محلول یو.

تماس: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang و همکاران

Cistanche tubulosa جلوگیری می کندکلیهبیماری، برای دریافت اینجا کلیک کنیدمحصولات و Cistanche Nz

چکیده

مقدمه:آسیب ایسکمی خونرسانی مجدد سرد (IRI) یک رویداد اجتناب ناپذیر است که عوارض پس از پیوند را افزایش می دهد. ما قبلاً نشان داده‌ایم که مکمل محلول دانشگاه ویسکانسین (UW) با مولکول‌های اهداکننده سولفید هیدروژن (H2S) غیر مورد تایید FDA، IRI سرد را به حداقل می‌رساند و عملکرد پیوند کلیه را پس از پیوند بهبود می‌بخشد. مطالعه حاضر بررسی می کند که آیا یک مولکول دهنده H2S تایید شده توسط FDA، تیوسولفات سدیم (STS)، اثر یکسان یا برتر را در یک مدل موش صحرایی مرتبط بالینی از ارتوتوپیک سیژنیک خواهد داشت یا خیر.کلیهپیوند.

روش:سی موش لوئیس تحت نفرکتومی دوطرفه قرار گرفتند و سپس پیوند ارتوتوپیک سیژنیک سمت چپ انجام شد.کلیهپس از 24-ساعت نگهداری در محلول UW یا UW به علاوه STS در دمای 4 ◦C. موش ها تا روز 14 پس از پیوند تحت نظر قرار گرفتند و برای ارزیابی عملکرد کلیه (برون ده ادرار، کراتینین سرم و نیتروژن اوره خون) قربانی شدند.کلیهمقاطع با H&E، TUNEL، CD68، و میلوپراکسیداز (MPO) رنگ آمیزی شدند تا نکروز حاد توبولار (ATN)، آپوپتوز، ارتشاح ماکروفاژها و ارتشاح نوتروفیل را تشخیص دهند.

نتیجه:پیوندهای UW به علاوه STS بهبود قابل توجهی عملکرد پیوند بلافاصله پس از پیوند، با بهبود بقای گیرنده در مقایسه با پیوندهای UW (p < {{0}}.05)="" نشان="" دادند.="" بررسی="" هیستوپاتولوژیک="" نشان="" داد="" که="" atn،="" آپوپتوز،="" ماکروفاژها،="" و="" ارتشاح="" نوتروفیل="" و="" کاهش="" ژنهای="" پیش="" التهابی="" و="" پیش="" آپوپتوز="" در="" پیوندهای="" uw="" به="" علاوه="" sts="" در="" مقایسه="" با="" پیوندهای="" uw="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" کاهش="" یافته="" است=""><>

نتیجه:ما برای اولین بار نشان می‌دهیم که حفظ پیوندهای کلیوی در محلول UW تکمیل‌شده با STS با سرکوب مسیرهای آپوپتوز و التهابی در برابر IRI سرد طولانی مدت محافظت می‌کند و در نتیجه عملکرد پیوند را بهبود می‌بخشد و بقای گیرنده را طولانی‌تر می‌کند. این می تواند یک استراتژی درمانی کاربردی جدید بالینی برای به حداقل رساندن پیامد بالینی مضر IRI سرد طولانی مدت درکلیهپیوند.

کلید واژه ها:تیوسولفات سدیم (STS) آسیب ایسکمی خونرسانی مجدد (IRI) ذخیره سازی سرد استاتیک (SCS)کلیهپیوند پیوند و بقای گیرنده

1. مقدمه

کلیهپیوند بهترین درمان برای مرحله نهایی استکلیهکلیهبیماری (ESRD). در مقایسه با دیالیز،کلیهپیوند برتر است، زیرا کیفیت زندگی بهتری را فراهم می کند و مزیت بقای قابل توجهی را همراه با مقرون به صرفه بودن آن به ارمغان می آورد [1-3]. با این حال، تهیه کلیه های اهداکننده ذاتاً با آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد (IRI) مرتبط است، که یک پیامد اجتناب ناپذیر از توقف و متعاقب ترمیم جریان خون در طول کاشت ترانس است [4]. استراتژی فعلی برای کاهش IRI ناشی از پیوند، ذخیره سازی سرد ثابت (SCS) پیوندهای کلیه در محلول های استاندارد نگهداری مانند محلول دانشگاه ویسکانسین (UW) روی یخ در دمای 4 درجه سانتیگراد در طول دوره قبل از پیوند است [5]. با این حال، نشان داده شده است که SCS طولانی‌مدت با افزایش مرگ سلولی، التهاب، و سایر رویدادهای سلولی و مولکولی آسیب‌رسان مرتبط است که در نهایت منجر به افزایش بروز تاخیر در عملکرد پیوند (DGF)، نکروز حاد توبولی (ATN) و کاهش پیوند می‌شود. بقا [6-10]. علاوه بر این، برای همگامی با افزایش شیوع ESRD در سطح جهانی و تعداد روزافزون بیماران در لیست انتظار پیوند، بسیاری از مراکز پیوند پیوند کلیه را با دوره های ایسکمیک سرد طولانی می پذیرند که بیشتر به آسیب کلی بافت کمک می کند. پس از SCS، خونرسانی مجدد است، زمانی که خون اکسیژن دار گرم به پیوند سرد ایسکمیک بازگردانده می شود. خونرسانی مجدد، که فاز مؤثر آسیب ایسکمیک است، با افزایش آسیب بافت مشخص می شود [11-13].

