اثر ضد پیری پلی پپتید شاخ مخملی به تعدیل میکروبیوتای روده و تنظیم مسیر PPAR/APOE4 PART 1 بستگی دارد

ما اثرات ضد پیری پلی پپتید شاخ مخملی را بر روی موش‌های پیری ناشی از D-گالاکتوز (D-gal) بررسی کردیم. موش‌های سالخورده ناشی از D-gal ایجاد و به‌طور تصادفی به پنج گروه، کنترل، مدل، ویتامین E (VE)، پلی‌پپتید شاخ مخملی با دوز پایین و گروه‌های پلی پپتید شاخ مخملی با دوز بالا تقسیم شدند. از آزمون ماز آبی موریس برای ارزیابی توانایی های یادگیری و حافظه موش های پیر استفاده شد. نورون های هیپوکامپ از طریق رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین و میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده شد. روش‌های بیوشیمیایی برای شناسایی فعالیت‌های سوپراکسید دیسموتاز، مالون‌آلدئید و سایر آنزیم‌ها و ارزیابی تأثیر پلی پپتید شاخ مخملی بر ظرفیت آنتی‌اکسیدانی موش‌های پیر استفاده شد. با استفاده از توالی یابی ژن 16S rRNA و فناوری مریستم، ما تأثیر پلی پپتید شاخ مخملی را بر فلور روده و متابولیسم اسیدهای چرب موش های پیر ارزیابی کردیم. نتایج تجربی نشان داد که پلی پپتید شاخ مخملی می تواند به طور قابل توجهی توانایی های یادگیری و شناختی موش های پیر را بهبود بخشد و فعالیت سوپراکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز را در سرم برای کاهش محتوای مالون آلدئید افزایش دهد. تجزیه و تحلیل میکرواکولوژیک روده نشان داد که پلی پپتید شاخ مخملی می تواند به طور قابل توجهی فراوانی جنس لاکتوباسیلوس باکتری مفید را افزایش دهد. تجزیه و تحلیل وسترن بلات بیشتر نشان داد که پلی پپتید شاخ مخملی می تواند متابولیسم اسیدهای چرب را با فعال کردن گیرنده فعال شده توسط تکثیرکننده پراکسی زوم (PPAR) و تنظیم مثبت بیان آنزیم های پایین دستی کارنیتین-پالمیتول ترانسفراز A و آسیل-CoA اکسیداز 1 و در عین حال پایین تنظیم کند. آپولیپوپروتئین E4 (APOE4)، در نتیجه تجمع اسیدهای چرب را کاهش داده و تولید آدنوزین تری فسفات (ATP) را افزایش می دهد. بنابراین، پلی پپتید شاخ مخملی میکرواکولوژی روده را بهبود می بخشد و مسیر PPAR/APOE4 را برای تنظیم متابولیسم اسیدهای چرب فعال می کند.

گلیکوزید سیستانچ همچنین می تواند فعالیت SOD را در بافت های قلب و کبد افزایش دهد و به طور قابل توجهی محتوای لیپوفوسین و MDA را در هر بافت کاهش دهد و به طور موثر رادیکال های مختلف اکسیژن فعال (OH-، H2O2 و غیره) را از بین ببرد و از آسیب DNA ناشی از آن محافظت کند. توسط رادیکال های OH گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ دارای توانایی مهار قوی رادیکال های آزاد، توانایی کاهش بالاتری نسبت به ویتامین C، بهبود فعالیت SOD در سوسپانسیون اسپرم، کاهش محتوای MDA و اثر محافظتی خاصی بر عملکرد غشای اسپرم هستند. پلی ساکاریدهای سیستانچ می توانند فعالیت SOD و GSH-Px را در گلبول های قرمز و بافت ریه موش های آزمایشگاهی مسن ناشی از D-گالاکتوز افزایش دهند و همچنین محتوای MDA و کلاژن را در ریه و پلاسما کاهش دهند و محتوای الاستین را افزایش دهند. اثر پاک کنندگی خوب بر روی DPPH، طولانی شدن زمان هیپوکسی در موش های پیر، بهبود فعالیت SOD در سرم، و به تاخیر انداختن انحطاط فیزیولوژیکی ریه در موش های آزمایشگاهی پیر. و این پتانسیل را دارد که دارویی برای پیشگیری و درمان بیماری های پیری پوست باشد. در عین حال، اکیناکوزید موجود در سیستانچ توانایی قابل توجهی در از بین بردن رادیکال های آزاد DPPH دارد و توانایی حذف گونه های فعال اکسیژن و جلوگیری از تخریب کلاژن ناشی از رادیکال های آزاد را دارد و همچنین اثر ترمیم خوبی بر آسیب آنیون رادیکال آزاد تیمین دارد.

