نقش اصلی تغییر فاکتور رشد (TGF-) در توسعه فیبروز کلیه

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

بخش Ⅰ: نقش فیبروبلاست اولیه کلیه انسان در TGF- 1-دستگاه‌های تقلیدکننده فیبروز واسطه‌ای

سونگ هی هوانگ، یون می لی و همکاران.

1. مقدمه

فیبروز کلیهآخرین مسیر مشترک بیماری‌های پیشرونده بی‌شماری کلیوی، با افزایش تولید پروتئین ماتریکس خارج سلولی (ECM)، کاهش تخریب ماتریکس، اختلال در عملکرد متقابل سلول-ماتریکس، تغییر شکل سلول‌های ساکن، و نفوذ سلول‌های التهابی مشخص می‌شود.تبدیل عامل رشد-(TGF-) یک پپتید دایمر چند منظوره است که فرآیندهای بیولوژیکی مانند تکثیر سلولی، تمایز و پاسخ های ایمنی را تنظیم می کند [1]. در میان فاکتورهای فیبروژنیک متعدد، TGF- (تبدیل عامل رشد-) نقش مرکزی دارد و اثر ضد التهابی دارد. TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)-موش‌های دارای کمبود در اثر التهاب شدید می‌میرند. موش های تراریخته با بیان بیش از حد TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)عملاً از ایجاد آسیب شناسی فیبروتیک کلیه، عمدتاً از طریق فعالیت ضد التهابی آن محافظت می شوند [2]. خواص سودآور و ضد التهابی TGF-(تبدیل عامل رشد-)شمشیرهای دولبه در مورد کاربرد درمانی TGF-(تبدیل عامل رشد-)بازداری. تلاش های قابل توجهی برای جلوگیری از TGF- انجام شده است.(تبدیل عامل رشد-)اقدامی برای جلوگیری از پیشرفتکلیهفیبروز[3]. اگرچه از روش های بسیاری برای مبارزه استفاده شده استکلیهفیبروز، یک مدل تجربی برای ارزیابی داروهای موجود در حال حاضر ایده آل نیست.

گیاه سیستانچ جلوگیری می کندبیماری های کلیوی

به طور کلی، مطالعات حیوانی نقش محوری در آزمایش‌های بالینی در پیش‌بینی فارماکوکینتیک و اثربخشی دارو دارند. با این حال، تفاوت‌های مختلفی بین حیوانات و انسان‌ها وجود دارد، که ما را وادار می‌کند تا صحت آزمایش‌های ایمنی و اثربخشی داروهای مبتنی بر حیوان را زیر سوال ببریم. عملکرد کلیه حیوانات بیش از دو برابر کلیه های انسان است. از این رو، داروها در حیوانات سریع‌تر از انسان متابولیزه می‌شوند و توضیح نتایج آزمایش‌های سمیت دارویی با استفاده از مطالعات حیوانی را دشوار می‌کند. علاوه بر این، از نتایج آزمایش‌های حیوانی نمی‌توان برای پیش‌بینی پاسخ‌های دارویی در انسان استفاده کرد، زیرا حیوانات عملکردهای فیزیولوژیکی متفاوتی دارند. مبتنی بر حیوانفیبروز کلیهمدل ها در تولید مثل انسان مشکل دارندفیبروز کلیه; از این رو، تحقیقات برای غلبه بر موانع فعلی و بهینه سازی پلت فرم های کشف دارو در حال انجام است [5].

