پروتئین ترشحی حفاظت شده غنی از سیستئین MaCFEM85 با MsWAK16 تعامل می کند تا دفاع گیاه را فعال کند.

خلاصه: Metarhizium anisopliaeیک قارچ حشره پاتوژن است که ممکن است رشد و مقاومت گیاه را در هنگام عمل به عنوان اندوفیت در گیاهان میزبان افزایش دهد. با این حال، اطلاعات کمی در مورد فعل و انفعالات پروتئین یا مکانیسم های فعال کننده آنها وجود دارد. پروتئین های رایج در غشای خارج سلولی قارچی (CFEM) به عنوان تنظیم کننده های ایمنی گیاهی شناسایی شده اند که پاسخ های مقاومت گیاه را سرکوب یا فعال می کنند. در اینجا، ما یک پروتئین حاوی دامنه CFEM، MaCFEM85 را شناسایی کردیم که عمدتاً در غشای پلاسمایی قرار داشت. مخمر دو هیبرید (Y2H)، گلوتاتیون-S-ترانسفراز (GST) و سنجش مکمل فلورسانس دو مولکولی نشان داد که MaCFEM85 با دامنه خارج سلولی یکMedicago sativaپروتئین غشایی (یونجه)، MsWAK16. تجزیه و تحلیل بیان ژن نشان داد که MaCFEM85 و MsWAK16 به طور قابل توجهی تنظیم مثبت شدند.M. anisopliaeوM. ساتیوابه ترتیب از 12 تا 60 ساعت پس از تلقیح همزمان. سنجش‌های دو هیبریدی مخمر اضافی و جهش محل خاص اسید آمینه نشان داد که دامنه CFEM و سیستئین 52 به طور خاص برای تعامل MaCFEM85 با MsWAK16 مورد نیاز است. سنجش عملکرد دفاعی نشان داد که JA تنظیم شده بود، اما اندازه ضایعه Botrytis cinerea و تولید مثل Myzus persicae با بیان گذرا MaCFEM85 و MsWAK16 در گیاه میزبان مدل Nicotiana benthamiana سرکوب شد. در مجموع، این نتایج بینش جدیدی در مورد مکانیسم‌های مولکولی نهفته در تعاملات M. anisopliae با گیاهان میزبان ارائه می‌کنند.

مزایای مکمل سیستانچ - افزایش ایمنی

کلمات کلیدی: کیناز مرتبط با دیوار. CFEM ها؛ Metahizium anisopliae; ایمنی گیاهی؛ Medicago sativa

1. معرفی

فعل و انفعالات بین گیاهان و میکروب ها گسترده است و نتیجه تکامل مشترک گذشته و مداوم است. این تعاملات می تواند برای هر شرکت کننده پیامدهای مفید، خنثی یا نامطلوب داشته باشد [1-3]. میکروبیوتای ریزوسفری مفید می‌تواند رشد گیاه را تقویت کرده و سلامت کلی را با محافظت در برابر بیماری‌های ناشی از خاک یا افزایش جذب مواد مغذی بهبود بخشد [4،5]. طیف وسیعی از میکروب‌های مفید می‌توانند قابلیت‌های گیاه مانند جذب مواد مغذی، رشد و دفاع از بیماری‌زا و حشرات را افزایش دهند [6،7]. Metarhizium Sorok¯ın یک جنس مهم از قارچ های حشره پاتوژن با توانایی کلونیزه کردن گیاهان است [8]، اما شواهدی نیز وجود دارد که نشان می دهد اعضای این جنس می توانند مقاومت پاتوژن گیاهی را افزایش دهند. به عنوان مثال، یک مطالعه آزمایشگاهی 60 درصد مهار Fusarium solani (Mart.) Sacc را نشان داد. در حضور Metarhizium robertsii (که قبلا به عنوان M. anisopliae شناخته می شد) در مقایسه با گروه شاهد بدون M. robertsii [9]. برخی از سویه های Metarhizium پتانسیل بهبود مقاومت گیاه در برابر آفات و بیماری ها را با تغییر بیان ژن های دفاعی گیاه دارند. کلونیزاسیون اندوفیت با M. Roberts بیان مسیرهای دفاعی اسید جاسمونیک (JA) و اسید سالیسیلیک (SA) را در برگ های ذرت فعال می کند. علاوه بر این، چنین استعماری با ترویج رشد گیاه و سرکوب رشد لارو Agrotis epsilon (Hufnagel) همراه است [10]. Metarhizium guizhouense -1،3-گلوکاناز و کیتیناز را در پوست میوه Lansium parasiticum فعال کرد که منجر به مهار رشد Botrytis sp. و Fusarium sp. بر میوه Aglaia dookkoo Griff [11]. علاوه بر این، هنگامی که M. anisopliae روی نهال‌های بادام زمینی استفاده شد، انواع فاکتورهای رونویسی از جمله WRKYs، MYCs، TGAs و فاکتورهای رونویسی پاسخ‌دهنده به اتیلن فعال شدند، در حالی که ناقل‌های نیترات و پروتئین‌های متصل‌کننده عناصر پاسخ‌دهنده به کم‌آبی نیز به طور متفاوت بیان شدند [12] . این نشان می‌دهد که M. anisopliae ژن‌های دفاعی گیاه را در حالی که گیاه را مستعمره می‌کند، تنظیم می‌کند. با این حال، نسبتا کمی در مورد مکانیسم های اساسی پاسخ های دفاعی گیاه پس از عفونت توسط Metarhizium شناخته شده است. افکتورها ابزار رایجی هستند که میکروارگانیسم ها به وسیله آن مقاومت گیاه را تنظیم می کنند [13]. فعال شدن مقاومت گیاه معمولاً با یک انفجار اکسیداتیو و القای هورمون ها، متابولیت ها و سایر سیگنال ها مشخص می شود [13]. هورمون های گیاهی SA و JA نقش مهمی در القای مقاومت گیاه ایفا می کنند و دو مسیر سیگنالینگ دفاعی مجزا را واسطه می کنند [14]. مسیر سیگنالینگ SA در درجه اول در پاسخ آلرژیک گیاه و در مقاومت اکتسابی سیستمیک به پاتوژن ها عمل می کند، اما ممکن است در پاسخ های غیرمستقیم دفاعی گیاه ناشی از تغذیه حشرات گزنده نیز نقش داشته باشد [15]. تجمع SA با افزایش بیان ژن های کد کننده پروتئین های انتقال لیپید (LTPs) و فنیل آلانین آمونیاک لیاز (PAL) [16]، که واسطه سنتز و تجمع متابولیت های تخصصی پایین دستی مانند فلاونوئیدها و لیگنین [17] است، مرتبط است. مسیر سیگنالینگ JA در پاسخ های مستقیم و غیرمستقیم به آسیب های مکانیکی، پاتوژن های قارچی و آفات حشرات عمل می کند. مطالعات نشان داده اند که سیگنال دهی JA اثر تنظیمی بر سنتز متابولیت های تخصصی مانند ترپنوئیدها، فنیل پروپانوئیدها و آلکالوئیدها دارد که طیف وسیعی از عملکردهای بیولوژیکی دارند [18]. نشان داده شده است که برخی از متابولیت های تخصصی پس از درمان با متیل JA (MeJA) در سلول های گیاهی تجمع می یابند، از جمله پاکلیتاکسل در گونه های تاکسس [19،20]، ترپنوئیدها در Centella Asiatica (L.) Urban [21]، و ساپونین ها در جینسنگ [22] . استفاده از SA و کیتوزان (CHT) به عنوان محرک‌ها باعث تجمع لیگنین و واکنش‌های آنزیم دفاعی در گوجه‌فرنگی شد که باعث کاهش بروز عفونت Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi شد [23]. علاوه بر این، سطوح JA و SA در گندم به طور قابل توجهی با استفاده از استخراج کننده PeaT انباشته شد و پاسخ دفاعی به شته جو دوسر Sitobion avenae (Fabricius) را افزایش داد [24]. این نشان می دهد که ایمنی گیاه را می توان توسط این عوامل از طریق هورمون ها و متابولیت های گیاهی تنظیم کرد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

