50-نوکلئوتیداز و ATPase بودند. علاوه بر این، وزیکول های لایه برداری شده حاوی RNA و فسفولیپیدهایی بودند که به ترتیب با سلول های مادر و غشای پلاسمایی مادر متفاوت بودند.

جوجه کشی وزیکول های لایه برداری شده از سلول های گلیوما C6 با سلول های نوروبلاستوما از پیش نشاندار شده با 32P، فسفریلاسیون پروتئین های نوروبلاستوما را با آزادسازی همزمان فسفر نشاندار رادیویی آزاد (32P) تحریک کرد.

این داده‌ها نشان داد که وزیکول‌های لایه‌برداری شده صرفاً حامل ضایعات سلولی (آنزیم‌ها) نیستند، بلکه عملکرد فیزیولوژیکی دارند. ترام و همکارانش اصطلاح اگزوزوم‌ها را برای توصیف «وزیکول‌های لایه‌برداری شده» [5] ابداع کردند (مقاله مشاهده شده توسط [6] برای تاریخچه وزیکول خارج سلولی را ببینید. قبل از 1981). چند سال بعد، دو گروه تحقیقاتی به طور مستقل سرنوشت گیرنده ترانسفرین در رتیکولوسیت ها را با میکروسکوپ الکترونی مطالعه کردند [7-9].

رتیکولوسیت های بالغ نیازی به ترانسفرین ندارند بنابراین گیرنده های ترانسفرین را از دست می دهند. هر دو گروه مشاهده کردند که رتیکولوسیت‌های کشت‌شده، وزیکول‌های کوچکی به قطر 50 نانومتر را در فضای خارج سلولی آزاد می‌کنند.

این وزیکول های کوچک حاوی گیرنده های ترانسفرین تجزیه شده بودند. در سال 1987، جانستون و همکارانش از اصطلاح اگزوزوم برای توصیف وزیکول های کوچک حاوی گیرنده های ترانسفرین استفاده کردند [10]. پس از این سال های اولیه، پتانسیل اگزوزوم ها به عنوان پیام رسان های بین سلولی جدید که می توانند فیزیولوژی سلول های هدف را تعدیل کنند، محقق شد.

جالب توجه است که پیدایش اگزوزوم‌ها با اندوسیتوز (فرآیندی که در سال 1883 شناسایی شد؛ بررسی شده توسط [3]) در سلول‌ها آغاز می‌شود و آزادسازی اگزوزوم در فضای داخل سلولی از فرآیند اگزوسیتوز استفاده می‌کند. با منشا آندوسیتی با محدوده اندازه 40 تا 160 نانومتر در قطر [11].

مطالعات ردیاب نشان داد که ماکرومولکول‌ها در فرورفتگی‌های پوشیده شده با مو (به عنوان مثال، با پوشش کلاترین) یا حفره‌های روی سطح سلول اندوسیتوز می‌شوند. این انواژیناسیون ها در نهایت از غشای پلاسمایی جدا شده و در سیتوپلاسم شناسایی می شوند.

پس از از دست دادن موها (به عنوان مثال، کلاترین)، وزیکول های پوشش داده شده اندوسیتوز صاف می شوند و با اندوزوم های اولیه برای بازیافت سریع به سطح سلول (بازیافت آندوزوم ها در شکل 1) [12] یا برای تشکیل اندوزوم های دیررس، به بلوغ می رسند.

اندوزوم‌های اولیه و دیررس به‌عنوان «هاب‌های مرتب‌سازی» برای هدایت مناسب محتوای خود عمل می‌کنند: (i) برای انتقال رتروگراد به شبکه ترانس گلژی (یعنی بازیابی اندوزوم به TGN) [13،14]. (2) به لیزوزوم ها برای تجزیه ماکرومولکول ها به محصولات ساده برای استفاده مجدد در سلول [15،16]. و/یا (iii) برای بازیافت به سطح سلول از طریق اجسام چند وزیکولی [17].

در طول بلوغ اندوزوم‌های اولیه به داخل اندوزوم‌ها، غشای اندوزوم داخلی تحت نفوذ قرار می‌گیرد و منجر به تشکیل وزیکول‌های داخل مجرای می‌شود (که اکنون به عنوان اگزوزوم نامیده می‌شوند). ماکرومولکول‌های خاص مانند پروتئین‌های سیتوزولی، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدها در اگزوزوم‌های در حال رشد دسته‌بندی می‌شوند.