یک استراتژی درمانی بالقوه برای محدود کردن IRI سرد در طولکلیهپیوند شامل تکمیل محلول نگهداری استاندارد با سولفید هیدروژن (H2S)، یک گازوترنسمیتر تولید شده درون زا است که نشان داده شده است که نقش های فیزیولوژیکی مهمی در اتساع عروق و سیگنال دهی سلولی ایفا می کند [14-16]. ما قبلاً نشان داده‌ایم که SCS طولانی‌مدت در محلول UW تکمیل‌شده با H2S، IRI سرد ناشی از پیوند را کاهش می‌دهد و بقای پیوند را در مدل‌های موشی پیوند کلیه syngeneic و allogeneic بهبود می‌بخشد [17-19،41، 42]. با این حال، مولکول های دهنده H2S مورد استفاده در این مطالعات از نظر بالینی قابل دوام نیستند. این امر منجر به در نظر گرفتن استفاده از تیوسولفات سدیم (STS)، یک داروی اهداکننده H2S است که توسط سازمان غذا و دارو (FDA) برای درمان کلسی فیلاکسی در بیماران ESRD، سمیت ناشی از سیس پلاتین در درمان سرطان، و به عنوان پادزهر مورد تایید قرار گرفته است. مسمومیت با سیانید [20-23]. مطالعات اخیر نشان داده است که STS اثرات محافظتی در مدل های حیوانی IRI نشان می دهد [24-26]. با این حال، اثر آن بر IRI کلیه سرد ناشی از پیوند ناشناخته است. بنابراین، مطالعه حاضر به بررسی اثرات حفاظتی STS در مدل آزمایشگاهی IRI کلیه و مدل موش پیوند کلیه ارتوتوپی سیژنیک می‌پردازد.

2. مواد و روشها

2.1. پروتکل آزمایشی in vitro

یک مدل آزمایشگاهی از هیپوکسی سرد و آسیب اکسیژن‌رسانی مجدد گرم که شرایط سلولی را در طول IRI سرد in vivo تقلید می‌کند برای ارزیابی اثرات محافظتی STS در طول IRI کلیه استفاده شد. سلول‌های اپیتلیال کلیه موش صحرایی (NRK{0}}}خط سلول E؛ ATCC، ایالات متحده آمریکا) در آزمایش‌های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گرفتند، زیرا این سلول‌ها مستعد آسیب ایسکمیک هستند [27]، و استفاده از آنها مطابق با موش صحرایی است. مدل پیوند برای هدف دوم این مطالعه استفاده شد. سلول ها در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) حاوی 1{36}} درصد سرم جنین گاوی (FBS) غیرفعال شده توسط حرارت در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه و 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین (P/S) کشت داده شدند. سلول ها در شرایط رشد طبیعی 37 درجه سانتیگراد، 21 درصد O2 و 5 درصد CO2 انکوبه شدند. سلول های کنترل در شرایطی مشابه با سلول های قبل از آزمایش بودند. سلول های تجربی با محیط های بدون سرم (SF)، SF به اضافه 200 نانومولار AP39، یا SF با غلظت های متفاوت (50 میکرومولار، 150 میکرومولار، 500 میکرومولار، 1 میلی مولار) از تیوسولفات سدیم پنتا هیدرات (STS)، که از یک محلول تزریقی 250 میلی گرم بر میلی لیتر STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]). غلظت 200 نانومولار AP39 استفاده شد زیرا قبلا نشان داده بودیم که AP39 در این غلظت در یک مدل مشابه IRI سرد در برابر همان رده سلولی محافظت کننده سلولی است [20]. سپس سلولها در دمای 10 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت تحت شرایط هیپوکسیک (5 درصد CO2، 0.5 درصد O2، 95 درصد N2) در اتاقک هیپوکسی HypOxystation H85 (HYPO2YGEN، ایالات متحده آمریکا) انکوبه شدند تا آسیب ایسکمیک سرد ایجاد شود. دمای هیپوترمی 10 ◦C استفاده شد، زیرا این پایین‌ترین دمایی بود که می‌توانست از نظر فناوری به دست آورد و در عین حال سطح اکسیژن 0.5 درصد هیپوکسی را حفظ کرد. به دنبال هیپوکسی، محیط‌های حاوی سلول‌های آزمایشی با محیط‌های کنترل جایگزین شدند و سلول‌ها از طریق انکوباسیون تحت شرایط رشد طبیعی (37◦C، 21 درصد O2 و 5 درصد CO2) به مدت 24 ساعت برای شبیه‌سازی خونرسانی مجدد و آسیب مرتبط با آن، اکسیژن‌رسانی مجدد کردند. پس از 24 ساعت اکسیژن‌سازی مجدد، زنده‌مانی سلولی از طریق رنگ‌آمیزی سلول‌ها با Annexin-V کونژوگه با FITC (FITC-Annexin-V؛ BioLegend، ایالات متحده آمریکا) و 7-آمینواکتینومایسین D (7-AAD؛ BioLegend، ایالات متحده آمریکا) ارزیابی شد. ) که به ترتیب آپوپتوز و نکروز سلولی را اندازه گیری می کند. سلول ها از طریق فلوسیتومتری با استفاده از CytoFLEX S (Beckman Coulter، ایالات متحده آمریکا) آنالیز شدند. FlowJo نسخه 11 (FlowJo LLC، USA) برای دروازه‌بندی مناسب داده‌ها برای تجزیه و تحلیل آماری استفاده شد.

2.2. حیوانات آزمایشی

سی موش نر لوئیس با وزن 275-300 گرم و خریداری شده از رودخانه چارلز (سنت کنستانت، QC، کانادا) در مرکز مراقبت از حیوانات و خدمات دامپزشکی در دانشگاه وسترن (لندن، ON) تحت شرایط استاندارد قرار گرفتند. مطالعات حیوانی توسط شورای دانشگاه غربی در مورد مراقبت از حیوانات و استفاده از حیوانات با شناسه پروتکل 2018-155 تأیید شد.

2.3. مدل پیوند کلیه

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 درصد کاهش وزن) یا مرگ. نقاط پایانی انسانی دو بار در روز بررسی شد و تمام موش ها با قرار گرفتن در معرض CO2 در یک محفظه با سرعت جریان 40 درصد معدوم شدند. در زمان اتانازی، هیچ عارضه جراحی وجود نداشت که بتواند منجر به تغییرات در نتایج شود.