پروتئین های رایج در غشای خارج سلولی قارچی (CFEM) در طیف وسیعی از قارچ ها وجود دارند. آنها دامنه هایی را رمزگذاری می کنند که معمولاً 60 اسید آمینه (aa) طول دارند و حاوی هشت سیستئین با فاصله مشخص هستند [25]. دامنه‌های CFEM شبیه به حوزه‌های شبه فاکتور رشد اپیدرمی (EGF) هستند که به عنوان گیرنده‌های خارج سلولی، مبدل‌های سیگنال یا مولکول‌های چسبندگی در تعاملات میزبان-پاتوژن عمل می‌کنند [26]. پروتئین‌های حاوی دامنه‌های CFEM ممکن است با عمل به‌عنوان تأثیرگذار، پاسخ مقاومت گیاه را دستکاری کنند. در قارچ زنگ برگ گندم Puccinia triticina Erikas، کاندید عامل CFEM PTTG{4}} پیشرفت مرگ سلولی را تسریع کرد و باعث تجمع گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) شد [27]. قارچ آنتراکنوز Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils حاوی پنج عامل (CgCFEM6، 7، 8، 9، و 15) است که نشان داده شده است مرگ برنامه ریزی شده سلولی ناشی از BAX را در Nicotiana benthamiana Domin [28] سرکوب می کنند. گزارش شده است که قارچ میکوریزای فیتوهمزیستی Laccaria bicolor (Maire) PDOrton چندین پروتئین CFEM مانند Lac310796، Lac296573 و Lac296572 را در بافت های همزیست ترشح می کند [29]. اگرچه عملکردهای پیچیده این پروتئین ها در همزیستی میکوریزا بیشتر مورد مطالعه قرار نگرفته است، نتایج قبلی نشان می دهد که پروتئین های CFEM ممکن است در سیگنال دهی بین قارچ ها و گیاهان عمل کنند. M. anisopliae می تواند به عنوان یک قارچ حشره پاتوژن یا اندوفیت در گیاه میزبان عمل کند [30]. با این حال، نقش پروتئین های CFEM هنوز گزارش نشده است. ما قبلا یک پروتئین حاوی دامنه CFEM را در M. anisopliae، MaCFEM85 (شناسه بانک ژن: MZ682609) شناسایی کردیم [31]. در اینجا، ما در مورد رابطه بین MaCFEM85 و کیناز MsWAK16 مرتبط با دیواره Medicago sativa گزارش می‌کنیم. ما توالی MaCFEM85 را تجزیه و تحلیل کردیم و آزمایش‌هایی انجام دادیم تا مشخص کنیم کدام باقیمانده‌ها برای تعامل با MsWAK16 حیاتی هستند. در نهایت، با استفاده از N. benthamiana به عنوان گیاه مدل، پاسخ‌های دفاعی گیاه به Botrytis cinerea و شته Myzus persicae را با و بدون بیان گذرا MaCFEM85 و MsWAK16 ارزیابی کردیم.

فواید سیستانچ توبولوزا-تقویت سیستم ایمنی بدن

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. نتایج

2.1. MaCFEM85 بیشترین ارتباط را با CFEMهای قارچی غیر بیماریزا داشت و در غشای پلاسمایی موضعی شد.

یک درخت فیلوژنتیک برای تجزیه و تحلیل روابط بین MaCFEM85 و سایر پروتئین‌های CFEM از قارچ‌های مدل بیماری‌زا و غیر بیماری‌زا ساخته شد. اینها عبارتند از Magnaporthe oryzae، Fusarium oxysporum (Schl)، Neurospora crassa Shear & BODodge، و Beauveria bassiana (Bals.) (به بخش 4 مراجعه کنید). MaCFEM85 بیشترین ارتباط را با پروتئین‌های CFEM در B. bassiana داشت و بنابراین، از نظر تکاملی به قارچ‌های بیماری‌زا نزدیک‌تر بود تا قارچ‌های بیماری‌زا (شکل 1a).

شکل 1a

2.2. MaCFEM85 در طول تعامل با M. sativa افزایش یافت

کینازهای گیرنده مانند مرتبط با دیوار (WAKs) نشان دهنده زیرگروهی در ابرخانواده پروتئین کینازهای گیرنده مانند (RLKs) است و شامل یک دامنه خارج سلولی، یک مارپیچ گذرنده و یک دامنه کیناز درون سلولی است. آنها نقش مهمی در تنظیم رشد، نمو، پاسخ به تنش و مسیرهای سیگنال دهی مقاومت پاتوژن دارند [32]. RNA از M. anisopliae hyphae و M. sativa پس از انکوباسیون همزمان برای بررسی الگوهای بیان MaCFEM85 و MsWAK16 استخراج شد. هر دو MaCFEM85 و MsWAK16 در سطوح به طور قابل توجهی بالاتر در طول انکوباسیون همزمان از 12 تا 6 0 ساعت بیان شدند (شکل 1c,d). از 0 تا 36 ساعت، بیان MaCFEM85 به تدریج افزایش یافت و در 36 ساعت به اوج خود رسید. این × 593 برابر بیشتر در ترکیب M. anisopliae و M. sativa در مقایسه با M. anisopliae به تنهایی بیان شد. اگر چه بیان MaCFEM85 کمی در دوره 48-60 ساعت کاهش یافته بود، آن را هنوز هم در سطوح به طور قابل توجهی بالاتر از M. anisopliae رشد به تنهایی بیان شد. MsWAK16 نیز به طور قابل توجهی تنظیم مثبت شد و بیان در 36 ساعت به اوج خود رسید. در M. sativa آلوده به M. anisopliae، MsWAK16 × 89.06 برابر بیشتر از M. sativa بدون M. anisopliae بیان شد. از 36 تا 60 ساعت، سطوح MsWAK16 اندکی کاهش یافت، اما بیان آن همچنان به طور قابل توجهی بیشتر از گیاهان تلقیح نشده بود.

2.3. MaCFEM85 با MsWAK16 In Vitro و In Vivo تعامل دارد

برای بررسی مکانیسم عملکردی بالقوه MaCFEM85 در پاسخ به درمان M. anisopliae، یک صفحه نمایش مخمر دو هیبریدی (Y2H) برای شناسایی اولیه پروتئین‌های میزبان که با MaCFEM85 تعامل دارند انجام شد. برهمکنش بین دامنه خارج سلولی MsWAK16 (MsWAK{5}}ED) و MaCFEM85 با یک روش دو هیبریدی مخمر یک به یک با استفاده از MaCFEM85 در pGBKT7 به عنوان بردار BD و MsWAK16 در pGADT7 به عنوان بردار AD مورد بررسی قرار گرفت. همه مخمرهای تبدیل شده در محیط با کمبود SD-T/L به خوبی رشد کردند، و گروه کنترل مثبت و گروه آزمایش با موفقیت در محیط کشت کمبود SD-T/L/H/A + X{17}}گال رشد کردند. این نشان داد که MaCFEM85 می‌تواند با MsWAK{19}}ED تعامل داشته باشد (شکل 2a).

شکل 2. اعتبار سنجی تعامل بین MaCFEM85 و MsWAK16.

برای اعتبار سنجی آزمایشگاهی، MsWAK{3}}ED با برچسب گلوتاتیون-S-ترانسفراز (GST) (که محصول 60 کیلو دالتون را کد می کند) در pGEX{5}}P2 و MaCFEM85 با برچسب پلی هیستیدین (His) وارد شد. رمزگذاری محصول 17 کیلو دالتون) در pET{10}}b وارد شد. بلات ایمنی با آنتی بادی‌های His و GST نشان داد که پروتئین نوترکیب MaCFEM{11}}His با طعمه GST-MsWAK{13}}ED اما نه تنها با GST و GST-MsWAK{15} ED با His تعامل داشت. -MaCFEM85 (شکل 2b). برای تأیید بیشتر تعامل بین MaCFEM85 و MsWAK16، ما یک سنجش مکمل فلورسانس دو مولکولی (BiFC) با ساختارهای MaCFEM{21}}YFPN و MsWAK{22}}YFPC انجام دادیم. بیان همزمان MaCFEM{24}}YFPN و MsWAK16-YFPC در برگ های تنباکو یک سیگنال فلورسانس زرد ایجاد کرد، که نشان می دهد MaCFEM85 با MsWAK16 تعامل دارد (شکل 2c).

2.4. سایت های کلیدی برای تعاملات MaCFEM85 و MsWAK16

برای تعریف ناحیه MaCFEM85 که برای تعامل با MsWAK{1}ED مورد نیاز است، دامنه های پروتئینی با نرم افزار آنلاین SMART پیش بینی شد (شکل 3a). MaCFEM85 حاوی یک دامنه CFEM در منطقه 19-86 aa بود. ساختار سوم نیز پیش بینی شده بود (شکل 3b). هشت سیستئین در این حوزه منجر به چهار پیوند دی سولفیدی شدند (CYS26 و CYS69، CYS30 و CYS64، CYS43 و CYS50، و CYS52 و CYS85)، که پایداری پروتئین را حفظ کردند (شکل 3b). برای اعتبارسنجی سایت(های) برهمکنش احتمالی در MaCFEM85، هفت نسخه جهش یافته از پروتئین تولید شد و به عنوان پروتئین طعمه در pGBKT7 قرار گرفت. هر ناقل نوترکیب با AD-MsWAK{19}}ED در سویه طلایی Y2H ترانسفکت شد. سویه با CYS52 جهش یافته روی محیط های انتخابی رشد نکرد (شکل 3c، با رنگ قرمز مشخص شده است)، که نشان می دهد CYS52 برای تعامل MaCFEM85 با MsWAK{25}}ED مورد نیاز است.

2.5. تعامل MaCFEM85 با MsWAK16 پاسخ ایمنی گیاه را فعال می کند.

