مطالعه عملکرد سیستم ایمنی عصبی سیستانش دسرتیکولا و محصولات بخارپز شراب برنج آن در مدل موش صحرایی القا شده با گلوکوکورتیکوئید - Ⅰ

1. معرفی

سیستانچه deserticolaکه "جین سینگ صحرا" نامیده می شود، یک داروی سنتی چینی است که قرن ها به عنوان یک گیاه یانگ تونیک استفاده می شود.تقویت کننده کلیه و تقویت یانگ[1]. هشت گونه و یک تنوع ازسیستانچ هربا در چین و فقط ثبت شده استCistanche deserticolaYC Ma وسیستانچ توبولوزا(Schenk) Wight در فارماکوپه چینی [2] ثبت شده است. مطالعات فارماکولوژیک نشان داد کهCistanches Herbaمحافظت کننده عصبی [3]، تعدیل کننده ایمنی [4]، محافظت کننده قلبی [5]، ضد خستگی [6]، ضد التهاب [7]، محافظ کبد [8]، آنتی اکسیدان [9]، ضد باکتری [10]، ملین [11] و ضد تومور نشان داده است. اثرات [12]. گستردهطیف فعالیت های بیولوژیکی گزارش شده این جنس به ترکیب پیچیده و متنوع فیتوشیمیایی آن نسبت داده شده است.Cistanche deserticolaحاوی گلیکوزیدهای فنیل اتانول، ایریدوئیدها، پلی ساکاریدها [13] و غیره است. محتوای فنیل اتانوئید گلیکوزیدها در مواد دارویی اصلی بالاترین میزان است [14].

سیستانچ توبولوزای طبیعی برای تقویت کلیه PHGS75% ECH 30% ACT 12%

پردازش مواد چینی مدیکا (CMM) یک تکنیک دارویی سنتی برای برآورده کردن الزامات مختلف برای درمان، توزیع، و ساخت آماده‌سازی بر اساس تئوری طب سنتی چینی است. این محصولات فرآوری شده قطعات جوشانده نام دارند که در کلینیک ها استفاده می شود. هدف فرآوری افزایش کارایی برای کاهش سمیت داروهای خام است. فارماکوپه چینی 2015 ثبت کرد که برش های ضخیم سیستانچ (CD) و سیستانچ بخارپز شده با شراب برنج (WCD) می توانند به عنوان قطعات جوشانده در کلینیک استفاده شوند. گروه تحقیقاتی ما نشان داد که اثر ملین کاهش یافت و اثرات ضد پیری و تقویت کننده کلیه یانگ پس از بخارپز کردن سیستانچ با شراب برنج افزایش یافت [15].

عملکرد محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-آدرنال-غده تیموس (HPAT) در سندرم کمبود کلیه-یانگ اختلال دارد [16]. بیماران مبتلا به کمبود کلیه یانگ نیز دارای اختلال عملکرد سیستم ایمنی گسترده ای هستند. اختلال عملکرد محور HPA ارتباط نزدیکی با نقص ایمنی دارد. نظریه شبکه عصبی غدد درون ریز (NEI) نشان می دهد که سیستم ایمنی و عصبی غدد درون ریز لیگاندها و گیرنده های بسیاری را به اشتراک می گذارند [17] و هیپوتالاموس به عنوان محوری برای پیوند عصبی غدد با سیستم ایمنی در نظر گرفته می شود.

در این مطالعه، ما کمبود کلیه یانگ را در موش‌های مدل با تزریق کورتیکواستروئید اگزوژن تکرار کردیم و مکانیسم کمبود کلیه یانگ را در پاسخ به محصولات مختلف فرآوری‌شده Cistanche deserticola از منظر عملکرد غدد درون‌ریز-ایمنی بررسی کردیم.

2. مواد و روشها

2.1. مواد و شناساگرها

Cistanche deserticola در سال 2019.5 از آلاشان نیمنگگو جمع آوری شد و توسط پروفسور Yanjun Zhai (دانشگاه داروسازی، دانشگاه طب سنتی چینی لیائونینگ، چین) به عنوان ساقه های گوشتی خشک شده Cistanche deserticola YC Ma شناسایی شد. نمونه‌های کوپن در مرکز فناوری مهندسی پردازش لیائونینگ نگهداری شدند.