روی Cong Rong Cistanche کلیک کنید

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

کلید واژه ها

پلی پپتید شاخ مخملی؛ دی گالاکتوز؛ سالخورده؛ میکرواکولوژی روده؛ یادگیری؛ اختلال شناختی؛ مسیر PPAR / APOE4. میکروبیوتا

1. معرفی

پلی پپتید شاخ مخملی (VAP) 50 تا 60 درصد وزن تر شاخ مخملی را تشکیل می دهد و یکی از مواد فعال اصلی آن است [1]. VAP غنی از پروتئین‌ها، اسیدهای آمینه، فسفولیپیدها، کلسترول و یون‌های کلسیم است و اثرات مختلفی برای ارتقای سلامتی دارد، با اثرات آنتی‌اکسیدان‌ها [2]، مقاومت به پوکی استخوان [3] و تنظیم ایمنی [4]. برای درک بهتر نقش VAP در پیشگیری و درمان بیماری‌های عصبی، تحقیقات قبلی توسط گروه تحقیقاتی ما نیز تایید کرد که VAP می‌تواند سطوح گیرنده گلوکوکورتیکوئید، گیرنده مینرالوکورتیکوئید و هورمون آزادکننده کورتیکوتروپین را کاهش دهد. اثرات VAP بر روی محور تالاموس-هیپوفیز-آدرنال و توانایی آن در مهار آپوپتوز عصبی نیز مشاهده شده است [5].

پیری مغز یک فرآیند فیزیولوژیکی طبیعی است که با استرس اکسیداتیو (OS)، تجمع مولکول‌های آسیب اکسیداتیو، و تغییرات در ساختار و عملکرد نورون‌ها مشخص می‌شود که در نهایت منجر به زوال شناختی و از دست دادن حافظه می‌شود [6]. در میان این عوامل، سیستم عامل عامل اصلی بیماری‌های عصبی مرتبط با پیری در نظر گرفته می‌شود [7]. هنگامی که بدن در معرض محرک‌های مضر قرار می‌گیرد، عدم تعادل بین تولید و حذف رادیکال‌های آزاد وجود دارد و در نتیجه میزان رادیکال‌های آزاد به حدی افزایش می‌یابد که از ظرفیت آنتی‌اکسیدانی بدن فراتر می‌رود. قابل توجه است که رادیکال های آزاد بیش از حد سیتوتوکسیک هستند و باعث آسیب مستقیم به سیستم عصبی مرکزی می شوند [8، 9]. مغز انسان تنها ۲ تا ۳ درصد وزن بدن انسان را تشکیل می دهد. با این حال، سیستم عصبی مرکزی (CNS) 20 درصد از کل اکسیژن بدن انسان را تشکیل می دهد. بنابراین، محتوای رادیکال‌های آزاد عصبی در CNS قابل توجه است و خطر بالای OS را ارائه می‌کند [10].