2.5.1. ارزیابی نقش MaCFEM85 و MsWAK16 در مقاومت بیماری در برابر B. cinerea

برای بررسی احتمال دخالت MaCFEM85 و MsWAK16 در پاسخ‌های دفاعی پاتوژن، بررسی کردیم که آیا بیان بیش از حد MaCFEM85، MsWAK16، یا MaCFEM85 و MsWAK16 می‌تواند باعث افزایش مقاومت به B. cinerea شود یا خیر. ما به طور گذرا این بردارها را در برگ های N. benthamiana بیان کردیم. آزمایش وسترن بلات نشان داد که MaCFEM85 و MsWAK16 در سطوح قابل مقایسه زمانی بیان می شوند که به تنهایی یا با هم بیان می شوند، که نشان می دهد MaCFEM85 و MsWAK16 با موفقیت در تنباکو بیان شده اند (شکل 4a). سنجش بیماری نیز با استفاده از N. benthamiana که با MaCFEM85، MsWAK16، MaCFEM{13}}MsWAK16 یا کنترل GFP نفوذ کرده بود، انجام شد. ضایعات به طور قابل توجهی کوچکتر (حدود 30٪ در 2 روز پس از تلقیح) در برگ های نفوذ شده با MaCFEM85، MsWAK16، یا MaCFEM{19}}MsWAK16 در مقایسه با گیاهان شاهد بود (شکل 4b). این داده‌ها نشان می‌دهند که بیان گذرا MaCFEM85 در N. benthamiana باعث افزایش مقاومت به B. cinerea شده و MaCFEM85 و MsWAK16 پاسخ دفاعی در برابر B. cinerea را به طور مثبت تنظیم می‌کنند.

شکل 3. شناسایی محل تعامل بین MaCFEM5 و MsWAK16.

شکل 4. القای مقاومت گیاه با بیان گذرا MaCFEM85 و MsWAK16.

2.5.2. ارزیابی نقش MaCFEM85 و MsWAK16 در دفاع از شته در N. benthamiana

برای بررسی بیشتر نقش MaCFEM85 و MsWAK16، گیاهان N. benthamiana که به طور موقت MaCFEM85 و MsWAK16 را بیان می‌کنند با M. persicae آلوده شدند و جمعیت‌ها مورد ارزیابی قرار گرفتند. برای این آزمایش، سطح وسیعی از هر برگ N. benthamiana با ناقل دوتایی نوترکیب pYBA1132 حاوی MaCFEM85 و MsWAK16 آگرو فیلتر شد. از GFP به عنوان کنترل استفاده شد. در 12 ساعت پس از نفوذ، 2 0 M. persicae بالغ بر روی هر برگ در قفس قرار گرفتند و ناحیه نفوذ شده را در معرض شته‌ها قرار دادند. در سه روز بعد، تلفات شته بالغ و تعداد پوره ها ثبت شد. سپس پوره ها برداشته شدند. هیچ تفاوت معنی‌داری در خطر مرگ و میر در میان جمعیت M. persicae که از گیاهانی که MaCFEM85، MsWAK16، یا MaCFEM{11}}MsWAK16 را بیان می‌کنند تغذیه می‌کنند، وجود نداشت (χ{13}}.65827، DF=3، p <0.30081 ) (شکل 4ج). با این حال، در 24، 48 و 72 ساعت، میانگین تعداد نتاج تولید شده توسط هر شته بالغ در N. benthamiana که کنترل GFP را بیان می‌کند در مقایسه با آنهایی که MaCFEM85، MsWAK16، یا MaCFEM{24}}MsWAK16 را بیان می‌کنند، به طور قابل‌توجهی بیشتر بود (شکل 4d).

2.5.3. ارزیابی نقش MaCFEM85 و MsWAK16 در تجمع هورمون و بیان ژن مرتبط با هورمون

برای تجزیه و تحلیل تفاوت‌های بین پاسخ‌های دفاعی گیاهان N. benthamiana که eGFP، MaCFEM85، MsWAK16 و MaCFEM{2}}MsWAK16 را بیان می‌کنند، سطوح JA، SA و کل فلاونوئید و بیان ژن‌های مرتبط را اندازه‌گیری کردیم. نتایج نشان داد که سطوح JA و SA بین گیاهانی که eGFP، MaCFEM85، MsWAK16، و MaCFEM{6}}MsWAK16 را بیان می‌کنند، متفاوت است (شکل 5a). در مقایسه با کسانی که eGFP را بیان می کنند، سطوح JA در گیاهانی که MaCFEM85 را بیان می کنند به طور قابل توجهی کمتر بود. سطوح SA کمی افزایش یافت، اما تفاوت ها معنی دار نبود. در مقابل، گیاهانی که MsWAK16 را بیان می کنند، تفاوت معنی داری در سطوح JA در مقایسه با کنترل eGFP نشان ندادند، در حالی که سطوح SA به طور قابل توجهی کمتر از شاهد بود (شکل 5a). سطوح JA و SA به ترتیب در گیاهانی که MaCFEM85+MsWAK16 را بیان می‌کنند در مقایسه با eGFP افزایش و کاهش یافت.

شکل 5. سطح هورمون و بیان ژن پاسخ هورمونی

محتوای کل فلاونوئید در گیاهانی که MaCFEM85+MsWAK16 را بیان می‌کنند در مقایسه با سایر گروه‌های تیمار به طور قابل توجهی بالاتر بود (شکل 5a). سطوح بیان ژن بیوسنتزی در گیاهان بیان کننده MsWAK16 و MaCFEM{4}}MsWAK16 مشابه بود. برای مثال، ژن‌های مربوط به پاسخ JA، یعنی COI1، MYC2، و PDF1.2، در مقایسه با گیاهانی که GFP را بیان می‌کنند، به طور قابل‌توجهی تنظیم مثبت شدند (شکل 5b). به طور مشابه، ژن‌های NPR1، WRKY70 و PR1 مربوط به SA به‌طور معنی‌داری در گیاهانی که MsWAK16 و MaCFEM را بیان می‌کنند، بیان شدند. NPR1 تنظیم مثبت شد، در حالی که WRKY70 و PR1 در مقایسه با کنترل کاهش یافتند (شکل 5b). ما همچنین بیان ژن‌های کلیدی را در مسیرهای سنتز شیکیمیک اسید و فنیل پروپانوئید که هر دو مربوط به سنتز فلاونوئید هستند، بررسی کردیم. به طور کلی، بیان MaCFEM85 به تنهایی باعث بیان بیشتر این ژن‌ها در تنباکو نشد. با این حال، این ژن‌ها در تنباکوی بیان‌کننده MsWAK16 یا MsWAK{24}}MaCFEM85 در مقایسه با کنترل GFP تنظیم مثبت شدند (شکل 5c).

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

3. بحث

3.1. موتیف پروتئین CFEM حفاظت شده عملکردهای متعددی را در گونه های قارچی انجام می دهد

دامنه CFEM منحصر به قارچ است و معمولاً در پروتئین‌های غشای خارج سلولی قارچی وجود دارد. دامنه در جدیدترین جد مشترک Ascomycota و Basidiomycota [33] منشا گرفته است. تحقیقات اخیر نشان داده است که پروتئین های CFEM موجود در پاتوژن های قارچی می توانند به عنوان تنظیم کننده های ایمنی گیاه عمل کنند و بسته به نوع عفونت باعث سرکوب یا فعال شدن سیستم ایمنی گیاه میزبان شوند [28،34،35]. گزارش‌های کمی از پروتئین‌های حاوی دامنه CFEM در M. anisopliae وجود دارد، تنها در چارچوب مقایسه‌ای تکاملی با سایر قارچ‌ها [36]. در این مطالعه، ما پروتئین های CFEM M. anisopliae را با سایر پروتئین های شناخته شده CFEM در قارچ های بیماری زا و غیر بیماری زا مقایسه کردیم. ما تأیید کردیم که نزدیکترین همولوگ MaCFEM85 Cfem5 است که در Beauveria bassiana، یکی از 12 پروتئین CFEM در آن گونه یافت می شود (شکل تکمیلی S1). BbCfem5 برای جذب آهن ضروری است [37]. علاوه بر این، بر اساس ساختار سوم پیش بینی شده، دامنه CFEM در MaCFEM85 بسیار شبیه به سطح پروتئین آنتی ژن 2 (CSA2) موجود در کاندیدا آلبیکنس (CPRobin) Berkhout است که در آن 65 باقیمانده (96٪ از توالی) با 99.8 مدل شده است. درصد اطمینان [31]. کاندیدا آلبیکنس یک پاتوژن حیوانی است. CSA2 با استخراج هِم از هموگلوبین و انتقال هم از دیواره سلولی به پلاسما، نقش مهمی در رشد و بیماری زایی دارد [38-40]. ما فرض می کنیم که MaCFEM85 ممکن است در حدت M. anisopliae میزبان حشرات نقش داشته باشد. این عملکردهای ترکیبی MaCFEM85 در عفونت های بیماری زا حیوانات و فعال سازی ایمنی گیاهی، پروتئین را به یک مرکز تحقیقاتی هیجان انگیز در آینده تبدیل می کند.

