بررسی مکانیسم شبه استروژنی گلیکوزیدهای سیستانچ با استفاده از متابولومیک

معرفی

استروژن ها نقش مهمی در بسیاری از فرآیندهای رشدی، فیزیولوژیکی و مرتبط با آن از جمله رشد رحم دارند.1–3 با این حال، استفاده طولانی مدت از استروژن می تواند عوارض جانبی زیادی داشته باشد، مانند افزایش خطر ابتلا به سرطان سینه، سرطان آندومتر و سایر تومورهای زنانه.4,5 بنابراین، محققان متعهد شده‌اند که به دنبال جایگزین‌های استروژن باشند که بتوانند از این عوارض جانبی، معروف به تعدیل‌کننده‌های انتخابی گیرنده استروژن، که فیتواستروژن‌ها دسته مهمی از آن هستند، جلوگیری کنند.6 ترکیبات فیتواستروژن به طور طبیعی در گیاهان با قدرت استروژنی وجود دارند و می توانند برای اعمال فعالیت خود به گیرنده های استروژن متصل شوند. بنابراین، فیتواستروژن‌ها می‌توانند رشد رحم را با ترکیب شدن با گیرنده‌های استروژن فراوان در رحم تحریک کنند، به این معنی که از روش uterotrophic می‌توان برای غربالگری اولیه و ارزیابی فیتواستروژن‌ها استفاده کرد.

سیستانچdeserticola (CD) که در چین به نام Rou Cong-Rong شناخته می شود، ظاهراً برای تولید مثل، رشد و عملکردهای باروری مؤثر است و برای بیش از 1800 سال به عنوان یک تونیک استفاده می شود. 8،9 اخیراً، مطالعات فارماکولوژی نشان داده است که این تونیک عملکردهای دارویی گسترده ای دارد، مانندتنظیم هورمون، فعال، تعدیل کننده ایمنی، آنتی اکسیداتیو، ضد آپوپتوز، محافظت کننده عصبی، ضد درد، ضد التهاب، ضد خستگی و فعالیت های استروژنی.10 گلیکوزیدهای سیستانش (GCs) استخراج شده از CD جزو اجزای اصلی فعال هستند و فعالیت های بیولوژیکی مختلفی را از خود نشان می دهند. اگرچه ترکیبات فعال CD قبلاً مشخص شده است، اما مکانیسم استروژن مانند GCs هرگز مورد بررسی قرار نگرفته است.

توبولوزای طبیعی سیستانچی برای پیشگیری از پوکی استخوان PHGS75% ECH 30% ACT 12%

در این مطالعه ادامه دار، هدف ما تایید استفاده احتمالی از GCs به عنوان فیتواستروژن و انجام یک تجزیه و تحلیل متابولومیک برای کشف مکانیسم استروژن مانند GCها بود. ابتدا، یک روش یوتروتروفیک و تجزیه و تحلیل بافت شناسی برای تایید فعالیت استروژنی GCها مورد استفاده قرار گرفت. مهمتر از همه، ما بر روی تغییرات متابولیک در سرم و ادرار موش با استفاده از تجزیه و تحلیل متابولومیک مبتنی بر UPLC-MS/MS تمرکز کردیم. با توجه به کمبودهای متابولومیک غیرهدفمند، مانند تکرارپذیری و تأثیرات پیچیده ماتریس، یک روش شبه مبتنی بر حالت MRM برای نظارت ویژه بر متابولیت‌ها و شاخص‌ها (از جمله متابولیسم انرژی، استرس اکسیداتیو، متابولیسم لیپیدها و متابولیسم آمینو) استفاده شد. مربوط به اثرات استروژنی، رشد و توسعه به عنوان نشانگرهای زیستی برای تشخیص انتخاب شد. نتایج ما مکانیسم استروژن مانند GCها را روشن می کند که به توسعه و استفاده از GCها کمک می کند.

