اثرات ضد التهابی سینرژیک عصاره Laminaria Japonica Fucoidan و Cistanche Tubulosa

به عنوان یک پاسخ ایمنی در برابر آنتی ژن های خارجی، ماکروفاژها سیتوکین های پیش التهابی مانند فاکتور نکروز تومور (TNF-)، اینترلوکین-1 (IL- 1)، IL-6 و غیره را آزاد می کنند. چنین سیتوکین هایی باعث هجوم کموتاکتیک گرانولوسیت ها، مونوسیت ها، لنفوسیت ها و ماست سل ها به بافت آسیب دیده می شود که باعث حذف آنتی ژن و بازیابی بافت می شود. با این حال، نفوذ و فعال شدن بیش از حد سلول ها، آسیب های بافتی را تشدید می کند و منجر به ادم (تراوش عروقی) و درد می شود که از پدیده های شناخته شده التهاب هستند.

TNF- یک عامل مهم برای القای بیان ژن نیتریک اکسید سنتاز (iNOS) در چندین رده سلولی است. فعال‌سازی iNOS منجر به تولید اکسید نیتریک (NO) می‌شود که نه تنها چندین عملکرد فیزیولوژیکی مانند باکتری‌کشی و اتساع عروق را تعدیل می‌کند، بلکه باعث التهاب نیز می‌شود. پس از آسیب بافتی، تجزیه توسط فسفولیپازهای فسفولیپیدهای غشای سلولی باعث تولید اسید آراشیدونیک می شود. اسید آراشیدونیک بیشتر توسط سیکلواکسیژناز (COX) به پروستاگلاندین ها (PGs) تجزیه می شود. مقدار بیش از حد PGE2 تشکیل شده توسط COX-II باعث ایجاد چندین سایتوکین برای التهاب می شود. از آنجایی که هر دو NO و PGE2 به عنوان عوامل اصلی برای التهاب و القای درد عمل می کنند، مسیرهای TNF--NO و COX-II-PGE2 جریان های اصلی فرآیند التهابی هستند که توسط کورتیکواستروئیدها و غیر استروئیدی مهار می شوند.داروهای ضد التهابی(NSAIDs) به ترتیب.

حتی اگر چندین استروئید و NSAID وجود دارددرمان بیماری های التهابیاین داروها ممکن است منجر به اثرات نامطلوب بر روی سیستم ایمنی، دستگاه گوارش، کلیه ها، کبد، سیستم عصبی مرکزی، فشار خون و سیستم قلبی عروقی شوند. بنابراین لازم است با جایگزینی آنها و یا استفاده در ترکیب با محصولات طبیعی، اثرات نامطلوب داروهای شیمیایی را به حداقل برسانیم.

Fucoidan، یک کمپلکس پلی ساکارید سولفات از جلبک های دریایی مانند Laminaria japonica و Cladosiphon okamuranus که به طور گسترده در بسیاری از کشورها توزیع شده است، برای مدت طولانی به عنوان درمان در طب شرقی استفاده شده است. در مطالعات قبلی نشان داده شده است که فوکویدان دارای آنتی اکسیدان، ضد انعقاد، ضد سرطان وفعالیت های ضد التهابی. بر این اساس، اثرات مفید فوکوئیدان بر بیماری های التهابی، ایسکمی، اختلال عملکرد سیستم ایمنی و تومورها توجه محققین را به خود جلب می کند. از سوی دیگر،سیستانچ توبولوزا(CT) همچنین به طور گسترده ای به عنوان یک داروی سنتی در چین استفاده شده است. گزارش شده است که عصاره CT تولید TNF-á و IL{1}} را کاهش می دهد که عوامل اصلی تولید NO در مسیرهای التهابی هستند [19].

چنین یافته‌های قبلی ما را به بررسی اثر ترکیبی فوکویدان و عصاره سی‌تی روی ۲ مسیر اصلی التهاب سوق داد. برای روشن کردن مکانیسم اثر، ما NO و PGE2 را در ترشحات ناشی از التهاب کیسه هوای ناشی از کاراگینان تجزیه و تحلیل کردیم.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای پیشگیریفعالیت های التهابیPHGS75% ECH 30% ACT 12%

مواد و روش ها

مواد

fucoidan نیمه خالص و عصاره آبی CT از Misuba RTech Co., Ltd. (آسان، کره) به دست آمد. عصاره Fucoidan و CT در دمای 4 درجه نگهداری شد، قبل از استفاده مخلوط (1:3) در آب تصفیه شده حل شد و به صورت خوراکی در حجم 5 میلی لیتر بر کیلوگرم تجویز شد.