اندوزوم های دیررس مملو از اگزوزوم ها به عنوان اجسام چند وزیکولی که به سمت غشای پلاسمایی مهاجرت می کنند شناسایی می شوند. پس از همجوشی با غشای پلاسمایی، اجسام چند وزیکولی اگزوزوم ها را از طریق فرآیند اگزوسیتوز به فضای خارج سلولی آزاد می کنند (شکل 1) [18،19]. زیرمجموعه بزرگی از پروتئین‌ها که به‌طور متوالی به‌کار گرفته می‌شوند، نقش تعیین‌کننده‌ای در فرآیند اندوسیتوز به آندوزوم‌های اولیه، بلوغ آندوزوم‌ها به lateendosomes و سرنوشت درون سلولی بعدی آن‌ها دارند (بازبینی شده توسط [17،18،20]).

اهمیت این پروتئین ها با از دست دادن آنها و/یا جهش(هایی) که باعث بیماری های مختلف می شوند برجسته می شود. برای مثال، پروتئین‌های Strumpellin و SWIP بخشی از کمپلکس WASH هستند که در پلیمریزاسیون اکتین و همچنین شکافت اندوزوم و مرتب‌سازی شرکت می‌کنند. جهش در ژن Strumpellin باعث پاراپلژی اسپاستیک ارثی می شود که با انحطاط نورون های حرکتی مشخص می شود [21].

یک جهش نقطه ای (Pro1019Arg) در پروتئین SWIP، کمپلکس WASH را بی ثبات می کند. کمپلکس بی‌ثبات‌شده WASH، قاچاق آندولیزوزومی را مهار می‌کند و باعث تجمع آندوزوم‌ها می‌شود. ترافیک اندوزومی معیوب بر عملکرد شناختی و نورون حرکتی تأثیر می گذارد، با علائمی که به عنوان عقب ماندگی ذهنی غیر سندرمی توصیف می شود [22،23].

در سیتوپلاسم، اگزوزوم‌ها از آندوزوم‌ها با استفاده از مجتمع‌های مرتب‌سازی آندوزومی مورد نیاز برای انتقال (ESCRT)، که به عنوان مکانیسم زیست‌زایی اگزوزوم وابسته به ESCRT نیز شناخته می‌شود، منشأ می‌گیرند (بازبینی شده توسط [18،20]).

دو گروه به طور مستقل بیوژنز اگزوزوم ها با واسطه لیپیدی را گزارش کردند، یک مکانیسم مستقل از ESCRT. دو لیپید شناسایی شده در این مطالعات بیس (مونوآسیل گلیسررو) فسفات/لیزوبیسفوس فاتیدیک اسید (BMP/LBPA) و سرامید [29،30] بودند.

Rab31 یکی دیگر از مکانیسم های مستقل از ESCRT برای بیوژنز اگزوزوم در سیتوپلاسم است. فعال سازی Rab31 باعث تحریک تشکیل وزیکول های داخل مجرای می شود [31]. مکانیسم دیگری وجود دارد که در حال حاضر مورد بحث و بررسی قرار نگرفته است.

این مکانیسم بر اساس مشاهدات فراساختاری انجام شده در اواخر دهه 1950 تا 1970 است که نشان می‌دهد هسته‌های سلولی می‌توانند محلی برای منشا اجسام چندوزیکولی مملو از وزیکول‌های کوچک باشند. وزیکول های کوچک توصیف شده در این مطالعات شاید اگزوزوم بودند اما اصطلاح اگزوزوم در آن زمان ابداع نشد. کیلارسکی و جاسینسکی فرآیندی به نام حباب‌های هسته‌ای یا اکستروژن‌های هسته‌ای را در سلول‌های کیسه شنای ماهی سوف، Perca fluviatilis L. مشاهده کردند (شکل 2a) [24] با محتوایی شبیه به هسته‌ی لارکاریوپلاسم [32].

این نویسندگان خاطرنشان کردند که حباب هسته ای را می توان با حذف گاز از مثانه شنا ماهی سوف تحریک کرد [24]. به نظر می رسد که فرآیند حباب هسته ای به عنوان محل منشاء اگزوزوم های غنی شده با اسیدهای نوکلئیک و/اوریبونوکلئوپروتئین دارای شایستگی باشد.