3.2. پیوندهای دی سولفیدی ساختارهای مهمی برای عملکرد پروتئین هستند

یکپارچگی ساختاری یک ساختار پروتئین به طور مستقیم با توانایی آن برای عملکرد مرتبط است. پیوندهای دی سولفیدی که توسط جفت‌های سیستئین تشکیل می‌شوند، چین خوردگی پروتئین و ثبات ساختاری را افزایش می‌دهند و به عنوان مکان‌های کلیدی برای شناسایی و اتصال گیرنده‌ها یا لیگاندهای خاص در نظر گرفته می‌شوند [41]. به عنوان مثال، برهم زدن هر یک از سه پیوند دی سولفیدی حفظ شده در پاتوژن گیاهی Cladosporium fulvum protein effector AVR4 منجر به حساسیت پروتئاز و کاهش توانایی اتصال به کیتین می شود [42]. در سه پروتئین دیگر C. fulvum (ECP1، ECP2 و ECP5)، جایگزینی منفرد آلانین‌ها برای سیستئین‌ها، پاسخ حساسیت بیش از حد گوجه‌فرنگی را تضعیف می‌کند، که نشان می‌دهد سیستئین‌ها برای حفظ ثبات و فعالیت تحریک‌کننده واکنش بیش‌حساس حیاتی هستند [43]. علاوه بر این، در پروتئین بالغ MC69 Magnaporthe oryzae، جهش زایی دو باقی مانده سیستئین حفظ شده (Cys36 و Cys46) ممکن است عملکرد MC69 را بدون تأثیر بر ترشح مختل کند، که نشان دهنده اهمیت پیوند دی سولفیدی به طور خاص در بیماری زایی MC69 است [44]. به نظر می رسد دامنه CFEM از نظر اندازه و الگوی باقی مانده های سیستئین مشابه دامنه های EGF مانند است که حاوی سه یا چهار جفت پیوند دی سولفید است. پروتئین‌های EGF می‌توانند به‌عنوان گیرنده‌های سطح سلول، مبدل‌های سیگنال یا مولکول‌های چسبنده در برهمکنش‌های میزبان و پاتوژن عمل کنند [45]. در این مطالعه، ما نه تنها دریافتیم که دامنه CFEM MaCFEM85 حاوی هشت سیستئین حفظ شده است که چهار جفت پیوند دی سولفیدی را تشکیل می‌دهند (شکل 3b)، بلکه اعتبار CFEM را نیز حوزه حیاتی برای تعامل بین MaCFEM85 و MsWAK16 است. علاوه بر این، از طریق جهش مستقیم باقی مانده های سیستئین به آلانین، ما دریافتیم که باقیمانده سیستئین در موقعیت 52، محل اصلی مورد نیاز برای تعامل است (شکل 3c). این نتایج مبنایی برای مطالعات بیشتر در مورد عملکردهای فیزیولوژیکی تعامل CFEM85-WAK16 فراهم می کند.

3.3. تعامل MaCFEM85 با دفاع گیاهی فعال شده MsWAK16

در فعل و انفعالات میکروبی-گیاه، پاسخ‌های دفاعی گیاه عموماً توسط پروتئین‌های عامل میکروبی فعال می‌شوند. دفاع القایی در حال تبدیل شدن به یک ابزار مهم در کنترل بیولوژیکی آفات برای ارتقاء مقاومت است. پروتئین‌های CFEM به‌عنوان عوامل مؤثر در تنظیم فعال‌سازی یا مهار سیستم ایمنی گیاه شناسایی شده‌اند [28،46]. با این حال، تعداد کمی از تحقیقات منتشر شده وجود دارد که تنظیم این عوامل ایمنی را به نقش خاص آنها در بیماری های گیاهی و مقاومت به حشرات مرتبط می کند. در این مطالعه، ما از یک قارچ حشره‌زا و اندوفیت، M. anisopliae برای شناسایی تعامل بین MaCFEM85 و یک کیناز مرتبط با دیواره سلولی، MsWAK16، در M. sativa استفاده کردیم. نتایج نشان داد که این برهمکنش نسبت ضایعه را پس از تلقیح با B. cinerea کاهش داد (شکل 4b) و نرخ رشد جمعیت M. persicae را کاهش داد (شکل 4d)، که نشان دهنده تعامل بین MaCFEM85 و MsWAK16 باعث افزایش مقاومت M. sativa به شته ها شد. تغییرات در سطوح JA، SA و اتیلن (ET) می تواند به عنوان نشانگر برای ارزیابی القای مقاومت گیاه استفاده شود [47،48]. در اینجا، ما نشان دادیم که MaCFEM85 با MsWAK16 برای تأثیرگذاری بر مقاومت گیاه از طریق تنظیم هورمونی و مهار نرخ تولید مثل M. persicae تعامل داشت (شکل 4d). مطالعات مشابهی قبلا گزارش شده است. به عنوان مثال، پروتئین موثر برروی باسیلوس لاتروسپوروس PeBL1 نشان داده شد که تجمع JA و SA را در گوجه فرنگی القا می کند و سرعت رشد جمعیت های نسل دوم و سوم M. persicae را که از آن گیاهان تغذیه می کردند، کاهش می دهد. علاوه بر این، بوته‌های گوجه‌فرنگی اسپری‌شده با افکتورها اثر دفعی بر M. persicae دارند [49]. استفاده از پروتئین استخراج کننده PeBC1 در لوبیا معمولی (Phaseolus vulgaris L.) منجر به اثرات برجسته و قابل توجه زیر کشنده بر روی شته های هلو سبز می شود. گیاهان تیمار شده با PeBC1 تغییرات قابل توجهی در ژن های مربوط به JA و SA نشان می دهند [50]. Beauveria bassiana elicitor PeBb1 باروری M. persicae را در تنباکو کاهش می دهد و بیان ژن های مرتبط با JA و ET را القا می کند [51]. در مطالعه حاضر، بیان گذرا MaCFEM85 و MsWAK16 در تنباکو به طور قابل توجهی ژن های مرتبط با پاسخ JA COI1، MYC2، و PDF1.2 (شکل 5b) را افزایش داد و محتوای JA و کل فلاونوئید را افزایش داد (شکل 5a)، که با نتایج قابل مقایسه بود. در ادبیات همانطور که در بالا توضیح داده شد. با این حال، ما سطوح بالایی از SA را در تنباکو 12 ساعت پس از نفوذ شناسایی نکردیم و گیاهانی که به‌طور موقت MsWAK16 یا MaCFEM{35}}MsWAK16 را بیان می‌کردند به طور قابل‌توجهی سطوح SA و کاهش ژن‌های دخیل در پاسخ SA را کاهش دادند (شکل 5a,b). . این نشان داد که تحریک هورمون‌های مختلف گیاهی می‌تواند نه تنها به فعالیت‌های هم افزایی منجر شود، بلکه منجر به گفتگو و بازخورد نیز می‌شود و به گیاهان اجازه می‌دهد تا به محرک‌های مختلف واکنش مناسب نشان دهند. افزایش سطح JA اما سطوح پایین SA قبلاً در گیاهان گزارش شده است. به عنوان مثال، در A. thaliana معیوب برای تجمع SA، سطوح JA {38} برابر بیشتر از A. thaliana نوع وحشی بود، و ژن‌های پاسخ‌دهنده به JA فعال شدند [52]. همچنین گزارش شده است که برخی از باکتری ها می توانند سطوح JA را در گیاهان افزایش دهند تا از تجمع SA جلوگیری کنند و از آسیب ناشی از SA جلوگیری کنند. به عنوان مثال، Pseudomonas syringae گیرنده COI1 را از طریق یک سم، coronatine، که به طور منفی مسیر JA را تنظیم می کند، هدف قرار می دهد [53]. این امر باعث افزایش دخیل در MYC{44}}عوامل رونویسی ANAC019، ANAC055 و ANAC072 می‌شود [54]، رونویسی ICS1 (یک ژن کلیدی برای سنتز SA) را مهار می‌کند و در نتیجه تولید SA و انتقال سیگنال را کاهش می‌دهد. در مطالعه حاضر، تعامل بین MaCFEM85 و MsWAK16 منجر به افزایش تجمع JA و تنظیم مثبت ژن‌های پاسخ‌دهنده به JA اما مهار تجمع SA و رونویسی ژن‌های مرتبط با SA شد. این نشان داد که تعامل بین MaCFEM85 و MsWAK16 باعث القای JA شده و در نتیجه مقاومت گیاه به شته ها را بهبود می بخشد.

