هدف قرار دادن کاتپسین B توسط سیکلواستراژنول، ایمنی ضد توموری سلول های CD8 T را از طریق مهار تخریب MHC-I افزایش می دهد قسمت 1

خلاصه

زمینهاز دست دادن آنتی ژن های تومور و تخلیه سلول های CD8 T ناشی از مسیر PD-1/PD-L1 عوامل مهمی برای فرار ایمنی تومور هستند. در سال های اخیر، تحقیقات فزاینده ای در مورد طب سنتی چینی در درمان تومور صورت گرفته است. سیکلواستراژنول (CAG)، یک مولکول فعال موثر در غشای گون، مشخص شده است که دارای عملکردهای ضد ویروسی، ضد پیری، ضد التهابی و غیره است. با این حال، اثر ضد توموری و مکانیسم آن مشخص نیست.

گلیکوزید سیستانچ همچنین می تواند فعالیت SOD را در بافت های قلب و کبد افزایش دهد و به طور قابل توجهی محتوای لیپوفوسین و MDA را در هر بافت کاهش دهد و به طور موثر رادیکال های مختلف اکسیژن فعال (OH-، H2O2 و غیره) را از بین ببرد و از آسیب DNA ناشی از آن محافظت کند. توسط رادیکال های OH گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ دارای توانایی مهار قوی رادیکال های آزاد، توانایی کاهش بالاتری نسبت به ویتامین C، بهبود فعالیت SOD در سوسپانسیون اسپرم، کاهش محتوای MDA و اثر محافظتی خاصی بر عملکرد غشای اسپرم هستند. پلی ساکاریدهای سیستانچ می توانند فعالیت SOD و GSH-Px را در گلبول های قرمز و بافت ریه موش های آزمایشگاهی مسن ناشی از D-گالاکتوز افزایش دهند و همچنین محتوای MDA و کلاژن را در ریه و پلاسما کاهش دهند و محتوای الاستین را افزایش دهند. اثر پاک کنندگی خوب بر روی DPPH، طولانی شدن زمان هیپوکسی در موش های پیر، بهبود فعالیت SOD در سرم، و به تاخیر انداختن انحطاط فیزیولوژیکی ریه در موش های آزمایشگاهی پیر. و این پتانسیل را دارد که دارویی برای پیشگیری و درمان بیماری های پیری پوست باشد. در عین حال، اکیناکوزید موجود در سیستانچ توانایی قابل توجهی در از بین بردن رادیکال های آزاد DPPH دارد و توانایی حذف گونه های فعال اکسیژن و جلوگیری از تخریب کلاژن ناشی از رادیکال های آزاد را دارد و همچنین اثر ترمیم خوبی بر آسیب آنیون رادیکال آزاد تیمین دارد.

روی مزایا و معایب cistanche کلیک کنید

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

مواد و روش هااثر ضد توموری CAG در مدل‌های تومور پیوند موش MC38 و CT26 مورد بررسی قرار گرفت. اثر ضد توموری CAG بیشتر از طریق توالی یابی چند omics تک سلولی مورد بررسی قرار گرفت. برای یافتن پروتئین هدف CAG از فناوری پروفایل دسترسی پاسخگو به هدف استفاده شد. پس از آن، مکانیسم ضد توموری CAG با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال، رسوب ایمنی، و ترانسفکشن پلاسمیدهای جهش یافته مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت، اثر ضد توموری ترکیبی آنتی‌بادی‌های CAG و PD{6}} در موش‌ها یا ارگانوئیدها بررسی شد.

نتایجما دریافتیم که CAG به طور موثر رشد تومور را در داخل بدن مهار می کند. اطلس چند omics تک سلولی ما نشان داد که CAG ارائه آنتی ژن های سطح سلولی تومور را ترویج می کند و با عملکرد کشتن افزایش یافته سلول های CD8 به علاوه T مشخص می شود. از نظر مکانیکی، CAG به پروتئین هدف خود کاتپسین B متصل شد، که سپس تخریب لیزوزومی کمپلکس اصلی سازگاری بافتی I (MHC-I) را مهار کرد و n تجمع MHC-I را به غشای سلولی ارتقا داد و پیش ایستگاه آنتی ژن تومور را تقویت کرد. . در همین حال، ترکیب CAG با آنتی‌بادی PD{7} به طور موثری سلول‌های CD8 و T کشنده تومور را در موش‌های پیوند زنوگرافت و ارگانوئیدهای سرطان کولورکتال افزایش داد. نتیجه‌گیری داده‌های ما برای اولین بار گزارش دادند که کاهش کاتپسین B ایمنی ضد توموری ایجاد می‌کند و مکانیسم ضد توموری CAG محصول طبیعی را نشان می‌دهد.