میکروبیوتای روده انسان، که بیش از 100 گونه را شامل می شود، تقریباً 10-برابر تعداد باکتری های بیشتری نسبت به سلول های انسانی دارد [11]. فیرمیکوت‌ها فراوان‌ترین گونه‌های موجود در میکروبیوتای روده انسان هستند که 60 درصد کل باکتری‌ها را تشکیل می‌دهند و پس از آن باکتری‌ایدت‌ها (15 درصد) و سایر اجزایی که نسبت کمی را تشکیل می‌دهند، قرار دارند. میکروبیوتای روده در حالت تعادل پویا با بدن انسان است و میکروب های روده نقش مهمی در متابولیسم انسان، عملکرد غدد درون ریز و تنظیم سیستم ایمنی دارند. بنابراین، هنگامی که ساختار میکروبیوتای روده مختل می شود، بیماری های عصبی، بیماری های قلبی عروقی و چاقی ممکن است رخ دهد [12]. تغییر در کمیت و تنوع میکروارگانیسم های روده نیز می تواند بر سیستم عصبی روده و مرکزی تأثیر بگذارد. این فعل و انفعالات به عنوان محور میکروبیوتا-روده-مغز شناخته می شوند که برای عملکرد بدن مهم است [13، 14]. اگرچه تغییرات در پروفایل میکروبیوتای روده لزوماً بر سلامت تأثیر نمی گذارد، از دست دادن تنوع در میکروبیوتای اصلی با کاهش عملکرد شناختی و حافظه همراه است [15]. در واقع، با افزایش سن، تغییرات در فلور باکتریایی در درجه اول با کاهش تنوع، پروبیوتیک ها، بی هوازی اختیاری و کل اسیدهای چرب با زنجیره کوتاه مشخص می شود [16].

اگرچه مطالعات متعدد تایید کرده اند که اثرات آنتی اکسیدانی و ضد پیری مرتبط با VAP پیری را کاهش می دهد، مکانیسم دقیق زیربنای این فعالیت نامشخص باقی مانده است. بنابراین، در کار حاضر، اثر ضد پیری VAP در داخل بدن در موش از طریق آزمایش ماز آبی موریس (MWM)، آنالیز بیوشیمیایی، رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) و میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) مورد ارزیابی قرار گرفت. علاوه بر این، ما تغییرات در میکرواکولوژی روده را در مدل‌های موش پیر تحت درمان با VAP با استفاده از فناوری توالی‌یابی ژن RNA ریبوزومی 16S (rRNA) ارزیابی کردیم. هدف ما روشن کردن مکانیسم فعالیت VAP در زمینه پیری و ارائه یک مبنای نظری برای توسعه رویکردهای درمانی جدید ضد پیری بود.

2. مواد و روش ها

2.1 مواد آزمایشی

VAP was provided by the Molecular Pharmacology Laboratory, Changchun University of Chinese Medicine. Dgalactose (D-gal) and VE (purity >90 درصد) از Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (شانگهای، چین) خریداری شد. کیت های تجاری سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، مالون آلدئید (MDA)، کاتالاز (CAT) و گلوتاتیون پراکسیداز (GSH-Px) از شرکت فناوری نانجینگ جیانچنگ (نانجینگ، چین) خریداری شد. تمام مواد شیمیایی و معرف ها دارای درجه تحلیلی بودند.

سیستم ردیابی و تجزیه و تحلیل ویدئویی پیچ و خم آبی موریس (MWM) از شرکت فناوری Chengdu Taimeng (چنگدو، چین) خریداری شد. یک میکروسکوپ الکترونی عبوری از شرکت Tecnai (هیلزبورو، OR، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. پلت فرم توالی یابی با توان بالا (MiSeq PE300) توسط Illumina (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) ارائه شده است.

