اثر حساس به سن محدودیت کالری بر بیوژنز میتوکندری و آسیب MtDNA در کبد موش صحرایی

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:محدودیت کالری (CR) موثرترین درمان برای به تاخیر انداختن شروع تغییرات مرتبط با افزایش سن مانند اختلال عملکرد میتوکندری است. با این حال، حساسیت نشانگرهای میتوکندری به CR و مرزهای مربوط به سن اثر CR به طور کامل مشخص نشده است. ما از نمونه‌های کبدی از موش‌های صحرایی با تغذیه آزاد (AL) استفاده کردیم که به دو دسته تقسیم شدند: , and 32-month-old(AL-32) group, and from CR-treated (CR) 28-month-old (CR-28) and 32- همتایان یک ماهه (CR-32) برای سنجش اثر CR بر روی چندین نشانگر میتوکندری. کاهش وابسته به سن در فعالیت سیترات سنتاز، در مقادیر پروتئین TFAM، MFN2 و DRP1 و محتوای mtDNA در گروه AL{22}} در همتایان CR{23}} جلوگیری شد. بر این اساس، CR آسیب اکسیداتیو mtDNA را کاهش داد که از طریق بروز پورین های اکسید شده در مناطق خاص mtDNA در حیوانات CR{24}} ارزیابی شد. این یافته ها از اثر ضد پیری CR تا 28 ماه پشتیبانی می کند. برعکس، مقدار پروتئین LonP1، Cytc، OGG1، و APE1 و محتوای حذف mtDNA 4.8 کیلوبایتی در موش‌های CR{32}} تحت تأثیر قرار نگرفت. عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین مقادیر AL-32 و همتایان CR-32، یک مرز مرتبط با سن CR را در این سن نشان می‌دهد.ویتامین C پوریتانسبا این حال، این تنها تا حدی مزایای CR را در مقابله با کاهش پیری عمومی و درگیری میتوکندریایی مرتبط کاهش می‌دهد.

کلید واژه ها:کبد موش صحرایی؛ سالخورده؛ محدودیت کالری؛ بیوژنز میتوکندری؛ آسیب mtDNA؛ اثربخشی حساس به سن CR