معرفی

سرطان کولورکتال یکی از شایع ترین سرطان ها در سراسر جهان است. میزان بروز و میزان مرگ و میر آن در بین سه رتبه اول قرار دارد و زندگی و سلامت انسان را به طور جدی تهدید می کند. 1 روش های درمانی متداول شامل شیمی درمانی جراحی و رادیوتراپی، داروهای هدفمند و ایمونوتراپی است. با این حال، سلول های سرطانی معمولاً آنتی ژن های سطحی را از دست می دهند و بیان می کنند سطوح بالای مولکول ها را مهار می کند تا از نظارت سلول های ایمنی فرار کنند. بنابراین، برای حل مشکل فرار سیستم ایمنی تومور، محققان مهارکننده‌های ایمن بازرسی و نئوآنتی‌ژن درمانی را برای جلوگیری از پوشاندن سلول‌های سرطانی به سلول‌های ایمنی ایجاد کرده‌اند. ۵-۸ اگرچه مهارکننده‌های نقطه بازرسی ایمنی می‌توانند سلول‌های ایمنی ضعیف شده، آنتی ژن سطحی سرطان را بازیابی کنند. سلول ها به طور قابل توجهی اصلاح نشده است. بنابراین، یافتن داروهایی که می‌توانند ارائه آنتی‌ژن‌های سطح تومور را تقویت کنند، به ویژه مهم است. TCR آنتی ژن موجود توسط پروتئین CI سلول دندریتیک/غشای سلول سرطانی را دریافت می‌کند و سیگنال را برای اتصال محکم CD3 ارسال می‌کند، که سپس عمیق‌تر به داخل سیتوپلاسم گسترش می‌یابد.{10}} همزمان، با فعال شدن سیگنال CD28/B7. سلول‌های CD8 پلاس T را می‌توان برای شناسایی و کشتن سلول‌های سرطانی با هم فعال کرد. مطالعات اخیر نشان داده‌اند که در فرآیند پیشرفت تومور، لیزوزوم‌ها منجر به کاهش تجمع MHC-I در سطح سلول‌های سرطانی می‌شوند که به طور موثری انجام نمی‌شود. لیو و همکاران گزارش کردند که مهار PCSK9 می تواند از تخریب MHC-I در لیزوزوم ها جلوگیری کند و MHC-I را قادر می سازد تا به غشای سلولی برای ارائه آنتی ژن ها بازگردد. MHC-I به ویژه برای مسدود کردن فرار ایمنی تومور مهم است.

تعداد فزاینده‌ای از مطالعات نشان داده‌اند که استفاده از مولکول‌های فعال طب سنتی چینی و مداخله ضد تومور چشم‌انداز بسیار خوبی دارد.14 15 سیکلواستراژنول (CAG) یک مولکول فعال موثر در غشای گون است که دارای ضد ویروس، ضد باکتری و ضد تومور است. اثرات التهابی و سایر فارماکولوژیک، اما اثر ضد توموری آن به ندرت گزارش شده است. 16-19 در این مطالعه، ما دریافتیم که CAG رشد تومورهای ترانس مورچه تومورهای سرطان روده بزرگ را مهار می کند. کاتپسین B (CTSB)، ارائه آنتی ژن سلول های سرطانی را ترویج می کند و سپس توانایی کشتن سلول های CD8 به علاوه T را افزایش می دهد.

مواد و روش ها

آنتی بادی ها و معرف ها

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 درصد). آنتی بادی های CTSB (Cat#12216-1-AP، PRID: AB_2086929)، HLA (Cat#15240-1-AP، PRID: AB_1557426)، Actin (Cat#{{{{ 5}}Ig، PRID: AB_2782959)، توبولین (Cat#10094-1-AP، PRID: AB_2210695)، و کیت تشخیص ایمونوهیستوشیمی ضد موش/خرگوش (Cat#PK10006) از Proteintech خریداری شد. آنتی بادی های H2-Kd (Cat#sc-53852، PRID: AB_784514)، LAMP1 (Cat#sc- 20011، PRID: AB_626853)، و CTSB (Cat#sc-365558، PRID: AB_10842446) از سانتا کروز بیوتکنولوژی خریداری شد. آنتی بادی Ki{19}} (Cat#12202، PRID: AB_2620142) از Cell Signaling Technology خریداری شد. آنتی بادی Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) از Abcam خریداری شد. آنتی بادی های فلوسیتومتری CD{24}}V500 (Cat#561487، RRID: AB_1069704 6)، CD{28}}APC (Cat#345767، RRID: AB_2833003) و CD{ {31}}PerCP (Cat#345774، RRID: AB_2868802) از BD Bioscience خریداری شد. آنتی بادی فلوسیتومتری Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) از BioLegend خریداری شد. آنتی بادی های فلوسیتومتری NK1. :AB_466192) از Thermo Fisher Scientific خریداری شد. محیط DMEM (Cat#01-052-1ACS)، PenicilinStreptomycin (Cat#15140122)، و سرم جنین گاو (Cat#C04001-500) از صنایع بیولوژیکی خریداری شد. سرم بز (Cat#88RNG001) و کیت سنجش پروتئین BCA پیرس (Cat#23225) از Thermo Fisher Scientific خریداری شد. آنتی بادی های ضد انسان PD-1 (Cat#BE0188، RRID: AB_1095031 8) و ضد موش PD-1 (Cat#BE0146، RRID: AB_1094905 3) از سلول Bio X خریداری شد. کیت جداسازی بافت تومور MACS (Cat#130-095-929) از Miltenyi Biotec خریداری شد.

کشت سلولی

رده های سلولی سرطان کولون موش MC38 و CT26 در آزمایشگاه ما نگهداری شدند. 20 سرطان کولون انسانی l lines HCT{3}} از مجموعه کشت نوع آکادمی علوم چین (شانگهای، چین) به دست آمد. سلول های MC38، CT26 و HCT{6}} در محیط DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاو و 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین در دمای 37 درجه در انکوباتور 5 درصد CO2 کشت داده شدند.

آزمایش تومور پیوند

موش‌های ماده شش هفته‌ای C57BL/6JGpt، موش‌های BALB/c، و موش‌های برهنه BALB/,c از GemPharmatech (نانجینگ، چین) خریداری شدند. سلول های سرطانی MC38 یا CT26 (106×1) به صورت زیر جلدی به هر موش تلقیح شدند. هنگامی که تومور تا 100 میلی متر مکعب رشد می کند، میکروفون به طور تصادفی به گروه سالین بافر فسفات (PBS) (به عنوان مثال، یک بار در روز) و گروه CAG (به عنوان مثال، 50 میلی گرم بر کیلوگرم یک بار در روز) تقسیم شد. حجم تومور با اندازه گیری کولیس با استفاده از فرمول V{12}}طول×عرض2/2 تعیین شد. وقتی حجم تومور موش‌های گروه PBS به 1000 میلی‌متر مکعب رسید، تومور موش‌ها خارج شد، عکس‌برداری شد و وزن شد.

