Stx2 بیان ژن دیفرانسیل را القا می کند و ژن های ریتم شبانه روزی را در لوله پروگزیمال مختل می کند Ⅱ

3. بحث

3.1. آسیب شناسی لوله پروگزیمال در بیماران STEC و مدل های حیوانی

الیگوری نشانه ای ازنکروز حاد لوله ای(ATN). به دلیل ATN، سلول‌های اپیتلیال فرورفته، مجرای لوله‌ها را مسدود می‌کنند تا جریان مایع را کاهش دهند که به صورت الیگوری ظاهر می‌شود. در بیماران STEC، الیگوری و آنوری اغلب یافته هایی هستند که نشان دهنده ATN هستند. کاهش عملکرد توبول پروگزیمال در مراحل اولیه بیماری عفونی STEC با افزایش 2MG و NAG ادرار نشان داده شده است [3،33]. B2MG یک پروتئین کوچک 12 کیلو دالتون است که آزادانه از طریق گلومرول ها فیلتر شده و در حالت سالم به طور کامل توسط لوله های پروگزیمال جذب می شود. با این حال، هنگامی که لوله های پروگزیمال آسیب می بینند، مقدار 2MG در ادرار افزایش می یابد، بنابراین به عنوان یک نشانگر زیستی برای عملکرد لوله پروگزیمال عمل می کند. NAG یک آنزیم لیزوزومی بزرگ 130 کیلو دالتون و گلوکوزیداز اصلی در توبول پروگزیمال است. به دلیل اندازه بزرگ، گلومرول نمی تواند NAG را فیلتر کند در حالی که لوله های پروگزیمال آسیب دیده NAG را در ادرار ترشح می کنند. بنابراین، افزایش NAG ادراری یکی دیگر از نشانگرهای زیستی برای آسیب لوله پروگزیمال است. هیستوپاتولوژی گلومرولی مانند مویرگ های انسدادی با فیبرین یافته های مکرر بیماران STEC است. با این حال، داده های ادراری بالا نشان دهنده آسیب لوله پروگزیمال در بیماری قبلی است. همچنین ادرار بیماران STEC حاوی گچ‌هایی متشکل از اپیتلیوم لوله‌ای است که در نتیجه خراشیده شدن سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال آسیب‌دیده است [1]. در مدل‌های حیوانی، ریزش سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال اغلب هم در مدل‌های عفونت STEC و هم در مدل‌های تزریقی Stx یافت می‌شود [25-27،34]. در مطالعه کنونی، ما ریزش سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال را در کلیه‌های موش{12}تزریق شده با Stx یافتیم که نشان‌دهنده تغییر لوله پروگزیمال ناشی از Stx است (شکل 1). همچنین، ما گیرنده Stx2 Gb3 را در هر دو موش ولوله های پروگزیمال کلیه انسانبا بیان سمت مجرا که نشان دهنده تعامل مستقیم Stx2 با لوله های پروگزیمال است (شکل 2 و 3). PDK4 پیرووات دهیدروژناز را فسفریله می کند تا فعالیت آن را مهار کند و در نتیجه مصرف گلوکز کاهش یابد و متابولیسم چربی در پاسخ به روزه داری طولانی مدت و گرسنگی افزایش یابد. از سلول های اپیتلیال جدا شده در برابر مرگ سلولی ناشی از جدا شدن (anoikis) محافظت می کند [35]. PDK4 در ابتدا در 4 ساعت اوج داشت، سپس اوج دیگری در ساعت 8 داشت (شکل 5A). در 12 ساعت کاهش یافت، اما از آنجا تا 72 ساعت با تغییر log{12}}برابر افزایش تدریجی داشت و به 3 (12-تغییر برابری) ختم شد (شکل 5A). جدا شدن سلول‌های اپیتلیال در سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال موش{16}تزریق شده با مورفولوژی نسبتاً دست‌نخورده (شکل 1) رخ داد، این ممکن است منعکس‌کننده دگرگونی PDK4 باشد.

پودر عصاره CISTANCHE TUBULOSA برای کلیه

از آنجایی که NHERF1 (SLC9A3R1) به چسبندگی سلولی طبیعی به ماتریکس خارج سلولی [36]، سازمان اسکلت سلولی اکتین، و حفظ مورفولوژی سلولی کمک می کند، کاهش بیان این ژن ممکن است عواقبی مانند ریزش سلول ها داشته باشد (شکل 5K).