2.4. تجزیه و تحلیل عملکرد کلیه

پس از پیوند کلیه، موش‌ها به مدت 14 روز در قفس‌های متابولیک تحت نظر قرار گرفتند و سپس قربانی شدند. نمونه های خون و ادرار در POD 3، 5، 7، 10 و 14 برای تعیین پارامترهای عملکرد کلیه (کراتینین سرم، نیتروژن اوره خون [BUN]، اسمولالیته ادرار و برون ده ادرار) جمع آوری شد. BUN و کراتینین سرم از گیرندگان پیوند کلیه بودند و موش‌های تحت عمل شم با استفاده از دستگاه IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer (Markham, ON) اندازه‌گیری شدند. سطوح اسمولالیته ادرار با اسمومتری نقطه انجماد با استفاده از دستگاه اسمومتر 3320 (Advanced Instruments, Norwood, MA) تعیین و با استانداردهای ارائه شده توسط شرکت مقایسه شد.

2.5. تجزیه و تحلیل هیستوپاتولوژیک و مورفومتریک

بافت‌های کلیوی تعبیه‌شده در پارافین به بخش‌هایی به ضخامت 4 میکرومتر بریده شدند و برای بافت‌شناسی روی لام‌های میکروسکوپی قرار گرفتند. برش‌ها با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)، برچسب‌گذاری انتهایی دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز dUTP (TUNEL) برای تعیین درجه ATN و آپوپتوز به ترتیب رنگ‌آمیزی شدند. بخش H&E توسط یک پاتولوژیست نابینا کلیه طبق طرح زیر امتیازی برای ATN تعیین شد: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 درصد ATN پیوند. مقاطع کلیه نیز با آنتی بادی های اولیه زیر رنگ آمیزی شدند: نشانگر آسیب کلیه (KIM{1}})، نشانگر سطح ماکروفاژ CD68 و آنزیم خاص نوتروفیل میلوپراکسیداز (MPO؛ Abcam®، تورنتو، کانادا) و با آنتی بادی های ثانویه و کروموژن بستر DAB با استفاده از سیستم Dako Envision (Dako، Glostrup، دانمارک) مطابق پروتکل سازنده و به دنبال آن در زیر میکروسکوپ نوری دیجیتال Eclipse 90i (Nikon® Instruments، نیویورک) با بزرگنمایی 10 برابر و با نرم افزار ImageJ نسخه 1.8 (ملی) تجزیه و تحلیل شد. مؤسسه بهداشت، Bethesda، MD).

2.6. تجزیه و تحلیل کمی PCR

RNA کل از بافت‌های پیوند کلیه به‌دست‌آمده در POD 3 با استفاده از کیت RNeasy® Mini (Qiagen، تورنتو، کانادا) جدا شد و با استفاده از کیت سنتز cDNA OneScript® Plus (ABM، کانادا) در ارتباط با oligo(dT)12- به cDNA رونویسی معکوس شد. 18 پرایمر طبق پروتکل سازنده. RNA و cDNA جدا شده قبل از استفاده از طریق نانو قطره (DeNovix DS{3}} Spectrophotometer, Canada) با رتبه‌بندی A260/280 به ترتیب > 1.95 و > 1.8 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. مخلوط واکنش هر نمونه qPCR دارای حجم 20 میکرولیتر بود و طبق پروتکل Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Canada) ساخته شد و با استفاده از دستگاه CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Canada) آنالیز شد. . توالی های پرایمر با استفاده از نرم افزار Primer-BLAST (NCBI) در برابر بتا-اکتین، پلی (ADP-ribose) پلیمراز (PARP)، اینترفرون-گاما (IFN-)، فاکتور نکروز تومور آلفا (TNF-)، اینترلوکین 6 (IL) طراحی شدند. -6)، لنفوم سلول B 2 (Bcl-2)، Bcl-2- پروتئین X مرتبط (BAX)، کاسپاز 3، آگونیست مرگ دامنه تعاملی BH3 (BID)، c-Jun کیناز N ترمینال 1/2 (JNK1/2)، کواکتیواتور Pparg 1 آلفا (PGC{37}})، کمپلکس میتوکندری I (NDUFB8)، کمپلکس میتوکندری II (SDHB)، پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن 1/2 (ERK1) /2)، ژن‌های لیپوکالین ژلاتیناز نوتروفیل (NGAL) و مولکول آسیب کلیه-1 (KIM{45}}). تمام ژن های مورد نظر در برابر بتا اکتین نرمال شدند. تغییرات برابری بیان ژن با موش های صحرایی شم مقایسه شد و با استفاده از روش ΔΔCt محاسبه شد.

2.7. تحلیل آماری

تمامی تحلیل های آماری با استفاده از بسته نرم افزاری آماری GraphPad (La Jolla, CA) Prism نسخه 9 انجام شد.{1}}. داده های بقا با استفاده از آنالیز بقای Kaplan-Meier و آزمون log rank و داده های بیان ژن qPCR با استفاده از آزمون t یک طرفه بدون جفت مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تمام داده های دیگر با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و سپس آزمون تعقیبی توکی برای تعیین تفاوت های آماری بین گروه ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. معنی‌داری آماری در ص<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. نتایج

3.1. محیط های بدون سرم حاوی STS بقای سلول های اپیتلیال لوله های کلیوی را در طول هیپوکسی سرد/ اکسیژن رسانی مجدد بهبود می بخشد.