کشت سلولی و تعیین مقدار NO

رده سلولی ماکروفاژ موش RAW 264.7 از مجموعه کشت نوع آمریکایی (ماناساس، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد و در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (سیگما، سنت لوئیس، ایالات متحده آمریکا) حاوی 10٪ سرم جنین گاو و آنتی بیوتیک [100 U/mL] کشت شد. پنی سیلین (سیگما) و 100 میکروگرم بر میلی لیتر استرپتومایسین (سیگما)]. سلول ها در اتمسفر 5% CO2 مرطوب شده در دمای 37 درجه انکوبه شدند.

برای ارزیابی اثرات فوکویدان و عصاره CT بر ترشح NO، سلول‌های RAW 264.7 (1×106 سلول در میلی‌لیتر) با فوکویدان یا عصاره CT (1-320 میکروگرم بر میلی‌لیتر) به مدت 5 دقیقه انکوبه شدند. و سپس اینترفرون (IFN-، 10 U/mL) و لیپوپلی ساکارید (LPS، 10 میکروگرم بر میلی لیتر) به مدت 24 ساعت. در مطالعات اولیه ما، تأیید شد که درمان با IFN- پلاس LPS برای فعال‌سازی سلول‌های RAW 264.7 بر زنده‌مانی سلول‌ها تا 24 ساعت تأثیری نداشت و فوکویدان و عصاره CT تا 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر سیتوتوکسیک نبودند. غلظت نیتریت (NO2-)، محصول اکسید شده NO، به عنوان شاخص NO اندازه گیری شد. محیط کشت با حجم مساوی از معرف گریس (1% سولفانیل آمید، 0.1% نفتیل اتیلن دی آمین در 2.5% اسید فسفریک) [21] مخلوط شد و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. غلظت نیتریت در طول موج 540 نانومتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت که در آن از NaNO2 برای تولید یک منحنی استاندارد استفاده شد.

حیوانات و درمان

موش‌های نر ICR (7 هفته‌ای) از Daehan Biolink (Eumseong، کره) خریداری شدند و در اتاقی با شرایط محیطی ثابت (22±2ºC؛ 40-70٪ رطوبت نسبی، 12- ساعت نور) قرار گرفتند. -چرخه تاریکی؛ 150-300 روشنایی لوکس). خوراک پلت و آب تصفیه شده به صورت آزاد در دسترس بود. تمام آزمایش‌های حیوانی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی (IACUC) دانشگاه ملی Chungbuk (CBNU)، کره تأیید شد و طبق رویه‌های عملیات استاندارد (SOP) مرکز تحقیقات حیوانات آزمایشگاهی، CBNU انجام شد.

موش‌ها (n{0}}/گروه) به صورت خوراکی با فوکویدان (18 یا 54 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، عصاره CT (54 یا 162 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، یا مخلوط آنها (18+54، {{6}) تحت درمان قرار گرفتند. }} یا 90+270 mg/kg) یک بار در روز به مدت ۷ روز. دوزهای پایین فوکویدان (18 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و عصاره CT (54 میلی‌گرم بر کیلوگرم) از دوزهای تخمینی انسانی 100 میلی‌گرم بر بدن (70 کیلوگرم) و 300 میلی‌گرم بر بدن پس از ترجمه سطحی وزن بدن (کیلومتر) بود. }} برای انسان/کیلومتر=3 برای ماوس)، به ترتیب. دوزهای بالای fucoidan و عصاره CT در 3 برابر، به تنهایی یا به صورت مخلوط تنظیم شد، و مخلوط بالاترین دوز در 5 برابر برای ارزیابی حداکثر اثرات هم افزایی ثابت شد.