به نظر می رسد اثر Stx2 بر لوله های پروگزیمال عامل مهمی برای بیماری عفونی STEC باشد. با این حال، تغییرات در بیان ژن با تمرکز بر سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال in vivo قبلاً در دسترس نبود. کیپرز و همکاران [37] ژن‌های بیان‌شده متفاوت (DEGs) را در کلیه‌های موش‌های تزریق شده با LPS نشان داد، به طوری که بیشتر ژن‌های اولیه و تا حد زیادی تغییر یافته از تأثیر LPS بودند و ژن‌هایی که خیلی دیر تغییر کردند، از اثر Stx2 بودند. . داده‌های آن‌ها بینش ارزشمندی را در مورد بیان ژن‌های افتراقی کلیه نشان داد، اما انواع سلول‌هایی را که مسئول این تغییر بودند از هم جدا نکردند. در مطالعه حاضر، ما سعی کردیم با مقایسه داده‌های ریزآرایه‌ای از موش، به دنبال DEGهایی باشیم که با سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال مرتبط هستند.کلیه و لوله پروگزیمال اولیه انسانسلول هایی که با Stx2 تیمار شدند.

3.2. فاکتورهای لوله پروگزیمال دخیل در Stx2-آسیب شناسی القا شده در رابطه با فعالیت های شناخته شده Stx2 در سلول های بیانگر Gb3

3.2.1. فعالیت (I)، انتقال سیگنال ناشی از اتصال Stxs به Gb3

زیرواحدهای B Stxs فسفوریلاسیون تیروزین کیناز src غیر گیرنده را القا می کنند [4]. بله فسفریله شده، مولکول های سیگنال دهی پایین دست را با فعالیت کیناز خود فعال می کند و منجر به بازسازی اسکلت سلولی می شود [5]. فسفوریلاسیون پروتئین مرتبط با بله (YAP) در Y357 توسط Yes برای القای جابجایی هسته ای YAP شناخته شده است، جایی که به عنوان یک فعال کننده رونویسی برای القای ژن های هدف مانند CTGF عمل می کند [38]. پروتئین های ماتریسلولی CYR61 (CCN1) و CTGF (CCN2) به ماتریکس خارج سلولی (ECM) ترشح می شوند و با اتصال اینتگرین های گیرنده و پروتئوگلیکان های هپاران سولفات متصل به سطح سلول (HSPGs) به حفظ چسبندگی سلول-ECM کمک می کنند [39،40]. مولکول کلیدی رونویسی CCN1 و 2 YAP است و در حالت عادی تحت مسیر سیگنالینگ Hippo غیر فعال نگه داشته می شود (فسفریله شده در باقیمانده سرین 127). هنگامی که چسبندگی سلولی کم تشخیص داده شد، YAP (S127) دیگر فسفریله نمی شود و به آن اجازه ورود به هسته را می دهد و رونویسی CCN1 و 2 افزایش می یابد [41-43]. CCN1 و 2 به عنوان مولکول های ترمیم کننده زخم برای ترمیم بافت از دست رفته سلول عمل می کنند [38،44]. در مجموعه داده ما، CCN1 و 2 در نقطه زمانی قبلی (6 ساعت) اوج های کوچکی داشتند. این ممکن است منعکس کننده فعال سازی بله ناشی از اتصال Stx2 باشد. ساعات بعد، sloughing ممکن است با خاموش کردن مسیر سیگنالینگ Hippo برای القای بیان بیشتر CCN1 و 2 در 12 ساعت یا بعد، باعث فعال شدن بیشتر YAP شود (شکل 5C).

3.2.2. فعالیت (II)، القای ER-Stress/UPR

Stxs به ER می‌رسند، جایی که قطعات A1 ​​و زیرواحدهای بریده‌شده B از پروتئین‌های بازشده تقلید می‌کنند [9،10،45،46]. پروتئین تنظیم شده با گلوکز 78 کیلو دالتون (Grp78، پروتئین ایمونوگلوبولین اتصال دهنده (Bip)) سه پروتئین کلیدی UPR را مهار می کند. ) و فعال کردن فاکتور رونویسی 6 (ATF6) در غشای ER در حالت عادی. با این حال، به دلیل تمایل بیشتر Grp78 به پروتئین‌های بازشده، آن پروتئین‌های لنگر را آزاد می‌کند. ATF6 پس از انتشار فعال می شود و CHOP (DDIT3) و پروتئین اتصال دهنده X-box 1 (XBP{19}}) mR NAs را افزایش می دهد، در حالی که Ire{20}} mRNA XBP-1 را برای تولید XBP{{{{ پروتئین 22}} که به رونویسی CHOP (DDIT3) کمک می کند. فعال‌سازی PERK منجر به فعال‌سازی ATF4 می‌شود که همچنین mRNA CHOP (DDIT3) را افزایش می‌دهد. بنابراین، افزایش mRNA ژن CHOP (DDIT3) مشخصه UPR است [47،48]. Stxs گزارش شده است که UPR را القا می کند و CHOP (DDIT3) در مجموعه داده ما تنظیم مثبت شده است (شکل 5D-G).