آنالیز فلوسایتومتری پس از رنگ‌آمیزی برای آپوپتوز و نکروز نشان داد که سلول‌های NRK{{0}}E تیمار شده با SF در طول IRI سرد in vitro، زنده‌مانی سلولی را به طور قابل‌توجهی در مقایسه با سلول‌های کنترل (نرموکسیک) کاهش دادند (شکل 1A؛ p < 0.05).="" در="" حالی="" که="" همه="" نمونه‌های="" آزمایشی="" زنده‌مانی="" سلول‌های="" اپیتلیال="" لوله‌ای="" کلیوی="" را="" به="" طور="" قابل‌توجهی="" پایین‌تر="" از="" سلول‌های="" رشد="" یافته="" در="" شرایط="" نرموکسیک="" نشان="" دادند="" (05/0p="">< 0)،="" سلول‌های="" تیمار="" شده="" با="" sf="" تکمیل‌شده="" با="" 150="" میکرومولار="" و="" 500="" میکرومولار="" sts="" زنده‌مانی="" به‌طور="" قابل‌توجهی="" نسبت="" به="" سلول‌های="" تیمار="" شده="" نشان="" دادند.="" تنها="" با="" محیط="" sf="" (شکل="" 1a؛="" p=""><0.05)، که="" با="" کاهش="" قابل="" توجه="" آپوپتوز="" در="" مقایسه="" با="" سلول="" های="" تیمار="" شده="" با="" محیط="" sf="" به="" تنهایی="" مطابقت="" داشت="" (شکل="" 1b؛="" p=""><0.05). علاوه="" بر="" این،="" به="" نظر="" می="" رسد="" افزایش="" در="" زنده="" ماندن="" سلول="" و="" کاهش="" آپوپتوز="" با="" 150="" میکرومولار="" و="" 500="" میکرومولار="" sts="" به="" سطوح="" بهینه="" می="" رسد،="" زیرا="" دوز="" بالاتر="" این="" روندها="" را="" معکوس="" می="" کند="" (شکل="" 1a="" و="">

3.2. مکمل محلول UW با STS بقای اولیه و عملکرد پیوند کلیه را بهبود می بخشد

حفظ گرافت های کلیوی در محلول UW تکمیل شده با STS به طور قابل توجهی بقای گیرنده را با 83 درصد بقا تا POD 14 (روز قربانی) در مقایسه با گروه کنترل بدون مکمل STS که 12.5 درصد بقا را به ویژه در 3 روز اول نشان داد، بهبود بخشید. 2A؛ p < 0.05).="" علاوه="" بر="" این،="" مکمل="" sts="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" عملکرد="" پیوند="" را="" در="" طول="" دوره="" اولیه="" پس="" از="" پیوند="" در="" مقایسه="" با="" درمان="" uw="" به="" تنهایی="" بهبود="" بخشید.="" سطح="" کراتینین="" و="" bun="" سرم="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" در="" هر="" دو="" گروه="" uw="" و="" uw="" به="" علاوه="" sts="" در="" pod="" 3="" افزایش="" یافت="" که="" با="" کاهش="" اسمولالیته="" ادرار="" در="" مقایسه="" با="" شم="" ارتباط="" داشت="" (شکل="" 2b،="" c،="" و="" 3a؛="" p=""><{18}}.{25} }}5).="" با="" این="" حال،="" سطح="" کراتینین="" و="" bun="" سرم="" در="" گروه="" uw="" به="" علاوه="" sts="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" در="" pod="" 3="" با="" افزایش="" متناظر="" در="" اسمولالیته="" ادرار="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" uw="" کاهش="" یافت="" (شکل="" 2b،="" c="" و="" 3a؛="" p=""><0.05). جالب="" توجه="" است="" که="" سطوح="" کراتینین="" سرم="" و="" bun="" در="" گروه="" uw="" به="" علاوه="" sts="" به="" طور="" پیوسته="" از="" pod="" 3="" به="" pod="" 14="" با="" افزایش="" اسمولالیته="" ادرار="" کاهش="" یافت="" و="" با="" سطوح="" sham="" قابل="" مقایسه="" بود="" (شکل="" 2b،="" c="" و="" 3a).="" همچنین،="" برون="" ده="" ادرار="" در="" گروه="" uw="" به="" علاوه="" sts="" در="" چهار="" روز="" اول="" پس="" از="" عمل="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" های="" uw="" و="" شم="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" بیشتر="" بود="" (شکل="" 3b؛="" p=""><0.05). با="" این="" حال،="" به="" طور="" پیوسته="" به="" سمت="" ارزش="" پایه="" (sham)="" کاهش="" یافت="" و="" با="" شم="" در="" pod="" 14="" قابل="" مقایسه="" بود="" در="" حالی="" که="" خروجی="" ادرار="" در="" موش="" زنده="" در="" گروه="" uw="" بالاتر="" از="" مقدار="" پایه="" در="" pod="" 14="" باقی="" ماند="" (شکل="">

3.3. افزودن STS به محلول UW مرگ سلولی ناشی از پیوند را پس از پیوند کلیه کاهش می دهد

مقاطع کلیه به دست آمده در POD 3 و 14 با TUNEL به عنوان معیاری برای مرگ سلولی آپوپتوز رنگ آمیزی شد و توسط یک پاتولوژیست نابینا کلیه نمره گذاری شد (شکل 4A). پیوندهای کلیوی از گروه UW مرگ سلولی آپوپتوتیک به طور قابل‌توجهی بالاتری را در POD 3 نشان دادند که با امتیاز TUNNEL بالاتر در مقایسه با کلیه‌های گروه‌های UW به علاوه STS و Sham نشان داده شد (شکل 5A و b؛ p <{5}}.{11} }="" 5).="" پیوندهای="" گروه="" uw="" به="" علاوه="" sts="" در="" مقایسه="" با="" پیوندهای="" sham="" در="" همان="" نقطه="" زمانی="" و="" در="" pod="" 14="" تفاوت="" معنی‌داری="" نداشتند="" (شکل="" 4b).="" علاوه="" بر="" این،="" در="" حالی="" که="" گرافت‌ها="" از="" هر="" دو="" گروه="" uw="" و="" uw="" به="" علاوه="" sts="" نمرات="" atn="" را="" در="" pod="" 3="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" sham="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" افزایش="" دادند="" (شکل="" 5؛="" p=""><0.{21}}5)، پیوند="" uw="" به="" علاوه="" sts="" نمرات="" atn="" در="" pod="" 3="" در="" مقایسه="" با="" uw="" کاهش="" یافته="" است="" (شکل="" 5؛="" p=""><0.05). همچنین،="" در="" حالی="" که="" گیرندگان="" گرافت‌های="" uw="" تا="" pod="" 14="" زنده="" نمی‌مانند="" و="" از="" این="" رو="" امتیازات="" atn="" آن‌ها="" در="" pod="" 14="" تعیین="" نمی‌شود،="" پیوندهای="" uw="" به="" علاوه="" sts="" تا="" pod="" 14="" زنده="" مانده‌اند="" اما="" امتیازات="" atn="" به="" طور="" قابل‌توجهی="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" شم="" افزایش="" یافته="" است="" (شکل="" 5؛="" p=""><>