تجربی

معرف ها

ال-لوسین، ال-کینورنین، ال-تریپتوفان، 5-HTP، اسید کولیک، Nphenylacetylglycine، 5-HT، گلوتاتیون (GSH) و 2،4-دینی تروفنیل هیدرازین ($99). 8}}٪، HPLC) از شرکت فناوری زیستی بیولوژی دالیان ملون (دالیان، چین) خریداری شد. N-Ethylmaleimide (98 دلار، HPLC)، ال-گلوتاتیون اکسید شده (GSSG، 98 دلار، HPLC)، و 1،1،3،3-تتراتوکسی پروپان (TEP) از سیگما (مادرید، اسپانیا) خریداری شد. ال-فنیل آلانین (Ring-D5, 98%, DLM{21}}) از آزمایشگاه های ایزوتوپ کمبریج (MA, USA) خریداری شد. متانول و استونیتریل درجه MS از ACS (هوستون، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. دی اتیل استیل بسترول (با خلوص، 99 دلار.{24}}%)، اسید فرمیک، اسید استیک یخچالی، و هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) از سیگما-آلدریچ (شرکت شیمیایی سیگما، سنت لوئیس، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. Naringenin (خلوص، 98٪ (HPLC)) از شرکت معرف Shanghai Jingchun Aladdin Reagent (شانگهای، چین) خریداری شد. GCها در آزمایشگاه ما تهیه شدند و خلوص آنها با اسپکتروفتومتری فرابنفش با استفاده از اکتئوزید به عنوان نشانگر برای تعیین 60٪ تعیین شد.

آماده سازی GCs

بری،پودر سیستانچ(100 گرم) به مدت 1 ساعت در اتانول 75 درصد (1000 میلی لیتر) خیسانده شد، سپس سه بار reux به مدت 2.5 ساعت استخراج شد. مایع رویی در خلاء غلیظ شد تا بدست آیدعصاره سیستانچ(23.3 گرم). عصاره با آب به غلظت 0.5 گرم در میلی لیتر{4}} رقیق شد (حلالیت با داروی خام تعیین شد). پس از جذب با رزین ماکرو متخلخل AB به مدت 8 ساعت، ستون به صورت متوالی با آب و اتانول 85 درصد شسته شد. شوینده اتانول 85 درصد برای به دست آوردن عصاره اتانولی (8.4 گرم) تغلیظ شد. عصاره اتانولی (0.02 گرم) با دقت وزن شد و در 5{25}} درصد متانول (10 میلی لیتر) حل شد. مقدار 1 میلی لیتر از محلول به 100 میلی لیتر با متانول رقیق شد. در نهایت محلول رقیق شده در طول موج 330 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری فرابنفش اندازه گیری شد. جذب اشعه ماوراء بنفش 0.341 بود، و رابطه خطی برای اکتئوزید توسط UV y ¼ 24.905X + 0.0426 (R2 ¼ 0.9982) بود. هنگامی که حاوی 5.04 گرم GCs بود، نرخ خالص سازی 60٪ بود (اکتئوزید به عنوان نشانگر برای تعیین GC استفاده شد). ارزیابی اثر انگشت GCها در ESI شکل S1 نشان داده شده است.

آزمایش های حیوانی و جمع آوری نمونه

موش های ماده SD نابالغ جنسی (45-60 گرم) و بلوغ جنسی (320-380 گرم) توسط مرکز حیوانات دانشگاه پزشکی هاربین، مجوز حیوانات آزمایشگاهی، SCXK- (ارتش): 2013-001 ارائه شد. حیوانات تحت شرایط آزمایشگاهی SPF قرار گرفتند و با یک رژیم غذایی استاندارد آب شیر به طور آزاد در آزمایشگاه ارائه شدند. تمام روش‌های حیوانی توسط دستورالعمل‌های رفاه و مراقبت از حیوانات استان هیلونگ‌جیانگ تأیید شد و طبق دستورالعمل‌های مؤسسه ملی بهداشت در مورد اصول مراقبت از حیوانات (2004) انجام شد. تمامی موش های مورد استفاده در این آزمایش به مدت یک هفته با محیط فوق سازگار شدند.

موش های SD نابالغ جنسی به طور تصادفی به سه گروه 10 موش تقسیم شدند: گروه خالی، گروه دی اتیل استیل بسترول و گروه GC. در همین حال، 10 موش SD بلوغ جنسی به عنوان گروه کنترل انتخاب شدند. گروه دی‌اتیل استیل‌بسترول با دی‌اتیل استیل‌بسترول (35/0 میلی‌گرم کیلوگرم{4}}، 1 میلی‌لیتر/100 گرم) تزریق شد، گروه GC با محلول GC (30 گرم در کیلوگرم، 1 میلی‌لیتر در 100 گرم) تجویز شد. ) و گروه بلانک و گروه شاهد آب مقطر به همان حجم را دو بار در روز (صبح و عصر) به مدت 3 روز دریافت کردند. در روز سوم، موش‌ها پس از تجویز در قفس‌های متابولیک قرار گرفتند و نمونه‌های ادرار به‌مدت 24 ساعت به‌طور مداوم جمع‌آوری شد. موش‌ها با استفاده از پنتوباربیتال بیهوش شدند و نمونه‌های خونی از آئورت شکمی جمع‌آوری شد و برای بدست آوردن سرم در گرما 3000 (15 دقیقه و 4 درجه سانتی‌گراد) سانتریفیوژ شد. همه نمونه ها در - 20 ذخیره شدند. ج- علاوه بر این، رحم جدا، توزین و با استفاده از فرمالین 10 درصد بررسی شد.