فناوری ارگان روی یک تراشه (OoC) به عنوان یک مفهوم جدید برای حل این مسائل ظاهر شده است. این پلتفرم با توجه به کاستی های موجود طراحی شده است و در زمینه نفرولوژی بسیار نویدبخش بوده است [6]. علاوه بر این، مدل‌های OoC دارای پتانسیل زیادی به عنوان جایگزینی برای مدل‌های حیوانی آزمایشی هستند، راه‌حلی برای تفاوت‌های بین گونه‌ای ارائه می‌دهند و می‌توانند به پایان دادن به ظلم به حیوانات و بحث‌های اخلاقی کمک کنند [7]. تعداد کمی از مدل‌های آزمایشگاهی وجود دارند که به طور همزمان از فیبروبلاست‌های کلیوی اولیه با سلول‌های اندوتلیال و اپیتلیال استفاده می‌کنند که سلول‌های مهمی هستند.کلیهفیبروز. نقش هر سلول درفیبروزبه طور جداگانه مطالعه می شود؛ با این حال، دانش محدودی در مورد تعامل سلول ها وجود دارد.

در مطالعه حاضر توسعه دادیمفیبروزدستگاه های تقلید با استفاده از فیبروبلاست های اولیه انسان. ما تایید کردیم که TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)درمان اثرات مختلفی بر رویفیبروز کلیهمدل. به طور قابل توجهی، فیبروبلاست ها نقش محوری به عنوان سلول های موثر دارند، تشکیل یک ریزمحیط پروفیبروتیک را ترویج می کنند و فاکتورهای رشد و سیتوکین ها را ترشح می کنند. بنابراین، بر اساس این روش جدید، فیبروبلاست ها ممکن است یک سیستم مدل سلولی ایده آل برای مطالعه بیماری کلیوی ارائه دهند. ما ارزیابی کردیم که آیا فیبروبلاست های مشتق از بیماری کلیوی فیبروتیک بر یکپارچگی سلول های کشت شده در سه بعدی (3 بعدی) تأثیر می گذارد. در نهایت، ما یک مطالعه اثبات اصل ارائه می کنیم که پتانسیل انسان را نشان می دهدفیبروز کلیه- تقلید از دستگاه ها به عنوان مدلی برای پیش بینی پاسخ به انسانفیبروز کلیه.

اثرات سیستانچ: درمان عفونت کلیه

2. نتایج

2.1. شناسایی اکتین ماهیچه صاف آلفا (a-SMA) و کراتین-8(KRT-8) توسط TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)در سلول های HK-2

در مرحله اولیه، ما نشانگرهای شناخته شده را بررسی کردیمفیبروزو اسکلت سلولی در فرهنگ های دو بعدی (2 بعدی). سنجش رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس برای تخمین بیان -SMA فیبروز و نشانگر انتقال اپیتلیال لوله ای به مزانشیمی (EMT) و سطوح KRT8 به عنوان یک نشانگر اسکلت سلولی انجام شد. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس نشان داد که بیان -SMA در ابتدا ضعیف بود و سطوح KRT8 در سلول های اپیتلیال تک لایه HK{6}} بالا بود. هیچ تغییر قابل توجهی در شدت فلورسانس توسط TGF مشاهده نشد- 1(تبدیل عامل رشد-)(5 نانوگرم در میلی لیتر) یا درمان با مهارکننده خاص سلول های اپیتلیال HK-2 به مدت 24 ساعت (شکل 1).

شکل 1. ایمونوفلورسانس نشان می دهد که بیان آلفا-SMA و کراتین{2}}(KRT8) با درمان TGF حفظ شد- 1(تبدیل عامل رشد-)یا مهارکننده در سلول‌های HK-2.(الف) بیان آلفا-SMA و (B)CCK-8 هیچ تأثیری بر سلول‌های HK-2 توسط TGF- 1 نداشت.(تبدیل عامل رشد-)(5ng/ml) یا مهارکننده. سلول ها در ابتدا با تراکم 1×10 درجه در هر چاه شاهد (ac) درمان نشده و (df) با 5ng/mL TGF تحریک شدند{6}}(تبدیل عامل رشد-) یا (gi) بازدارنده 10 میکرومولار (SB431542) به مدت 24 ساعت و با 4 درصد پارافورمالدئید تثبیت شد. سپس سلول ها به مدت 20 دقیقه با آنتی- -SMA و آنتی سیتوکراتین-8 رنگ آمیزی شدند. رنگ آمیزی همزمان با رنگ هوخست H33342 برای شناسایی هسته سلولی انجام شد. میله های مقیاس در میکروگراف ها 200 um را نشان می دهد.