3.4. پیوند کلیه حفظ شده در محلول UW حاوی STS نشانگر کاهش نشانگر آسیب و نفوذ التهابی را پس از پیوند کلیه نشان داد.

مقاطع کلیه به‌دست‌آمده در POD 3 و 14 با KIM{2}} رنگ‌آمیزی شدند تا آسیب لوله‌ای پروگزیمال و همچنین CD68 (نشانگر ماکروفاژ) و MPO (نشانگر نوتروفیل) تشخیص داده شود و توسط آسیب‌شناس کلیه نابینا نمره‌گذاری شد (شکل‌های 6A, 7A, و سی). بیان بافت کلیوی KIM{6}}، CD68 و MPO در گروه UW در POD 3 در مقایسه با گروه‌های UW به علاوه STS و Sham به طور قابل‌توجهی بالاتر بود (شکل‌های 6B، 7B و D؛ p <{11} }.{16}}5)="" در="" حالی="" که="" بیان="" این="" نشانگرها="" در="" پیوندهای="" uw="" به="" علاوه="" sts="" در="" مقایسه="" با="" sham="" روی="" pod="" 14="" تفاوت="" معنی‌داری="" نداشت="" (شکل‌های="" 6b،="" 7b="" و="" d؛="" p=""> 0.05).

3.5. مکمل STS به محلول UW بیان کلیوی ژن های پیش التهابی، پرو آپوپتوز و میتوکندری را سرکوب کرد.

بیان ژن نشانگرهای پیش التهابی، پیش آپوپتوتیک، هدفمند میتوکندری و آسیب کلیه از طریق qRT-PCR در کلیه پیوندی به دست آمده در POD 3 تعیین شد. بیان ژن های پیش التهابی IFN-، TNF- و IL{8 }} به طور قابل توجهی در پیوندهای UW نسبت به پیوندهای UW به علاوه STS در POD 3 افزایش یافت (شکل 8A؛ p < 0.05)="" و="" از="" همان="" الگوی="" با="" ژن‌های="" طرفدار="" آپوپتوز="" parp،="" bax="" پیروی="" کردند.="" ،="" کاسپازها-3،="" bid،="" jnk1="" و="" jnk2="" (شکل="" 8a؛="" p=""><0.05) در="" حالی="" که="" بیان="" bcl="" ضد="" آپوپتوتیک-2="" اندکی="" در="" uw="" افزایش="" یافت.="" به="" علاوه="" گروه="" sts="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" uw،="" اگرچه="" این="" افزایش="" به="" معنی="" آماری="" نمی="" رسد="" (شکل="" 8a).="" علاوه="" بر="" این،="" بیان="" ژن‌های="" میتوکندریایی="" pgc{23}}،="" ndufb8="" (کمپلکس="" i)="" و="" sdhb="" (کمپلکس="" ii)="" در="" پیوندهای="" uw="" در="" مقایسه="" با="" پیوندهای="" uw="" به="" علاوه="" sts="" به‌طور="" معنی‌داری="" کاهش="" یافت="" (شکل="" 8b؛="" p=""><{35}} .{38}}5)="" در="" حالی="" که="" معکوس="" با="" عبارات="" erk1="" و="" erk2="" مشاهده="" شد="" (شکل="" 8b؛="" p=""><0.05). علاوه="" بر="" این،="" بیان="" ژن="" kim{33}}="" در="" پیوندهای="" uw="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" در="" مقایسه="" با="" پیوندهای="" uw="" به="" علاوه="" sts="" افزایش="" یافت="" (شکل="" 8c؛="" p=""><0.05) در="" حالی="" که="" کاهش="" بیان="" ngal="" در="" پیوندهای="" uw="" به="" علاوه="" sts="" در="" مقایسه="" با="" پیوندهای="" uw="" به="" معنی="" آماری="" نشد.="" پیوندهای="" uw="" (شکل="" 8c؛="" p=""> 0.05).

4. بحث

این مطالعه مکمل محلول نگهدارنده استاندارد را با STS، یک اهداکننده H2S مورد تایید FDA، برای کاهش IRI کلیه سرد ناشی از پیوند، بهبود کیفیت پیوند و طولانی‌تر کردن بقای گیرنده، ایجاد می‌کند. با استفاده از یک مدل آزمایشگاهی IRI کلیه و مدل موش پیوند کلیه ارتوتوپی سیژنیک، ما برای اولین بار نشان می‌دهیم که مکمل‌سازی محلول UW با STS در طول SCS طولانی‌مدت، محافظ اندام و بدن است.