تفکیک تک سلولی از موش برای تک سلولی RNA/ATACseq

تومورهای جامد موش با استفاده از کیت جداسازی تومور برای به دست آوردن تک سلولی تک سلولی هضم شدند. سلول های تک سلولی تک سلولی با غلظت 1000 سلول/1000 سلول بر روی تک سلولی کنترل کننده کروم ژنومیک 10 با پیروی از پروتکل سازنده ژنومیکس 10 بارگذاری شده است. معرف های رونویسی معکوس، دانه های ژل بارکد شده، و روغن پارتیشن با سلول ها برای ژن مخلوط شدند تا دانه های ژل در امولسیون (GEM) برای رونویسی معکوس تولید شود. پیش پردازش داده scRNA-seq و کنترل کیفیت.

بر اساس ژنوم مرجع موش GRCm38 (mm10)، خط لوله CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) برای پردازش RNA تک سلولی داده های توالی برای هر آزمایش (GSE197229). ماتریس های بیان ژن دیجیتال در R (V.4.0.4) با استفاده از بسته Seurat (V.4.0.0) zed شدند.<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

پیش پردازش و کنترل کیفیت داده SeaTac-seq

داده های تک سلولی ATAC-seq (GSE197229) توسط سلول ranger-at (V.2.{4}}.0) با خط فرمان count پیش پردازش شدند. برای پردازش و تحلیل داده scATAC-seq بعدی، از بسته ArchR (V.1.{8}}.1) استفاده کردیم.24 سپس، از تابع addArchRGethe nome ('mm10') برای حاشیه نویسی ژنوم استفاده کردیم و یک فایل arrow با تابع cre ArrowFiles با پارامترهای پیش فرض. در مرحله بعد، از تابع filterDoublets برای حذف دوتایی های بالقوه استفاده کردیم و یک پروژه ArchR با استفاده از تابع ArchRProject با پارامترهای پیش فرض ایجاد کردیم. سپس از بسته Harmony برای حذف اثر دسته ای توسط تابع addHarmony استفاده کردیم. برای کاهش ابعاد، از تابع addIterativeLSI در ArchR برای اجرا با پارامترهای def t استفاده می کنیم. برای جاسازی تک سلولی، شیء کاهش یافته Dims را با هماهنگی انتخاب کردیم و از تابع addTSNE با پارامتر «گیج=30» برای تجسم استفاده کردیم.

تجزیه و تحلیل یکپارچه داده های siRNA-seq و scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. برای بهبود دقت پیش‌بینی‌ها برای ادغام بهتر دو مجموعه داده، ما یک بار دیگر داده‌های scATAC-seq و scRNA-seq را با استفاده از حالت "ادغام محدود" ادغام کردیم. به طور خلاصه، ما داده‌های scATAC-seq را با انواع سلول‌ها بر اساس امتیازات ژنی scATAC-seq توضیح دادیم. سپس، ما یک لیست محدود ایجاد کردیم به طوری که شباهت بیان ژن فقط در همان نوع سلول برای scATAC-seq و scRNA-seq محاسبه شد. خوشه‌بندی بدون نظارت با t-SNE 13 خوشه زیر سلولی را نشان داد که توسط نشانگرهای شناخته شده یا فرضی در جدول تکمیلی آنلاین 1 حاشیه‌نویسی شده‌اند.

خط سیر دودمان شبه زمان

خط سیر نسل سلولی سلول‌های سرطانی با استفاده از بسته R Monocle2 (V.2.18.0) استنباط شد. 26 مونوسیت نمودار اصلی صریح را از داده‌های ژنومیک تک سلولی توسط Reversed Graph Embedding یاد می‌گیرند تا سلول‌ها را مرتب کنند، بنابراین پیچیده را حل می‌کنند. فرآیندهای بیولوژیکی قوی و دقیق. 27 ما از تابع "تست دیفرانسیل ژن" برای استخراج DEG از هر خوشه استفاده کردیم و پس از ساخت مسیر سلولی، ژن های بیان شده متفاوت را در زمان شبه شناسایی کردیم. همه ژن‌های وابسته به شبه زمان با استفاده از تابع نقشه حرارتی_شبه زمان{10}}که یک شی CellDataSet را می‌گیرد، مشاهده شدند. نمودارهای مسیر دودمان و منحنی‌های بیان صاف براساس CellDataSet به ترتیب توسط ژن‌های نمودار{11}}سلول_مسیر و نمودار_در{15}}شبه زمان ایجاد شدند.28

تماس با تنوع شماره تک سلولی

برای شناسایی سلول‌های بدخیم با تغییرات تعداد کپی کروموزومی کلونال در مقیاس بزرگ (CNV)، از بسته inferCNV R برای استنتاج پروفایل‌های ژنتیکی هر سلول بر اساس میانگین بیان مجموعه‌های ژنی بزرگ در هر ناحیه کروموزومی ژنوم تومور در مقایسه با سلول های نرمال. 29 بر اساس نمونه به نمونه، سلول های ایمنی به عنوان مرجعی برای تخمین CNV در سلول های مرتبط با سرطان استفاده شد.