پودر سیستانچ عملکرد کلیه را بهبود می بخشد

2.2. بیان KRT8 توسط TGF کاهش یافت- 1(تبدیل عامل رشد-)روی یک تراشه

در مرحله بعد، سطح بیان -SMA و KRT8 را در HK کشت سه بعدی و طول کل سلول‌های اندوتلیال ورید ناف انسانی GFP (HUVECs) تیمار شده با TGF را ارزیابی کردیم- 1(تبدیل عامل رشد-)و یک مهار کننده خاص برای انجام این کار، ابتدا یک الگوی تراشه بافتی شامل دو نوع سلول، سلول‌های اپیتلیال HK-2 و GFP-HUVECs ایجاد کردیم. پس از تایید سازه، تراشه بافت را با TGF در معرض دید قرار دادیم- 1(تبدیل عامل رشد-)(5 نانوگرم در میلی لیتر) یا یک مهارکننده خاص (10 میکرومتر SB431542) به مدت 24 ساعت.

همانطور که در شکل 2A-C نشان داده شده است، بیان -SMA به طور خاص توسط TGF تغییر نکرده است{3}}(تبدیل عامل رشد-)یا درمان با مهارکننده خاص با این حال، بیان KRT8 در تراشه دو سلولی کشت مشترک کاهش یافت. علاوه بر این، افزودن یک مهارکننده TGF-ß1 بیان KRT8 را افزایش داد.

ما تشکیل یک شبکه سه بعدی مویرگی لوله مانند توسط TGF را بررسی کردیم- 1(تبدیل عامل رشد-)درمان در HUVECs، زیرا سلول‌های اندوتلیال می‌توانند به طور خود به خود یک شبکه مویرگی لوله‌ای سه بعدی تشکیل دهند. مطابق با شرایط فرهنگی ما، تشکیل خطوط ضخیم به طور قابل توجهی کاهش یافت. با این حال، خطوط نازک مویرگی در TGF افزایش یافت- 1(تبدیل عامل رشد-)GFP-HUVEC های درمان شده در مورد TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)درمان بازدارنده بر روی تراشه سه بعدی کشت شده، طول کل خطوط ضخیم و ضخیم تمایل معکوس به TGF نشان داد{2}}(تبدیل عامل رشد-)رفتار. افزایش طول خط ضخیم در مقایسه با گروه کنترل درمان نشده مشاهده شد. یک الگوی مشابه در قطر خط ضخیم در GFP-HUVEC بعد از TGF مشاهده شد{1}}(تبدیل عامل رشد-)درمان و درمان بازدارنده قطر GFP-HUVEC توسط TGF سرکوب شد- 1(تبدیل عامل رشد-)درمان اما بدون توجه به ضخامت خط توسط بازدارنده در مقایسه با گروه شاهد و TGF افزایش یافت- 1(تبدیل عامل رشد-). طول و قطر کل خط ضخیم با تیمار مهارکننده TGF- 1 نسبت به تیمار شاهد و تیمار TGF{1}} به طور چشمگیری افزایش یافت. قابل توجه، نتایج به‌دست‌آمده نشان‌دهنده افزایش تراکم عروق ریز در TGF- بود.(تبدیل عامل رشد-)گروه تحت درمان در مقایسه با همتایان درمان نشده خود. در مقابل، تراکم عروق ضخیم در TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)گروه درمان کمتر از گروه کنترل درمان نشده بود (شکل 2D، E).