ترکیبات استاندارد آجوگل از Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (چنگدو، چین) خریداری شد. سیستانوزید F،اکیناکوزید، سیستانوزید A و ایزواکتئوزیداز شرکت Must (سیچوان چین) خریداری شدند. اکتئوساید از Dalian Meilun Bio خریداری شد. Co., Ltd. (دالیان، چین). استونیتریل و متانول درجه MS از Merck KGaA (دارمشتات، آلمان) خریداری شد. اسید فرمیک درجه HPLC از Merck KGaA (دارمشتات، آلمان) خریداری شد. شراب برنج از ژجیانگ برند برج شراب Shaoxing Wine Co., Ltd. (ژجیانگ، چین) خریداری شد.

کورتیکوسترون (CAS: 50-22-6، خلوص > 98٪، شرکت TCI Shanghai Development Ltd.)، قرص chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.)، موش ACTH، CRH، T، IL{{{ کیت‌های تشخیص ELISA 2}}، IFN-c، TNF-، IL-2 و IL-10 از Nanjing Jiancheng Co., Ltd خریداری شدند. کیت ELISA کورتیزول موش توسط شرکت BOSK ارائه شد، آنتی بادی CD4 موش صحرایی، آنتی بادی CD8a (شماره های 561833 و 559976)، لیزات RBC (Solarbio، R1010)، محلول بافر PBS (Solarbio، P{12}})، TRIzol (MAN0001271)، CaM، و اکتین بالادست و پایین دست کیت رونویسی معکوس شرکت Guangzhou Invitrogen (شماره RR037A) و کیت سنتز cDNA (شماره 10000068167) توسط Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. محلول‌ها همگی از نظر تحلیلی خالص بودند و توسط شرکت Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. تولید شدند.

2.2. ابزارهای آزمایشی

نشانگر آنزیمی (Thermo، مدل 3530911931)، بشقاب شوینده اتوماتیک (مدل HBS{1}})، نمایشگر دیجیتال فشار سنج فشار-کشش (مدل VICTOR- 50N)، سانتریفیوژ انجماد با سرعت بالا (مدل Sigma 3k15) اسپکتروفتومتر اولترا میکرو (مدل B-50Q)، تقویت کننده ژن (مدل L96G)، PCR کمی فلورسانس بلادرنگ (مدل StepOne)، فلوسایتومتر (مدل AC66051710132)، میکروتوم پارافین (مدل Olymp)، میکروسکوپ Laika مدل BS{11}}) و دستگاه آب خالص (مدل F7JA36507) استفاده شد.

2.3. تهیه نمونه برای UPLC-Q-TOF-MS و آزمایش های فارماکولوژیک

WCD از همان دسته پردازش شدسیستانچه deserticolaدر آزمایشگاه ما برای تهیه WCD، قطعات خشک CD (ضخامت 5 میلی‌متر) (100 گرم) با شراب برنج (30 میلی‌لیتر) تزریق شد، با فشار بالا (25/1 کیلو پاسکال) به مدت 4 ساعت بخار داده شد و سپس در دمای 55 درجه خشک شد.

پودرهای درشت CD و WCD به مدت 0.5 ساعت در 10 بار 95% اتانول خیسانده شدند، هر بار 3 بار به مدت 1 ساعت با رفلاکس استخراج شدند و فیلتر شدند و فیلترها 3 بار با هم ترکیب شدند. اتانول تحت فشار کاهش یافته بازیابی شد و عصاره برای تجویز به دست آمد. عصاره (1 میلی لیتر) به متانول 50 درصد اضافه شد و حجم کل به 20 میلی لیتر رسید و برای تجزیه و تحلیل محتوا در دمای 4 درجه نگهداری شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای بهبود عملکرد جنسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. شرایط UPLC-QqQ-MS برای تجزیه و تحلیل عصاره های CD و WCD