GDF15 به خانواده فاکتور رشد تبدیل کننده بتا (TGF) تعلق دارد. اخیراً نشان داده شده است که GDF15 واسطه کاهش وزن ناشی از داروی دیابتی متفورمین است [49]. در موش‌های خوراکی متفورمین، mRNA GDF15 روده و کلیه افزایش یافت که منجر به افزایش GDF15 سرم شد. GDF15 در گردش از طریق یک گیرنده محدود شده توسط ساقه مغز برای سرکوب دریافت غذا و کاهش وزن بدن عمل می کند [50]. در موش‌هایی که با متفورمین تجویز شده‌اند، افزایش GDF15 کلیه حداقل تا حدی تحت نظارت CHOP (DDIT3) است. در مجموعه داده ما از کلیه‌های موش‌های تزریق شده{12}}Stx، CHOP (DDIT3) ابتدا در 4 ساعت با یک پیک بسیار کوچک افزایش یافت و سپس روند افزایشی را به سمت 48 ساعت شروع کرد، جایی که سطح یک گزارش را حفظ کرد{16 }}تغییر برابر در حدود 1.3 (شکل 5E). بر اساس تحلیل خوشه‌ای STRING، GDF15 ورودی فعال را از فاکتورهای رونویسی CHOP (DDIT3) و ATF3 (شکل 5E) دریافت می‌کند [51،52]. وزن موش تزریق شده{26}}بعد از 24 ساعت شروع به کاهش یا انحراف از کنترل سالین کرد (شکل S3B). افزایش mRNA ژن GDF15 در کلیه در 12 ساعت ممکن است بر ساقه مغز تأثیر بگذارد تا مصرف غذا را کاهش دهد، که به نوبه خود به عنوان کاهش وزن ظاهر شد (شکل 5E و S3B). از آنجایی که سطح بیان GDF15 پس از 24 ساعت همچنان بالا بود، موش ها همچنان وزن خود را کاهش دادند (شکل 5E و S3B).

با استرس ER، PERK از Grp78 (Bip) آزاد می‌شود و الیگومریزه می‌شود و فسفریله می‌شود و eIF2 را مهار می‌کند که منجر به سرکوب ترجمه جهانی می‌شود، به جز چند پروتئین پاسخ‌دهنده به UPR مانند ATF4، CHOP و Grp78. GADD34 (زیر واحد تنظیمی پروتئین فسفاتاز 1 15A (PPP1R15A)) یکی از پروتئین‌های افزایش‌یافته تحت مهار فسفریله فسفریله شده با eIF2 (eIF2 (P)) است و در مجموعه داده ما تنظیم شده است (شکل 5D,G). GADD34 یک پروتئین فسفاتاز{16}} است که eIF2 (P) را دفسفریله می‌کند تا مهار سنتز پروتئین ناشی از UPR را تنظیم منفی کند [53]. عبارت GADD34 (PPP1R15A) بعد از 12 ساعت Stx2 در مجموعه داده ما، log2-تغییر برابر بزرگتر از 1 می شود و تا 24 ساعت زمانی که فلات می شود، افزایش می یابد (log2-تغییر برابری برابر با 2.1) و این را حفظ می کند. سطح را تا انتها (شکل 5D,G). این نشان می‌دهد که UPR ناشی از Stx پس از 12 ساعت بازخورد منفی داشته است. افزایش رونویسی و ترجمه CHOP (DDIT3، GADD153) مشخصه استرس ER است و الگوی بیان دیفرانسیل شبیه GADD34 است به جز اینکه log2 بزرگتر از 1 بعد از 24 ساعت رخ می دهد و پس از آن به تدریج فلات می شود (log2 برابر با 1.3) (شکل 5D,G). همچنین، CEBPB، شریک اصلی دیمریزاسیون CHOP، در مجموعه داده ما تنظیم شده است (شکل 5D,G). این نتایج نشان می‌دهد که در حالی که استرس ER ناشی از Stx از اوایل دوره زمانی شروع می‌شود، اثر را تا 24 ساعت افزایش می‌دهد و این سطح از استرس ER را تا انتها حفظ می‌کند در حالی که بازوی بازخورد منفی نیز به طور همزمان خود را متعادل می‌کند.

3.2.3. فعالیت (III)، فعالیت پروتئین غیرفعال کننده ریبوزوم (RIP).

با جدا کردن یک آدنین از rRNA، Stxs سنتز پروتئین de novo را مهار می کند. rRNA دپورینه شده بر تغییر مورفولوژی ریبوزومی تأثیر می‌گذارد، که انتقال سیگنال [11] معروف به پاسخ استرس ریبوتوکسیک (RSR) را فعال می‌کند و منجر به فعال‌سازی ژن مشخص می‌شود (به پاراگراف بعدی مراجعه کنید).

3.2.4. فعالیت (IV)، پاسخ به استرس ریبوتوکسیک (RSR).