تجزیه و تحلیل بافت شناسی

بافت های متوالی به ضخامت 5 میلی متر از رحم بریده شد. سپس مقاطع بافتی در پارافین جاسازی شدند، با استفاده از روش‌های معمول با H&E رنگ‌آمیزی شدند و با میکروسکوپ نوری مشاهده شدند (BZ{2}}؛ Keyence، اوزاکا، ژاپن). ارتفاع سلول های اپیتلیال رحم با میکرومتر زیر میکروسکوپ اندازه گیری شد.

سیستانچه توبولوزای طبیعی برای تقویت رشد سینه PHGS75% ECH 30% ACT 12%

متابولومیک

تهیه سرم زغال فعال

سرم خالی مخصوص از سرم موش که از مواد درون زا با استفاده از پودر زغال فعال جدا شده بود تهیه شد. پودر زغال فعال (6 گرم) به سرم موش (1{10}}0 میلی لیتر) اضافه شد که به مدت 2 ساعت در دمای اتاق تکان داده شد و در 4 سانتریفیوژ شد. C و 13 500 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه. مایع رویی با استفاده از غشاهای Millipore express PES (Merck Millipore, Ltd.) متصل به سرنگ 20 میلی لیتری به ترتیب زیر تغییر داده شد: 5 میلی متر، 1.2 میلی متر و 0.45 میلی متر. سرم "برهنه شده" بدون نشانگرهای زیستی توسط LC-MS/MS تایید شد.

تهیه محلول های استاندارد

ال-تریپتوفان (Try)، ال-کینورنین (Kyn)، GSSG، N-phenylacetylglycine (N-Phe)، 5- HTP، L-لوسین (Leu)، 5-HT، و اسید کولیک ( CA) محلول‌های استوک (1 میلی‌گرم میلی‌لیتر- 1) ​​با استفاده از متانول 1{10}}0 درصد تهیه شد. GSH در 0.5 میلی‌گرم میلی‌لیتر{12}} در بافر 10 میلی‌مولار NEM PBS تهیه و در {14}} ذخیره شد. C در بطری های قهوه ای. کالیبراتورها با استفاده از ال-تریپتوفان، ال-کینورنین، GSSG، N-phenylacetylglycine، 5-HTP، L-leucine، 5-HT، اسید کولیک و GSH-NEM ترکیبی تولید شدند که به صورت سریالی با مقطر رقیق شدند. اب. محلول استوک ال-فنیل آلانین-d5 (d{25}}Phe) در متانول 100% تهیه شد و محلول کاری d5-Phe (10 نانوگرم در میلی لیتر- 1) تهیه شد. در 100% متانول و ذخیره شده در - 40. سی.

در طول تجزیه و تحلیل، یک مرحله مشتق‌سازی برای جلوگیری از تخریب GSH ضروری بود که باعث بهبود پایداری برای تشخیص و تعیین کمیت GSH شد. GSH پس از واکنش با NEM تعیین شد. 15،16 بر اساس گزارش قبلی، 50 میلی مولار NEM برای GSH انتخاب شد.

آماده سازی نمونه

برای نمونه‌های سرم، 10 میلی‌مولار NEM (200 میلی‌لیتر) به نمونه (200 میلی‌لیتر) اضافه شد، به دنبال آن متانول (1000 میلی‌لیتر حاوی IS Phe-d5 در 10 نانوگرم میلی‌لیتر- 1) و به مدت 20 دقیقه در انکوبه شد. {9}}. ج. پس از سانتریفیوژ در 4. C و 12 000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه، مایع رویی (1000 میلی لیتر) به سانتریتوهای 2 میلی لیتری منتقل شد و تا خشک شدن تبخیر شد. باقیمانده خشک شده پس از سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه در 4 درجه در آب مقطر (100 میلی لیتر) بازسازی شد. C و {18}} دور در دقیقه، و مقدار 10 میلی لیتر از مایع رویی برای تجزیه و تحلیل تزریق شد.