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

با توجه به پیشرفت چشمگیر مطالعاتی که فرآیند پیری را بررسی می‌کنند، چندین تعاریف مختلف از این فرآیند به‌طور متوالی ارائه شده‌اند و مجموعه‌ای از مسیرها و واسطه‌ها به‌اصطلاح مشخصه‌های پیری شناسایی شده‌اند [1،2]. در این میان، اختلال عملکرد میتوکندری، استرس اکسیداتیو، و آسیب مولکولی میتوکندری به عنوان عوامل حیاتی ظاهر شده‌اند. یکی از ویژگی های مهم پیری ویژگی بافتی است که برای درگیری میتوکندری [3،4]، تغییرات اپی ژنتیکی [5] و سایر تغییرات مانند طول تلومر [6] برجسته شده است. در میان درمان‌های مختلف با هدف جلوگیری یا به تاخیر انداختن شروع تغییرات مرتبط با سن، محدودیت کالری (CR) قدیمی‌ترین استراتژی پیشنهادی است [7]، و هنوز هم استاندارد طلایی برای تعداد بسیار زیادی از اثرات مفیدی است که توسط این مداخله منتقل می‌شود. در واقع، مطالعات اخیر بر روی مکانیسم‌های مولکولی برانگیخته شده توسط CR نشان داده‌اند که چندین مسیر به طور مثبت تحت تأثیر این مداخله تغذیه‌ای قرار می‌گیرند [{10}}].سیستانچهعلاوه بر این، این یافته‌ها نیز قویاً از وجود یک «پلاستیسیته» پیری [5،9،11،12] حمایت می‌کنند که می‌تواند از طریق تعاملات محیطی مانند مداخلات تغذیه‌ای یا دارویی یا عادات سبک زندگی تعدیل شود. قبلاً نشان داده شده است که CR با تغییرات مربوط به سن در بیوژنز و متابولیسم میتوکندری در چندین بافت موش با اثرات بافت خاص مقابله می کند [3،13،14]. به طور خاص، مطالعات قبلی توسط گروه ما بر روی کبد موش صحرایی، که عمیقاً تحت تأثیر پیری در سطح میتوکندری است، بررسی نشانگرهای اندامکی تأثیر مثبت CR را بر تغییرات مرتبط با سن میتوکندری نشان داد. در واقع، در موش‌های 28-ماهه تیمار شده با CR، محتوای DNA میتوکندری (mtDNA)، مقدار پروتئین‌های درگیر در بیوژنز میتوکندری یا حساس به ROS، و میزان اتصال فاکتور رونویسی میتوکندری A(TFAM) در مناطق خاص mtDNA مقادیر قابل توجهی متفاوت از همتایان همتای همتا با تغذیه آزاد (AL) همسان با سن و تفاوت آماری با حیوانات 18-ماهه جوان‌تر که با AL تغذیه می‌شوند، متفاوت است [15]. اخیراً، تجزیه و تحلیل بیوژنز میتوکندری و آسیب mtDNA در کبد از موش‌های با سن AL (28-ماهه) و بسیار مسن (32-ماهه) به ما اجازه داد تا مجموعه‌ای متنوع را مطالعه کنیم. از پارامترهای میتوکندری و برای نشان دادن سرعت متفاوتی از پیری در رابطه با درگیری میتوکندری، در حیوانات معدودی که به طور طبیعی به طول عمر می‌رسند با توجه به اکثریت آنهایی که پیر می‌شوند [16،17]. با این مقدمات، هدف ما ارزیابی اثربخشی CR بر روی مجموعه بزرگی از نشانگرهای میتوکندریایی در سنین مختلف در کبد موش بود. برای این منظور، ما از حیواناتی از سویه هیبریدی بسیار با عمر Fischer 344× Brown Norway استفاده کردیم، که از آن‌ها 18-موش‌های صحرایی یک ماهه (AL-18) به عنوان کنترل انتخاب شدند. برای مقایسه با حیواناتی که به طور آزاد تغذیه می‌شوند، سالخورده (AL{-28) و بسیار مسن (AL-32) و حیوانات همسان تحت درمان با CR (CR-28 و CR{) {39}}). در این گروه از موش‌ها بررسی کردیم: فعالیت آنزیم میتوکندری سیترات سنتاز، بیان مجموعه‌ای از پروتئین‌ها شامل TFAM، لون پروتئاز (LonP1) و سیتوکروم c (Cytc)، آنزیم‌های ترمیم mtDNA 8- oxo DNA گلیکوزیلاز/آپورینیک یا آپیریمیدینیک (AP) لیاز (OGG1) و آپورینیک/آپیریمیدینیک اندونوکلئاز 1 (APE1)، و پروتئین‌های دینامیک میتوکندری میتوفوزین 2 (MFN2) و پروتئین مرتبط با دینامین 1 (DRP1). در نهایت، محتوای mtDNA و آسیب اکسیداتیو در مناطق خاص نیز تعیین شد.

2. نتایج

2.1. ارزیابی سن و اثرات CR بر نشانگرهای عملکرد میتوکندری

فعالیت سیترات سنتاز، که همچنین نشانگر توده میتوکندری است، در هر پنج گروه موش صحرایی برای ارزیابی حساسیت عملکرد میتوکندری به پیری و CR تعیین شد (شکل 1).