2.2 آزمایش بر روی حیوانات

شصت موش سالم ICR (درجه SPF، نیمی نر و نیمی ماده، با وزن 22-26 گرم) از شرکت فناوری حیوانات آزمایشگاهی Changchun Yisi (گواهینامه شماره SCXK(Ji) -2018-0007) خریداری شدند. موش ها در قفس های جداگانه تحت چرخه نور/تاریکی 12 ساعت و دمای استاندارد (2 ± 22 درجه سانتیگراد)، با غذا و آب به صورت آزاد بزرگ شدند. همه موش‌ها حداقل یک هفته قبل از شروع آزمایش‌ها با این شرایط سازگار شدند. همه موش ها به پنج گروه، کنترل، مدل، ویتامین E (VE)، VAP با دوز پایین (VAP1) و VAP با دوز بالا (VAP2) تقسیم شدند. گروه‌های VE، VAP1 و VAP2 به ترتیب VE (100 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، VAP (200 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، و VAP (400 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به مدت 10 روز تجویز شدند، در حالی که گروه‌های کنترل و مدل آب مقطر دریافت کردند. (همان حجم و از طریق همان مسیر داخل معده). از روز یازدهم به گروه کنترل نرمال سالین به صورت زیر جلدی تزریق شد. D-gal (mg/kg 1000) به صورت زیر جلدی به پشت گردن موش‌های گروه‌های دیگر تزریق شد و تجویز مدل به مدت 60 روز ادامه یافت.

2.3 ماز آبی موریس

آزمایش MWM 1 ساعت پس از تجویز D-gal در روز 57 انجام شد. به طور خلاصه، یک سکو در وسط ماز آبی قرار گرفت. آب به سکو اضافه شد تا زمانی که از 1 سانتی متر گذشت و تقریباً در دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری شد. موش‌ها به‌مدت 1 هفته به‌طور مداوم آموزش دیدند و آزمایش MWM به‌طور رسمی طبق روش عملیاتی استاندارد ماز آبی انجام شد. قبل از شروع رسمی آزمایش، دی اکسید تیتانیوم به آب اضافه شد تا موش ها موقعیت خاص سکو را درک نکنند. برای ردیابی و جمع‌آوری داده‌ها، سر موش‌ها زرد رنگ شد. نرم افزار تحلیل ردیابی ویدئوی پیچ و خم آبی موریس مسیر شنای موش ها، درصد زمان اقامت در حلقه میانی و درصد فاصله حرکت حلقه میانی را ثبت کرد.

2.4 رنگ آمیزی H&E

کل مغز موش ها در محلول پارافورمالدئید 4 درصد تثبیت و در پارافین جاسازی شد. پس از 24 ساعت، بافت های مغز برش داده شد، پارافین زدایی شد، آبگیری شد و با H&E رنگ آمیزی شد. سپس مقاطع زیر میکروسکوپ نوری برای ثبت تغییرات پاتولوژیک مشاهده شدند.

2.5 آیتم

پس از پرفیوژن، بافت‌های هیپوکامپ جدا شدند، با محلول بافر 2 درصد پارافورمالدئید و 2.5 درصد گلوتارآلدئید فسفات ثابت شدند، با استفاده از گرادیان الکل آب‌گیری شدند، با اتوکسی پروپان تمیز شدند، جاسازی شدند، برش خورده و با اورانیل استات و سیترات سرب رنگ‌آمیزی شدند. فراساختار نورون های هیپوکامپ در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده شد.

2.6 تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی

نمونه خون موش جمع آوری شد و با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد و پس از آن مایع رویی جمع آوری شد. محتوای MDA سرم و تعیین فعالیت SOD، GSH-Px و CAT همگی توسط دستورالعمل‌های کیت انجام شد.