برای نمونه های ادرار، 100 میلی لیتر نمونه در یک لوله 2 میلی لیتری قرار داده شد و به هر نمونه ادرار 1 حجم PBS (m/v) حاوی 50 میلی مولار NEM اضافه شد. سپس متانول (1000 میلی‌لیتر حاوی IS در 10 نانوگرم میلی‌لیتر- 1) اضافه شد و نمونه در - 20 انکوبه شد. C به مدت 20 دقیقه، و سپس با سرعت 12 000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در 4 سانتریفیوژ شد. ج) مایع رویی (1000 میلی لیتر) تحت جریان ملایم نیتروژن در دمای اتاق تا خشک شدن تبخیر شد و سپس باقیمانده در 60 میلی لیتر فاز متحرک حل شد و به مدت 1 دقیقه قبل از سانتریفیوژ با سرعت 13 500 دور در دقیقه و 4 گردابی شد. . C به مدت 15 دقیقه مقدار 10 میلی لیتر مایع رویی برای تجزیه و تحلیل تزریق شد.

اعتبار سنجی روش

اعتبارسنجی سنجش بر اساس «راهنمای صنعت: اعتبارسنجی روش تحلیلی زیستی» (سازمان غذا و دارو، سپتامبر 2013) انجام شد. کالیبراتورها با استفاده از یک ماتریس جایگزین برای Trp، Kyn، GSH، GSSG، 5-HT، 5-HTP، N-Phe، و CA از محلول‌های کاری استاندارد در سرم "برهنه شده" تولید شدند. هر کالیبراتور غلظت کپی شد. منحنی استاندارد با رگرسیون خطی حداقل مربعات وزنی 1/X غلظت کالیبراتور منحنی استاندارد و نسبت‌های مساحت پیک برای آنالیت به IS محاسبه شد.

سنجش دقت و صحت

دقت سنجش نمونه‌های QC ادغام‌شده و نمونه‌های QC سرم / ادرار موش‌های صحرایی تیمار نشده با استفاده از یک دوره تحلیلی درون روز و سه دوره بین روز مورد ارزیابی قرار گرفت. نمونه‌های QC با سه غلظت مختلف با افزودن ال-تریپتوفان، ال-کینورنین، GSSG، N- فنیل استیل گلیسین، 5-HTP، L-لوسین، 5-HT، اسید کولیک و GSH-NEM تولید شدند. محلول‌های استاندارد سرم/PBS که سپس به همان روشی که نمونه‌های in vivo پردازش شدند. محلول‌های استوک استاندارد Try، Kyn، GSSG، N-Phe، 5-HTP، 5-HT، Leu، و CA (1 میلی‌گرم میلی‌لیتر- 1) در 1{16}} تهیه شد. متانول 0 درصد، به جز GSH که در 0.5 میلی‌گرم میلی‌لیتر{18}} در بافر 10 میلی‌مولار NEM PBS تهیه شد. منحنی‌های استاندارد در هشت غلظت مختلف به همان روشی که نمونه‌های QC تولید شدند و با رگرسیون خطی حداقل مربعات وزنی 1/X تجزیه و تحلیل شدند. برای مطالعه اعتبار سنجی روش، روش QC دیگری به طور همزمان با استفاده از سرم/ادرار ادغام شده (50 میلی لیتر) از هر نمونه از گروه های کنترل یا مدل برای به دست آوردن یک نمونه QC انجام شد و سپس به عنوان نمونه های in vivo پردازش شد. یک سری از نمونه های QC و منحنی های استاندارد برای هر 50 نمونه حیوان اجرا شد.

جلوه های ماتریسی

تنوع ماتریکس، که به عنوان تغییر در دقت سنجش برای تعداد زیادی از ماتریس تعریف می‌شود، با استفاده از شش قطعه مختلف سرم/ادرار موش‌های صحرایی برای تجزیه و تحلیل و ارزیابی بازیابی مشخصه‌ای ارزیابی شد. ارزیابی کل اثر ماتریس برای سنجش ترکیب درون‌زا چالش برانگیز است. . یک راه برای آزمایش اینکه آیا یک سنجش دارای اثر ماتریسی (کلی) است یا خیر، ارزیابی بازیابی اسپک است. تست بازیابی اسپیکی شامل اسپک کردن آنالیت به داخل نمونه‌های قبل از استخراج است که با آزمایش فاکتورهای ماتریس (MF) که شامل اسپک کردن آنالیت در نمونه‌های پس از استخراج است متفاوت است. MF به عنوان مساحت پیک آنالیت در سال محاسبه شد وجود ماتریس بیولوژیکی در مقایسه با عدم وجود ماتریس بیولوژیکی. MF نرمال شده با IS مورد استفاده قرار گرفت: نسبت MF ¼ اوج منطقه/IS در حضور ماتریس در مقابل نسبت منطقه اوج/IS در غیاب ماتریس.