2.4.1. شرایط تحلیلی LCThMS

سیستم UPLC-MSThMS با نرم افزار MassLynx 4.1 Analyst برای انجام جمع آوری و پردازش داده ها استفاده شد. ستون تحلیلی Acquity UPLC BEH C18 (1{{1{12}}}}0 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) در دمای 40 درجه سانتیگراد بود. فاز متحرک محلول آبی اسید فرمیک (A) و استونیتریل حاوی 0.1 درصد اسید فرمیک (B) 0} بود. گرادیان شستشو 0 بود.{15}}–1.{17}} دقیقه با 3% B، 1.01–2.{22}} دقیقه با 3%–11.5% B، 2.01–3.{29} }} دقیقه با 12% B، 3.01–4.00 دقیقه با 15% B، 4.01–5.00 دقیقه با 20% B، 5.01–6.00 دقیقه با 22% B % B، 6.01-8.{49}} دقیقه با 25٪ B، و 8.01-9.{54}} دقیقه با 10٪ B. سرعت جریان 0.3 میلی لیتر در دقیقه و حجم تزریق 1.0 میکرولیتر بود.

طیف‌سنج جرمی چهارگانه واترز (Xevo TQD، Waters Corp.، Milford، MA، USA) مجهز به منبع یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) در حالت یون منفی استفاده شد. گاز حل زدایی نیتروژن با دبی 500 LThh در دمای 250 درجه بود. همه ترکیبات شناسایی شده در حالت نظارت بر واکنش چندگانه (MRM) اندازه‌گیری شدند. جدول 1 پارامترهای انرژی را نشان می دهد و جدول 2 منحنی های کالیبراسیون برای اجزای مورد تجزیه و تحلیل را نشان می دهد.

2.4.2. تهیه مواد مرجع

توبولوزید A (3.{10}}2 میلی‌گرم)، اکیناکوزید (3.{3}} میلی‌گرم)، 2'-استیلاکتئوزید (2.34 میلی‌گرم)، آکتئوزید (2.45 میلی‌گرم)، ایزواکتئوزید (0.61 میلی‌گرم)، سیستانوزید F ( 2.14 میلی گرم)، سالیدروسید (3.39 میلی گرم)، ژنیپوزیدیک اسید (2.84 میلی گرم)، آژوگل (1.58 میلی گرم)، و کاتالپول (2.39 میلی گرم) در متانول حل شدند تا محلول استوک تهیه شود. محلول استوک با متانول رقیق شد تا غلظت مناسب برای محلول های استاندارد کاری بدست آید. تمام محلول های آماده شده قبل از استفاده در دمای 4 درجه نگهداری می شوند.

2.5. تهیه و گروه بندی مدل های حیوانی

موش‌های نر SD (180 تا 220 گرم) از شرکت بیوتکنولوژی لیائونینگ چانگ‌شنگ، شماره مجوز حیوانات: SCXK (Liao) 2015-0001 خریداری شدند. همه موش‌ها با دسترسی آزاد به غذا و آب در دمای 25 درجه و رطوبت نسبی 30 تا 50 درصد نگهداری شدند. حیوانات به مدت 7 روز قبل از آزمایش در خانه نگهداری شدند.

100 موش صحرایی به طور تصادفی به 1 گروه تقسیم شدند: گروه شاهد خالی (BC)، گروه کنترل مدل (MC)، گروه کنترل مثبت (PC)، گروه کنترل شراب برنج (WC)، گروه CD با دوز بالا (CD). گروه -HD)، گروه با دوز متوسط CD (CD-MD)، گروه CD با دوز کم (CD-LD)، گروه با دوز بالا (WCD-HD)، گروه دوز متوسط WCD (WCD-MD) و گروه دوز کم WCD (WCD-LD). دوزهای CD-HDThWCD-HD، CD-MDTh WCD-MD، و CD-LDThWCD-LD به ترتیب 5.48 gTh (kg ∙ d)، 2.74 gTh (kg ∙ d)، و 1.37 gTh (kg ∙ d) بود. دوز برای گروه PC 1.646 gTh (kg ∙ d) و برای گروه WC، 1 mLTh100 گرم به مدت 40 روز بود. در روز ششم پس از تجویز، به موش‌ها سوسپانسیون آبی کورتیکوسترون (کورتیکوسترون + 0.1% دی متیل سولفوکسید + 0.1% توئین-80 + 0.9% کلرید سدیم) به صورت زیر جلدی تزریق شد. برای گروه BC [18]. غلظت کورتیکوسترون 5 gThL و دوز 0.1 mLTh100 گرم بود. به موش‌های گروه قبل از میلاد با تزریق در همان دوز، نمک نرمال سالین + 0.1% دی متیل سولفوکسید + 0.1% Tween- 80 + 0.9% کلرید سدیم داده شد.