کاهش معنی‌دار آماری مرتبط با سن در فعالیت سیترات سنتاز در موش‌های AL-28(-41 درصد) و AL-32(-40 درصد) در مقایسه با AL{{{{{ 5}} کنترل سن. تفاوت آماری معنی داری بین گروه های AL-28 و AL-32 مشاهده نشد. اثر CR با فعالیت آنزیم به طور قابل‌توجهی بالاتر (به علاوه 40 درصد) در موش‌های صحرایی CR در مقایسه با مقدار AL{11}} موش صحرایی هم‌سن با سن نشان داده شد. علاوه بر این، فعالیت CR{12}} مشابه آنچه در موش‌های کنترل جوان AL{13}} مشاهده شد (شکل 1) بود. این اثر در عوض در حیوانات CR{15}} کمرنگ شد. در واقع، در سن بالاتر از 32 ماه، هیچ تفاوت آماری بین گروه های AL و CR مشاهده نشد.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

برای عمیق‌تر کردن آنالیز اثرات سن و CR بر عملکرد میتوکندری، مقدار پروتئین TFAM و LonP1 در میتوکندری‌های جدا شده از همه گروه‌های موش توسط آنالیزهای وسترن بلات تعیین شد، که در آن پروتئین از غشای خارجی میتوکندری VDAC به عنوان یک ماده مورد استفاده قرار گرفت. کنترل بارگذاری داخلی (شکل 2).

شکل 2. مقدار پروتئین های TFAM و LonP1 در میتوکندری های جدا شده کبد از ماه AL-18، AL-28، CR-28، AL-32 و CR-32- - موش های پیر (آ). مقادیر پروتئین TFAM در میتوکندری های کبد جدا شده از گروه های مختلف موش صحرایی. در این قسمت، یک وسترن بلات نماینده بر روی یک موش از هر یک از گروه‌های مورد سنجش انجام شد. نوارهای Immunoreactive، از بالا به پایین، به ترتیب نشان دهنده سیگنال های TFAM و VDAC هستند. هیستوگرام اندازه گیری شدت باندهای TFAM را نشان می دهد که به شدت VDAC. (B) نرمال شده است. مقادیر پروتئین LonP1 در میتوکندری های کبد جدا شده از گروه های مختلف موش صحرایی. در این قسمت، یک وسترن بلات نماینده بر روی یک موش از هر یک از گروه‌های مورد سنجش انجام شد. از بالا به پایین، باندهای ایمونوراکتیو به ترتیب نشان دهنده سیگنال های LonP1 و VDAC هستند.سیستانچ چیستهیستوگرام کمی شدت باندهای LonP1 را نشان می‌دهد که به شدت VDAC نرمال شده است. (A, B) داده‌ها نتایج حاصل از آزمایش‌های وسترن بلات سه‌گانه را نشان می‌دهند و با استفاده از آزمون ANOVA یک طرفه و آزمون مقایسه چندگانه توکی آنالیز شدند. . میله ها نشان دهنده مقادیر میانگین و SD برای پنج گروه آزمایشی هستند. داده‌ها در برابر مقدار AL{2}} موش‌های صحرایی نرمال‌سازی شدند که به صورت 1.*p ثابت شد.<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" aging="" led="" to="" a="" statistically="" significant="" (-31%)decrease="" in="" the="" tfam="" amount="" comparing="" al-18="" control="" rats="" with="" both="" al-28="" and="" al-32="" animals,="" whereas="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" values="" of="" al-28="" and="" al-32="" groups.="" as="" an="" effect="" of="" cr,="" the="" cr-28="" rats="" had="" a="" tfam="" amount="" significantly="" higher(+39%)="" than="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" counterparts="" and="" not="" different="" from="" that="" of="" the="" younger="" al-18="" controls.="" conversely,="" such="" diet="" effect="" was="" not="" visible="" anymore="" in="" the="" cr-32="" animals="" that="" showed="" a="" tfam="" amount="" not="" statistically="" different="" from="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" group="" and="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" al-18="" rats.="" as="" for="" the="" lonp1="" amount,="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" (-65%)="" age-related="" decrease="" in="" the="" al-28="" group="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" value.="" the="" age="" progression="" made="" the="" statistically="" significant="" decrease="" in="" the="" lonp1="" amount,="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" rats,="" more="" marked(-75%)in="" the="" al-32="" group.="" interestingly,="" there="" was="" no="" evident="" effect="" of="" cr="" on="" the="" lonp1="" amount="" since="" the="" comparison="" between="" the="" al-28="" value="" and="" the="" cr="" age-matched="" counterpart="" did="" not="" show="" any="" significant="" difference="" and="" the="" same="" occurred="" for="" the="" comparison="" between="" the="" al-32="" and="" cr-32="">

برای ارزیابی اثر پیری و CR روی یکی دیگر از عملکردهای متابولیک میتوکندری که شروع مسیر آپوپتوز ذاتی میتوکندری است، با آزمایش‌های وسترن بلات، مقدار Cyt c درون میتوکندریایی را تعیین کردیم (شکل 3).