تجزیه و تحلیل UPLC-MS/MS

تجهیزات MS مجهز به ستون تحلیلی Waters X BridgeTM BEH C18 XP (2.5 میلی متر، 3.0 × 100 میلی متر؛ Waters، Torrance، CA) برای LC-MS استفاده شد. تجزیه و تحلیل /MS. فاز متحرک گرادیان خطی Q متشکل از 0.1% آب اسید فرمیک (حلال A) و متانول (حلال B) بر اساس برنامه گرادیان زیر استفاده شد: 0–3.{15}} دقیقه (0–1% B); 3. 0–10.0 دقیقه (1–3% B); 1{29}}.0–14.{35}} دقیقه (3–50% B); 14.{40}}–18.0 دقیقه (50–95% B); 18.0-22.0 دقیقه (95-0٪ B)، زمان توقف 25 دقیقه است. حجم تزریق 10 میلی لیتر و سرعت 0.6 میلی لیتر در دقیقه بود. در روش نهایی از پارامترهای زیر استفاده شد: نوع اسکن، MRM. حالت یون، یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) در حالت های یون مثبت و منفی. ولتاژ اسپری یون، ± 4500 ولت؛ گاز پرده 20; دما، 450. C; گاز منبع یون 1, 40; گاز منبع یونی 2, 40. تمام داده‌های UPLC-MS با استفاده از نرم‌افزار AB Analyst (نسخه 1.6.2) و m/z 171.1-125.2 برای استاندارد داخلی d5-Phe (DP, 63 V؛ CE) به‌دست آمدند. 8 ولت، 21 ولت EP، 24 ولت) و شرایط MS در جدول S1 نشان داده شده است.

تحلیل آماری

تمام مقادیر به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد. معنی‌داری تفاوت‌ها بین گروه‌ها از طریق آزمون ANOVA یک طرفه و سپس آزمون دانت با استفاده از بسته آماری برای برنامه علوم اجتماعی (SPSS 20.0، شیکاگو، IL، ایالات متحده آمریکا) مقایسه شد. آستانه معنی داری در این آزمون 05/0p< تعیین شد.

نتایج و بحث

تاثیر GCها بر روی رحم

وزن رحم و تجزیه و تحلیل بافت شناسی برای ارزیابی اثر GCs بر روی رحم استفاده شد. وزن رحم در گروه‌های دی‌اتیل استیل‌بسترول، GC و شاهد نسبت به گروه خالی به‌طور معنی‌داری افزایش یافت (01.0 < {{0}}}). در گروه خالی، اپیتلیوم آندومتر ستونی کم با غدد کوچک، اپیتلیوم غده ای مکعبی شکل و بدون سلول های التهابی بینابینی بود. در گروه دی اتیل استیل‌بسترول، اپیتلیوم غددی و آندومتر ستونی بالا بودند و هیپرپلازی، با تعداد زیادی سلول‌های التهابی بینابینی را نشان دادند. در گروه GC، اپیتلیوم غددی و آندومتر دندانه‌دار بسیار ستونی بودند و هیپرپلازی همراه با تعداد زیادی سلول‌های التهابی بینابینی و ضخیم شدن انتیما را نشان دادند. در گروه کنترل، آندومتر ستونی بالا و اپیتلیوم غدد ستونی کم، با تعداد کمی سلول های التهابی بینابینی بود. در مقایسه با گروه خالی، ارتفاع سلول های اپیتلیال رحم در سایر گروه ها به طور قابل توجهی افزایش یافت (01/0 > P) (شکل 1).

روش اعتبار سنجی نشانگر زیستی شناسایی شده توسط UPLC-MS/MS

محدوده خطی و کالیبراسیون

برای هر اندازه گیری، یک منحنی کالیبراسیون خطی با ضریب وزنی 1/X در ماتریس مورد مطالعه ساخته شد. منحنی های کالیبراسیون برای تجزیه و تحلیل در سرم در روزهای مختلف مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. محدوده کالیبراسیون برای آنالیزها در امتداد هفت نقطه کالیبراسیون، همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، توزیع شده است.