تجزیه و تحلیل غنی سازی

تجزیه و تحلیل مسیر KEGG و حاشیه نویسی GO با استفاده از بسته R بسته clusterProfiler (V.3.11.1) با پارامترهای PValueCutoff=0 انجام شد.05، PAdjustMethod=BH، QValueCutoff }.05، MingsSize=10، و MaxGSSize=500.۲۰ تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن (GSEA) با استفاده از 50 مجموعه ژن مشخصه (h.all.V.7.4.symbols. gmt) برای شناسایی غنی شده به طور قابل توجهی استفاده شد. مسیرهای عملکردی از طریق نرم افزار GSEA (V.4.1.0)، با معیارهای غربالگری P-value اسمی<0.05and false discovery rate q<0.250.30

تجزیه و تحلیل کمی PCR زمان واقعی

سلول های MC38 و HCT{1}} به مدت 6 ساعت در صفحات شش چاهی کاشته شدند و سپس به مدت 24 ساعت دیگر با CAG تیمار شدند. سلول ها سه بار با PBS سرد شسته شدند و در 18{18}} گرم به مدت 5 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ شدند. در همان زمان، پس از سنگ زنی بافت تومور. طبق دستورالعمل سازنده، RNA کل از سلول‌های MC38، HCT{9} و بافت تومور با استفاده از معرف TRIZol استخراج شد. حجم واکنش 20 میکرولیتر شامل: 1 میکروگرم RNA، 5 میکرولیتر 5×Hiscript III qRT SuperMix و RNase Free dH2 O بود. cDNA تحت PCR کمی قرار گرفت، با حجم واکنش 10 میکرولیتر با 1 µL cDNA، 5 µL مخلوط qPCR، 0.75 میکرولیتر مخلوط qPCR، 0.75 µL. (به جلو و معکوس)، و 3.25 میکرولیتر dH2 O بدون RNase. پرایمرها توسط GenScript Biotech Corporation (نانجینگ، چین) مطابق توالی زیر (جدول تکمیلی آنلاین 2) سنتز شدند.

کشف هدف از طریق یک رویکرد پروفایل دسترسی پاسخگو به هدف

غربالگری پروتئین های متصل شونده به CAG همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد.31 32 به طور خلاصه، رویکرد پروفایل دسترسی پاسخگو به هدف (TRAP) برای کشف پروتئین های اتصال دهنده برای CAG در محیط سلولی با نظارت بر لیزین ناشی از درگیری لیگاند استفاده شد. تغییرات دسترسی در سطح پروتئوم به طور خلاصه، دو ظرف از سلول ها به ترتیب با 10 میکرومولار CAG و دی متیل سولفوکسید (DMSO) تیمار شدند. پس از 1-ساعت انکوباسیون، سلول‌ها توسط بافر M-PER (Thermo Scientific) نفوذپذیر شدند و لیزهای حاصل با افزودن کمپلکس فرمالدئید و بوران پیریدین که با هم به طور خاص بقایای لیزین پروتئینی را در دمای اتاق برای پروفایل دسترسی برچسب‌گذاری می‌کنند، به صورت کووالانسی برچسب‌گذاری شدند. . سپس، lysates توسط حلال آلی رسوب داده شد، و گلوله های جمع آوری شده در 8mol/L اوره، با دی تیوتریتول (DTT) در دمای 56 درجه به مدت 30 دقیقه کاهش یافته و سپس با استفاده از iodoacetamide (IAA) در تاریکی به مدت 30 دقیقه، آلکیلاسیون شدند. مقدار مناسبی از محلول DTT دوباره برای واکنش با IAA اضافی اضافه شد. پس از آن، پروتئوم با محلول بی کربنات آمونیوم رقیق شد تا غلظت نهایی اوره به 1mol/L برسد. هضم‌های پروتئینی جمع‌آوری‌شده روی ستون‌های C18 HLB (واترز، میلفورد، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا) نمک‌زدایی شدند و پپتیدهای غنی‌شده خشک و در محلول آبی 0.1 درصد اسید فرمیک (FA) بازسازی شدند. سیستم AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) برای تجزیه و تحلیل نمونه‌ها برای پروفایل کمی تغییرات دسترسی لیزین در پاسخ به اتصال CAG برای کشف هدف استفاده شد. اکتساب وابستگی داده در حالت مثبت برای اکتساب داده به کار گرفته شد. تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Canada) انجام شد. به طور خاص، cys alkylation به عنوان یک اصلاح ثابت انتخاب شد، و اکسیداسیون متیونین و دی متیلاسیون لیزین، به دست آمده توسط برچسب زدن TRAP، به عنوان تغییرات متغیر تنظیم شد. به طور خلاصه، پپتیدهایی که حاوی دی متیلاسیون ناشی از TRAP هستند و تغییرات فراوانی قابل توجهی را با و بدون انکوباسیون CAG نشان دادند به عنوان پپتیدهای پاسخگو به هدف اختصاص داده شدند. نسبت فراوانی هر پپتید نشاندار شده با TRAP میزان تغییر دسترسی را نشان می‌دهد و ارتباط نزدیکی با میل پیوند لیگاند دارد. آزمون t Student برای ارزیابی اینکه آیا تغییرات دسترسی شناسایی شده پپتیدهای نشاندار شده از نظر آماری معنی دار هستند یا خیر انجام شد. یک مقدار p بین گروهی (ص<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

کشت ارگانوئیدی

ارگانوئیدهای سرطان کولورکتال انسانی توسط Chongqing Kingbiotech ساخته و پرورش داده شدند. 33 نمونه بافت بیمار که توسط عمل جراحی به دست آمده بود با قیچی استریل به قطعات کوچکترین قسمت ممکن خرد شد. قطعات بافت به طور کامل با ماتریژل (Corning، Cat#356231) با نسبت تقریبی 1:4 روی یخ مخلوط شدند. پردازش بعدی به پروتکل های منتشر شده اشاره داشت. به طور خلاصه، سوسپانسیون های تکه های ماتریژل به سرعت در صفحه چند چاهی برای تشکیل قطرات نیمکره ای کاشته شدند و به مدت 15 تا 20 دقیقه به 37 درجه منتقل شدند و اجازه دادند قطرات جامد شوند. مقدار مناسبی از محیط کشت (KingcultureTM Organoid Growth Medium، Cat#KCW-2) ​​را به هر چاهک اضافه کرد و هر ۲ تا ۴ روز یک بار محیط کشت را تغییر داد.