شکل 3. مقادیر پروتئین Cyt c در میتوکندری های کبدی جدا شده از AL-18، AL-28، CR-28، AL-32، و CR-32-ماه- موش های پیر در این قسمت، یک وسترن بلات نماینده بر روی یک موش از هر یک از گروه‌های مورد سنجش انجام شد. از بالا به پایین، باندهای ایمونوراکتیو به ترتیب نشان دهنده سیگنال های Cyt c و VDAC هستند. هیستوگرام اندازه گیری شدت باندهای Cytc را نشان می دهد که به شدت VDAC نرمال شده است. تمام داده‌ها نتایج آزمایش‌های وسترن بلات سه‌گانه را نشان دادند و با استفاده از آزمون ANOVA یک‌طرفه و آزمون مقایسه چندگانه توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. میله ها نشان دهنده مقادیر میانگین و SD برای پنج گروه آزمایشی هستند. داده‌ها در برابر مقدار AL{8}} موش‌های صحرایی نرمال‌سازی شدند که به صورت 1.* p ثابت شد.<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" the="" age-related="" effect="" on="" the="" intra-mitochondrial="" cyt="" c="" amount="" was="" peculiar="" since="" there="" was="" a="" marked(-44%)statistically="" significant="" decrease="" passing="" from="" the="" al-18="" rats="" to="" the="" al-28="" animals,="" but="" such="" decrease="" was="" partially="" prevented="" in="" the="" al-32="" group="" showing="" a="" small(-13%)="" decrease="" in="" comparison="" with="" the="" al-18counterpart="" and="" a="" significant="" marked="" (+55%)="" increase="" in="" comparison="" with="" the="" al-28="" rats.="">ضد پیری سیستانچاثر CR به هیچ وجه مرتبط نبود زیرا تفاوت معنی داری در مقادیر پروتئین Cyt c بین گروه های AL و CR همسان با سن در 28 و همچنین در 32 ماهگی وجود نداشت. کاهش مربوط به سن در مقادیر Cytc در دو گروه روندی مشابه با آنچه در گروه‌های AL-28 و AL-32 مشاهده شد با کاهش مرتبط‌تر در حیوانات CR-28 نشان داد. تا حدی در موش‌های CR-32 مسن‌تر جلوگیری شد.

2.2. ارزیابی سن و اثرات CR بر روی آنزیم های ترمیم کننده mtDNA

از آنجایی که نشان داده شده است که پیری تا حد زیادی با تجمع آسیب به mtDNA مرتبط است، ما با آزمایش‌های وسترن بلات، بیان دو آنزیم اصلی ترمیم mtDNA، یعنی 8-oxo DNA glycosylase/apurinic را در میتوکندری‌های جدا شده کبد اندازه‌گیری کردیم. یا apyrimidinic (AP)lyase (OGG1) و apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) که هر دو در ترمیم برداشتن پایه (BER) که مکانیسم رایج ترمیم mtDNA است نقش دارند (شکل 4).