دقت و دقت. این روش از نظر دقت و صحت، هم در روز و هم در روز، برای همه نمونه‌های مورد مطالعه مناسب است. مقادیر این پارامترها در غلظت‌های تنظیم‌شده برای GSH، GSSG، Leu، Trp، Kyn، 5-HTP، اسید کولیک، 5-HT و N-phenylacetylglycine با سه تکرار کمتر از 5% بود. از هر غلظت تجزیه و تحلیل شده است. داده های مربوط به مقادیر بین روز و درون روز دقت و دقت در جدول ESI S2 نشان داده شده است.

جلوه های ماتریسی

همانطور که در جدول S3 ESI نشان داده شده است، هنگام اضافه کردن 1000 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 GSH، 2000 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 GSSG، 1000 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 Leu، بازیابی‌های نوک‌شده 92.5 تا 118.1 درصد بود. , 6000 نانوگرم در میلی لیتر- 1 از Trp, 50 نانوگرم در میلی لیتر- 1 از Kyn, 2 نانوگرم در میلی لیتر- 1 از 5-HTP, 400 نانوگرم در میلی لیتر- 1 اسید کولیک 8 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 از 5-HT، و 2500 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 N-phenylacetylglycine در سه پلات مختلف سرم موش، و هنگام افزودن 100 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 GSH، 200 نانوگرم میلی‌لیتر- 1 از GSSG، 1000 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 از Leu، 6000 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 از Trp، 50 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 از Kyn، 2 نانوگرم میلی‌لیتر{ {37}} از 5-HTP، 400 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 اسید کولیک، 8 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 از 5-HT، 2500 نانوگرم در میلی‌لیتر- 1 از N فنیل استیل گلیسین به سه قطعه مختلف ادرار موش با سطوح پایه مختلف. CV غلظت های Trp و Kyn اندازه گیری شده از این تعداد 10٪ (5 ¼ n) بود. این نتایج نشان داد که ماتریس‌های مختلف به‌طور معنی‌داری بر روی سنجش تأثیر نمی‌گذارند.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای پیشگیری از سرطان رحم PHGS75% ECH 30% ACT 12%

تجزیه و تحلیل پروفایل متابولیت به روش شبه هدفمند

روش شبه هدف برای بررسی متابولیت MRM سرم و ادرار در چهار گروه (بلنک، دی‌اتیل استیل‌بسترول، کنترل و GC) مورد استفاده قرار گرفت.

در مرحله اول، مدل PCA برای نشان دادن تمایز متابولیک چهار گروه ساخته شد. از تجزیه و تحلیل چند متغیره، تفاوت‌های متابولیکی آشکاری بین گروه‌های GC (از جمله دی‌اتیل استیل‌بسترول و گروه‌های کنترل) و گروه خالی وجود داشت. نمونه‌های QC در نمودار امتیازی PCA به‌طور محکمی در کنار هم قرار گرفتند، که نشان داد پایداری سیستم برای این مطالعه متابولومیک سازگار است (شکل 2).

سپس برای متابولیت‌های با تفاوت معنی‌دار در این تحقیق، P-value بحرانی روی 0.05 تنظیم شد. بر این اساس، همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است، متابولیت های افتراقی در مقایسه با گروه خالی به طور آزمایشی به شرح زیر شناسایی شدند: 17 در نمونه های سرم و

12 در نمونه ادرار برای گروه GC، 15 نمونه در نمونه سرم و 9 نمونه در نمونه ادرار برای گروه دی اتیل استیل بسترول، 12 نمونه در نمونه سرم و 11 نمونه در نمونه ادرار برای گروه شاهد، و 11 در نمونه سرم و 7 نمونه در نمونه ادرار که به طور همزمان انجام شده است. موجود در GC، دی اتیل استیل‌بسترول و گروه‌های کنترل. برای درک بیشتر تفاوت‌های متابولیکی بین گروه‌های مختلف، یک نقشه حرارتی خوشه‌بندی برای همه متابولیت‌های متفاوت ایجاد شد که افزایش نسبی (قرمز) یا کاهش (سبز) را نشان می‌دهد (شکل 3).

هجده متابولیت افتراقی که به طور همزمان در گروه‌های GC، دی اتیل استیل‌بسترول و کنترل وجود دارند به‌عنوان شرح داده شدند.