جداسازی و کشت سلول های CD8 T انسانی

همان حجم نرمال سالین را به خون محیطی افراد سالم حاوی داروهای ضد انعقاد اضافه کنید تا کل خون رقیق شود. حجم مشخصی از محلول جداسازی را به یک لوله سانتریفیوژ 15 میلی لیتری اضافه کنید، به آرامی خون کامل رقیق شده را در امتداد دیواره لوله به بالای محلول جداسازی اضافه کنید و به مدت 20 دقیقه در 750 گرم سانتریفیوژ کنید. پس از سانتریفیوژ، از یک پیپت برای مکیدن مونوسیت های لایه سفید میانی به داخل لوله سانتریفیوژ 15 میلی لیتری استفاده کنید، حجم مشخصی از PBS را برای معلق کردن مجدد اضافه کنید، 250 گرم را به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید و مایع رویی را دور بریزید. پس از افزودن دانه های مغناطیسی CD8 انسانی به رسوبات سلولی، سلول های CD8 T توسط ستون مرتب سازی LS مرتب شدند. سلول‌های CD8 T به صفحه سوراخ‌دار که از قبل با آنتی‌بادی 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) و سپس 10ng/mL IL پوشش داده شده بود، اضافه شدند. } (Peprotech Cat# 212-12) و 5μg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81، RRID: AB_468920) آنتی‌بادی‌های عملکردی به مدت ۲۴ ساعت کشت داده شدند.

همفرهنگی

پس از اینکه ارگانوئیدها با CAG به مدت 24 ساعت انکوبه شدند، محیط کشت تازه جایگزین شد و سپس ارگانوئیدها و سلول های CD8 T فعال شده در ژل ماتریکس سوسپانسیون شدند، سپس سوسپانسیون به صفحه شش چاهی اضافه شد و در 37 قرار گرفت. انکوباتور درجه به مدت 15 دقیقه و سپس 2 میلی لیتر محیط کشت کامل بدون سرم به مدت 24 ساعت اضافه شد.

وسترن بلات

سلول های MC38 و HCT{1}} به مدت 6 ساعت در صفحات شش چاهی کاشته شدند و سپس به مدت 24 ساعت دیگر با CAG تیمار شدند. سلول ها سه بار با PBS سرد شسته و در دمای 180 گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند. پروتئین کل با لیز WB-IP حاوی 1 درصد بازدارنده پروتئاز به مدت 30 دقیقه روی یخ لیز شد. پروتئین کل با استفاده از کیت کمی پروتئین BCA ارزیابی شد. نمونه های پروتئینی با الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید SDS 10 تا 12 درصد جدا شده و به غشاهای PVDF (پلی وینیلیدین فلوراید) در 350 میلی آمپر به مدت 90 دقیقه منتقل شدند. غشاهای PVDF با 5 درصد BSA به مدت 1 ساعت مسدود شدند، نوارها با آنتی بادی اولیه مشخص شده در طول شب، و با آنتی بادی ثانویه به مدت 90 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. در نهایت، نوارها با استفاده از یک سیستم بستر نورتابی شیمیایی LumiGLO (KPL، Gaithersburg، مریلند، ایالات متحده آمریکا) شناسایی شدند.

فلوسیتومتری

پس از هضم بافت تومور و سوسپانسیون تک سلولی تهیه شد. رنگ آمیزی سطحی با آنتی بادی های آنتی ژن سطحی در بافر FCM (Flow Cytometry) (PBS حاوی 1 درصد FBS) انجام شد و به مدت 30 دقیقه روی یخ با آنتی بادی های مناسب رنگ آمیزی شد. برای از بین بردن سلول های مرده از رنگ های واکنشی (eBioscience) استفاده شد. رنگ‌آمیزی سیتوکین‌های داخل سلولی با محلول تثبیت‌کننده سلول BD/محلول غشای خارج سلولی انجام شد و سلول‌ها تثبیت و نفوذ کردند و سپس با آنتی‌بادی‌ها علیه سیتوکین‌ها در بافر Perm/Wash (BD Biosciences) رنگ‌آمیزی شدند.

پلاسمیدهای جهش یافته CTSB ترانسفکت شدند

سلول های HCT به مدت 12 ساعت در صفحات چاهک کاشته شدند و سپس با پلاسمیدهای جهش یافته CTSB-WT-EGFP یا CTSB (Y75A، A77V و G198A) به مدت 36 ساعت ترانسفکت شدند.

تداخل انتقال یا پلاسمید بیان بیش از حد CTSB به سلول های MC38 یا سلول های HCT{2}}

سلول‌های MC38 (1×106 / چاه) به مدت 6 ساعت در پلیت‌های چاهک تلقیح شدند، سپس با RNA مداخله‌گر CTSB (توالی: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT و Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) به مدت 48 ساعت یا سطوح پروتئین ترانسفکت شدند. از Ctsb و H{8}}k1 شناسایی شد. سلول های HCT (106×1/چاه) به مدت 6 ساعت در صفحات چاهک تلقیح شدند، سپس با تداخل CTSB (توالی: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) یا پلاسمید با بیان بیش از حد به مدت 48 ساعت و mRNA ترانسفکت شدند. یا سطح بیان پروتئین CTSB و HLA-A شناسایی شد.