حباب‌های هسته‌ای با وزیکول‌های کوچکی پر شده‌اند که از چین‌خوردگی‌های غشای داخلی حباب‌های هسته‌ای به وجود آمده‌اند (شکل 2b)، فرآیندی شبیه به تشکیل وزیکول‌های داخل مجرای در اندوزوم‌ها. حباب‌های هسته‌ای پر از «وزیکول‌های کوچک» در نهایت از هسته‌ها جدا شدند و بخشی از سیتوپلاسم شدند (شکل 2c).

کیلارسکی و جاسینسکی به دلیل فقدان اصطلاحات بهتر، در دست نوشته‌های خود از حباب‌های هسته‌ای به عنوان اجسام چند وزیکولی یاد کردند. ممکن است سهواً حق با این نویسندگان باشد زیرا مطالعات بعدی وجود اجسام چند وزیکولی را در هسته سلول ها گزارش کردند [33]. بلوک های هسته ای پر شده با وزیکول های کوچک مورفولوژی شبیه اجسام چند وزیکولی دارند که از اندوزوم های سیتوپلاسم منشا می گیرند (شکل های 1 و 2).

به دلیل شباهت اجسام چند وزیکولی هسته ای با نوکلئوکپسید ویروسی، محققان توجه خود را بر ویروس شناسی و پدیده حباب هسته ای و عملکرد سلولی آن ناشناخته باقی مانده است [34].

صرف نظر از نحوه بیوژنز، اگزوزوم ها از دو لایه آلیپیدی تشکیل شده اند و حاوی محتوای ماکرومولکولی متشکل از لیپیدها، پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک هستند.

برخی از ماکرومولکول‌ها در اگزوزوم‌هایی که از همه سلول‌ها سرچشمه می‌گیرند مشترک هستند و از این رو به عنوان نشانگرهای اگزوزوم طبقه‌بندی می‌شوند و به عنوان یک ابزار تأییدکننده برای تشخیص اگزوزوم‌ها از سایر وزیکول‌های خارج سلولی استفاده می‌شوند. ماکرومولکول‌های منحصربه‌فرد موجود در اگزوزوم نرم‌کننده منشأ والدین خود را منعکس می‌کنند و از این رو احتمالاً به عنوان نشانگر(های) زیستی تعیین می‌شوند.

همه سلول ها اگزوزوم ها را در فضای خارج سلولی آزاد می کنند. از فضای خارج سلولی، اگزوزوم ها به مایعات بیولوژیکی مختلف راه پیدا می کنند و به صورت محلی و دوردست به سلول ها می رسند. سلول های کشت شده در شرایط آزمایشگاهی اگزوزوم های خود را در محیط کشت آزاد می کنند. انتشار مداوم اگزوزوم ها در فضای خارج سلولی، محیط کشت و مایع بیولوژیکی را منبع غنی برای جداسازی اگزوزوم ها می کند.

اگزوزوم ها حاوی مقدار قابل توجهی RNA های کد کننده و غیر کد کننده، قطعات DNA ژنومی دو رشته ای و DNA میتوکندری هستند. ترام ها و همکارانش اولین کسانی بودند که حضور RNA را در "وزیکول های لایه برداری شده"، مخلوطی از اگزوزوم ها و میکرووزیکول ها توصیف کردند.

آنها مشخص کردند که "وزیکول ها یا اگزوزوم های لایه برداری شده" حاوی 5% RNA هستند [5]. ولادی و همکارانش اولین کسانی بودند که به طور سیستماتیک اینگزوزوم های بسته بندی شده RNA را تجزیه و تحلیل کردند. RNA های اگزوزومی شامل mRNA های قابل ترجمه و microRNA (miRs) [35] بود.

MicroRNA ها دسته ای از RNA های غیر کد کننده (ncRNAs) هستند. آنها 22 نوکلئوتید در طول دارند و بیان ژن را در سطح پس از رونویسی با اتصال به 30-مناطق ترجمه نشده RNA های پیام رسان هدف خود تنظیم می کنند [36]. جالب توجه است، برخی از miRNA های غنی شده در اگزوزوم ها در سلول های والد شناسایی نمی شوند که نشان دهنده یک سیستم مرتب سازی/بسته بندی RNA انتخابی در طول بیوژنز اگزوزوم ها است [35،37].