ZAK (یک MAPKKK) کیناز شناخته شده در RSR است و مسیرهای پایین دستی JUN N ترمینال کیناز (JNK) و مسیرهای MAPK p38 را فعال می کند [12،15]. Stx1 بیان mRNA ژن JUN و FOS را در سلول‌های اپیتلیال روده انسان القا می‌کند و این رویداد به Stx1 دارای فعالیت RIP مثبت نیاز دارد که تصور می‌شود تحت کنترل RSR باشد [15]. یکی دیگر از مولکول‌های پایین‌دست RSR، p38 MAPK، برای القای ژن‌های پاسخ اولیه مانند JUN، FOS، EGR1، MAFF، DDIT3 و ATF3 شناخته شده است [54]، که همه آنها به‌طور متفاوتی در مجموعه داده ما بیان شده‌اند. مسیرهای MAPK JNK و p38 همچنین شناخته شده‌اند که رویدادهای پایین‌دستی Ire{13}} تحت UPR فعال می‌شوند (شکل‌های 4B,D و 5B,E,F) [47]. به همین دلیل، Stxs ممکن است این دو مسیر را از طریق RSR و/یا UPR فعال کند. مسیر کیناز تنظیم‌شده با سیگنال خارج سلولی (ERK) 1/2 نیز نشان داده شده است که در پایین دست RSR [55] قرار دارد و ژن DUSP1 (MKP1) توسط مسیر ERK1/2 القا می‌شود [56]. Stx1 و آنیزومایسین (یکی دیگر از مهارکننده های سنتز پروتئین) قادر به القای بیان DUSP1 در سلول های Caco هستند [57]. در مجموعه داده ما، بیان DUSP1 القا شد و این ممکن است نشان دهنده فعال سازی ERK1/2 باشد (شکل 4B,D).

3.2.5. فعالیت (V)، رونویسی ژن خاص منجر به سیتوکین

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 به ترتیب پس از 24 و 48 ساعت (شکل 5F). این نشان می‌دهد که ژن‌های کلاه تحت هر دو مسیر NF-kB، IκB (کلاسیک) و RelB (جایگزین)، القا می‌شوند. از آنجایی که بیان دیفرانسیل CHOP (DDIT3) بعد از 24 ساعت از log2 بزرگتر از 1 بیشتر می شود، کلیه موش تحت UPR قرار می گیرد، بنابراین PERK فسفریلات فعال شده فاکتور شروع ترجمه یوکاریوتی 2 زیرواحد آلفا (eIF2) برای مهار ترجمه NFKBIA [60]. به همین دلیل، افزایش mRNA NFKBIA ممکن است بسیاری از مسیر NF-kB را مهار نکند، بنابراین رونویسی عوامل التهابی مجاز است (شکل 5L).

سوبه و همکاران [61] نشان داد که هر دو مسیر NF-kB کلاسیک (RelA-p50) و جایگزین (RelB-p52) در موش‌های تزریق شده با Stx فعال بودند که سیتوکین‌های هدف RelA CCL20، CXCL1 و CXCL10 را تشخیص می‌دادند که به طور متفاوت در ما بیان می‌شدند. مجموعه داده (شکل 5L).

3.2.6. فعالیت (VI)، آپوپتوز ناشی از Stxs

کاسپاز 3 بریده شده در مرگ سلولی مرتبط با Stxs یافت شده است [13،15،62]. نشان داده شده است که فعال شدن یا القای آپوپتوز کاسپاز توسط Stxs در زمینه RSR و UPR رخ می دهد. در RSR ناشی از Stxs، هر دو مسیر MAPK و JNK p38 درگیر هستند [15] و همچنین فعال سازی ERK گزارش شده است [55]. از طرف دیگر UPR به عنوان القای مسیرهای NF-κB، JNK و p38 MAPK شناخته شده است. نشان داده شده است که CHOP (DDIT3) تحت UPR در آپوپتوز نقش دارد [63] و همچنین در آپوپتوز مرتبط با Stxs نشان داده شده است [13]. درگیری JNK در آپوپتوز ناشی از UPR نیز گزارش شده است [64]. در مجموعه داده ما، چندین DEG مانند CHOP (DDIT3)، NFKBIA، FOS، JUN، و JUNB در RSR و UPR درگیر هستند (شکل 5B،F).

3.3. اختلال در تنظیم شبانه روزی توسط Stx2

افزایش اندوتلین سرم (ET{1}}، EDN1) در بیماران STEC-HUS [65] رخ می دهد. همچنین، به طور تجربی، Stx2 بیان EDN1 را با فعال کردن آبشارهای انتقال سیگنال شامل MAPK ها [66] القا می کند، در حالی که UPR به عنوان القای رونویسی EDN1 شناخته شده است [67]. در مجموعه داده ما، بیان EDN1 ناشی از درمان Stx2 در سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال انسان و کلیه موش (شکل 5G). از آنجایی که بیان ژن EDN1 مخرج مشترک کلیه موش و سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال انسان بود، نشان می دهد بیان EDN1 حداقل تا حدی در سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال در داخل بدن علاوه بر سلول های اندوتلیال رخ می دهد. همچنین، ET ترشح شده، بیان EGR1 را از طریق فعال‌سازی MAPK القا می‌کند [68]. داده‌های ما تنظیم مثبت EGR1 در زمان‌بندی زمانی که EDN1 تنظیم مثبت است را تأیید می‌کند (شکل 5H). EGR1 بیان PER1 عامل کلیدی ریتم شبانه روزی [69] را القا می کند، بنابراین، دامنه سایر عوامل شبانه روزی را تنظیم می کند (شکل 5H).