به شرح زیر است: گلوکز، اسید سیتریک، پرولین، بتائین، اورنیتین، N-فنیل استیل گلیسین، فنیل پیروویک اسید، اینوزین، C16:0LPC، کراتینین، و گزانتوزین در سرم، و بنزن استیل گلیسین، اسید پیروگلوتامیک، و اسید پیروگلوتامیک، N{3}}استیل لیزین در ادرار به طور قابل توجهی کاهش یافته است (P < 0.05). در حالی که تورین، اورنیتین، اسید a-ketoglutaric، و اسپرمیدین در ادرار به طور قابل توجهی افزایش یافت (P <{11}}.{12}}5). علاوه بر این، تورین (سرم) به طور قابل توجهی افزایش یافت، در حالی که اسید a-ketoglutaric (سرم)، C18:{17}}LPC (سرم) و بتائین (ادرار) به طور قابل توجهی در گروه دی اتیل استیل‌بسترول و GC کاهش یافت (P <{ 19}}.05); ال-کینورنین (سرم) در گروه دی اتیل استیل‌بسترول تنظیم شد، اما در گروه GC تنظیم شد (05/0 P <). اسید پیروگلوتامیک (سرم) و پرولین (ادرار) کاهش یافت، و اسید سیتریک (ادرار) و نیکوتین آمید (ادرار) به طور قابل توجهی در گروه شاهد و GC افزایش یافت (P <0.05). و فنیل آلانین در گروه GC تنظیم شد (P <0.05).

در این مطالعه، اثرات GCها بر رحم موش‌های صحرایی نابالغ مورد بررسی قرار گرفت. رحم حساس ترین عضو برای سنجش اثرات مواد شیمیایی وابسته به ER است.هربا سیستانچگزارش شده است که با افزایش عملکرد آزادکننده لوتروپین هیپوتالاموس-هیپوفیز-تخمدان باعث افزایش وزن رحم می شود، که در این مطالعه برای GCها نیز مشاهده شد. این نشان داد که GCها فعالیت شبه استروژنی دارند. اخیراً، گزارش‌ها عمدتاً بر مکانیسم غالبی متمرکز شده‌اند که توسط آن اثرات استروژنی از طریق اتصال به ERها بیان می‌شود، اما مکانیسم متابولیک به طور عمیق مورد مطالعه قرار نگرفته است. در این مطالعه، از یک روش شبه متابولومیک برای بررسی مکانیسم استروژن مانند GCها استفاده شد.

واسطه‌های متابولیک یک سری واکنش‌های متوالی به شکل واضح‌تری نسبت به سینتیک آنزیمی یا فردی تغییر می‌کنند. 24 هفده متابولیت در سرم، از جمله گلوکز، اسید سیتریک، تورین، پرولین، بتائین، اورنیتین، اسید پیروگلوتامیک، اسید a-ketoglutaric، N- فنیل استیل گلیسین، فنیل پیروات اسید، اینوزین، C18:0LPC، C16:0LPC،

کراتینین، فنیل آلانین، ال-کینورنین، و گزانتوزین، و 12 متابولیت در ادرار، از جمله بنزن استیل گلیسین، بتائین، تورین، اسید سیتریک، اورنیتین، پیروگلوتامیک اسید، استیل کارنیتین، N{2}}استیل لیزین، نیکوتین‌آمیک اسید، اسپرمیدین و پرولین در مکانیسم استروژن مانند GCها دخیل بودند. چندین متابولیت تغییر یافته از توجه ویژه ای برخوردار بودند زیرا هم در سرم و هم در ادرار وجود داشتند. به عنوان مثال، اسید سیتریک، که از تراکم استیل کوآنزیم A و اسید اگزالواستیک تشکیل می شود و نقش مهمی در چرخه اسید سیتریک مربوط به متابولیسم انرژی ایفا می کند، در سرم گروه GC کاهش یافت، اما در ادرار تنظیم شد. . علاوه بر این، اسید a-ketoglutaric با یک چارچوب کربن گلوتامین، که می تواند تعادل نیتروژن کل را حفظ کند و سنتز پروتئین را تقویت کند، و ماده مرکزی چرخه اسید سیتریک است، در سرم گروه GC کاهش یافت، اما تنظیم آن افزایش یافت. در ادرار. چرخه اسید سیتریک نه تنها مسیر متابولیک نهایی سه ماده مغذی اصلی (کربوهیدرات ها، لیپیدها و اسیدهای آمینه) است، بلکه پیوندی بین متابولیسم قند، لیپید و اسیدهای آمینه و راه اصلی برای به دست آوردن انرژی است. برای بدن. 27،28 این نشان داد که مکانیسم استروژن مانند GCها با متابولیسم انرژی مرتبط است، که همان دی اتیل استیل‌بسترول است. بنابراین، ارتباط واضحی بین چرخه اسید سیتریک و افزایش وزن رحم در موش‌های نابالغ تحت درمان با GC وجود داشت. بتائین به‌عنوان یک اهداکننده مهم متیل، نقش مهمی در رشد و نمو جنین ایفا می‌کند، که نشان می‌دهد بتائین در افزایش وزن رحم نقش دارد. جالب توجه است که تورین در سرم و ادرار تنظیم می‌شود که می‌تواند هضم و جذب لیپید را تقویت کند. و جذب سلولی و استفاده از گلوکز با ترویج متابولیسم گلوکز. همچنین گزارش شده است که کمبود تورین منجر به کاهش وزن در حیوانات جوان می شود، که نشان می دهد تورین نقش مهمی در رشد و نمو دارد. اثر در مقایسه با دی اتیل استیل بسترول.