2.6. تعیین توابع محور HPA

2.6.1. تست وزن، دما و قدرت نگهداری

آزمایش وزن هر 3 روز انجام شد و دما هر 6 روز اندازه گیری شد. در طول آزمایش در روز سی و نهم، حداکثر قدرت اندام عقبی با یک گریپ متر اندازه گیری شد. موش ها بر روی سکوهای صاف قرار گرفتند و باعث شد اندام عقبی آنها تیرک را بگیرد. موش‌ها به طور غریزی هر شیئی را می‌گیرند تا وقتی دم کشیده می‌شود از حرکت به عقب جلوگیری کنند تا زمانی که نیروی کشش از چنگال بیشتر شود. هنگامی که موش قدرت گرفتن خود را از دست داد، پیش تقویت کننده می تواند به طور خودکار حداکثر نیروی چنگ زدن را ثبت کند.

2.6.2. تعیین سطح T، CRH، ACTH، CORT و کورتیزول در سرم

یک ساعت پس از آخرین تزریق، موش‌ها با تزریق داخل صفاقی محلول یورتان (20 gTh100 میلی‌لیتر) بیهوش شدند. سپس نمونه‌های خون جمع‌آوری شد و در دمای 3500 r به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد تا سرم به دست آید و در دمای 20- درجه نگهداری شود. غلظت T، CRH، ACTH، CORT و کورتیزول با کیت های ELISA موش مطابق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد.

2.6.3. مشاهدات میکروسکوپی

ساختار مورفولوژیکی بافت غده آدرنال با رنگ‌آمیزی HE مشاهده شد. بافت آدرنال در پارافورمالدئید 10 درصد تثبیت شد، در اتانول دهیدراته شد، با یک محلول زایلن شفاف شد، با روش‌های معمولی جاسازی شد، به برش‌هایی به ضخامت 4 میکرومتر بریده شد، با محلول زایلن موم زدایی شد، با گرادیان اتانول هیدراته شد، و سپس با هماتوکسیلین و eos رنگ‌آمیزی شد. محلول رنگ آمیزی پس از شفاف شدن با زایلن، صفحه با صمغ خنثی مهر و موم شد و زیر میکروسکوپ مشاهده شد.

2.6.4. رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی بیان پروتئین Bax، Bcl-2، Caspase-3، Fas و FasL در غده فوق کلیوی

بخش‌های آدرنال موش صحرایی تثبیت‌شده با فرمالین، پس از برش در ضخامت 4 میکرومتر، پارافین‌زدایی و هیدراته شدند. برای جلوگیری از فعالیت آنزیم پراکسیداز، بخش‌ها به مدت 10 دقیقه در بلوک پراکسید هیدروژن پیش انکوبه شدند. مقاطع در سیترات 0.01 مولار (pH 6.0) غوطه ور شدند و حرارت داده شدند تا به جوش آید. این فرآیند پس از 5-10 دقیقه تکرار شد. پس از سرد شدن، مقاطع با PBS (pH 7.2-7.6) 1-2 بار شسته شدند، در دمای اتاق به مدت تقریباً 5 دقیقه رها شدند و با PBS (pH 7.2-7.6) 2-3 بار شسته شدند. محلول مسدودکننده BSA 5 درصد در دمای اتاق اضافه شد و مایع اضافی روی بخش 20 دقیقه بعد تکان داده شد. آنتی بادی های اولیه رقیق شده مخصوص FasTh FasL، Bcl-2ThBax، و کاسپاز{26}} (1:100 رقیق شده با PBS) اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت یا 4 درجه یک شبه انکوبه شد. مقاطع 2-3 بار با PBS (pH 7.2-7.6) شسته شدند. سپس IgG ضد موش بز بیوتینیله اضافه شد و برش ها در دمای 20 تا 37 درجه به مدت 20 دقیقه خشک شدند و با PBS (pH 7.2-7.6) 4 بار به مدت 5 دقیقه شسته شدند. پس از شستشوی کامل در PBS، بخش ها با مخلوطی از معرف های A و B به مدت 30 دقیقه، با PBS به مدت 45 دقیقه انکوبه شدند و در نهایت با بستر DAB (DAKO) به مدت 30 دقیقه قبل از رنگ آمیزی کمی با هماتوکسیلین، آبگیری شدند. و سوار شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچی برای تقویت حس جنسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. تعیین عملکردهای ایمنی