در روز اول درمان با فوکویدان و عصاره CT، موش ها به صورت زیر جلدی با 10 میلی لیتر هوای استریل به پشت تزریق شدند تا کیسه ای تشکیل شود [22،23]. پس از 2 و 5 روز، کیسه مجدداً با 5 میلی لیتر هوا تزریق شد. یک ساعت پس از درمان نهایی، 1 میلی لیتر کاراگینان (1٪ در سالین؛ سیگما) یا وسیله نقلیه آن (سالین) به کیسه تزریق شد.

تجزیه و تحلیل ترشحات

کیسه هوا با 1 میلی لیتر سالین سرد 6 ساعت پس از تزریق کاراگینان شسته شد و حجم خالص مایع لاواژ ثبت شد. تعداد کل سلول های التهابی، نوتروفیل ها، مونوسیت ها و لنفوسیت ها با استفاده از شمارنده کولتر تعیین شد. غلظت NO و PGE2 به ترتیب توسط معرف گریس (سیگما) و ایمونواسی آنزیمی (EIA) با استفاده از کیت Correlate-EIA (Assay Designs، Ann Arbor، Ann ArboUSA) تعیین شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای انسداد بر روی سلول های التهابی شیمی تاکسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

بررسی هیستوپاتولوژیک

بافت پوشش کیسه برداشته شد و در محلول فرمالین خنثی ثابت شد. اسلایدهای بافتی تعبیه شده در پارافین با هماتوکسیلین-ائوزین رنگ آمیزی شدند و زیر میکروسکوپ نوری از نظر ضایعات التهابی مورد بررسی قرار گرفتند.

تحلیل آماری

نتایج به صورت میانگین ± SE ارائه شده است. مقایسه‌های گروه آزمایشی با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه و سپس تصحیح آزمون توکی انجام شد. مقدار AP<0.05 was considered statistically significant.

نتایج

در شرایط آزمایشگاهی، کشت سلولی RAW 264.7، IFN- و تیمار LPS تولید NO را تا حد زیادی افزایش داد (شکل 1). پیش تیمار با فوکویدان (1-320 میکروگرم بر میلی لیتر) بر آزادسازی NO از رده سلولی ماکروفاژ تأثیری نداشت (شکل 1A). در مقایسه، عصاره CT (32-320 میکروگرم بر میلی لیتر) به طور قابل توجهی تولید NO را سرکوب کرد که نشان دهنده یک فعالیت ضد التهابی است (شکل 1B).

تزریق کاراگینان به کیسه هوای موش به طور قابل توجهی باعث افزایش حجم اگزودا در داخل کیسه شد (شکل 2). چنین افزایش ترشح با درمان با فوکویدان (18 میلی گرم بر کیلوگرم) و عصاره CT (54 و 162 میلی گرم بر کیلوگرم) کاهش یافت. قابل‌توجه، تیمار ترکیبی فوکویدان و عصاره سی‌تی حجم اگزودا را در مقایسه با اثرات فردی کاهش داد، اگرچه ترکیب‌های دوز بالاتر (54+162 mg/kg و 90+270 mg/kg) اثر اضافی نشان ندادند. به کمترین ترکیب دوز (18+54 mg/kg) (شکل 2A). میزان نفوذ درجه N در کیسه نیز به دنبال تزریق کاراگینان به شدت افزایش یافت (شکل 2B). در مقایسه با اثر خفیف فوکویدان، عصاره سی تی به طور قابل توجهی غلظت درجه N را کاهش داد. تیمار ترکیبی فوکویدان و عصاره CT باعث کاهش بیشتر سطح NO به صورت وابسته به دوز شد. به طور مشابه، افزایش محتوای PGE2 به طور هم افزایی با درمان ترکیبی فوکویدان و عصاره CT سرکوب شد (شکل 2C).

به موازات واسطه های التهابی در کیسه، تعداد سلول های التهابی با تزریق کاراگینان به شدت افزایش یافت: به ترتیب 37.8، 4.8 و 24.1 برابر سطوح کنترل برای نوتروفیل ها، مونوسیت ها و لنفوسیت ها (جدول 1). با این حال، فوکوئیدان و عصاره CT به طور قابل توجهی نفوذ سلول های التهابی را کاهش دادند، که در آن فوکویدان تا حدودی نسبت به عصاره CT برتری داشت. به طور غیر منتظره، هیچ اثر هم افزایی در ارتشاح سلول های التهابی با تجویز همزمان فوکویدان و عصاره CT حاصل نشد.