در تنظیم شبانه روزی، هترودایمر CLOCK-BAML1 (ARNTL) PER1 و CRY1 را افزایش می دهد. در مقابل، هترودایمر PER{4}CRY1 به CLOCK-BAML1 (ARNTL) متصل می‌شود تا رونویسی بیشتر خود را سرکوب کند، بنابراین یک حلقه منفی از ریتم شبانه‌روزی ایجاد می‌کند. بنابراین، پیک بیان ژن‌های تنظیم‌کننده مثبت (CLOCK و BAML1 (ARNTL)) و ژن‌های تنظیم‌کننده منفی (PER1 و CRY1) در یک ساعت متناوب اتفاق می‌افتند که وقتی CLOCK و BAML1 (ARNTL) افزایش بیان داشتند، PER1 و CRY1 کاهش می‌یابد. و الگو در ساعات بعدی تغییر می کند. هنگامی که مقادیر تغییر log{14}}CLOCK و BAML1 (ARNTL) را به نمودار اضافه کردیم (شکل 5J)، در زمان‌های قبلی، PER1 و BAML1 (ARNTL) یک الگوی ریتمیک مخالف با قله‌های تیز/باریک نشان دادند. با این حال، پس از 24 ساعت پیک ها شروع به کسل کننده شدن کردند و به طور مداوم بدون ریتم افزایش یافتند. این بدان معناست که Stx2 بر ریتم شبانه روزی کلیه از جمله در لوله های پروگزیمال تأثیر می گذارد. اگرچه آزمایش تاییدی بیشتری مورد نیاز است، داده های ما همراه با ادبیات منتشر شده که اثر PER1 را بر تنظیم شبانه روزی کلیه بر محرک ها توصیف می کند [70،71]، احتمال دخالت Stx2 در اختلال ریتم شبانه روزی و اثرات آن بر عملکرد لوله های پروگزیمال را با کاهش ژن های ساعت کلیوی نشان می دهد. عوامل تنظیم شده مانند SGLT1 (SLC5A1) (شکل 5K). در واقع، ما گلوکوزوری را در موش‌های تزریق شده با Stx مشاهده کردیم که در مطالعه دیگری با موش‌های تزریق‌شده Stx [21] تولید مثل می‌کنند که نشان‌دهنده اختلال عملکرد SGLT1 (SLC5A1) در لوله‌های پروگزیمال است (جدول 3). با بهترین دانش ما، این اولین گزارشی است که نشان دهنده دخالت Stx2 در اختلال ریتم شبانه روزی کلیه است.

4. نتیجه گیری

ما ژن‌های مهم مربوط به عبارات مرتبط با لوله پروگزیمال را که توسط Stx2 تغییر داده شده بودند تعیین کردیم. بیان متفاوت این ژن‌ها نتیجه فعالیت‌های Stx2 مانند القای UPR، RSR مرتبط با دپوریشن rRNA و انتقال سیگنال ناشی از اتصال گیرنده Gb3 غشای پلاسمایی است. ژن بسیار بیان شده، GDF15، ممکن است کاهش وزن ناشی از Stx2 را از طریق گیرنده های محدود شده توسط ساقه مغز با کاهش مصرف غذا تحت تاثیر قرار دهد. ماتریکس خارج سلولی و چسبندگی سلول ممکن است تحت تأثیر PDK4، NHERF1 (SLC9A3R1)، CYR61، و CTGF قرار گیرند که باعث هیستوپاتولوژی خاص Stx و لجن‌کشی می‌شوند. علاوه بر این، اختلال در ریتم شبانه روزی کلیه توسط Stx2 ممکن است منجر به نقص عملکردی لوله پروگزیمال مانند بازجذب گلوکز شود.

5. مواد و روش ها

5.1. حیوانات موش

(C57BL/6، نر، 19 تا 22 گرم، بدون پاتوژن خاص) از آزمایشگاه‌های رودخانه چارلز ژاپن، شرکت (یوکوهاما، ژاپن) خریداری شد. غذا و آب به طور آزاد داده شد. موش ها با چرخه استاندارد 12 ساعت: 12 ساعت نور تا تاریکی نگهداری شدند که در آن نور در ساعت 7 صبح روشن و در ساعت 7 بعد از ظهر خاموش می شود. دمای اتاق حیوانات در حدود 24 درجه سانتیگراد نگه داشته شد. تمام مراحل توسط کمیته مراقبت از حیوانات دانشگاه تایید شد.

5.2. بافت کلیه انسان

در این مطالعه از بافت جسد بدون هیچ شناسه شخصی استفاده شد و طبق دستورالعمل‌های تحقیقات انسانی دانشگاه مستثنی شده است.