علاوه بر این، اسیدهای آمینه متعدد به طور قابل توجهی تغییر کردند. نتایج ما نشان داد که GCها باعث ناهنجاری های متابولیکی در اسیدهای آمینه می شوند. متابولیسم اسید آمینه می تواند برای سنتز پروتئین های خاص، پپتیدها و سایر ترکیبات نیتروژن دار یا دکربوکسیلاسیون توسط دآمیناسیون، ترانس آمیناسیون، همراه با تجزیه آمونیاک، یا برای آزادسازی انرژی از طریق چرخه اسید سیتریک استفاده شود. بنابراین، تغییرات این ترکیبات ممکن است در رویدادهای مهم سیگنال دهی که باعث افزایش وزن رحم می شود، دخیل باشند.

علاوه بر این، برای تجزیه و تحلیل دقیق مسیر، متابولیت های دیفرانسیل به چندین مسیر اصلی از جمله چرخه سیترات (چرخه TCA)، متابولیسم گلوتاتیون، طبقه بندی شدند.

متابولیسم آرژنین و پرولین، متابولیسم D-گلوتامین و D-گلوتامات، بیوسنتز فنیل آلانین، تیروزین و تریپتوفان، متابولیسم فنیل آلانین، و سایر مسیرها با استفاده از Pathway Analysis of MetaboAnalyst soware (http://www.metaboanalyst.ca)، همانطور که نشان داده شده است. در شکل 4. مسیر مرتبط با متابولیسم انرژی، از جمله چرخه TCA و متابولیسم گلوتاتیون (هم در سرم و هم در ادرار)، یکی از اهداف اصلی اثرات استروژنی بود. با توجه به مطالعات قبلی، نقش حیاتی مواد شیمیایی استروژنی در متابولیسم انرژی توسط ERها تأیید شد که ژن‌های مورد نیاز برای عملکرد میتوکندری، چرخه TCA و موارد دیگر را تنظیم می‌کنند. نسبت به دی اتیل استیل‌بسترول، که هر دو تا حدودی به چرخه TCA و متابولیسم گلوتاتیون مرتبط هستند، اما GCها بهتر از دی اتیل استیل‌بسترول عمل می‌کنند.

اگرچه مکانیسم‌های احتمالی در این مطالعه مشخص نشد، برخی از متابولیت‌ها انتخاب شدند که می‌توان از آنها برای کشف مکانیسم‌های استروژنی دیگر GCs در رحم در آینده استفاده کرد. بنابراین، برای کشف بهتر مکانیسم، فناوری‌های دیگری مانند پروتئومیکس در تحقیقات آتی مورد استفاده قرار خواهند گرفت.

نتیجه گیری

به طور خلاصه، یک روش متابولومیک شبه هدفمند سرم و ادرار بر اساس UPLC-QTRAP MS برای بررسی مکانیسم‌های استروژن مانند GCها ایجاد شد که نتایج قوی و قابل اعتمادی ارائه کرد. با استفاده از رویکرد شبه هدفمند ایجاد شده، یک دیدگاه جامع از تغییرات در متابولومیک سرم و ادرار مکانیسم شبه استروژنیک (GCs) نشان داده شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای بهبود عملکرد جنسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%