2.7.1. محاسبه شاخص اندام ایمنی

یک ساعت پس از آخرین تزریق، موش‌ها با تزریق داخل صفاقی محلول یورتان (20 gTh100 میلی‌لیتر) بیهوش شدند و سپس طحال و غده تیموس خارج و بلافاصله در هود استریل وزن شدند. ضرایب وزن طحال یا تیموس (%) � وزن طحال یا تیموس (میلی گرم) وزن بدن (گرم).

2.7.2. تشخیص زیرمجموعه های لنفوسیت T در خون محیطی

اسپلنوسیت ها و هموسیت ها با آنتی بادی های مونوکلونال anti-CD4 (PE) و anti-CD8 (FITC) به مدت 30 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. 2 میلی لیتر لیزات گلبول قرمز اضافه شد و محلول با گرداب مخلوط شد. محلول به مدت 10 دقیقه در تاریکی رها شد و به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی دور ریخته شد و سپس محلول 3 بار با PBS سرد یخ شسته شد و مجدداً در محلول نفوذپذیر PBS معلق شد. حداقل 10 سلول با فلوسیتومتری در عرض 1 ساعت از هر رنگ آمیزی Mab آنالیز شدند.

2.7.3. تعیین سطح IL-10، IL-6، IL-2، TNF- و IFN-c در سرم

یک ساعت پس از آخرین تزریق، موش‌ها با تزریق داخل صفاقی محلول یورتان (20 gTh100 میلی‌لیتر) بیهوش شدند و از آئورت شکمی خون گرفته شد. خون در 3500 r به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد تا سرم بدست آید و در دمای 20- درجه نگهداری شود. غلظت‌های IL-10، IL-6، IL-2، TNF- و IFN-c با کیت‌های الایزای موش طبق دستورالعمل سازنده شناسایی شد.

2.8. بیان CamM در بافت های هیپوتالاموس و هیپوفیز

RNA کل از بافت هیپوتالاموس و هیپوفیز توسط TRIZol استخراج شد. رونویسی معکوس بر روی 10 میکرولیتر RNA کل طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. مقادیر مساوی از cDNA از طریق qPCR در حضور رنگ متصل شونده به dsDNA (Promega، ایالات متحده آمریکا) و سیستم PCR Real-time CFX 96 (Bio-Rad، ایالات متحده آمریکا) برای بررسی ژن‌های مختلف تحت شرایط فعال‌سازی اولیه در 95 درجه برای 10 دقیقه، 40 چرخه دناتوراسیون در 95 درجه برای 15 ثانیه، و گسترش بازپخت در 60 درجه به مدت 1 دقیقه.

پرایمرهای CaM و -actin در جدول 1 آورده شده است و -actin به عنوان یک کنترل داخلی استفاده شد. هر نمونه با استفاده از تفاوت در آستانه بحرانی (Ct) بین ژن هدف و -اکتین نرمال شد. از معادله زیر برای توصیف نتیجه استفاده شد: ΔΔCt � (ژن هدف Ct - ژن Ct - اکتین) گروه آزمایش - (ژن هدف Ct - ژن Ct - اکتین) گروه کنترل. سپس سطوح mRNA هر نمونه با استفاده از بیان 2- ژن هدف ΔΔCt مقایسه شد. نتایج هر گروه به طور میانگین محاسبه شد (جدول 3).

2.9. تحلیل آماری

تمامی داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS (نسخه 19.{1}}، SPSS Institute Inc., Chicago, IL) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تفاوت بین گروه ها با استفاده از آنالیز واریانس با اندازه گیری های مکرر یک طرفه (ANOVA) آنالیز شد. نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism (نسخه 6.{5}}، San Diego, CA, USA) بیان شد. تفاوت‌های با مقدار P کمتر از 05/0 0 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد.