شکل 2. بیان KRT8 در HK-2 و طول و قطر کل HUVECها.(الف) ایمونوفلورسانس نشان می دهد که بیان -SMA حفظ شد و بیان KRT8 به طور چشمگیری با درمان TGF کاهش یافت{2}}(تبدیل عامل رشد-)در HK-2. سلول ها با 5 نانوگرم در میلی لیتر TGF پوشش داده شدند و تحریک شدند{2}}(تبدیل عامل رشد-)یا مهارکننده 10 میکرومتری (SB 431542) به مدت 24 ساعت و با 4 درصد پارافورمالدئید تثبیت شد. سلول ها با آنتی{4}SMA و آنتی سیتوکراتین-8 به مدت 20 دقیقه رنگ آمیزی شدند. رنگ آمیزی همزمان با رنگ هوخست H33342 برای شناسایی هسته سلولی انجام شد. بیان -SMA(ac) هیچ تغییری نداشت اما KRT8(df) در سلول‌های HK{14}} و GFP در بیان HUVEC (gi) به‌طور معنی‌داری توسط TGF تغییر کرد{16}}(تبدیل عامل رشد-)(5 نانوگرم در میلی لیتر) و بازدارنده (B, C). در طول کل HUVECها، رگ نازک افزایش یافت اما رگ ضخیم با TGF کاهش یافت- 1(تبدیل عامل رشد-). قطر در هر دو رگ نازک و ضخیم افزایش یافت. این نتایج توسط بازدارنده SB431542 (D، E) معکوس شد. نوارهای مقیاس در میکروگراف ها 100 میکرومتر * p را نشان می دهد<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">

سیستانچ برای چه استفاده می شود: درمان بیماری های مزمن کلیوی

2.3. TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)بر سه نوع سلول تراشه با ساختار چند محفظه ای تأثیر می گذارد

برای مطالعه TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)در پاسخ به تراشه سه بعدی پیشنهادی، رنگ آمیزی ایمنی را روی هر محفظه به طور جداگانه انجام دادیم (شکل 3). فیبروبلاست های اولیه کلیه انسان در این تجزیه و تحلیل استفاده شد. نمونه ها با استفاده از FACS آنالیز شدند و مثبت بودن آنتی بادی نشانگر فیبروبلاست تایید شد. پس از انکوباسیون سه نوع سلول با TGF{2}}(تبدیل عامل رشد-)به مدت 24 ساعت، ایمونوهیستوشیمی برای ارزیابی بیان -SMA و KRT8 انجام شد. بیان a-SMA با درمان TGF{4}} تنظیم مثبت شد و نتایج معکوس با TGF مشاهده شد- 1(تبدیل عامل رشد-)درمان بازدارنده برعکس، بیان KRT8 توسط TGF کاهش یافت{1}}(تبدیل عامل رشد-)و پاسخی مخالف به TGF- نشان داد(تبدیل عامل رشد-)بازدارنده (شکل 4A-C).

شکل 3. تصویر نمونه با نمایش شماتیک دستگاه از زمان بندی ساخت و آزمایش.(الف) دو تصویر بالا طرح‌بندی را نشان می‌دهند. تصویر سمت چپ یک عکس کلی از بالا به پایین از دستگاه را نشان می دهد. تصاویر پایین سطح مقطع را نشان می دهد. نمای شماتیک با جزئیات ابعاد راهنماهای مایع. (ب) این شکل برنامه های آزمایشی را برایفیبروزدستگاه های تقلید کننده فرآیند بارگذاری چهار مرحله‌ای برای هر چاه. مکان هر ناحیه الگوبرداری هیدروژل و همچنین قرارگیری رسانه در سطح مقطع از بالا به پایین و ایزومتریک. (1) در مجموع 1.5 uL هیدروژل 1 به طور خود به خود به کانال مرکزی هدایت می شود. (2) کانال مرکزی با 5 uL هیدروژل پر شده است. (3) در مجموع 10uL هیدروژل 3 بر روی کف مخزن طرح ریزی شده است. (4) در مجموع 200μL رسانه توزیع می شود. نوار مقیاس قرمز=9 میلی متر.