در N. benthamiana که به طور موقت MaCFEM85 و MsWAK16 را بیان می کند، سطوح JA افزایش یافته و اندازه ضایعات B. cinerea کاهش یافته است (شکل 4b)، مطابق با مطالعات قبلی. JA در مقاومت گیاه به حشرات و پاتوژن های نکروتروف نقش دارد [52،55]. به عنوان یک پاتوژن نکروتروف، B. cinerea توسط تجمع JA و ET مهار شد [56]. در A. thaliana جهش یافته با کمبود ET ein2-1 و coi جهش یافته با پاسخ JA1-1، سطوح ژن دفاعی پایین دست، PDF1.2 به طور قابل توجهی کاهش یافت و حساسیت به B. cinerea افزایش یافت [ 57]. ما در اینجا متوجه شدیم که تجمع JA و رونویسی ژن‌های مربوط به JA در N. benthamiana که به طور گذرا MaCFEM85 و MsWAK16 را بیان می‌کند به طور قابل‌توجهی افزایش یافته است، در حالی که تجمع SA و رونویسی ژن‌های مربوط به SA مهار شد. بیان MaCFEM85 و MsWAK16 نیز اثر مهاری بر B. cinerea نشان داد. این نشان داد که JA توسط MaCFEM85 و MsWAK16 فعال شد و نقش مهمی در مقاومت گیاه به B. cinerea داشت.

4. مواد و روش ها

4.1. سویه های قارچی، مواد گیاهی و روش های کشت

سویه های ایزوله Metarhizium anisopliae Ma 9 بر روی محیط کشت سیب زمینی- قند آگار (PSA) (2{19}}{41}} گرم عصاره سیب زمینی پوست کنده در آب، 20 گرم ساکارز و 15 گرم آگار در لیتر) کشت داده شدند. پودر اسپورانژیوم تازه پس از 10 روز جمع آوری شد. گیاهان Nicotiana benthamiana در یک اتاقک آب و هوایی مصنوعی با چرخه نور/تاریکی 14/10 ساعت (27/25 ◦C) رشد کردند. برای بیان ژن گذرا از طریق تبدیل با واسطه Agrobacterium، Agrobacterium tumefaciens سویه GV3101 در محیط Luria Broth (LB) (10 گرم تریپتون، 5 گرم عصاره مخمر، و 10 گرم NaCl/L) کشت داده شد. سویه مخمر طلا (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) بر روی محیط کشت پپتون دکستروز عصاره مخمر (YPDA) (10 گرم عصاره مخمر، 20 گرم پپتون، 20 گرم گلوکز و 0.03 گرم آدنین نیم سولفات در لیتر) کشت شد. برای هر ناقل و سویه، آنتی بیوتیک های مناسب، یعنی ریفامپین، کانامایسین، یا آمپی سیلین (به ترتیب 25، 50، یا 50 میکروگرم در میلی لیتر) استفاده شد. سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول تکمیلی S1 فهرست شده اند. دانه های Medicago sativa با 75% اتانول به مدت 1 دقیقه و سپس 50% NaClO (5.5%) به مدت 15 دقیقه استریل شدند. دانه ها کاملاً مخلوط شده و سپس در آب استریل سه بار به مدت 5 دقیقه شسته شدند. بذرها در دمای 4 درجه سانتیگراد در تاریکی به مدت بیش از 24 ساعت انکوبه شدند، سپس در صفحات آب آگار 1 درصد در دمای اتاق به مدت یک شب جوانه زدند. سه روز پس از جوانه زنی، نهال های در حال رشد به کاغذ صافی روی ظروف پتری استریل {35} سانتی متری با 20 نهال در هر ظرف منتقل شدند. تیمارها و شاهد به ترتیب به 15 ظرف اختصاص یافتند. سپس گیاهچه ها با 10 میلی لیتر سوسپانسیون اسپور M. anisopliae حاوی 107 در میلی لیتر آبیاری شدند و شاهد با 10 میلی لیتر آب استریل آبیاری شدند. در ساعت های 0، 12، 24، 48 و 60، از سه پتری دیش برای هر بازه زمانی، انتخاب تصادفی نهال انتخاب شد. نمونه ها در نیتروژن مایع منجمد و در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

4.2. qRT-PCR و ساخت پلاسمید

RNA کل از M. anisopliae (hyphae) و M. sativa (ریشه) با معرف TRIZol (Invitrogen، CA، USA) طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. کیفیت و فراوانی RNA حاصل با نانوفوتومتر (Implen، مونیخ، آلمان) اندازه‌گیری شد. سنتز cDNA رشته اول (تا 2ug RNA) با استفاده از 5× All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Canada) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. qRT-PCR با استفاده از 2×SYBR Green qPCR Master Mix از US EVER BRIGHT ® INC و سیستم ABI QuantStudio 5 طبق دستورالعمل های سازنده انجام شد. پرایمرهای مورد استفاده برای هر ژن در جدول تکمیلی S2 آمده است. Maury [58]، Msactin [59] و Nbactin [6{24}}] به عنوان ژن مرجع داخلی برای عادی سازی داده های بیان استفاده شدند. واکنش تحت شرایط زیر انجام شد: 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد، به دنبال آن 40 چرخه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه و در دمای 60 درجه سانتیگراد برای 40 ثانیه. برای هر نمونه سه تکرار فنی وجود داشت. بیان نسبی با استفاده از روش 2−∆∆Ct [61] محاسبه شد. معنی‌داری آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و آزمون چند دامنه‌ای دانکن در SPSS نسخه 20.0 (SPSS) تعیین شد.

4.3. بیان گذرا پروتئین ها در N. benthamiana

توالی کد کننده MaCFEM85 (CDS) با DNA پلیمراز فوق العاده وفاداری با استفاده از cDNA به عنوان الگو تقویت شد. برای سنجش محلی سازی درون سلولی، محصولات PCR حاوی CDS برای MaCFEM85 به ترتیب در pYBA{3}}eGFP (هضم شده با EcoRI و SalI) و pcambia{4}}گیلاس (EcoRI و SacI) کلون شدند. تمام سازه ها با توالی یابی اعتبارسنجی شدند (شرکت بیوتکنولوژی Tsingke، آموزشی ویبولیتین پکن، چین). پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول تکمیلی S2 آمده است. برای بیان گذرا MaCFEM85-eGFP و MaCFEM85-mCherry در N. benthamiana، سویه A. tumefaciens GV3101 با هر پلاسمید تبدیل شد و با PCR تأیید شد. آگروباکتریوم یک شبه در دمای 28 درجه سانتیگراد با تکان دادن کشت داده شد. سلول ها از طریق سانتریفیوژ 5 دقیقه 5000 دور در دقیقه در دمای اتاق جمع آوری شدند، سه بار با آب مقطر استریل شسته شدند و در بافر 10 میلی مولار MgCl2 (حاوی 10 میلی مولار MES و 10 میلی مولار استوسیرینگون، pH 7/5) مجدداً معلق شدند. سوسپانسیون سلولی به OD600 0.5 تنظیم شد، سپس با سرنگ 1- میلی‌لیتری به سطح زیرین 4- تا 5-برگ‌های N. benthamiana یک هفته‌ای نفوذ کرد. هر برگ با 50 میکرولیتر A. tumefaciens نفوذ داده شد. سه برگ در هر بوته و سه بوته در هر گروه تیمار قرار گرفتند. برگهای تیمار شده پس از 30 ساعت جمع آوری و با میکروسکوپ کانفوکال زایس LSM980 (کارل زایس، آلمان) برای تعیین محلی سازی زیر سلولی مشاهده شدند.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی

4.4. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک

یک درخت فیلوژنتیک با استفاده از روش اتصال همسایه در MEGA X ساخته شد. 1000 تکرار بوت استرپ از مدل فاصله P استفاده کردند. توالی‌های اسید آمینه مورد استفاده برای تولید درخت با جستجوهای BLASTP در برابر پایگاه‌داده NCBI قارچ‌های مرتبط (به عنوان مثال، Magnaporthe oryzae، Botrytis cinerea، Fusarium graminearum، Colletotrichum graminicola، Fusarium oxysporum، Neurospora crassa، Aspergillus. ، Trichoderma harzianum، Beauveria bassiana و Paecilomyces lilacinus) با استفاده از MaCFEM85 به عنوان پرس و جو.