شکل 4. مقدار پروتئین های OGG1 و APEl در میتوکندری های کبدی جدا شده از ماه AL-18، AL-28، CR-28، AL-32 و CR-32- - موش های پیر (الف) در داخل، یک وسترن بلات نماینده بر روی یک موش از هر یک از گروه‌های سنجش انجام شد. باندهای Immunoreactive، از بالا به پایین، به ترتیب نشان دهنده سیگنال های OGGl و VDAC هستند. هیستوگرام کمی شدت باندهای OGG1 نرمال شده به شدت VDAC را نشان می‌دهد. (B).سیستانچ سوداز بالا به پایین، باندهای ایمونوراکتیو به ترتیب نشان دهنده سیگنال های APE1 و VDAC هستند. هیستوگرام اندازه گیری شدت باندهای APE1 را که به شدت VDAC نرمال شده است نشان می دهد. (A, B) داده‌ها نتایج حاصل از آزمایش‌های وسترن بلات سه‌گانه را نشان می‌دهند و با استفاده از آزمون ANOVA یک طرفه و آزمون مقایسه چندگانه توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. میله ها نشان دهنده مقادیر میانگین و SD برای پنج گروه آزمایشی هستند. داده‌ها در برابر مقدار AL{3}} موش‌های صحرایی نرمال شدند.

مقدار پروتئین داخل میتوکندریایی هر دو آنزیم روند مشابهی برای اثرات سن و CR داشت. به طور خاص، OGG1 و APE1 هیچ تغییر معنی‌داری مرتبط با سن را در هر دو گروه AL و CR نشان ندادند که نشان می‌دهد اصلاً تأثیر سنی وجود ندارد. به طور غیر منتظره، همچنین CR هیچ اثر قابل توجهی بر مقادیر OGG1 و APE1 در گروه CR-28 در مقایسه با حیوانات AL همسان با سن و همچنین بین گروه‌های {{8} ماهه ایجاد نکرد.

2.3. ارزیابی سن و اثرات CR بر دینامیک میتوکندری

با گزارش یک اثر سن مشخص بر بیان پروتئین‌های درگیر در همجوشی (MFN2) و شکافت (DRP1) [16]، ما در اینجا اثرات CR را در یک بازه زمانی طولانی بر روی این نشانگرها ارزیابی کردیم. بنابراین، مقادیر پروتئین MFN2 و DRP1 با آزمایش‌های وسترن بلات، در میتوکندری‌های کبد جدا شده از تمام گروه‌های موش تعیین شد (شکل 5).

شکل 5. مقدار پروتئین‌های MFN2 و DRP1 در میتوکندری‌های جدا شده کبد از ماهانه AL{3}}، AL-28، CR-28، AL-32 و CR-32- - موش های پیر (الف) در داخل، یک وسترن بلات نماینده بر روی یک موش از هر یک از گروه‌های سنجش انجام شد. از بالا به پایین، باندهای ایمونوراکتیو به ترتیب نشان دهنده سیگنال های MFN2 و VDAC هستند. هیستوگرام اندازه گیری شدت باندهای MFN2 نرمال شده به شدت VDAC را نشان می دهد.(B). در این قسمت، یک وسترن بلات نماینده بر روی یک موش از هر یک از گروه‌های مورد سنجش انجام شد. نوارهای Immunoreactive، از بالا به پایین، به ترتیب نشان دهنده سیگنال های DRP1 و VDAC هستند. هیستوگرام کمیت باندهای DRP1 نرمال شده به شدت VDAC را نشان می‌دهد. (A, B) داده‌ها نتایج حاصل از آزمایش‌های وسترن بلات سه‌گانه را نشان می‌دهند و با استفاده از آزمون ANOVA یک طرفه و آزمون مقایسه چندگانه توکی آنالیز شدند. میله ها نشان دهنده مقادیر میانگین و SD برای پنج گروه آزمایشی هستند. داده‌ها در برابر مقدار موش‌های AL{14}} نرمال‌سازی شدند.<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="">