2.7 پروفایل میکروبی نمونه های مدفوع

DNA کل از نمونه های مدفوع استخراج شد و به عنوان الگوی PCR برای تقویت ناحیه V3-V4 ژن 16S rRNA باکتریایی استفاده شد. مجموعه داده خام در NCBI BioProject PRJNA731623 تحت شماره های دسترسی BioSample SAMN19291644 به SAMN19291668 سپرده شده است. محصولات PCR به صورت کمی آنالیز شدند و توالی یابی ژن 16S rRNA با استفاده از پلت فرم Illumina MiSeq (Illumina، San Diego، USA) انجام شد. داده های خام بر اساس حداقل طول همپوشانی 10 جفت باز است، با حداکثر نسبت عدم تطابق مجاز در ناحیه همپوشانی 0.2 (پیش فرض). قرائت های هر نمونه به هم متصل شد و برچسب هایی با طول کمتر از 75 درصد طول برچسب پس از کنترل کیفیت فیلتر شدند. کایمراها (یعنی اگر دو والد دنباله ای داشته باشند که بیش از 80 درصد شبیه دنباله پرس و جو است، در این صورت پرس و جو به عنوان یک واهی قضاوت می شود) برای به دست آوردن دنباله های برچسب با کیفیت بالا حذف شدند. نرم افزار تحقیقاتی (Sonoma، ایالات متحده آمریکا) [17] برای خوشه بندی برچسب ها در سطح شباهت 97 درصد، طبقه بندی واحدهای طبقه بندی عملیاتی (OTUs)، به دست آوردن طبقه بندی گونه ها بر اساس ترکیب توالی OTU، و رسم رقت نمونه [18] و منحنی های شاخص شانون استفاده شد. . PICRUSt (Halifax, CAN) [19] برای تعیین ترکیب ژن عملکردی هر نمونه از طریق مقایسه اطلاعات ترکیب گونه‌ها با توجه به نتایج توالی‌یابی ژن 16S rRNA استفاده شد. به این ترتیب، تفاوت های عملکردی بین نمونه ها یا گروه های مختلف می تواند تعیین شود. فراوانی ها، مسیرها، اطلاعات EC، و فراوانی OTU در زمینه هر دسته عملکردی با استفاده از پایگاه داده کیوتو دایره المعارف ژن ها و ژنوم ها [20] به دست آمد.

2.8 وسترن بلاتینگ

پروتئین کل از بافت مغز استخراج شد و از روش آبی درخشان Coomassie برای ارزیابی غلظت پروتئین استفاده شد. سپس، پس از الکتروفورز SDS-PAGE، پروتئین ها به غشاء منتقل شدند، که سپس با آنتی بادی های اولیه علیه پروتئین های هدف آپولیپوپروتئین E (APOE4)، آسیل-CoA اکسیداز 1 (ACOX1)، گیرنده فعال شده با تکثیر پراکسی زوم (PPAR) انکوبه شد. کارنیتین-پالمیتویل ترانسفراز (CPT1A) و گلیسرآلدئید{9}فسفات دهیدروژناز (GAPDH) یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد. پس از آن، غشاء شسته شد و سپس با یک آنتی بادی ثانویه در دمای اتاق به مدت 1 ساعت انکوبه شد. پس از شستشوی غشاء با نمک تریس بافر شده و Tween 20 (TBST)، یک محلول نورتابی شیمیایی تقویت شده (ECL) اضافه شد. یک سیستم تصویربرداری ژل تمام اتوماتیک (Aplegen، Pleasanton، ایالات متحده آمریکا) برای اسکن عکاسی استفاده می شود.

2.9 تشخیص سطوح اسید چرب آزاد (FFA) در بافت مغز

بافت های مغز موش جمع آوری شد و مقدار مناسبی از نرمال سالین به آن اضافه شد. سپس نمونه ها در دمای 4 درجه سانتی گراد با دور 3000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شده و مایع رویی جمع آوری شد. سطوح FFA در بافت های مغز با دستورالعمل کیت تعیین شد.

2.10 تشخیص محتوای ATP در بافت مغز

بافت‌های مغز موش جمع‌آوری شد و در نسبت بافر لیز بافت مغز 1:5 لیز شد. سپس نمونه ها در دمای 12 × گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی جمع آوری شد. محتوای ATP در بافت های مغز با دستورالعمل کیت تعیین شد.