3. نتایج تجربی

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalysis

برای دستیابی به بهترین جداسازی، شکل پیک و زمان تحلیل کوتاه، شرایط کروماتوگرافی شامل ستون، فاز متحرک و برنامه گرادیان در آزمایش اولیه ما مورد مطالعه قرار گرفت. کروماتوگرام های معمولی با حالت MRM در شکل 1 ارائه شده است.

از جدول 4، می بینیم که محتویات گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید در WCD نسبت به CD افزایش یافته است، به ویژه برای اکیناکوزید و اکتئوزید، در حالی که محتوای ایریدوئیدها در WCD کاهش یافته است.

3.2. مقررات برای عملکرد محور HPA

3.2.1. تست وزن، دما و قدرت نگهداری

موش‌های گروه MC و گروه‌های تجربی پس از دریافت کورتیکوسترون به تدریج علائم کمبود کلیه یانگ را نشان دادند. علائمی مانند کاهش وزن، هیپوترمی، از دست دادن درخشندگی مو، افتادگی روحیه، تاخیر در پاسخ و کاهش قابل توجه مصرف آب و فعالیت، در گروه CD و WCD بسیار بهبود یافت. شکل 2 (الف) تغییرات وزن را نشان می دهد. وزن هر یک از گروه های دارویی به ویژه در گروه های CDHD و WCD-HD افزایش یافت. افزایش وزن در گروه MC کمترین بود. شکل 2(b) تغییرات دما را نشان می دهد که در گروه MC کمترین میزان بوده و در گروه های WCD-HD، WCD-MD و WCD-LD دما افزایش یافته است.

شکل 2(c) نشان می دهد که قدرت نگهداری برای گروه BC و هر یک از گروه های آزمایشی افزایش یافته است و گروه WCD-MD بالاترین میزان را دارد که نشان می دهد علائم ضعف ناشی از کمبود کلیه یانگ پس از تجویز بهبود یافته است.

3.2.2. سطوح T، CRH، ACTH، CORT و کورتیزول

شکل 3 نشان می دهد که در مقایسه با گروه BC، سطح T، CRH، ACTH، و CORT در سرم موش کاهش یافته است (P < 0.01) و سطح کورتیزول کاهش یافته است (P < 0.05) در گروه MC. در مقایسه با گروه MC، سطح T در گروه‌های WCD-HD و WCD-MD افزایش یافت (P < 0.01)، سطح CRH در WCD-LD، گروه‌های WCD-MD و WC بهبود یافتند (P < 0 گروه‌های CD-MD، WCD-MD، و WCD-HD (01/0 > P) و در گروه‌های CDHD و WCD-LD افزایش یافت (05/0 > P)، و سطح کورتیزول در هر یک از گروه‌های دارویی افزایش یافت.

3.2.3. نتایج مشاهده میکروسکوپی

بافت غده آدرنال را می توان به لایه کورتیکال و لایه بصل النخاع تقسیم کرد. لایه های قشری شامل لایه های کروی، باندلی و شبکه ای است. سلول ها حاوی چربی بیشتری هستند و لایه بصل النخاع عمدتاً از سلول های فئوکروموسیتوم و مقدار کمی بافت فیبری تشکیل شده است. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، ما دریافتیم که همه چیز در گروه BC طبیعی بود، در حالی که در گروه MC، قشر آدرنال هیپرپلازی آشکار، آتروفی سلولی و تراکم فزاینده داشت. نوار پیازی ضخیم شد و ناحیه فاسیکولار نیمه شفاف، زونا مشبک باریک و سلول‌های کوچک‌تر رنگ‌آمیزی ناهموار و احتقان مویرگی را نشان دادند. در گروه PC، مرزهای قشر مغز و مدولار قابل مشاهده بود. سلول های باند کروی و بسته نرم افزاری به طور یکنواخت مرتب شدند و ساختار مورفولوژیکی بازسازی شده بود. همان ترمیم بهتر در گروه‌های WCD مشاهده شد و اثرات در گروه WCD-MD بهتر از گروه‌های WCD-HD و WCD-LD بود. مورفولوژی غده فوق کلیوی در گروه های CD به خوبی در گروه های WCD نبود.