همانطور که در شکل 4D-G نشان داده شده است، طول خط نازک مویرگی به طور قابل توجهی توسط TGF افزایش یافته است- 1(تبدیل عامل رشد-)درمان در GFP-HUVECs اما ضخامت خط ضخیم در TGF کاهش یافت{1}}(تبدیل عامل رشد-)HUVEC های درمان شده قطر به طور متوسط ​​برای عروق نازک و ضخیم در HUVEC ها کاهش یافت. در مورد TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)درمان بازدارنده بر روی تراشه سه بعدی کشت شده، طول کل خطوط ضخیم و ضخیم روندی مخالف با تیمار TGF- 1 نشان داد. علاوه بر این، طول خط ضخیم نسبت به گروه کنترل درمان نشده افزایش یافت.

شکل 4. تغییر HK-2 و HUVECهای سه بعدی کشت شده با فیبروبلاست های کلیوی اولیه.کل سلول ها با تراکم 5×10 درجه در هر تراشه سه بعدی اندود شدند و با 5 نانوگرم در میلی لیتر TGF تحریک شدند{4}}(تبدیل عامل رشد-)یا مهارکننده 10 میکرومتری (SB 431542) به مدت 24 ساعت و با 4 درصد پارافورمالدئید تثبیت شد. (الف) سلول‌های تراشه سه بعدی با anti-o-SMA و anti-cytokeratin رنگ‌آمیزی شدند. بیان -SMA (ac) افزایش یافت و بیان KRT8(df) با TGF{13}}(ng/mL 5) به طور معنی‌داری کاهش یافت. طول کل HUVECها؛ عروق نازک به طور چشمگیری افزایش یافته و عروق ضخیم توسط TGF-ß1 کاهش یافته است(تبدیل عامل رشد-)(D، E). قطر برای عروق نازک و ضخیم (F, G) کاهش یافت. این نتایج توسط بازدارنده SB431542 معکوس شد. میله های مقیاس در میکروگراف ها 100 میکرومتر * p را نشان می دهد<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">

2.4.TGF{2}} میانجی التهابی و عوامل رشد را تعدیل می‌کند

در مرحله بعد، ما سیتوکین های التهابی و فاکتورهای رشد را در مایع رویی بررسی کردیم. IL-1، FGF-2، TGF- 2(تبدیل عامل رشد-)و TGF- 3(تبدیل عامل رشد-)ترشح پروتئین در تراشه‌های کشت سه‌بعدی به‌طور چشمگیری بیشتر از فیبروبلاست دوبعدی بود که به خوبی کشت شده بودند، حتی اگر تعداد کل سلول‌ها یکسان بود. با این حال، TGF- 1(تبدیل عامل رشد-) سطوح مشابه بودند، زیرا مدل‌های دو بعدی یا سه بعدی با غلظت‌های مشابه TGF درمان شدند{4}}(تبدیل عامل رشد-)(شکل 5A-E). به ویژه، آزادسازی FGF-2 از فیبروبلاست‌های کلیوی اولیه انسان 20.9 ± 0.4 pg/day/5×10 درجه سلول‌های کشت تک لایه دوبعدی و 0.2 ± 3094.8 pg/day/5×10 درجه سلول شامل HUVECs و HK{17}} تراشه کشت سه بعدی در کنترل درمان نشده. ترشح FGF{20}} توسط TGF- 1(تبدیل عامل رشد-)تحریک 31.0±0.2pg/day/5×10 درجه سلول برای کشت 2 بعدی و 3683.9±0.8 pg/day/5×10 درجه سلول برای سه بعدی بود. تراشه کشت شده این افزایش در تولید پروتئین FGF{15}} در کشت تک لایه دوبعدی با افزایش مدل تراشه‌های کشت سه‌بعدی توسط TGF هم‌آهنگ بود{19}}(تبدیل عامل رشد-)درمان (شکل 5B).