2.11 تجزیه و تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل داده ها از SPSS 19.{1}} (Chicago, IL, USA) استفاده شد. نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار (x ± s) بیان می شود. برای مقایسه گروه‌ها از آزمون t دانشجویی استفاده شد و تفاوت‌ها در P <{3}} معنی‌دار در نظر گرفته شد.05 یا P <0.01.

3. نتایج

3.1 بهبود شناخت، یادگیری و حافظه در موش های مسن تحت درمان با VAP

تست MWM برای یافتن سکوی فرار به غریزه بقای حیوانات متکی است و شامل جستجوی موقعیت فضایی مرتبط با حافظه است. شکل 1 نشان دهنده ردیابی موش هایی است که آزمایش MWM را در روز آخر انجام دادند. نمودار مسیر رفتار موش گروه مدل پیچیده‌تر و نامنظم‌تر بود و موش‌ها سکو را پیدا نکردند. قابل توجه، نمودار مسیر رفتار موش‌ها در گروه‌های VAP1 و VAP2 ساده بود و یک پلتفرم پیدا شد. در مقایسه با گروه کنترل، درصد زمان ماند در حلقه میانی و درصد فاصله حرکت شده توسط حلقه میانی در گروه مدل به طور قابل توجهی کاهش یافت (P < 0.01). در مقایسه با گروه مدل، درصد زمان ماند در حلقه میانی و درصد فاصله حرکت شده توسط حلقه میانی در گروه‌های VE، VAP1 و VAP2 به طور قابل‌توجهی افزایش یافت (P < 0.05، P < 0.01). این یافته ها نشان می دهد که تجویز VAP توانایی شناختی موش های پیری ناشی از D-gal را بهبود می بخشد.

3.2 اثر محافظتی VAP بر نورون های هیپوکامپ در موش های پیر

رنگ‌آمیزی H&E برای مشاهده مورفولوژی پاتولوژیک بافت‌های مغز در موش‌های پیر استفاده شد تا بررسی شود آیا VAP می‌تواند آسیب‌های آسیب‌شناسی عصبی ناشی از D-gal را بهبود بخشد (شکل 2A). سلول‌های CA1 در هیپوکامپی از گروه کنترل، فراوان، با ساختار سلولی طبیعی، مورفولوژی کامل و هسته‌های آشکار بودند. در مقابل، تعداد سلول‌های CA1 در هیپوکامپی از گروه مدل کاهش یافت و مورفولوژی نامنظم را نشان داد، بدون اینکه هسته واضحی در زیر میکروسکوپ مشاهده شود. نورون‌های ناحیه CA1 هیپوکامپی نسبتاً طبیعی بودند و انقباض هسته‌ای در گروه VE در مقایسه با گروه مدل کاهش یافت. شایان ذکر است، ناحیه CA1 در هیپوکامپی از گروه‌های VAP1 و VAP2 به طور قابل‌توجهی با آنچه در گروه مدل مشاهده شد متفاوت بود و مشابه با گروه کنترل بود. ساختار نسبتاً نرمال، سلول‌ها مرتب و منظم و مورفولوژی کامل بود.