ما کاهش معنی‌داری مرتبط با سن (-43 درصد) در MFN2 در موش‌های AL-28 در مقایسه با گروه کنترل AL-18 یافتیم. چنین کاهشی در موش‌های AL{5}} که اثر سنی پیچیده‌ای را نشان می‌دهند، مشابه آنچه برای Cyt c گزارش شده بود، جلوگیری شد. با این حال، متفاوت از Cyt c، CR تأثیر بسیار مثبتی روی حیوانات 28-ماهه داشت، و در موش‌های CR-28 از کاهش وابسته به سن حیوانات AL-28 جلوگیری کرد و منجر به افزایش قابل توجه قابل توجهی (به علاوه 52 درصد) در MFN2 در مقایسه با همتای همتای AL همسان با سن می شود. علاوه بر این، مقدار MFN2 در موش‌های صحرایی CR-28 با مقدار کنترل‌های AL-18 تفاوتی نداشت، که نشان‌دهنده پیشگیری مؤثر از تأثیر مرتبط با سن است. تفاوت معنی‌داری بین گروه‌های AL-32 و CR-32 یافت نشد، بنابراین نشان‌دهنده تأثیر محدود CR در قدیمی‌ترین حیوانات است. علاوه بر این، هیچ اثر مرتبط با سن برای MFN2 در گروه AL-32 در مقایسه با همتای AL-18 یافت نشد. به طور مشابه، مقادیر پروتئین DRP1 کاهش قابل توجهی وابسته به سن ({26}} درصد) در موش‌های AL-28 در مقایسه با گروه AL{28}} نشان داد که توسط CR در {{29} جلوگیری شد. }}حیوانات یک ماهه. در واقع، گروه CR{31}} یک تفاوت مثبت (به علاوه 50 درصد) در مقایسه با یک AL-28 نشان داد که یک اثر CR قوی را نشان داد. با این حال، عدم وجود تفاوت بین AL{34}} و CR-32 در مورد مقادیر پروتئین DRP1 بیشتر نشان دهنده کارایی محدود CR در پیری طولانی مدت است. باز هم، هیچ اثر سنی مشهودی برای مقادیر DRP1 که از گروه AL-18 به گروه AL{-32 منتقل می‌شد، وجود نداشت. سپس، مقادیر شاخص همجوشی (FI به عنوان نسبت بین MFN2/DRP1 برای هر یک از موش‌های مورد بررسی را تعیین کردیم (شکل 6).

مقادیر FI در گروه AL{{0}} محدوده باریکی از 1.37 تا 2.64 را پوشش می‌دهد، در حالی که در گروه AL-28 همه مقادیر بالاتر از 2.20 تا 8.24 هستند. . مقادیر FI گروه CR{{10}} از 0.99 تا 5.14 متغیر بود و کاملاً شبیه به موش‌های AL-18 بود. در حیوانات AL-32، مقادیر FI از 0.70 تا 2.27 متغیر بود، بنابراین بازه‌ای مشابه با گروه AL-18 را پوشش می‌دهد که نشان دهنده عدم وجود اثر سنی مشخص است. در گروه CR-32، مقادیر FI از 0.87 تا 2.02 متغیر بود و با حیوانات AL-32 قابل مقایسه بود، بنابراین از این ایده پشتیبانی می‌کند که پیری طولانی مدت (۳۲ ماه) ممکن است نسبت به CR حساسیت کمتری داشته باشد. نسبت به پیری (28 ماهگی).

تجزیه و تحلیل آماری مقادیر FI از همه گروه‌ها در شکل 7 ارائه شده است. در مقایسه بین گروه‌های AL-18 و AL-28، مقدار FI بالاتر گروه دوم نشان‌دهنده تغییر وابسته به سن است. تعادل پویا در مورد موش‌های تحت درمان با CR، مقدار گروه CR-28 با همتای AL-18 تفاوتی نداشت و از اثربخشی رژیم غذایی در مقایسه با همتایان همسان تغذیه شده با AL پشتیبانی کرد. . تجزیه و تحلیل مقادیر AL-32 و CR-32 FI، عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین آنها مشهود بود و این ایده کاهش اثربخشی رژیم غذایی را در حیواناتی که به طور طبیعی به پیری طولانی‌مدت می‌رسند، تقویت می‌کند. علاوه بر این، مقادیر FI هر دو گروه 32-ماهه با همتای AL-18 تفاوتی نداشت و از عدم وجود اثر سن مشخص در مسن‌ترین حیوانات پشتیبانی می‌کرد.

این مقاله از Int استخراج شده است. جی. مول. علمی 2021، 22، 1665