یافته اولیه در مدل آزمایشگاهی ما این است که مکمل STS به محیط‌های بدون سرم سلول‌های اپیتلیال کلیه را از هیپوکسی سرد و آپوپتوز ناشی از اکسیژن‌رسانی مجدد گرم محافظت می‌کند و زنده‌مانی را افزایش می‌دهد، که با مطالعه قبلی ما که در آن اثرات محافظتی میتوکندری را نشان دادیم مطابقت دارد. داروی اهداکننده H2S، AP39، در یک مدل آزمایشگاهی IRI سرد کلیه [20]. جالب توجه است، غلظت STS بالاتر از 1 میلی مولار اثرات مفید را معکوس کرد، به این معنی که STS یک پدیده دوز-پاسخ دو فازی به نام hormesis را نشان می دهد، که در آن غلظت پایین تر محافظ سلولی است در حالی که غلظت بالاتر سیتوتوکسیک است. آسیب میتوکندری پیامد اصلی IRI کلیه است، زیرا نفوذپذیری میتوکندری می تواند تولید آدنوزین تری فسفات (ATP) را مهار کند و تشکیل گونه های اکسیژن فعال (ROS) را افزایش دهد، که یک واسطه مخرب آسیب بافت است [13]. اخیراً پیشنهاد شده است که میتوکندری ها محل اولیه فعالیت STS هستند. نه تنها STS برای تولید H2S در میتوکندری از طریق احیای وابسته به گلوتاتیون و بالعکس از طریق مسیر اکسیداسیون سولفید شناخته شده است، بلکه سنتز ATP میتوکندریایی را حفظ می‌کند، تولید ROS را کاهش می‌دهد و فعالیت‌های آنزیمی پیچیده در زنجیره انتقال الکترون (ETC) را بهبود می‌بخشد [24]. 28-30]. علاوه بر این، مطالعات اخیر نشان داد که STS به طور قابل‌توجهی بیان PGC را افزایش می‌دهد، تنظیم‌کننده مثبت بیوژنز میتوکندری و تولید ATP [26]، که با مشاهدات in vivo ما مطابقت دارد. این مکانیسم‌های مولکولی می‌توانند بیانگر افزایش قابل‌توجهی کمپلکس‌های ETC میتوکندری I و II (به ترتیب NDUFB8 و SDHB) در مدل پیوند کلیه ما با افزایش بقا و عملکرد همانطور که در پیوندهای کلیوی حفظ‌شده در محلول UW تکمیل‌شده با STS مشاهده شد، توضیح دهند.

بر اساس نتایج آزمایشگاهی خود، تصمیم گرفتیم که بررسی کنیم که آیا اثر محافظتی STS در داخل بدن با استفاده از یک مدل پیوند که در آن IRI سرد سهم عمده‌ای در اختلال عملکرد پیوند و افزایش عوارض پس از پیوند دارد، قابل اجرا است یا خیر. یافته های ما نشان می دهد که SCS طولانی مدت (24 ساعت) پیوند کلیه در محلول UW تکمیل شده با STS به طور قابل توجهی کیفیت و عملکرد پیوند را بهبود می بخشد که مشخصه آن کاهش کراتینین سرم و سطوح BUN، برون ده ادرار بیشتر و بقای طولانی مدت گیرنده در مقایسه با پیوندهای حفظ شده در محلول UW به تنهایی است. . توجه به این نکته مهم است که فوری بودن برون ده ادرار حتی پس از پیوند کلیه بالینی یک نتیجه حیاتی است که تعیین می کند آیا دیالیز برای رسیدگی به عملکرد تاخیری پیوند (DGF) لازم است یا خیر. بنابراین، مشاهده ما مبنی بر اینکه STS برون ده ادرار را بلافاصله پس از پیوند افزایش می دهد و با گروه شم در POD 14 قابل مقایسه است، یک یافته امیدوارکننده است. بهبود مشاهده شده در عملکرد کلیه پس از پیوند پیوندهای حفظ شده در محلول UW تکمیل شده با STS نیز مزیت بقای قابل توجهی را به همراه داشت. از نظر کمی، مکمل STS طول عمر پیوند را طولانی کرد به طوری که 83 درصد (5/6) از موش هایی که پیوند UW به علاوه STS دریافت کردند تا POD 14 (روز قربانی) زنده ماندند در مقایسه با تنها 12.5 درصد (1/8) از موش های دریافت کننده پیوندها در محلول UW بدون مکمل STS حفظ شده اند. این یافته از مطالعه حاضر نیز با مطالعه قبلی ما مطابقت دارد، که در آن تنها 14 درصد (1 از 7) از موش‌های دریافت‌کننده پیوندها در محلول UW به مدت 24 ساعت بدون مکمل H2S (GYY4137) نگهداری شدند و تا POD 14 زنده ماندند [20] .

علاوه بر بهبود در پارامترهای عملکرد کلیوی، مکمل STS همچنین با کاهش بیان بافتی ژن‌های پیش آپوپتوز و پیش التهابی، آپوپتوز و التهاب پیوند کلیه را مهار کرد و همزمان ژن‌های ضد آپوپتوز را افزایش داد و ماکروفاژها و CD{3} مثبت را کاهش داد. نوتروفیل های MPO مثبت، که در مجموع منجر به کاهش بیان KIM{5}} و ATN و در نهایت حفظ مورفولوژی کلیه شد. این سایتوکاین‌های التهابی به عنوان واسطه‌های مرگ سلولی در طول IRI سرد شناخته می‌شوند [31]، و کاهش آنها در پیوندهای UW به علاوه STS احتمالاً به دلیل ویژگی‌های شناخته شده STS برای کاهش نفوذپذیری اندوتلیال در تک لایه اندوتلیال عروقی و کاهش تولید سیتوکین است. و باعث تولید سیتوکین های ضد التهابی می شود [32]. همچنین، یافته‌های ما مبنی بر اینکه مکمل STS به محلول UW بیان ژن‌های پیش التهابی را کاهش می‌دهد با مطالعه قبلی در مورد فعالیت ضد التهابی STS با کاهش سطح TNF- و IL{13}} در بیماری‌های عصبی مطابقت دارد [33] ، 34]. از نظر مکانیکی، STS با اتصال به محل فعال آن از طریق پیوندهای هیدروژنی قوی و در نتیجه جلوگیری از دسترسی بستر طبیعی به محل فعال، در نهایت آپوپتوز را متوقف می‌کند،{16}} را غیرفعال می‌کند. STS همچنین فعال‌سازی JNK را مسدود می‌کند، پروتئینی که نقش مهمی در سیگنال‌دهی آپوپتوز ایفا می‌کند [35]، که از یافته‌های ما در مورد اثر تنظیم‌کننده STS روی کاسپاز3 و JNK پشتیبانی می‌کند. با این حال، ما نمی‌توانیم تعیین کنیم که آیا چنین مکانیسم‌هایی در مطالعه حاضر عملیاتی هستند، زیرا آزمایش‌های اضافی برای کشف این مکانیسم‌های مولکولی انجام ندادیم.