TEM بیشتر برای مشاهده فراساختار نورون‌های هیپوکامپ در موش‌های مسن و درک اینکه آیا اثر معکوس VAP بر کاهش یادگیری و حافظه با تنظیم ریزساختار نورون در مغز مرتبط است یا خیر، مورد استفاده قرار گرفت (شکل 2B). نورون های هیپوکامپ مورفولوژی دست نخورده، توزیع کروماتین یکنواخت و اندامک های فراوان در سیتوپلاسم را در گروه کنترل نشان دادند. در بزرگنمایی بالا، میتوکندری ها بیضوی، با یک غشای بیرونی دوتایی شفاف و کریستاهای دست نخورده بودند. در مقابل، نورون‌های ناحیه هیپوکامپ گروه مدل غیرطبیعی بودند. تغییرات آپوپتوز اولیه مانند تراکم کروماتین مشاهده شد. سلول های لیپوفوسین بیشتر بود. ساختار سیناپسی نامشخص بود. قطرات چربی پراکنده شدند، و گسترش شبه وزیکول مجموعه گلژی و کاهش شبکه آندوپلاسمی خشن تشخیص داده شد. قابل توجه است، در مقایسه با گروه مدل، گروه‌های VAP1 و VAP2 دارای نورون‌های هیپوکامپ بودند که از نظر ساختار و مورفولوژی طبیعی بودند، با غشای هسته‌ای صاف، هسته‌های طبیعی و اندامک‌های فراوان. قابل ذکر است، سیناپس های بیشتری مشاهده شد، وزیکول های سیناپسی در غشای قدامی تجمع غیر طبیعی نداشتند، مورفولوژی بدن گلژی داخل سیتوپلاسمی و میتوکندری طبیعی بود و لیپوفوسین نادر بود.

3.3 اثرات VAP بر آنزیم های مرتبط با آسیب اکسیداتیو

یک اثر منفی OS تولید رادیکال های آزاد در بدن است که یکی از دلایل اولیه پیری و بیماری است (شکل 3). در مقایسه با گروه کنترل، فعالیت‌های SOD، CAT و GSH-Px در سرم موش‌های مدل D-galadministered به‌طور معنی‌داری کاهش یافت (P < 0).01، P <{{7} }}.{{1{12}}}}5)، و محتوای MDA به طور قابل توجهی افزایش یافت (P < 0.05)، که نشان دهنده مدل سازی موفق است. در مقایسه با گروه مدل، فعالیت‌های SOD، CAT و GSH-Px در گروه VE به طور قابل‌توجهی افزایش یافت (P < 0.01، P < 0.05) . در مقایسه با گروه مدل، فعالیت های SOD و GSH-Px در گروه VAP1 به طور قابل توجهی افزایش یافت (0.05 < P، 0.01 < P). در مقابل، CAT کمی افزایش یافت اما تفاوت معنی‌داری نداشت. در مقایسه با گروه مدل، فعالیت‌های SOD، CAT، و GSH-Px در گروه VAP2 به طور قابل‌توجهی افزایش یافت (05/0 > P، 01/0 > P). در مقایسه با گروه مدل، محتوای MDA سرم موش‌ها در گروه‌های VAP1 و VAP2 به‌طور معنی‌داری کاهش یافت (05/0 > P). نتایج فوق نشان می دهد که اثر ضد پیری VAP با افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی سرم در موش های پیر و کاهش پراکسیداسیون لیپیدی مرتبط است.

3.4 اثرات VAP بر ترکیب و تنوع میکروبیوتای روده در موش

نتایج توالی یابی ژن 16S rRNA 1,999,460 خواندن PE را به همراه داشت و پس از فیلتر کردن و حذف کایمراها، 1,776,708 برچسب موثر به دست آمد. میانگین طول توالی نمونه‌ها در گروه‌های کنترل، مدل، VE، VAP1 و VAP2 به ترتیب 2/417، 2/416، 2/418، 0/421 و 4/420 جفت باز بود. نسبت خواندن با نمره کیفیت Phred بیش از 30 (Q30) از 94.15 تا 95.71 درصد متغیر بود.