تکنولوژی داکینگ

ساختار سه بعدی CTSB از پایگاه داده پروتئین (PDB ID: 2iPP) و ساختارهای CAG از PubChem دانلود شد. فرآیند اتصال در Autodock 2 با اتصال درشت با استفاده از یک الگوریتم بازپخت شبیه‌سازی شده و پالایش بعدی با استفاده از الگوریتم ژنتیک انجام شد.

سنجش شیفت حرارتی سلولی

سلول های MC38 در یک شب در صفحات 10 سانتی متری کاشته شدند و سپس با CAG یا 0.1 درصد DMSO به مدت 2 ساعت دیگر تیمار شدند. سلول ها جمع آوری شدند، با PBS سرد شسته شدند و در 180 گرم به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس سلول ها به طور مساوی به لوله های سانتریفیوژ (هر لوله 70 میکرولیتر) تقسیم شدند و به مدت 3 دقیقه در دمای زیر: 46، 49، 52، 55، 58، 61، 64 و 67 درجه حرارت داده شدند، نمونه ها به مدت 3 دقیقه در دماها سرد شدند. سپس روی یخ نگهداری می شود. سپس نمونه ها به مدت یک شب در یخچال با دمای 80- درجه قرار گرفتند. نمونه ها به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق ذوب شدند و سپس در دمای 80- درجه به مدت 4 ساعت در یخچال نگهداری شدند. در نهایت، نمونه ها در 12، 000 گرم به مدت 25 دقیقه سانتریفیوژ شدند، مایع رویی به بافر بارگذاری اضافه شد و با وسترن بلات آنالیز شد.

رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی

مقاطع پارافینی بافت تومور به مدت 20 دقیقه در زایلن غوطه ور شدند تا موم زدایی کنند و سپس در اتانول 100 درصد، 75 درصد و 50 درصد به مدت 10 دقیقه غوطه ور شدند. پس از اینکه برش ها تحت ترمیم آنتی ژن با محلول ترمیم آنتی ژن سیترات سدیم قرار گرفتند، پراکسید هیدروژن درون زا با پراکسید هیدروژن 3 درصد غیرفعال شد. پس از انسداد با سرم 5 درصد بز به مدت 1 ساعت، آنتی بادی ضد Ki67 (1:200) اضافه شد و یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شد. پلیمر نشاندار HRP ضد موش/خرگوش (100µL) اضافه شد و نمونه‌ها در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه و سپس 100 میکرولیتر محلول کاری DAB و انکوباسیون در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه انکوبه شدند. پس از 1 دقیقه رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین، نمونه‌ها با اتانول 50، 75 و 100 درصد و زایلن به مدت 5 دقیقه شسته شدند و از صمغ خنثی برای آب‌بندی فیلم استفاده شد. این فیلم زیر میکروسکوپ مشاهده و عکسبرداری شد.

آماریتحلیل و بررسی

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism (V.8.{1}}) انجام شد. همه نتایج به عنوان میانگین ± SEM سه آزمایش مستقل بیان شده است. تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه به دنبال آزمون تعقیبی دانت برای ارزیابی تفاوت ها زمانی که بیش از دو گروه وجود داشت استفاده شد. برای بررسی تفاوت معنادار بین دو گروه از آزمون t-test استفاده شد. یک معنادار آماری در p<0.05.

نتایج

تجزیه و تحلیل چند omics تک سلولی CAG که رشد سرطان روده بزرگ پیوندی را در موش مهار می کند

برای بررسی اینکه آیا CAG اثر ضد توموری دارد، ابتدا سلول‌های سرطانی MC38 را به موش‌های C57BL/6 پیوند زدیم. ما اشاره کردیم که CAG به طور قابل توجهی از رشد تومورها جلوگیری می کند (شکل مکمل آنلاین S1A, B). متعاقبا، سلول‌های CT26 را به موش‌های BALB/c پیوند زدیم و متوجه شدیم که CAG از رشد تومورها نیز جلوگیری می‌کند (شکل مکمل آنلاین S1C, D).

برای آشکارسازی بیشتر مکانیسم خاصی که توسط آن CAG رشد تومور را مهار می‌کند، آن را با استفاده از تکنیک‌های scRNA-seq و scATAC-seq تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 1A). ما جمعیت سلولی را به چهار گروه تقسیم کردیم: سلول های سرطانی، فیبروبلاست ها، سلول های میلوئیدی و لنفوسیت ها (شکل 1B، شکل مکمل آنلاین S2A، B). ما دریافتیم که سلول های سرطانی (52 درصد) و فیبروبلاست ها (41 درصد) عمدتاً در بافت های تومور نفوذ می کنند، در حالی که سلول های ایمنی تنها 7 درصد را تشکیل می دهند. سپس سلول های سرطانی را به هشت زیر مجموعه و فیبروبلاست ها را به سه زیر مجموعه تقسیم کردیم (شکل 1C-E). متعاقبا، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی ژن‌های با بیان بالا در هر جمعیت سلولی نشان داد که مسیرهای مولکولی MHC-I در سلول‌های سرطانی، و همچنین سیگنال‌های ضد توموری سلول‌های T و سلول‌های NK (شکل مکمل آنلاین S2C) غنی شده‌اند. سپس، چهار گروه از سلول ها نیز با استفاده از تجزیه و تحلیل ادغام scATAC-seq و scRNA-seq پیدا شدند (شکل 2D-G). پس از مقایسه، متوجه شدیم که سلول‌های سرطانی (سلول‌های C01، C03)، سلول‌های CD8 به علاوه T، سلول‌های Spp1 به علاوه TAM، و فیبروبلاست‌ها (سلول‌های F01 و F02) در توالی‌یابی ATAC ظاهر شدند (شکل 1F، G)، و در ادامه، به شدت بیان شدند. فاکتورهای رونویسی در این سلول ها غنی شدند (شکل 1H). از طریق این تجزیه و تحلیل، ما حدس می زنیم که مهار رشد تومور توسط CAG ارتباط نزدیکی با تغییرات در این سلول ها دارد.