شکل 5. مقایسه مدل های دو بعدی و سه بعدی کشت شده به عنوان پلت فرم های تقلید کننده فیبروز کلیه.سلول ها با تراکم 5×10 درجه در هر چاه دو بعدی یا تراشه 3 بعدی اندود شدند و با 5 نانوگرم در میلی لیتر TGF تحریک شدند{5}}(تبدیل عامل رشد-)یا مهارکننده 10 میکرونی (SB 431542) به مدت 24 ساعت. فیبروبلاست های کلیوی انسانی اولیه در مدل کشت دو بعدی و در مدل کشت سه بعدی استفاده شد. فیبروبلاست ها با تراکم 8×10* کشت شده با HUVECs و HK{9}} مورد استفاده قرار گرفتند. نسبت اولیه فیبروبلاست کلیه انسان به HUVEC یا نسبت F: H برای ارزیابی 1:5 بود.فیبروزسلول های .HK-2 با تراکم 2×104 استفاده شد. تشخیص (A)IL{3}}، (B) فاکتور رشد پایه فیبروبلاست (FGF{4}})، و (CE)TGF-بتا 1، 2 و 3 در مایع رویی با استفاده از آنالیز چندگانه انجام شد. سیتوکین ها و ایمونواسی مهره های چندگانه هر نوار نشان دهنده میانگین ± SE.*p است<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(تبدیل عامل رشد-).

مزایای cistanche tubolosa: درمان بیماری های کلیوی

علاوه بر این، بیان mRNA سیتوکین های پیش التهابی مانند IL-1، IL-6، IL-8 و TNF- را تخمین زدیم. نتایج به طور قابل توجهی توسط TGF نوترکیب انسانی کاهش یافت{5}}(تبدیل عامل رشد-)درمان در تراشه کشت سه بعدی به عنوان یک خاصیت ضد التهابی TGF-(تبدیل عامل رشد-). ما دریافتیم که بیان mRNA توسط TGF تنظیم شده است- 1(تبدیل عامل رشد-)مهار کننده (SB431542). علاوه بر این، بیان IL-6، IL{3}} و TNF- با واسطه مهارکننده به طور خاص در مقایسه با کنترل درمان نشده کاهش یافت (شکل 6A-D). سطح mRNA VEGF، یک فاکتور فیبروتیک، به طور قابل توجهی توسط TGF افزایش یافت{7}}(تبدیل عامل رشد-)رفتار. سطح mRNA VEGF توسط مهارکننده TGF{0}} کاهش یافت (شکل 6E)، در حالی که بیان mRNA IL{2}} با اثر ضد فیبروتیک در شرایط فیبروتیک ناشی از TGF کاهش یافت{4}} . در مقابل، بیان mRNA I با درمان با مهارکننده TGF افزایش یافت (شکل 6F).

شکل 6. Real-time PCR بیان کلی mRNA تراشه سه بعدی را نشان می دهد.سلول ها با تراکم 5×10 درجه در هر تراشه سه بعدی اندود شدند و با 5 نانوگرم در میلی لیتر TGF تحریک شدند{4}}(تبدیل عامل رشد-)یا مهارکننده 10 میکرونی (SB431542) برای 24 ساعت. RNA کل استخراج شده از تراشه کشت سه بعدی. بیان mRNA (A)IL-1، (B)TNF-، (C)IL-6 و (D)IL-8 نشان دهنده اثر ضد التهابی TGF است. {10}}(تبدیل عامل رشد-)رفتار. (E) بیان VEGF به عنوان یک عامل رگ زایی افزایش یافت. بیان (F)IL-10 به عنوان یک عامل ضد فیبروتیک به طور قابل توجهی توسط TGF- 1 کاهش یافت.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(تبدیل عامل رشد-).

برای قسمت Ⅰ Ⅱ اینجا را کلیک کنید