پس از آن، ما ترکیب میکروبیوتای روده را با استفاده از خوانش ژن 16S rRNA تعیین کردیم. برچسب‌های به‌دست‌آمده از توالی‌یابی با توان بالا در سطح شباهت 97 درصد خوشه‌بندی شدند و یک نمودار ون ایجاد شد (شکل 4A). هر گروه دارای 490 OTU بود و اساساً هیچ OTU خاصی در هر گروه وجود نداشت. برای بررسی اینکه آیا عمق توالی‌بندی الزامات شناسایی گونه‌ها را برآورده می‌کند، منحنی‌های شانون و نادری را برای همه نمونه‌ها ترسیم کردیم (شکل 4B، C). هر دو منحنی در همه نمونه‌ها نزدیک به فلات اشباع بودند که پوشش بالایی (99 درصد) را نشان می‌داد. این داده ها نشان می دهد که اکثریت قریب به اتفاق اطلاعات تنوع میکروبی در نمونه ها استخراج شده است و ساختار و تنوع جامعه باکتریایی را می توان با دقت تعیین کرد.

تنوع آلفا نشان دهنده فراوانی گونه (غنا) و تنوع گونه است. شاخص های شانون و سیمپسون برای اندازه گیری تنوع گونه ها استفاده می شود و تحت تأثیر فراوانی گونه ها در جامعه نمونه و یکنواختی گونه ها (یکنواختی جامعه) قرار می گیرند. هر چه مقدار شاخص شانون بزرگتر باشد، مقدار شاخص سیمپسون کوچکتر است، که نشان می دهد تنوع گونه ای نمونه بیشتر است [21]. نتایج ارائه شده در شکل 4D تفاوت معنی داری را در مقادیر شاخص شانون فلور موش بین گروه ها نشان نمی دهد.

در مقایسه با گروه کنترل، مقدار شاخص سیمپسون گروه مدل تفاوت معناداری ندارد. تفاوت معنی داری بین گروه مدل و هر گروه درمانی مشاهده نشد. این نتایج تفاوت معنی داری را در تنوع فلور روده موش ها بین گروه ها نشان نمی دهد.

PCA روی فلور روده موش انجام شد (شکل 4E)، که در آن PC1 و PC2 دو مقدار مشخصه ای هستند که بیشترین تفاوت را بین نمونه ها ایجاد می کنند. نتایج نشان داد که 94/32 و 74/19 درصد از میزان تأثیر را به ترتیب PC1 و PC2 به خود اختصاص دادند. هر چه نقاط دورتر باشند، تفاوت بیشتر است. پنج گروه از نمونه‌ها در سه دسته دسته‌بندی می‌شوند که نمونه‌های گروه مدل در گوشه سمت چپ بالای شکل، بسیار دور از گروه‌های دیگر توزیع شده‌اند. گروه‌های کنترل، VE و VAP2 همپوشانی‌های بیشتری نشان دادند و سه گروه از نمونه‌ها نزدیک به هم بودند. وسط بالایی شکل 4E نشان می دهد که پس از مداخله VAP، شباهت فلور روده موش های گروه VAP2 با موش های کنترل بهبود یافته است.

تفاوت در فراوانی باکتری ها در مدل کنترل، گروه های VE، VAP1، و VAP2 برای 20 جنس برتر ارزیابی شد (شکل 4F). فراوانی گروه Lachnospiraceae_NK4A136_ و Lactobacillus بین حیوانات شاهد و مدل متفاوت بود، که در آن فراوانی لاکتوباسیلوس در گروه مدل به طور معنی‌داری کاهش یافت. در مقابل، فراوانی جنس های باقی مانده به طور قابل توجهی افزایش یافت. قابل ذکر است که اعضای لاکتوباسیلوس پروبیوتیک هایی با اثرات ضد پیری و ضد التهابی هستند [22، 23]. بنابراین، این نتایج تعجب آور نبود. قابل توجه است که فراوانی لاکتوباسیلوس در گروه‌های VAP1 و VAP2 در مقایسه با گروه مدل به طور قابل‌توجهی افزایش یافته است، که نشان می‌دهد VAP ممکن است محتوای باکتری‌های مفید روده را افزایش دهد و از پیری جلوگیری کند.

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】