4.5. سنجش مخمر دو هیبریدی

سیستم Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid (Clontech Laboratories, Inc.؛ اکنون Takara Bio USA, Inc.) برای تأیید تعامل بین MaCFEM85 و MsWAK16 استفاده شد. MaCFEM85 بدون پپتید سیگنال به عنوان طعمه به pGBKT7 و دامنه خارج سلولی MsWAK16 (MsWAK{6}}ED) به عنوان طعمه به pGADT7 وارد شد. آماده‌سازی و تبدیل سلول‌های دارای مخمر با استفاده از Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research، CA، USA) به دنبال دستورالعمل‌های سازنده انجام شد. پلاسمیدهای طعمه و طعمه همزمان به سویه مخمر Gold تبدیل شدند. فعل و انفعالات پروتئین-پروتئین بر اساس رشد بر روی محیط انحراف مضاعف SD (DDO، SD/-Trp-Leu) و محیط حذف چهارگانه SD (QDO، SD/-Trp-Leu-His-Ade) صفحات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

4.6. سنجش BiFC

برای تولید ساختارهای BiFC، بردارهای pUC-SPYNE و pUC-SPYCE با هضم با BamHI خطی شدند. CDSهای تمام طول MaCFEM85 و MsWAK16 هر کدام کلون شدند و با استفاده از یک آنزیم نوترکیب در پلاسمیدهای خطی شده قرار گرفتند تا ساختارهای MaCFEM85-YFPN و MsWAK16-YFPC به دست آید. پلاسمیدهای حاوی MaCFEM85 و MsWAK16 با بردارهای خالی به عنوان کنترل منفی (MaCFEM{10}}YFPN + pUC-SPYCE، MsWAK{13}}YFPC + pUC-SPYNE، و pUC-SPYNE + pUC-SPYNE) تبدیل شدند. . تمام ناقل ها از طریق تبدیل با واسطه Agrobacterium همانطور که در بالا توضیح داده شد به N. benthamiana وارد شدند. سیگنال های فلورسانس در سلول های اپیدرمی برگ با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال زایس LSM980 (کارل زایس، آلمان) مشاهده شد. آغازگرهای مورد استفاده برای ساخت وکتور در جدول تکمیلی S2 فهرست شده است.

4.7. سنجش GST Pull-Down

برای سنجش‌های کشویی GST، MsWAK16-ED در بردار pGEX-6P-2 و MaCFEM85 در pET-21b وارد شد. پروتئین های فیوژن خالص (GST- MsWAK{7}} ED) و pGEX{8}}P{9}} پروتئین بدون بار (GST) به عنوان پروتئین طعمه و pET خالص استفاده شد{11}} پروتئین فیوژن b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85) به عنوان طعمه مورد استفاده قرار گرفت. سنجش‌های کاهش‌دهنده GST با سیستم تصفیه پروتئین Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech، شانگهای، چین) طبق دستورالعمل‌های سازنده انجام شد. به طور خلاصه، Mag-Beads پنج بار با 1× سالین بافر فسفات (PBS، pH 7.4) شسته شد تا محافظ الکل آزاد شود و 10 میلی لیتر GST یا GST-MsWAK{24}}ED اضافه شد. دانه ها با وارونگی در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه مخلوط شدند. پس از حذف مایع رویی، Mag-Beads پنج بار با PBS 1 شسته شد. His-MaCFEM85 به Mag-Beads که قبلاً با GST متصل شده بود اضافه شد و مخلوط یک شبه در دمای 4◦C با چرخش انکوبه شد. سپس دانه ها پنج بار با 1× PBS شسته شدند تا پروتئین های متصل نشده حذف شوند. پس از آن، پروتئین های تثبیت شده بر روی دانه ها توسط SDS-PAGE جدا شدند، به یک غشای نیتروسلولزی (100 V، 1 ساعت) منتقل شدند و از طریق وسترن بلات آنالیز شدند. غشاها سه بار به مدت 10 دقیقه با PBS + Tween (PBST) شسته شدند. غشاها به مدت 2 ساعت در دمای اتاق با 5 درصد شیر بدون چربی مسدود شدند، سپس با آنتی بادی مونوکلونال موش ProteinFind anti-His (TransGen Biotech، پکن، چین) (رقیق شده 1:3000) یا آنتی بادی مونوکلونال ضد GST ProteinFind برای 2 انکوبه شدند. ساعت در 4 ◦C. سپس غشاها در آنتی بادی ProteinFind ضد خرگوش IgG(H+L) (HRP) (TransGen Biotech، پکن، چین) (رقیق شده 1:5000) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق غوطه ور شدند. غشاها با کیت وسترن بلات EasySee® (TransGen Biotech، پکن، چین) به دنبال دستورالعمل های سازنده مشاهده شدند.

4.8. شناسایی سایت کلید در MaCFEM85

برای تعیین اندازه مورد نیاز برای تعامل MaCFEM85 با MsWAK16، تقویت PCR برای تولید چندین اشکال کوتاه شده از MaCFEM85 انجام شد. دامنه CFEM (MaCFEM{3}}CFEM؛ aa residues 19-86) و پایانه C بدون دامنه CFEM (MaCFEM85-C، aa residues 87-170) در بردار درج شدند. pGBKT7 به عنوان پروتئین طعمه (جدول تکمیلی S1). پنج نوع دیگر با استفاده از سنتز پلی پپتیدی برای جهش سیستئین به آلانین در موقعیت های 26، 30، 43، 52 و 26/30/43/50/52/64/69/85 ساخته شد (∆CFEM8526، ∆CFEM8530، ∆43، ∆CFEM8 CFEM8552 و ∆CFEM858 به ترتیب). این گونه‌ها برای انجام آزمایش‌های Y2H با MsWAK{29}}ED استفاده شدند. سلول‌های مخمر تبدیل‌شده برای رشد بر روی صفحات SD/-Trp-Leu مصنوعی و صفحات SD/-Trp-Leu-His-Ade حاوی X{36}}Galactosidase (X{37}Gal) مورد سنجش قرار گرفتند.

4.9. سنجش مقاومت گیاهی

Myzus persicae از Henan Quanying Biological Co., Ltd. یک هفته قبل از شروع آزمایشات زیستی، 150 شته بالغ روی سه گیاه N. benthamiana (50 شته در هر بوته) قرار گرفتند. پس از 72 ساعت، تمام حشرات بالغ با یک برس نرم هنرمند خارج شدند و پوره ها به مدت 4 روز دیگر اجازه دادند قبل از انتقال به N. benthamiana برای سنجش عملکرد شته ها تغذیه کنند.

4.10. سنجش عملکرد شته

نیکوتیانا بنتامیانا دومین. (Solanales: Solanaceae) برای ارزیابی عملکرد M. persicae، مقاومت به بیماری گیاهی در برابر B. cinerea و بیان ژن‌های مرتبط با هورمون استفاده شد. اگروباکتریوم حامل pYBA-eGFP، pYBA-MaCFEM85، pYBA-MsWAK16، یا pYBA-MaCFEM{7}}pYBA-MsWAK16 در LB همراه با آنتی بیوتیک مناسب به مدت 36 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد رشد کردند. سلول ها سه بار شسته شدند، سپس در بافر نفوذ (1{19}} میلی مولار MgCl2، 10 میلی مولار MES، و 100 میکرومولار استوسیرینگون، pH 5.6) مجدداً به OD600 0.6 معلق شدند. برای عفونت همزمان، باکتری های حامل MaCFEM85 و MsWAK16 به OD600 1.2 تنظیم شدند و سپس در حجم های مساوی مخلوط شدند. برگ‌های کاملاً منبسط شده با استفاده از سرنگ‌های بدون سوزن 1- میلی‌لیتر با باکتری نفوذ کردند. روی هر بوته سه برگ نفوذ کرد و هر تیمار روی سه بوته در مجموع 12 بوته در هر آزمایش اعمال شد.

برای سنجش عملکرد شته، 12 ساعت پس از استفاده از آگروباکتریوم، 20 شته بالغ در ناحیه نفوذی هر برگ اعمال شد. شته ها با استفاده از قفس های گیره ای به قطر 5 میلی متر محصور شدند. هر درمان پنج بار تکرار شد. مرگ و میر شته بالغ و تعداد پوره های تازه تخمگذاری شده روزانه به مدت سه روز ثبت شد. B. cinerea به مدت پنج روز در روز PDAY کشت داده شد. در 12 ساعت پس از نفوذ آگروباکتریوم، B. cinerea تازه کشت شده در یک کیک قارچ 5- میلی‌متری پانچ شد و سطح رشد میسلیوم به ناحیه نفوذ در سطح برگ متصل شد. برای تسهیل توسعه بیماری، گیاهان با پوشاندن آنها با لایه پلاستیکی در سینی‌هایی در دمای 22 درجه سانتیگراد مرطوب نگه داشته شدند تا پیشرفت بیماری تسهیل شود. پس از 48 ساعت، پیشرفت بیماری در برگ های تلقیح شده با اندازه گیری اندازه ضایعه برآورد شد. برای تعیین کمیت بیان نسبی ژن‌های مربوطه، سه برگ نفوذ شده از هر گیاه 12 ساعت پس از نفوذ جمع‌آوری شد، سپس در نیتروژن مایع منجمد شد و در دمای 80- درجه نگهداری شد. استخراج RNA کل، سنتز cDNA و qRT-PCR همانطور که در بخش 3.2 توضیح داده شد انجام شد. اسید سالیسیلیک (SA)، اسید جاسمونیک (JA)، و سطوح فلاونوئید در 15 برگ N. benthamiana فیلتر شده در هر تیمار اندازه‌گیری شد. برگ ها جمع آوری شده، در نیتروژن مایع منجمد شده، سپس در دمای 80- درجه نگهداری شدند. هورمون های گیاهی با استفاده از کیت های الایزای اسید سالی سیکلیک گیاهی و کیت های الایزای اسید جاسمونیک گیاهی (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) و فلاونوئیدها با استفاده از کیت سنجش فلاونوئیدهای میکرو گیاهی (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) اندازه گیری شدند. دستورالعمل سازنده

4.11. تحلیل آماری

داده‌ها در نرم‌افزار SPSS نسخه 2{1}} تجزیه و تحلیل شدند.{7}}. تفاوت معنی داری در سطوح بیان MaCFEM85 و MsWAK16 با استفاده از آزمون t-test تعیین شد. تفاوت معنی داری در سطوح SA، JA و فلاونوئیدها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون چند دامنه ای دانکن با آستانه 05/0p< تعیین شد.