بر خلاف سلول ها، اگزوزوم ها حاوی RNA ریبوزومی کمی هستند یا اصلاً وجود ندارند، اما حاوی قطعات tRNA هستند [38]. مرتب‌سازی RNA به اگزوزوم‌ها بستگی به (1) پروتئین مرتبط با کمپلکس خاموش‌کننده (RISC) القا شده با RNA، (2) موتیف‌های توالی RNA و پروتئین‌های راهنما، (3) افزودن نوکلئوتید در انتهای 30 miRNA، (4) در دسترس بودن سلولی miRNA‌ها، و (5) سرامید [39،40].

ما بر این باوریم که حباب‌های هسته‌ای فرآیند سلولی دیگری است که امکان مرتب‌سازی افتراقی RNA، کمپلکس‌های RNA-پروتئین، و DNA ژنومی را در اگزوزوم‌ها فراهم می‌کند. دلایل متعددی برای این دیدگاه وجود دارد: (1) محتوای "وزیکول های داخل مجرا" شبیه کاریوپلاسم هسته ای [32] بود. "وزیکول ها" در اجسام چند سیکولار هسته ای (MVB II) با RNA، پروتئین های اسیدی و بازی غنی شده بودند، و از این رو نویسندگان در نظر گرفتند " وزیکول های داخل مجرای به عنوان محل سنتز RNA علاوه بر تونوکلئول [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >اگزوزوم های 10 کیلوبین [43-47].

اتفاقاً، DNA ژنومی تنها در اگزوزوم‌های مشتق شده از رده‌های سلولی سرطانی و نه سلول‌های طبیعی شناسایی شد [47]. سلول های سرطانی کروماتین غیرطبیعی به دلیل بازآرایی/جابجایی کروماتین و شاید پلوئیدی دارند [48] که می تواند باعث تکه تکه شدن DNA ژنومی در هسته سلول های سرطانی شود. این قطعات DNA به راحتی می توانند در MVB نوع II (و اگزوزوم) در حال توسعه در هسته گنجانده شوند. (3) نحوه بیوژنز "وزیکول کوچک" در حباب های هسته ای که توسط کیلارسکی و جاسینسکی [24] توصیف شده است، شبیه به تشکیل وزیکول های داخل مجرای در اندوزوم های دیررس در سیتوپلاسم است.

ما قویاً معتقدیم که وجود DNA ژنومی در اگزوزوم ها پاتولوژیک است و از این رو حضور آن در اگزوزوم می تواند به عنوان یک ابزار تشخیصی برای توسعه سلول های غیر طبیعی (یا سرطانی) در بدن استفاده شود. (4) افزایش وابسته به فعالیت در تعداد اگزوزوم‌های آزاد شده توسط سلول‌ها [49] قابل مقایسه با سلول‌های گازی است که با حذف گاز از مثانه شنا ماهی سوف، افزایش حباب هسته‌ای را نشان دادند [24].

اخیراً، پروتئین‌های میتوکندریایی و DNA در اگزوزوم‌های پلاسمایی برخی از بیماران سرطانی شناسایی شده‌اند و حضور آنها با تهاجمی بودن سرطان مرتبط است [50،51].

تجزیه میتوکندری اغلب در سلول های در حال تخریب مشاهده می شود [52،53]. کریستای میتوکندریایی آزاد شده از میتوکندری در حال انحطاط ممکن است توسط اجسام چند وزیکولی درونی شده و در نهایت به صورت اینگزوزوم بسته بندی شوند.

این تصور توسط تصاویر فراساختاری سلول‌های لنفوبلاستوئیدی انسان و لومن آسینی پروستات بابون که دارای «میکرووزیکول‌ها» (یا اگزوزوم‌ها) ناشی از تجزیه کریستاهای میتوکندری است، پشتیبانی می‌شود [54].

بر اساس بحث فوق و شواهد تجربی پشتیبان، ما پیشنهاد می‌کنیم که طبیعت ناهمگن اگزوزوم‌ها از بیوژنز اجسام چند وزیکولی و اگزوزومات‌های مرتبط با مکان‌های زیر سلولی مختلف و نه کاملاً در سیتوپلاسم طبق باور فعلی ما سرچشمه می‌گیرد. پیشنهاد ما می‌تواند ناهمگنی اگزوزوم‌ها را توضیح دهد. و همچنین عدم تطابق بین محاسبات نظری و داده های تجربی در مورد تعداد RNA های کوچک یا مولکول های پروتئین موجود در یک اگزوزوم خالص شده از سرم [55].