یک محدودیت عمده در آزمایش آزمایشگاهی ما چالش فنی ما در استفاده از دمای نگهداری استاندارد فعلی 4◦C [36] است، زیرا 10◦C مورد استفاده ما پایین‌ترین دمایی بود که می‌توانست از نظر فناوری بدون به خطر انداختن محیط کم اکسیژن به دست آورد. این یک تفاوت واقعی در فرآیندهای فیزیولوژیکی سلولی و همچنین در تکنیک های نگهداری است. یک راه حل بالقوه استفاده از هیپوکسی ناشی از مواد شیمیایی در یک کیسه پلاستیکی و قرار دادن آن در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد است تا تنظیمات بالینی SCS را منعکس کند. با این حال، این کیسه‌های تولید اتمسفر بی‌هوازی برای استفاده در دماهای گرم (21 تا 37 درجه سانتیگراد) طراحی شده‌اند، زیرا ترکیبات شیمیایی که باعث ایجاد محیط هیپوکسیک در آن شرایط می‌شوند. هدف مطالعات آینده باید بهینه سازی دما در اتاقک هیپوکسی برای تقلید از تنظیمات بالینی SCS باشد. دستیابی به دمای ثابت 4◦C بدون به خطر انداختن یک محیط هیپوکسیک به ما اجازه می دهد تا تعیین کنیم که آیا فنوتیپ های مشاهده شده در مدل آزمایشگاهی IRI سرد آزمایشگاهی به طور مداوم بیان می شوند یا خیر. جدا از آزمایش آزمایشگاهی، مدل پیوند موش صحرایی ما نیز بدون اشکال نیست. ما پیوند کلیه سنتز را انجام دادیم (اهداکنندگان و گیرندگان ژنتیکی یکسان با سازگاری ایمونولوژیک)، که فقط برای دوقلوهای همسان در پیوند کلیه بالینی قابل استفاده است، در حالی که اکثر پیوندهای کلیوی بالینی آلوژن هستند (اهداکنندگان و گیرندگان ژنتیکی متفاوت). پیوند آلوژنیک گیرندگان پیوند را وادار می‌کند تا قبل از پیوند تحت آزمایش‌های ایمونولوژیک قرار گیرند تا آنتی‌ژن‌های لکوسیت انسانی اهداکننده (HLA؛ مولکول‌هایی که پاسخ ایمنی را القا می‌کنند و تنظیم می‌کنند)، تعیین سازگاری ایمونولوژیک بین اهداکنندگان و گیرندگان، و اجتناب از رد عضو [37،38] انجام دهند. مطالعات آینده با استفاده از STS باید پیوند آلوژنیک را در نظر بگیرند. یکی دیگر از محدودیت‌های مدل پیوند کلیه، این واقعیت است که ما بر اهداکنندگان زنده تمرکز کرده‌ایم، پیوندهای غیربهینه از اهدای اهداکنندگان پس از مرگ قلبی (DCD) به طور فزاینده‌ای به عنوان منبع کلیه‌های اهداکننده در بسیاری از مراکز پیوند در سراسر جهان رایج می‌شوند [39]. DCD اندام های دهنده را در معرض دوره های مختلف ایسکمی گرم علاوه بر زمان های ایسکمیک سرد در طول SCS قرار می دهد و با افزایش نرخ DGF و کاهش بقای پیوند در مقایسه با اهداکنندگان زنده همراه است [40]. بنابراین، مطالعات آینده باید مدل پیوند کلیه DCD را برای ارزیابی اثر STS بر علیه IRI در این مدل در نظر بگیرند.

در نتیجه، مطالعه ما نشان می‌دهد که مکمل محلول نگهدارنده استاندارد با یک داروی اهداکننده H2S قابل دوام بالینی در طول طولانی‌مدت SCS پیوند کلیه، از IRI سرد کلیه ناشی از پیوند محافظت می‌کند، کیفیت کلی پیوند و عملکرد پیوند را بهبود می‌بخشد و بقای گیرنده پیوند را طولانی‌تر می‌کند. با توجه به اینکه خطر ابتلا به DGF با طولانی شدن زمان ایسکمیک سرد در پیوند کلیه بالینی افزایش می‌یابد، که یک نگرانی بالینی عمده ایجاد می‌کند، مشاهده اینکه STS از پیوند کلیه در طول SCS طولانی‌مدت محافظت می‌کند و از DGF پس از پیوند جلوگیری می‌کند، یک نوید بالینی بزرگ است که می‌تواند باعث کاهش یا جلوگیری از پیوند کلیه شود. بروز DGF در پیوند کلیه بالینی در آینده نزدیک بنابراین، مزیت آینده افزودن STS به راه‌حل‌های حفاظتی ممکن است راه‌حل بالقوه‌ای برای این مسئله جاری باشد. به طور کلی، این مطالعه به مجموعه مقالات رو به رشدی اضافه می کند که از اثرات محافظتی سلولی STS و سایر اهداکنندگان H2S در برابر IRI عضو، به ویژه بهبود نتایج پیوند در IRI کلیه سرد ناشی از پیوند، پشتیبانی می کند. این استراتژی‌ها می‌توانند استفاده از گرافت‌های بیشتری را که در معرض زمان‌های ایسکمیک سرد طولانی‌مدت قرار گرفته‌اند، تسهیل کند، که می‌تواند استخر اندام‌های قابل کاشت ترانس را افزایش دهد.