5.3. کشت سلولی

کشت اولیه سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای پروگزیمال کلیه انسان (RPTEC) از Clonetics (Walkersville، MD، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، اتمسفر CO2 5٪ نگهداری شد. سلول ها در محیط رشد سلول های اپیتلیال کلیه حاوی فاکتور رشد اپیدرمی انسانی، هیدروکورتیزون، اپی نفرین، انسولین، تری یدوتیرونین، ترانسفرین، GA{4}} و FBS کشت داده شدند.

5.4. تصفیه حذف Stx2 بدون LPS از Stx2 همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد [72]. به طور خلاصه، از ستون کونژوگه آنتی‌بادی ضد Stx2 11E1{0 برای بدست آوردن کسر Stx2 استفاده شد، و بخش متعاقباً از ژل Detoxi عبور داده شد (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) برای حذف LPS کسر Stx2 با فیلتر .2 میکرومتری 0 فیلتر شد و سطح LPS با روش لیزات آمبوسیت لیمولوس (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA) مورد آزمایش قرار گرفت. کسر Stx2 به عنوان دارای کمتر از 0.03 واحد اندوتوکسین (EU) / میلی لیتر تعیین شد. نوع Stx2 Stx2a بود.

5.5. تجویز Stx2 به موش‌ها دوز 2LD50 (5 نانوگرم Stx2/20 گرم وزن بدن)، که موش‌ها را در عرض چهار روز می‌کشد (شکل S3A)، به صورت داخل صفاقی در حجم 0.1 میلی‌لیتر در سالین بدون LPS به موش‌ها تزریق شد. (داروسازی Otsuka، ژاپن). تزریق سم بین ساعت 7 تا 9 صبح انجام شد که در آن موش‌ها با دوره طولانی‌تری Stx2 را در ساعت 7 صبح دریافت کردند و سپس نمونه‌برداری در 24، 48 و 72 ساعت در ساعت 7 صبح انجام شد.

5.6. جمع‌آوری ادرار و اندازه‌گیری گلوکز ادرار پس از 2، 6، 8، 12، 24، 36، 48، 6{17}} و 84 ساعت تزریق Stx2، ادرار گرفته شد و 10 میکرولیتر روی لام خشک شیمی فوجی ریخته شد. P III (FUJIFILM، کاناگاوا، ژاپن) و گلوکز ادرار با Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) در مرکز مدیریت شده اندازه‌گیری شد. ادرار قبل از تزریق Stx2 به عنوان نمونه 0 ساعت استفاده شد. جمع آوری ادرار با دو موش انجام شد

5.7. پردازش بافت پس از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، و 72 ساعت از تزریق Stx2، سه موش در هر نقطه توسط CO2 معدوم شدند، و کلیه ها جمع آوری شد. نیمی از یک کلیه با 4% سالین پارافورمالدئید/فسفات بافر به مدت 7 روز در دمای 4 درجه سانتیگراد تثبیت شد و برای بخش پارافین پردازش شد. نیمی دیگر از کلیه برای استخراج RNA برای تجزیه و تحلیل ریزآرایه استفاده شد. سه موش بدون هیچ درمانی به عنوان کنترل عادی (بی‌سابقه یا 0 ساعت) مورد استفاده قرار گرفتند. به سه موش PBS (وسایل نقلیه) تزریق شد و در 72 ساعت قربانی شدند و به عنوان کنترل وسیله نقلیه برای نشان دادن تغییرات ناچیز در بیان ژن در مقایسه با کنترل عادی وجود دارد.

5.8. مقاطع پارافینی رنگ آمیزی دوره ای اسید-شیف (PAS) هیدراته شده و با محلول اسید پریودیک 0.5% رنگ آمیزی شدند و سپس با آب مقطر شستشو داده شد. مقاطع به معرف شیف منتقل شدند. پس از شستشوی کامل مقاطع با محلول بی سولفیت سدیم 0.6 درصد، با هماتوکسیلین ضد رنگ آمیزی شدند.

5.9. درمان Stx2 در سلول‌های RPTEC انسانی RPTEC با 10 نانوگرم در میلی‌لیتر Stx2 به مدت 6، 13 و 19 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، CO2 5 درصد تیمار شدند. RPTEC بدون تیمار Stx2 به عنوان شاهد استفاده شد. دو کپی بیولوژیکی در هر نقطه زمانی انجام شد. پس از شستشو با PBS، سلول ها برای استخراج RNA مورد استفاده قرار گرفتند.