بر اساس محاسبات نظری با استفاده از اندازه متوسط ​​اگزوزوم، لی و همکاران پیش‌بینی کردند که هر اگزوزوم تقریباً 70 تا 25،{2}} RNA یا مولکول پروتئین کوچک را در خود جای دهد.

با این حال، داده های تجربی آنها وجود یک مولکول RNA را در هر اگزوزوم خالص شده از سرم نشان داد [55]. فرضیه ما نیاز به کاوش بیشتر در مورد حباب‌های هسته‌ای، اجسام چند سیکولار هسته‌ای، و بیوژنز اگزوزوم‌های حاوی RNA/ریبونوکلئوپروتئین، اگزوزوم‌های چند وزیکولی درون هسته‌ای دارد. ترکیب لیپیدی بین غشای سلول مادر و غشای اگزوزوم متفاوت است.

به طور کلی، لیپیدهای غنی شده در غشاهای بیرونی عبارتند از اسفنگومیلین، سرامید، کلسترول و ریز دامنه های لیپیدی غنی از کلسترول، گانگلیوزید GM3، چربی های غیراشباع و فسفاتیدیل سرین [56-58]. پروتئین های اگزوزومی و بیشتر پروتئین های اگزوزومی متشکل از آن پروتئین های منحصر به فرد هستند و همچنین از پروتئین های منحصر به فرد تشکیل شده اند. به یک سلول والد خاص

محتوای پروتئین تمام اگزوزوم ها به طور کلی برای هدف قرار دادن و ترکیب پروتئین هایی مانند تتراسپانین ها، اینتگرین ها، چاپرون پروتئین ها، به عنوان مثال، پروتئین های شوک حرارتی (Hsp60، Hsp70، و Hsp90)، پروتئین های کوچک قاچاق کننده غشای HSP، پروتئین های Rab، ARF GTPases، annexins، غنی شده است. پروتئین های دخیل در تشکیل اجسام چند وزیکولی مانند ALIX و TSG101 [59].

مطالعات جدیدتر وجود پروتئین های متصل شونده به RNA را نشان می دهد که مجتمع های RNA-پروتئین را در اگزوزوم ها تشکیل می دهند [38]. چندین فرآیند سلولی که بارگذاری پروتئین‌ها را در اگزوزومار تضمین می‌کنند عبارتند از (1) مکانیسم‌های ESCRT برای پروتئین‌ها با تغییرات خاص پس از ترجمه مانند یوبی کوئیتیناسیون، متیلاسیون آرژنین تحریک‌شده با Wnt، اکسیداسیون، فسفوریلاسیون، گلیکوزیلاسیون و سیترولیناسیون. (2) اتوفاژی با واسطه چاپرون (CMA) که متکی بر تعامل بین پروتئین 71 کیلو دالتون (HSC70) و پروتئین‌های دارای یک موتیف KFERQ است.

پس از اتصال HSC70 به پروتئین هایی با موتیف KFERQ، پروتئین ها به اجسام چند وزیکولی هدف قرار می گیرند. اتوفاژی با واسطه چپرون معمولاً برای تخریب پروتئین ها در لیزوزوم ها عمل می کند. داده‌های جدیدتر نشان می‌دهد که CMA در انتشار اگزوزوم و انتشار توده‌های پروتئینی با واسطه اگزوزوم در برخی از بیماری‌های نورودژنراتیو نقش دارد [60-63].

از دهه 1990 افزایش تصاعدی در تحقیقات اگزوزومی وجود داشته است و داده های زیادی در مورد محموله اگزوزومی تولید شده است. پایگاه‌های اطلاعاتی برای ارائه مجموعه‌ای از محموله‌های اگزوزومی قبل از اینکه مدیریت مجموعه داده‌های بزرگ بسیار دشوار شود، ایجاد شده‌اند.

تکرارپذیری داده های منتشر شده در مورد اگزوزوم ها دلیل دیگری است زیرا اکثر آزمایشگاه ها از روش های مختلفی برای جداسازی اگزوزوم ها استفاده می کنند. برای مثال، Vesiclepedia خلاصه‌ای از محموله‌های مولکولی (لیپید، RNA و پروتئین) است که در کلاس‌های مختلف وزیکول‌های خارج سلولی شناسایی شده است [64]. Vesiclepedia منبع ارزشمندی برای محققان فراهم می کند.