Cag باعث ایجاد آنتی ژن سلول تومور می شود

برای تجزیه و تحلیل مکانیسم ضد توموری CAG، ابتدا جمعیت سلول های تومور را تجزیه و تحلیل کردیم و سلول های سرطانی را به هشت زیر گروه تقسیم کردیم (شکل 2A، B، شکل مکمل آنلاین S3A). نتایج نشان داد که در مقایسه با گروه PBS، سلول های گروه C05 به طور قابل توجهی کاهش یافت در حالی که سلول های گروه C07 افزایش یافت (شکل 2C). در همین حال، برای تأیید صحت خوشه‌بندی سلول‌های تومور، CNV لنفوسیت‌ها و سلول‌های میلوئیدی را به عنوان سلول‌های مرجع مقایسه کردیم. نتایج نشان داد که CNV سلول های سرطانی به طور قابل توجهی بالاتر از سلول های ایمنی بود (شکل مکمل آنلاین S3B). هنگام تجزیه و تحلیل زیرمجموعه‌های سلول‌های سرطانی، متوجه شدیم که ژن‌های پاسخ اینترفرون Isg15، Irf7، Ifit3 و Ifi47 در جمعیت‌های سلولی C07 و C08 گروه CAG در مقایسه با گروه PBS (شکل مکمل آنلاین S3C) به شدت بیان می‌شوند. تجزیه و تحلیل جمعیت سلول های تومور نشان داد که مسیرهای مربوط به ارائه آنتی ژن به طور قابل توجهی در جمعیت های سلولی متعدد غنی شده است. بنابراین، ما حدس می زنیم که CAG ممکن است ارائه آنتی ژن سلول های سرطانی را برای ایفای نقش ضد تومور ترویج کند (شکل 2D). سپس، ژن های مربوط به ارائه آنتی ژن را انتخاب کردیم و دریافتیم که سطح بیان در گروه CAG به طور قابل توجهی بالاتر از گروه PBS بود (شکل 2E، شکل مکمل آنلاین S3D). ما همچنین دریافتیم که CAG باعث افزایش ارائه آنتی ژن در بافت های تومور می شود (شکل 2F، G).

در مرحله بعد، ما از scATAC-seq برای تجزیه و تحلیل دلایل خاص پشت ارائه آنتی ژن سلول تومور CAG استفاده کردیم. ما دریافتیم که جمعیت سلول های تومور فاکتورهای رونویسی Fos، Junb، Jund، Fosb و Fosl1 را به شدت بیان می کنند (شکل 2H، I). متعاقباً، ما نقشه‌ای از تعامل بین فاکتورهای رونویسی و ژن‌های مربوطه ساختیم تا توضیح دهیم که CAG بیان ژن‌های مرتبط با آنتی‌ژن سلول تومور را ارتقا می‌دهد (شکل 2J). در بافت های تومور، ما همچنین دریافتیم که فاکتورهای رونویسی Junb، Fos، Jund و Fosb در گروه PBS تحت درمان CAG به طور قابل توجهی بیش از حد بیان می شوند (شکل 2K-N، شکل مکمل آنلاین S3E-I). تاکنون دریافته‌ایم که CAG می‌تواند بیان فاکتورهای رونویسی ژن‌های مرتبط با آنتی‌ژن را تقویت کند و در نتیجه عملکرد ارائه آنتی‌ژن سلول‌های سرطانی را تقویت کند. با این حال، چگونگی پاسخ این سلول های سرطانی به پاسخ های سلول های ایمنی نامشخص است.

برای کشف پدیده ای که توسط آن CAG ارائه آنتی ژن سلول های سرطانی را ترویج می کند، ما تجزیه و تحلیل مسیر را برای بررسی چگونگی تغییر سلول های سرطانی یکدیگر در پاسخ به پاسخ های سلول های ایمنی انجام دادیم. ما دریافتیم که با گذشت زمان، سلول‌های سرطانی C07 به سلول‌های C05، C06 و C08 تبدیل شدند و غنی‌سازی ژن نیز نشان داد که سلول‌های سرطانی به ارائه آنتی‌ژن تبدیل می‌شوند (شکل 3A-E).

CAG عملکرد کشتن سلول های ایمنی را افزایش می دهد

این نتایج نشان می‌دهد که CAG می‌تواند آنتی‌ژن‌های سلول تومور را نشان دهد، بنابراین آیا افزایش ارائه آنتی‌ژن سلول تومور منجر به افزایش عملکرد سلول‌های ایمنی می‌شود؟ برای پی بردن به این موضوع، ما به ترتیب لنفوسیت ها و سلول های میلوئیدی را تجزیه و تحلیل کردیم. نتایج نشان داد که CAG باعث افزایش نفوذ سلول‌های CD8 به علاوه T در بافت‌های تومور می‌شود، و نفوذ سلول‌های CD8 به علاوه T و سلول‌های NK نیز افزایش یافته است که توسط فلوسایتومتری شناسایی می‌شود (شکل مکمل آنلاین S4A-F). ما همچنین مشاهده کردیم که CAG بیان ژن‌های Ifitm2، Cxcr6 و S100a6 را در سلول‌های CD8 به علاوه T افزایش می‌دهد.