5.10. رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس شناور آزاد برای پردازش بخش شناور آزاد، یک موش معمولی همانطور که در Obata و همکارانش توضیح داده شد، تثبیت شد. [69]. کلیه‌های موش جدا شدند و در 4% PFA/PBS به مدت 3 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد با هم زدن ملایم غوطه‌ور شدند. بافت ها با PBS شسته شدند و با 30 درصد ساکارز/PBS در دمای 4 درجه سانتیگراد در طول شب یا تا زمانی که به پایین فرو رفتند، محافظت در سرما شدند. مقاطع منجمد ضخیم (50 میکرومتر) با میکروتوم کشویی با تنظیمات یخ زده برش داده شدند. بخش ها با آنتی بادی IgM ضد موش بز 1:50 در PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, USA) به مدت 1 ساعت مسدود شدند و با آنتی بادی anti-Gb3/CD77 1:100 در مسدود کننده انکوبه شدند. محلول یا کنترل ایزوتیپ (IgM موش) در غلظت منطبق به عنوان آنتی بادی اولیه برای یک شب در دمای 4◦C. پس از شستشو، مقاطع با یک آنتی بادی ثانویه (ضد موش IgM Alexa Fluor 488، رقت 1:2000 در PBS) به مدت 2 ساعت در دمای 4◦C انکوبه شدند. بخش‌ها برای سایر پروب‌های AQP1 (رقت 1:1000، Sigma-Aldrich Japan، توکیو، ژاپن) و CD31 (550274، رقت 1:50، BD Biosciences، Franklin Lakes، NJ، USA) با آنتی‌بادی‌های ثانویه ضد خرگوش IgG Alexa رنگ‌آمیزی شدند. فلور 546 (رقت 1:2000 در PBS) و ضد IgG الکسا فلور 647 موش (رقت 1:2000 در PBS) به ترتیب. پس از شستشو با PBS، رنگ آمیزی فنیلیندول 40،6-دیامیدینو{47} (DAPI, D21490, Thermo Fisher) به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد. هر بار که محلول عوض می‌شد، بخش‌ها در یک چاه از صفحه چاه (U شکل) با یک رژگونه نقاشی کوچک در مایعات غوطه‌ور شدند. مرحله شستشو در چاه های بزرگتر مانند صفحات چاه 12- یا 6- انجام شد. از محیط های نصب آبی برای لغزش پوشش استفاده شد. برای آماده سازی بافت انسانی، کلیه پس از مرگ به مدت 2 هفته در فرمالین 20 درصد تثبیت شد و برای آماده سازی شناور آزاد همانطور که برای بافت موش انجام شد، با یک استثنا، آنتی بادی ضد CD31 انسانی (CBL468، رقت 1:20، Merck KGaA، Darmstadt) پردازش شد. ، آلمان) استفاده شد.

5.11. تجزیه و تحلیل ریزآرایه

نیمی از کلیه در 2 میلی لیتر RNALater (Ambion, Austin, TX, USA) در دمای 4◦C غوطه ور شده و RNA کل با کیت Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) استخراج شد. ژنوم موش 430A 2.0 آرایه (Affymetrix، Santa Clara، CA، USA) استفاده شد. فایل‌های CEL با میانگین‌گیری چند تراشه‌ای قوی (RMA) به‌دست آمدند و نرمال‌سازی شدند، محاسبه اعداد کپی RNA، و تغییرات برابر در برابر 0 ساعت در R (v.3.6.0) با بسته آن انجام شد. affy [73] و RankProd 2.0 [74]. داده‌ها در مقادیر تغییر log{14}}نشان داده می‌شوند. مجموعه داده به Gene Expression Omnibus (GEO) (شماره دسترسی GSE172465) سپرده می شود. از سلول های RPTEC، RNA کل با RNAgents Total RNA سیستم جداسازی (Promega، توکیو، ژاپن) استخراج شد. ریزآرایه الیگونوکلئوتیدی کل ژنوم انسان (ریزآرایه DNA الیگونوکلئوتیدی 44K، Agilent Technologies، توکیو، ژاپن) برای آزمایش‌های ریزآرایه استفاده شد. نمونه‌های RNA کل برای تهیه پروب‌های cDNA نشاندار Cy{17}} و Cy{18} استفاده شد. نمونه های نشاندار شده با فلوروفور روی هر لام شیشه ای هیبرید شده و شسته شدند، سپس با اسکنر ریزآرایه DNA (مدل G2505A؛ Agilent Technologies) اسکن شدند. نرم افزار استخراج ویژگی و تجزیه و تحلیل تصویر (تکنولوژی های Agilent) برای مکان یابی و ترسیم هر نقطه در آرایه و ادغام شدت ها استفاده شد که سپس با استفاده از روش هموارسازی پراکنده با وزن محلی فیلتر و نرمال شد. تکرارپذیری تجزیه و تحلیل ریزآرایه با دو تکرار تعویض رنگ در هر آزمایش ارزیابی شد. تفاوت در بیان mRNA بین کنترل و RPTEC تیمار شده با Stx که در 6، 10 یا 19 ساعت برداشت شده بود، مقایسه شد. داده‌های قالب TXT از نرم‌افزار GeneSpring برای تعیین نام ژن‌ها از شناسه پروب و تبدیل تغییرات فولد به تغییرات log{26}}استفاده شد. مجموعه داده به GEO (شماره دسترسی GSE172466) سپرده می شود.