بیانیه مشارکت نویسنده CRediT

همه نویسندگان با ارسال این مقاله موافقت کرده اند. تضاد منافع وجود ندارد.

منابع

[1] RA Wolfe، VB Ashby، EL Milford، و همکاران، مقایسه مرگ و میر در همه بیماران تحت دیالیز، بیماران تحت دیالیز در انتظار پیوند، و دریافت کنندگان اولین پیوند جسد، New Engl. جی. مد. 341 (23) (1999) 1725-1730.

[2] M. Tonelli، N. Wiebe، G. Knoll، و همکاران، مرور سیستماتیک: پیوند کلیه در مقایسه با دیالیز در نتایج مرتبط بالینی، Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093-2109.

[3] MC Cavallo، V. Sepe، F. Conte، و همکاران، مقرون به صرفه بودن پیوند کلیه از DCD در ایتالیا، پیوند. Proc. 46 (10) (2014) 3289-3296.

[4] B. Dorweiler، D. Pruefer، TB Andrasi، SM Maksan، W. Schmiedt، A. Neufang، CF Vahl، آسیب ایسکمی- پرفیوژن مجدد، Eur. J. Trauma Emerg. سرگ. 33 (6) (2007) 600-612.

[5] EE Guibert، AY Petrenko، CL Balaban، AY Somov، JV Rodriguez، BJ Fuller، حفظ اندام: مفاهیم فعلی و استراتژی‌های جدید برای دهه آینده، Transfus. پزشکی مادر. 38 (2) (2011) 125-142.

[6] AK Salahudeen، N. Haider، W. May، ایسکمی سرماخوردگی و کاهش بقای طولانی مدت آلوگرافت کلیه جسد، کلیه Int. 65 (2) (2004) 713-718.

[7] I. Quiroga، P. McShane، DD Koo، و همکاران، اثرات عمده تاخیر در عملکرد پیوند و زمان ایسکمی سرد بر بقای آلوگرافت کلیه، Nephrol. شماره گیری کنید. پیوند. 21 (6) (2006) 1689-1696.

[8] LK Kayler، J. Magliocca، I. Zendejas، TR Srinivas، JD Schold، تأثیر زمان ایسکمی سرد بر بقای پیوند در بین گیرندگان پیوند ECD: تجزیه و تحلیل کلیه زوجی، Am. J. پیوند. 11 (12) (2011) 2647-2656.

[9] MD Doshi، N. Garg، PP Reese، CR Parikh، عوامل خطر گیرنده مرتبط با تاخیر در عملکرد پیوند: تجزیه و تحلیل کلیه زوجی، پیوند 91 (6) (2011) 666-671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr'ebern-Launay, et al., هر ساعت اضافی از زمان ایسکمی سرد به طور قابل توجهی خطر شکست پیوند و مرگ و میر را به دنبال پیوند کلیه افزایش می دهد. 87 (2) (2015) 343-349.

[11] A. Kezic، I. Spasojevic، V. Lezaic، M. Bajcetic، آنتی اکسیدان های هدفمند میتوکندری: چشم اندازهای آینده در آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد کلیه، اکسید. پزشکی سلول Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng، MJ Jou، استرس اکسیداتیو ناشی از اضافه بار کلسیم میتوکندری، Ann. آکادمی نیویورک علمی 1201 (2010) 183-188.

[13] W. Jassem، SV Fuggle، M. Rela، DD Koo، ND Heaton، نقش میتوکندری در آسیب ایسکمی / خونرسانی مجدد، پیوند 73 (4) (2002) 493-499.

[14] PM Snijder، E. van den Berg، M. Whiteman، SJ Bakker، HG Leuvenink، H. van Goor، نقش در حال ظهور گازوترنسمیترها در پیوند کلیه، Am. J. پیوند. 13 (12) (2013) 3067-3075.

[15] JT Hancock، M. Whiteman، سولفید هیدروژن و سیگنالینگ سلولی: بازیکن تیم یا داور؟ فیزیول گیاهی بیوشیمی. 78 (2014) 37-42.

[16] و. 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., درمان سولفید هیدروژن آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد آلوگرافت کلیوی را در طول نگهداری در سرد کاهش می دهد و عملکرد و بقای کلیه پیوند زودهنگام را پس از پیوند کلیه آلوژنیک، J. Urol بهبود می بخشد. 194 (6) (2015) 1806-1815.

[18] I. Lobb، A. Mok، Z. Lan، W. Liu، B. Garcia، A. Sener، سولفید هیدروژن مکمل از عملکرد کلیه پیوند محافظت می کند و بقای گیرنده را پس از آسیب طولانی مدت ایسکمی خونرسانی مجدد سرد با کاهش آپوپتوز پیوند کلیه طولانی می کند. و التهاب، BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Hydrogen Sulfide از پیوندهای کلیوی در برابر آسیب طولانی مدت ایسکمی خونرسانی مجدد سرد از طریق اقدامات خاص میتوکندری محافظت می کند. J. پیوند. 17 (2) (2017) 341-352.

[20] C. Renard، SW Borron، C. Renaudeau، FJ Baud، تیوسولفات سدیم برای مسمومیت حاد سیانید: مطالعه در مدل موش، Ann. فارم. Fr. 63 (2) (2005) 154-161. [21] N. Laplace، V. Kepenekian، A. Friggeri، و همکاران، تیوسولفات سدیم از نارسایی کلیوی به دنبال شیمی درمانی داخل صفاقی هیپرترمیک (HIPEC) با سیسپلاتین، بین المللی محافظت می کند. جی. هایپرث. 37 (1) (2020) 897–902.