5. نتیجه گیری ها

در این مطالعه، ما یک پروتئین ترشح شده جدید، MaCFEM85، را در M. anisopliae شناسایی و مشخص کردیم. مشخص شد که این یک عامل حفاظت شده است که می تواند با MsWAK16 تعامل داشته باشد و پاسخ دفاعی N. benthamiana را فعال کند. ما نشان دادیم که دامنه CFEM و باقیمانده سیستئین در موقعیت 52 در MaCFEM85 برای تعامل حیاتی بودند. این تعامل ممکن است پاسخ های ایمنی مرتبط با JA و مکانیسم های مقاوم به بیماری و مقاوم در برابر حشرات را در گیاه فعال کند.

منابع

1. پائولوچی، NS; Anta، GG; گالاراتو، لس آنجلس؛ Vicario، JC; سزاری، AB; Reguera، YB; کیلموری، سی. بوئنو، MA; گارسیا، مگابایت؛ داردانلی، MS مشارکت گیاهی و میکروبی: پیامدهایی برای رشد و سلامت گیاه. در همزیستی میکروب گیاهی: مبانی و پیشرفت ها. Springer: برلین/هایدلبرگ، آلمان، 2013; صص 105-117. [CrossRef]

2. Schenk، PM; Carvalhais, LC; کازان، ک. بازگشایی برهمکنش‌های گیاه – میکروب: آیا رونویسی چند گونه می‌تواند کمک کند؟ روند بیوتکنول. 2012، 30، 177-184. [CrossRef]

3. ساسه، ج. مارتینویا، ای. نورتن، تی. به دوستان خود غذا دهید: آیا ترشحات گیاهی میکروبیوم ریشه را شکل می دهند؟ Trends Plant Sci. 2018، 23، 25-41. [CrossRef]

4. لوگتنبرگ، بی. کامیلوا، F. ریزوباکتری های محرک رشد گیاه. آنو. Rev. Microbiol. 2009، 63، 541-556. [CrossRef]

5. شورش، م. هارمن، جنرال الکتریک؛ مستوری، ف. مقاومت سیستمیک القاء شده و پاسخ گیاه به عوامل کنترل بیولوژیک قارچی. آنو. کشیش فیتوپاتول. 2010، 48، 21-43. [CrossRef]

6. van de Mortel, JE; de Vos، RC; دکرز، ای. پیندا، ا. گیلود، ال. Bouwmeester، KJ; ون لون، جی. دیک، ام. Raaijmakers، JM تغییرات متابولیک و ترانویسی ناشی از آرابیدوپسیس توسط ریزوباکتریوم سودوموناس فلورسنس SS101. فیزیول گیاهی 2012، 160، 2173-2188. [CrossRef]

7. لارین، ا. برتون، اف. Schafer, P. ارتباط ریشه و میکروب گیاه در شکل دادن به میکروبیوم های ریشه. گیاه مول. Biol. 2016، 90، 575-587. [CrossRef]

8. ساسان، ر.ک. Bidochka، MJ قارچ بیماری زا حشره Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) نیز یک اندوفیت است که رشد ریشه گیاه را تحریک می کند. صبح. جی. بات. 2012، 99، 101-107. [CrossRef]

9. ساسان، ر.ک. Bidochka، MJ تضاد قارچ بیماریزا حشره اندوفیت Metarhizium robertsii در برابر پاتوژن گیاه لوبیا Fusarium solanif. sp. فازولی می توان. جی. پاتول گیاهی. 2013، 35، 288-293. [CrossRef]

10. احمد، ط. Jiménez-Gasco، MdM; لوث، دی.اس. Shakeel، SN; Barbercheck، ME Endophytic Metarhizium robertsii رشد ذرت را تقویت می کند، رشد حشرات را سرکوب می کند و بیان ژن دفاعی گیاه را تغییر می دهد. Biol. Control 2020, 144, 104167. [CrossRef]

11. چایرین، تی. Petcharat، V. القای پاسخ های دفاعی در میوه هنگ کنگ (Aglaia dookkoo Griff.) در برابر قارچ های پوسیدگی میوه توسط Metarhizium guizhouense. Biol. کنترل 2017، 111، 40-44. [CrossRef]

12. هائو، ک. وانگ، اف. نونگ، ایکس. مک نیل، MR; لیو، اس. وانگ، جی. کائو، جی. Zhang, Z. پاسخ ریشه های بادام زمینی Arachis hypogaea به حضور قارچ های مفید و بیماری زا با تجزیه و تحلیل رونوشت. علمی Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. پاتل، ز.ام. ماهاپاترا، آر. Jampala، SSM فصل 11-نقش تحریک کننده قارچ در مکانیسم دفاعی گیاه. در جنبه های مولکولی میکروب های مفید گیاهی در کشاورزی. شرما، وی، سلوان، ر.، العانی، ل.، ویراستار. مطبوعات دانشگاهی: کمبریج، MA، ایالات متحده آمریکا، 2020؛ صص 143-158. [CrossRef]

14. دونگ، ایکس. Sa، JA اتیلن، و مقاومت به بیماری در گیاهان. Curr. نظر. گیاه بیول. 1998، 1، 316-323. [CrossRef] [PubMed]

15. توما، BP; اگرمونت، ک. Penninckx، IA; مائوچ مانی، بی. وگلسنگ، آر. Cammue، BP; Broekaert، WF مسیرهای پاسخ دفاعی وابسته به جاسمونات و وابسته به سالیسیلات جدا در آرابیدوپسیس برای مقاومت در برابر پاتوژن‌های میکروبی متمایز ضروری هستند. Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا 1998، 95، 15107-15111. [CrossRef] [PubMed]

16. شلوار، SR; ایریگوین، اس. لیو، جی. بدره، ر. کریستنسن، SA; اشملز، EA; سدبروک، جی سی. Scholthof, K.-BG; مندادی، KK Brachypodium فنیل آلانین آمونیاک لیاز (PAL) دفاع ضد ویروسی در برابر ویروس موزاییک پانیکوم و ماهواره های آن را ارتقا می دهد. mBio 2021, 12, e{4}}. [CrossRef]

17. لیو، آر. خو، اس. لی، جی. هو، ی. Lin, Z. نمایه بیان یک ژن PAL از Astragalus membranaceus var. Mongholicus و نقش مهم آن در شار به بیوسنتز فلاونوئید Plant Cell Rep. 2006, 25, 705-710. [CrossRef]

18. د گایتر، ن. غلامی، ع. گورماختیگ، اس. Goossens, A. ماشین‌های رونویسی در متابولیسم ثانویه گیاهی استخراج‌شده توسط جاسمونات. Trends Plant Sci. 2012، 17، 349-359. [CrossRef]

19. میرجلیلی، ن. اثرات ترکیب فاز گاز لیندن، JC بر روی کشت سوسپانسیون Taxus cuspidata. بیوتکنول. Bioeng. 1995، 48، 123-132. [CrossRef]

20. Li, ST; ژانگ، پی. ژانگ، ام. فو، CH; ژائو، سی اف. دونگ، YS؛ Guo، AY; Yu, LJ نمایه رونویسی سلولهای تاکسوس چیننسیس در پاسخ به متیل جاسمونات. BMC Genom. 2012، 13، 295. [CrossRef]

21. توگیزیمانا، ف. Ncube، EN؛ Steenkamp، PA; Dubery، بینش های مشتق شده از IA Metabolomics در مورد دستکاری سنتز ترپنوئید در سلول های Centella asiatica توسط متیل جاسمونات. بیوتکنول گیاهی Rep. 2015, 9, 125-136. [CrossRef]

22. لو، م. وونگ، اچ. Teng, W. اثرات استخراج بر تولید ساپونین در کشت سلولی Panax ginseng. سلول گیاهی، 2001، 20، 674-677. [CrossRef]

23. ماندال، س. کار، آی. موکرجی، AK; پاسخ‌های دفاعی ناشی از Acharya، P. Elicitor در Solanum lycopersicum در برابر Ralstonia solanacearum. علمی World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. لی، ال. وانگ، اس. یانگ، ایکس. فرانسیس، اف. Qiu، D. استخراج کننده پروتئین PeaT1 باعث افزایش مقاومت در برابر شته (Sitobion avenae) در گندم شد. آفت مناگ. علمی 2020، 76، 236-243. [CrossRef] [PubMed]