ژن‌های Fcer1g، Gzmb، AW112010، و Zfp36i2 در سلول‌های NK، و ژن‌های Nfkbia و Junb در سلول‌های CD4 به علاوه T (شکل مکمل آنلاین S4G). بیان Ifng و Gzmb در سلول های CD8 به علاوه T نیز به طور قابل توجهی افزایش یافته است، همانطور که توسط فلوسیتومتری شناسایی شد (شکل مکمل آنلاین S4H، I). علاوه بر این، ما دریافتیم که پس از درمان CAG، بیان گیرنده های بازدارنده Lag3، Tigit و Havcr2 در سطح سلول های CD8 به علاوه T کاهش یافت و بیان ژن های Cd28، Cd69، Gzmk، Ccl5 و Pdcd1 که مشخص کننده فعال سازی سلول های CD8 به علاوه T، به طور قابل توجهی افزایش یافته است (شکل مکمل آنلاین S4J). برای تأیید بیشتر اینکه CAG عملکرد کشتن سلول‌های CD8 به علاوه T را با ترویج افزایش ارائه آنتی‌ژن تومور افزایش می‌دهد، سلول‌های CT26 را به تومورهای پیوندی در موش‌های برهنه پیوند زدیم و مشاهده کردیم که CAG نمی‌تواند به طور موثر رشد تومورها را مهار کند (شکل مکمل آنلاین S4K-M ).

به دنبال این، سلول‌های میلوئیدی را تجزیه و تحلیل کردیم و دریافتیم که سلول‌های Spp1 به علاوه TAM پس از درمان CAG افزایش یافت، در حالی که تعداد سلول‌های C1qc به علاوه TAM کاهش یافت و تعداد Il1b به علاوه مونوسیت‌ها افزایش یافت (شکل مکمل آنلاین S5A-D). پس از درمان CAG، سلول های Spp1 به علاوه TAM و C1qc به علاوه TAM نسبت به تبدیل TAM پیش التهابی حساس تر بودند. تجزیه و تحلیل غنی سازی نشان داد که عمدتاً بر Tnf-، Ifn-g و مسیر سیگنالینگ پاسخ التهابی متمرکز است (شکل مکمل آنلاین S5E-H). بر اساس نتایج ذکر شده در بالا، استنباط می‌کنیم که CAG با ترویج ارائه آنتی‌ژن در سلول‌های سرطانی، شناسایی و عملکرد کشتن سلول‌های ایمنی را افزایش می‌دهد. با این حال، چگونگی تنظیم CAG مشخص نیست.

کشف پروتئین هدف CAG CTSB توسط تله

در مرحله بعد، پروتئین هدف CAG خاص که نقش ضد توموری ایفا می کند را بررسی خواهیم کرد. ما سلول‌های سرطانی را به عنوان هدف تحقیق انتخاب کردیم، زیرا دریافتیم که CAG می‌تواند نمایش آنتی‌ژن سلول‌های سرطانی را افزایش دهد و در نتیجه عملکرد کشتن سلول‌های ایمنی را افزایش دهد. ما ابتدا مشتق بیوتین CAG را سنتز کردیم و دریافتیم که فقط 3-OH می‌تواند واکنش نشان دهد (شکل مکمل آنلاین S6A). سپس بررسی کردیم که آیا CAG-بیوتین همچنین بیان ژن‌های مرتبط با ارائه آنتی ژن را در رده سلولی تومور MC38 موش ترویج می‌کند یا خیر. نتایج نشان می‌دهد که CAG-بیوتین بر بیان ژن‌های H2-K1، Cd74 و Anxa1 تأثیری ندارد (شکل مکمل آنلاین S6B-D).

بنابراین، ما از روش قبلی جستجوی هدف TRAP در آزمایشگاه استفاده کردیم. 32 CAG و DMSO هر دو با رده سلولی MC38 انکوبه شدند (شکل 4A). ما پروتئین با FC بزرگتر یا مساوی 2 و ap کمتر یا مساوی 0.05 0 را به عنوان پروتئین هدف کاندید CAG انتخاب کردیم. با پیروی از این اصل که اتصال مولکول های کوچک به پروتئین ها منجر به بازده برچسب گذاری پایین لیزین می شود، ما CTSB را برای مطالعه انتخاب کردیم (شکل 4B). در مرحله بعد، ما از روش انتقال حرارتی سلولی (شکل 4C) و ترموفورز در مقیاس میکرو (MST) (شکل 4D) برای تأیید اتصال بین CAG و CTSB استفاده کردیم و دریافتیم که میل ترکیبی بین CAG و CTSB 26.6nM است (شکل 4D). پس از آن، ما مکان‌های اتصال بین CAG و CTSB را با توجه به ساختار کریستالی پروتئین CTSB در کتابخانه PDB پیش‌بینی کردیم. ما دریافتیم که گروه‌های هیدروکسیل در هر دو انتهای CAG و محل‌های ALA77 و GLY198 CTSB توسط یک پیوند هیدروژنی متصل می‌شوند، در حالی که مکان‌های TYR75، PRO76 و ALA173 CAG و CTSB توسط نیروی واندروالس محدود شده‌اند (شکل 4E). . برای تأیید محل اتصال بین CAG و CTSB، پلاسمید جهش یافته CTSB را در سلول‌های HCT{18}} ترانسفکت کردیم. نتایج نشان می دهد که میل ترکیبی بین پلاسمید جهش یافته در A77V و G198A و CAG صدها برابر بیشتر از پلاسمید WT بود (شکل 4F، G). در بخش بعدی، مکانیسم خاصی را بررسی می کنیم که توسط آن CAG نقش ضد توموری را از طریق CTSB ایفا می کند.

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】