پایگاه داده Vesiclepedia به صورت عمومی در دسترس است و به کاربران اجازه می دهد تا داده های محموله اگزوزوم را بر اساس معیارهای جستجوی وارد شده توسط کاربر جستجو و دانلود کنند. EV pedia، Exocarta، ExoRbase و EV miRNA پایگاه‌های اطلاعاتی دیگری هستند که پروتئین‌های اگزوزومال و RNA را فهرست‌بندی می‌کنند [64].

پایگاه های داده توسط حاشیه نویسی های جامعه هدایت می شوند. داده‌های تهیه‌شده در این پایگاه‌های داده با جداسازی اگزوزوم‌ها با استفاده از انواع تکنیک‌های جداسازی که در پایگاه داده گنجانده نشده‌اند، به‌دست می‌آیند.

بنابراین محتوای محموله اگزوزومی ممکن است بر اساس روش جداسازی مورد استفاده متفاوت باشد و باعث ایجاد درجه ای از ابهام در نتایج گزارش شده شود. برای بهبود تکرارپذیری و شفافیت تجربی، یک مجموعه ابزار EV-TRACK مبتنی بر دانش منبع باز توسعه داده شد. EV-TRACK شامل آماده سازی اگزوزوم داده و خصوصیات اگزوزوم [65] است.

یکی از ویژگی های کلیدی EV-TRACK EV-METRIC است که گزارش پارامترهای آزمایشی را به عنوان درصد اجزای تکمیل شده یک لیست 9 تایی ارائه می کند [66]. این مؤلفه‌ها توسط کنسرسیوم EVTRACK تصمیم‌گیری شدند و برای تفسیر و بازتولید داده‌های آزمایشی ضروری تشخیص داده شدند. بنابراین، EV-METRIC برای کمک به محققان و بازبینان در ارائه یک نمای کلی از داده ها طراحی شده است.

2. روش های فعلی برای جداسازی اگزوزوم

اگزوزوم ها منبع غنی برای کشف نشانگرهای زیستی و استراتژی های درمانی جدید از جمله پزشکی احیا کننده هستند. مهمترین عامل برای موفقیت این اهداف، جداسازی اگزوزوم های خالص از طریق یک روش تکرارپذیر است.

جداسازی اگزوزوم‌های دارای قابلیت عملکرد به‌ویژه برای کاربردهای درمانی بالقوه حیاتی است. اگزوزوم ها از مایعات بیولوژیکی مختلف مانند خون، پلاسما، مایع مغزی نخاعی، بزاق، ادرار و شیر خالص شده اند. هر مایع بیولوژیکی دارای خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متفاوتی است که قبل از جداسازی اگزوزوم باید در نظر گرفته شود.

در برخی موارد، اقدامات احتیاطی خاص ممکن است برای جداسازی اگزوزوم ضروری باشد. کاربرد نهایی اگزوزوم های خالص شده یکی دیگر از عوامل تعیین کننده است که بر روش جداسازی اگزوزوم تأثیر می گذارد.

تا به امروز، چندین روش جداسازی اگزوزوم توسعه یافته‌اند و برخی از آنها بر اساس ویژگی‌های اگزوزومی مانند اندازه، چگالی، بار سطحی و پروتئین‌های مرتبط با سطح اگزوزوم هستند (شکل 3) [67].

برخی از روش‌های جداسازی اگزوزوم در حال حاضر در جدول 1 فهرست شده‌اند. روش های برجسته در زیر به اختصار مورد بحث قرار می گیرند.

شکل 3. روش های رایج برای جداسازی اگزوزوم و کاربردهای پایین دست آنها. چندین روش توسعه یافته تا به امروز برای جداسازی اگزوزوم بر اساس چگالی شناور آنها است، طرح 1، 13، و 1.19 گرم در میلی لیتر، روش اولتراسانتریفیوژ (UC) بیشتر به تصحیح رسید. فرآورده‌های خالص اگزوزوم‌ها را بر اساس چگالی شناور آن‌ها با سوکروز اولتراسانتریفیوژ ایزوپیکنیک یا گرادیان چگالی یدیکسانول (DG) جدا کنید.

برای حذف محتوای پروتئین بالا در پروتئینوری، روش اولتراسانتریفیوژ با کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) ترکیب شد. محدودیت زمانی مرتبط با روش اولتراسانتریفیوژ منجر به توسعه روش فیلتراسیون (UF) شد.