5.12. تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک داده‌های ریزآرایه و تجسم در داده‌های کلیه موش و داده‌های ریزآرایه RPTEC، ژن‌هایی که در هر دو مشترک هستند و در آن‌ها تغییر بیان بیش از 2-برابر کاهش یا افزایش (یا log{3}}برابر شدن تغییر می‌کند. است یا کوچکتر از -1 یا بزرگتر از 1) در هر نقطه زمانی توسط R انتخاب شدند. علاوه بر این، در داده های ریزآرایه کلیه موش. تغییرات ژنی متناسب با منحنی‌های مکعبی با استفاده از پکیج R maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ maSigPro.html (آخرین دسترسی در 4 ژانویه 2022)] [75] انتخاب شدند. منحنی مکعب برای سازگاری با افزایش یا کاهش آن ژن ها در طول یک دوره زمانی مناسب است. درجه چند جمله ای بالاتر مانند منحنی مکعبی امکان انتخاب ژن هایی با تغییرات متعدد در طول دوره زمانی را بهتر از منحنی درجه دوم می دهد. ژن‌هایی که با مسیر مشابهی رفتار می‌کردند، خوشه‌بندی شدند و الگوهای کاهش/افزایش آن‌ها با یک نقشه حرارتی با استفاده از gplots بسته R [https://CRAN.R-project.org/package{10}}gplots (آخرین دسترسی در ۴ ژانویه) مشاهده شد. 2022)] [76]. هستی شناسی ژن (GO) اختصاص داده شد و عملکردهای GO در میان ژن های رایج با استفاده از Metascape [http://metascape.org (آخرین دسترسی در 4 ژانویه 2022)] [77] غنی شد. ارتباط/ارتباط ژن‌های مشترک با استفاده از STRING [https://string-db.org/ (آخرین دسترسی در 4 ژانویه 2022)] [78] تجزیه و تحلیل شد. ارتباط بین ژن های رایج به صورت دستی و همچنین با استفاده از تابع متن کاوی STRING جستجو شد.

منابع

1. جیانانتونیو، سی. ویتاکو، م. مندیلاهرزو، ف. روتی، ا. Mendilaharzu، J. سندرم همولیتیک-اورمیک.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. ویتسکی، BH; سوزوکی، ی. اشتراوس، ال. Churg، J. سندرم همولیتیک-اورمیک: مطالعه تغییرات پاتولوژیک کلیه.صبح. جی. پاتول.1969, 57, 627–647. 

3. تاکدا، تی. ضحی، س. ایگاراشی، تی. یاماناکا، تی. یوشیا، ک. Kobayashi, N. اختلال عملکرد لوله توسط وروتوکسین به آسیب کلیوی که در سندرم اورمیک همولیتیک دیده می شود کمک می کند.ج. عفونی کردن.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. کاتاگیری، یو. موری، تی. ناکاجیما، اچ. کاتگیری، سی. تاگوچی، تی. تاکدا، تی. کیوکاوا، ن. Fujimoto، J. فعال‌سازی کیناز خانواده Src بله ناشی از اتصال سم شیگا به گلوبوتریاوسیل سرامید (Gb3/CD77) در ریزدامنه‌های نامحلول در مواد شوینده با چگالی کم.جی. بیول. شیمی.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. تاکنوشی، ح. کیوکاوا، ن. تاگوچی، تی. ماتسویی، جی. کاتگیری، یو. اوکیتا، اچ. اوکودا، ک. فوجیموتو، جی. شیگا، اتصال سم به گلوبوتریوسیل سرامید، سیگنال‌های درون سلولی را القا می‌کند که در بازسازی اسکلت سلولی در سلول‌های مشتق شده از کارسینوم کلیوی انسان واسطه می‌شوند.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. گاررد، او. ون دیورز، بی. Sandvig، K. Furin ناشی از برش و فعال شدن سم شیگا.جی. بیول. شیمی.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. مجول، آی. فراری، دی. Söling، HD کاهش پیوندهای دی سولفید پروتئین در یک محیط اکسید کننده. پل دی سولفیدی زیرواحد A توکسین وبا در شبکه آندوپلاسمی کاهش می یابد.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; واتسون، PD; Marsden، CJ; اسمیت، دی سی; مور، KAH; کوک، جی پی؛ لرد، جی.ام. رابرتز، LM پروتئین دی سولفید ایزومراز ریسین را به زنجیره های A و B آن در شبکه آندوپلاسمی کاهش می دهد.بیوشیمی. جی.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. یو، م. Haslam، DB Shiga Toxin از شبکه آندوپلاسمی به دنبال برهمکنش با چپرون لومینال HEDJ/ERdj3 منتقل می شود.آلوده کردن ایمنی2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T. Johannes، L. Shiga توکسین زیرواحد B به چپرون BiP و پروتئین هسته ای B23 متصل می شود.Biol. سلول2006, 98, 125–134. [CrossRef]