همانطور که از نفوذ سلول های التهابی در اگزودا استنباط می شود، بافت زیر جلدی اطراف کیسه های هوا ضایعات التهابی شدیدی را نشان می دهد (شکل 3). سلول های بسیار زیادی در بافت زیر جلدی ضخیم شده در معرض کاراگینان مشاهده شد (شکل 3B)، در مقایسه با ویژگی های تقریباً طبیعی در حیوانات کنترل (شکل 3A). چنین ضایعات التهابی به طور قابل ملاحظه ای با درمان با فوکویدان (شکل 3C و 3D) یا عصاره CT (شکل 3E و 3F) کاهش یافتند.

قابل ذکر است که اثرات ضد التهابی بالاتری با درمان ترکیبی با فوکویدان و عصاره CT بدست آمد (شکل 3G-3I).

بحث

با استفاده از یک مدل التهاب کیسه هوای ناشی از آراگینان در درجه داخل بدن، تزریق هوا به پشت جوندگان باعث تکثیر سلول‌هایی می‌شود که در سطح حفره طبقه‌بندی می‌شوند و ساختاری شبیه به سینوویوم تشکیل می‌دهند. در این مدل، تزریق انفیلتراسیون سلولی التهابی ناشی از کاراگینان باعث افزایش اگزودا شد که نشان دهنده نشت عروقی است. کیسه هوا به عنوان مخزن سلول های التهابی و واسطه ها عمل می کند که به راحتی می توان آنها را در مایعی که به صورت موضعی جمع می شود اندازه گیری کرد.

در میان واسطه‌های التهابی متنوعی که می‌توانند نفوذپذیری عروقی را القا کنند، به خوبی شناخته شده است که NO و PGE2 عوامل اصلی در پاتوژنز بسیاری از بیماری‌های التهابی هستند. آنها همچنین به عنوان واسطه القا و درک درد شناخته می شوند. iNOS که در انواع مختلف سلول با تحریک با TNF- و/یا LPS در طول التهاب بیان و فعال می‌شود، غلظت‌های بالا و پایدار NO تولید می‌کند. NO یک مولکول تنظیم کننده مهم در عملکردهای فیزیولوژیکی مختلف است، مانند اتساع عروق که منجر به نشت عروقی می شود. PGE2 که از اسید آراشیدونیک از طریق COX ها تولید می شود، به ایجاد بسیاری از بیماری های التهابی کمک می کند و تولید بیش از حد PGE2 در پاسخ به تحریکات التهابی مختلف با تنظیم بالا سطح COX-II و پیشرفت التهاب همراه است. بنابراین، مسیرهای TNF{- - NO و COX-II-PGE2 به عنوان دو جریان اصلی فرآیندهای التهابی در نظر گرفته شده‌اند که به ترتیب توسط مهارکننده‌های iNOS (کورتیکواستروئیدها) و COX (NSAIDs) مسدود می‌شوند.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای منع بیماری های التهابی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

در مطالعه حاضر، تجویز همزمان فوکوئیدان و عصاره CT باعث کاهش حجم اگزودا در کیسه می شود که نشان می دهد آنها دارای فعالیت سرکوب کننده در برابر نشت عروقی هستند (شکل 2A). در مقایسه با اثرات فردی هر یک از فوکوئیدان و عصاره CT، درمان ترکیبی بیشتر افزایش یافت، که نشان می‌دهد که دو درجه بیش‌تر به صورت هم افزایی عمل می‌کند. چنین اثرات هم افزایی بین فوکویدان و عصاره CT توسط فعالیت آنها بر روی سطوح NO و PGE2 در اگزودا پشتیبانی می شود (شکل 3B و 2C).