عبور نمونه های رقیق مانند محیط کشت و ادرار از یک متمرکز کننده نانو یا میکرو غشایی امکان خالص سازی اگزوزوم را فراهم می کند. گرفتگی غشاء و بازیابی ضعیف پروتئین اگزوزومی، این روش را برای کاربردهای پایین دستی مانند جداسازی RNA و کاربردهای با توان عملیاتی بالا، نامحبوب کرده است.

روش دیگری برای جداسازی اگزوزوم ها از دیالیز فیلتراسیون هیدرواستاتیک سیال بیولوژیکی بسیار رقیق (HFD *) در ترکیب با سانتریفیوژ توسعه یافته است. در روش HFD، نمونه از طریق یک غشای دیالیز با بریدگی 1000 کیلو دالتون وزن مولکولی تحت فشار هیدرواستاتیک دیالیز می‌شود و به ماکرومولکول‌های ناخواسته اجازه می‌دهد تا از نمونه خارج شوند و اگزوزوم‌ها با سانتریفیوژ بازیابی شوند.

روش بارش اگزوزوم بر اساس حلالیت یا پراکندگی و تجمع برای پردازش چندین نمونه به طور همزمان توسعه داده شد. کیت های تجاری برای خالص سازی اگزوزوم بر اساس این استراتژی است.

در این روش اوراسیت های ادرار با پلی اتیلن گلیکول (PEG) 6000 یا در ترکیب با پروتامین (به اضافه 35000 PEG) مخلوط شده و یک شبه یا 1 ساعت روی یخ انکوبه می شوند.

مخلوط گل آلود حاصل از T برای بازیابی اگزوزوم هایی که برای تجزیه و تحلیل RNA و پروتئین پایین دست استفاده می شود سانتریفیوژ می شود. سایر معرف های مورد استفاده برای رسوب اگزوزوم ها عبارتند از: (1) 0.1 مولار استات سدیم pH 4.75 (روش نمک زدایی) (NaAc)، (2) یک4-برابر حجم استون سرد (20- درجه سانتیگراد) ( رسوب حلال آلی پروتئین و به اختصار asPROSPR، (3) و مخلوطی از محلول PEG و دکستران (تا 1.5٪) (روش دو فازی که امکان جداسازی پروتئین ها از اگزوزوم ها را فراهم می کند).

شناسایی پروتئین‌های سطح اگزوزومی منجر به توسعه روش‌های مبتنی بر جذب ایمنی با استفاده از آنتی‌بادی‌ها برای پروتئین‌های سطح اگزوزوم مانند Tim4، انکسین، EpCAM، پروتئین سطح اگزوزوم معمول، CD63 و پروتئین‌های شوک حرارتی (تقابل میل) شد. میل ترکیبی برای لکتین (که به گلیکوپروتئین های روی سطح اگزوزوم ها متصل می شود) و هپارین (که به پروتئوگلیکان های سولفات هپاران روی سطح اگزوزوم متصل می شود) برای توسعه روش های جداسازی اگزوزوم مورد بهره برداری قرار گرفت.

چندین پلت فرم مانند دانه های مغناطیسی، ریز نوک های سیلیسی یکپارچه بسیار متخلخل، سطح صفحات پلاستیکی، فیلترهای سلولزی، فیلترهای میل ترکیبی غشایی، یک ماده جاذب آگاروسومی و دستگاه های میکروسیال برای روش های خالص سازی اگزوزوم مبتنی بر میل ترکیبی مورد استفاده قرار گرفتند و مزایای مختلفی برای استفاده در آنها دارند. تشخیصی، پیش آگهی، به عنوان سیستم های دارورسانی، و تشخیص و تجزیه و تحلیل محموله های فورکسومی.

اقتباس شده با مجوز Konoshenko MY، Lekchnov EA، Vlassov AV، Laktionov PP. جداسازی وزیکول های خارج سلولی: روش های عمومی و آخرین روندها. Biomed Res Int. 30 ژانویه 2018; 2018:8545347. doi: 10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; حق چاپ © 2022 ماریا یو. کونوشنکو و همکاران

این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت مجوز Creative Commons Attribution توزیع شده است، که اجازه استفاده، توزیع، و بازتولید نامحدود را در هر رسانه ای می دهد، مشروط بر اینکه کار اصلی به درستی ذکر شده باشد [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com