جالب توجه است، با این حال، تایید شد که فوکویدان مستقیماً از فعال شدن ماکروفاژها در آزمایش آزمایشگاهی جلوگیری نمی کند (شکل 1A). به طور مشابه، پتانسیل مهاری فوکویدان در تجمع NO و PGE2 در روش in vivo نسبتاً کمتر از عصاره CT بود (شکل 2B و 2C). چنین مکانیسم عمل فوکویدان با غیرفعال کردن مستقیم سلول ها توسط عصاره CT متفاوت است (شکل 1B). در مقایسه، فوکویدان کارایی بالایی در مهار نفوذ سلول های التهابی در کیسه ها اعمال کرد (جدول 1). Fucoidan در جلوگیری از مهاجرت نوتروفیل‌ها، مونوسیت‌ها و لنفوسیت‌ها به محل‌های آسیب بافتی ناشی از کاراژینان نسبت به عصاره CT برتری داشت. جالب توجه است که هیچ اثر ضد مهاجرتی هم افزایی وجود نداشت که نشان دهنده مکانیسم های عمل متفاوت بین فوکویدان و عصاره CT باشد: به عنوان مثال، فوکویدان نفوذ سلول های التهابی را مسدود می کند، در حالی که عصاره CT از فعال شدن سلول ها جلوگیری می کند.

سلول‌های پلی‌مورفونوکلئر، به‌ویژه نوتروفیل‌ها، اجزای اصلی سلولی هستند که برای مکان‌های التهابی حاد ناشی از کاراگینان انتخاب می‌شوند. علاوه بر این، سلول‌های التهابی متعاقب آن مانند ماکروفاژها و لنفوسیت‌ها نیز با ترشح سیتوکین‌ها، نقش اصلی را در فرآیند التهابی ایفا می‌کنند. هنگامی که با فوکوئیدان یا عصاره CT پیش تیمار شد، تعداد گلبول‌های سفید خونی که به کیسه‌های هوای تزریق شده با کاراژینان مهاجرت می‌کردند، به‌طور قابل توجهی سرکوب شد. این نتیجه با اثری که توسط کورتیکواستروئیدها مانند دگزامتازون به دست می‌آمد، مطابقت داشت، اما نه توسط NSAIDها از جمله ایندومتاسین. بنابراین، فرض بر این است که عصاره فوکویدان و CT تا حدی دارای خاصیت استروئیدی هستند.

عصاره CT علاوه بر عملکرد مسدود کننده کموتاکسی سلول های التهابی، به نظر می رسد که فعال شدن ماکروفاژها را سرکوب می کند. این با اعمال مهاری آن بر روی NO در شرایط in vitro و in vivo، که واسطه اصلی التهابی تولید شده توسط ماکروفاژها است، تأیید شد. بنابراین، اثر عصاره CT بر ماکروفاژها ممکن است به دلیل سرکوب بیان mRNA و/یا مهار مستقیم فعالیت iNOS در این سلول ها باشد.

PGE2 نیز یکی از واسطه های اصلی التهابی است. به موازات ادم بافت افزایش می یابد، که توسط NSAID ها، مهارکننده های COX، سرکوب می شود. کاراگینان می تواند تولید PGE2 را با القای COX-II mRNA و پروتئین COX-II در اگزودای کیسه ای افزایش دهد. در این مدل، کاراگینان به طور قابل توجهی مقدار PGE2 را افزایش داد و به طور قابل توجهی توسط عصاره CT سرکوب شد. جالب است بدانید که این نتیجه با اثری که توسط یک NSAID ایندومتاسین به دست می‌آمد مطابقت داشت. بنابراین، از نتایج استنباط می شود که عصاره CT دارای خواص اضافی NSAID ها است. روی هم رفته، اعتقاد بر این است که عصاره CT هر دو اثرات کورتیکواستروئیدی و شبه NSAID را در مدل التهاب ناشی از کاراگینان اعمال می کند و فوکویدان باعث افزایشاثرات ضد التهابی عصاره CTبا مسدود کردن نفوذ سلول های التهابی.

اگرچه تعیین مکانیسم دقیق اثر مستلزم مطالعه بیشتر است، مخلوطی از فوکویدان و عصاره CT با مسدود کردن مسیرهای TNF--NO و COX-II-PGE2 در التهاب کیسه هوای ناشی از کاراگینان، علائم التهابی را به طور قابل توجهی کاهش داد. این یافته‌ها شواهدی را ارائه می‌دهند که درمان ترکیبی فوکویدان و عصاره CT ممکن است یک کاندید امیدوارکننده برای تسکین انواع مختلف التهابی باشد که به کورتیکواستروئیدها یا NSAIDها پاسخ می‌دهند.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای منع بیماری های التهابی PHGS75% ECH 30% ACT 12%