25. Bujalowski، W. گسترش نقش فیزیولوژیکی هلیکاز DnaB هگزامریک. Trends Biochem. علمی 2003، 28، 116-118. [CrossRef]

26. وکنین، ی. شادچان، ی. لودانسکی، ای. موروزوف، م. رومانو، جی. Osherov، N. سه پروتئین Aspergillus fumigatus CFEM دامنه CFEM (CfmA-C) بر پایداری دیواره سلولی تأثیر می‌گذارند اما نقشی در حدت قارچی ندارند. قارچی. ژنت Biol. 2014، 63، 55-64. [CrossRef]

27. ژائو، اس. شانگ، ایکس. بی، دبلیو. یو، ایکس. لیو، دی. کانگ، ز. وانگ، ایکس. Wang, X. ژنوم گسترده شناسایی کاندیداهای اثرگذار با نقوش حفاظت شده از قارچ زنگ برگ گندم Puccinia triticina. جلو. میکروبیول. 2020، 11، 1188. [CrossRef]

28. گونگ، ا. جینگ، ز. ژانگ، ک. تان، Q. وانگ، جی. لیو، W. تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک و خصوصیات عملکردی پروتئین های CFEM در قارچ آنتراکنوز ذرت Colletotrichum graminicola. جی. اینتگر. کشاورزی 2020، 19، 541-550. [CrossRef]

29. مارتین، اف. Aerts، A.; اهرن، دی. برون، آ. دانچین، EG; دوشاوسوی، اف. گیبون، جی. کوهلر، ا. لیندکویست، ای. پردا، وی. و همکاران ژنوم Laccaria bicolor بینش هایی را در مورد همزیستی میکوریزا ارائه می دهد. طبیعت 2008، 452، 88-92. [CrossRef]

30. استفان، وی. قارچ‌های حشره‌زای بیماری‌زای لارا، RJ به‌عنوان اندوفیت: برهم‌کنش‌های گیاه-اندوفیت-گیاهخوار و چشم‌انداز استفاده در کنترل بیولوژیکی. Curr. علمی 2015، 109، 46-54.

31. کای، ن. لیو، آر. یان، دی. ژانگ، ن. زو، ک. ژانگ، دی. نونگ، ایکس. تو، ایکس. ژانگ، ز. وانگ، جی. تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک و خصوصیات عملکردی پروتئین های CFEM Metarhizium anisopliae. J. قارچ. 2022, 8, 661. [CrossRef]

32. استفنز، سی. Hammond-Kosack، KE; و Kanyuka، K. WAKsing ایمنی گیاهی، بیماری های در حال کاهش. J. Exp. Bot 2022, 73, 22-37. [CrossRef]

33. ژانگ، ZN; وو، QY; ژانگ، جی.زی. زو، YY; مورفی، RW; لیو، ز. Zou، CG تجزیه و تحلیل سیستماتیک منحصر به فرد و منشاء دامنه CFEM در قارچ ها را نشان می دهد. علمی Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. نیش، ا. گائو، اچ. ژانگ، ن. ژنگ، ایکس. کیو، اس. لی، ی. ژو، اس. کوی، اف. Sun، W. یک ژن موثر جدید SCRE2 به حدت کامل Ustilaginoidea virens به برنج کمک می کند. جلو. میکروبیول. 2019، 10، 845. [CrossRef] [PubMed]

35. زو، دبلیو. وی، دبلیو. وو، ی. ژو، ی. پنگ، اف. ژانگ، اس. چن، پی. Xu, X. BcCFEM1، یک پروتئین حاوی دامنه CFEM با سایت لنگر GPI فرضی، در بیماریزایی، تولید کندی و تحمل استرس در Botrytis cinerea نقش دارد. جلو. میکروبیول. 2017، 8، 1807. [CrossRef]

36. خو، ایکس. لی، جی. لی، ال. سو، ز. Chen, C. تجزیه و تحلیل مقایسه ای ژنومی گیرنده های احتمالی مرتبط با پروتئین G مرتبط با Pth11- در قارچ های متعلق به Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017، 17، 166. [CrossRef] [PubMed]

37. پنگ، YJ; هو، جی. ژانگ، اچ. لی، جی اچ. Lin, HY; دینگ، جی ال. فنگ، ام جی؛ یینگ، SH مشارکت سیستماتیک دامنه CFEM حاوی پروتئین در اکتساب آهن برای تعامل بین گونه ای قارچ بیماری زا رشته ای Beauveria bassiana ضروری است. محیط زیست میکروبیول. 2022، 24، 3693-3704. [CrossRef] [PubMed]

38. روی، یو. Kornitzer، D. اکتساب آهن هِم در قارچ. Curr. نظر. میکروبیول. 2019، 52، 77–83. [CrossRef] [PubMed]

39. اوکاموتو-شیبایاما، ک. کیکوچی، ی. کوکوبو، ای. ساتو، ی. Ishihara، K. Csa2، عضوی از خانواده پروتئین Rbt5، در استفاده از آهن از هموگلوبین انسانی در طول رشد هیف کاندیدا آلبیکنس نقش دارد. FEMS Yeast Res. 2014، 14، 674-677. [CrossRef]

40. پرز، ا. پدروس، بی. مورگی، ا. کازانووا، ام. لوپز-ریبات، جی ال. مارتینز، JP تشکیل بیوفیلم توسط جهش‌یافته‌های کاندیدا آلبیکنس برای ژن‌های کدکننده پروتئین‌های قارچی که دامنه CFEM حاوی هشت سیستئین را نشان می‌دهند. FEMS Yeast Res. 2006، 6، 1074-1084. [CrossRef]

41. Hogg، PJ دی سولفید باند به عنوان سوئیچ برای عملکرد پروتئین. Trends Biochem. علمی 2003، 28، 210-214. [CrossRef]

42. ون دن بورگ، HA; وسترینک، ن. فرانسویس، کی جی. راث، آر. ووستنک، ای. بورن، اس. د ویت، پی جی; Joosten، MH; Vervoort، J. جهش یافته با پیوند دی سولفید طبیعی AVR4 پاتوژن گوجه فرنگی Cladosporium fulvum به پروتئولیز حساس هستند، مقاومت واسطه شده Cf{3}}را دور می زنند، اما توانایی اتصال به کیتین خود را حفظ می کنند. جی بیول. شیمی. 2003، 278، 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; کائو، جی. ژانگ، جی. شیا، اف. که، ی. ژانگ، اچ. زی، دبلیو. لیو، اچ. کوی، ی. کائو، ی. و همکاران بهبود صفات زراعی متعدد توسط یک ژن مقاومت به بیماری از طریق تقویت دیواره سلولی نات. Plants 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. سایتوح، ح. فوجیساوا، اس. میتسوکا، سی. ایتو، ا. هیرابوچی، ا. ایکدا، ک. ایریدا، اچ. یوشینو، ک. یوشیدا، ک. ماتسومورا، اچ. و همکاران اختلال ژن در مقیاس بزرگ در Magnaporthe oryzae، MC69 را شناسایی می‌کند، یک پروتئین ترشح شده برای عفونت توسط پاتوژن‌های قارچی تک لپه‌ای و دو لپه‌ای. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]

45. کولکارنی، RD; کلکار، HS; Dean, R. یک دامنه CFEM حاوی هشت سیستئین منحصر به فرد برای گروهی از پروتئین های غشای قارچی. Trends Biochem. علمی 2013، 28، 118-121. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​پنگ، ج. وو، ال. ژانگ، دبلیو. ژانگ، Q. زینگ، کیو. وانگ، ایکس. لی، ایکس. Yan, J. شناسایی سیستمیک و خصوصیات عملکردی رایج در پروتئین های غشای خارج سلولی قارچی در Lasiodiplodia theobromae. جلو. علوم گیاهی 2021, 12, 804696. [CrossRef]

47. باری، ر. جونز، JD نقش هورمون های گیاهی در پاسخ های دفاعی گیاه. گیاه مول. Biol. 2009، 69، 473-488. [CrossRef]

48. ورما، وی. راویندران، پ. تنظیم پاسخ های استرس با واسطه هورمونی گیاهی کومار، PP. BMC Plant Biol. 2016، 16، 86. [CrossRef]

49. جاوید، ک. Qiu, D. استخراج کننده پروتئین PeBL1 Brevibacillus laterosporus مقاومت در برابر Myzus persicae در گوجه فرنگی را افزایش می دهد. Pathogens 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. بسیت، ع. حنان، ع. نذیر، ت. مجید، MZ; Qiu, D. خصوصیات مولکولی و عملکردی استخراج کننده PeBC1 استخراج شده از Botrytis cinerea در القای مقاومت در برابر شته هلو سبز (Myzus persicae) در لوبیا معمولی (Phaseolus vulgaris L.). Insects 2019, 10, 35. [CrossRef]

51. نظیر، ت. حنان، ع. بسیت، ا. مجید، MZ; انور، ت. نواز، من. Qiu, D. نقش احتمالی یک استخراج کننده پروتئین PeBb1 هنوز مشخص نشده که از سویه Beauveria bassiana ARSEF 2860 در برابر Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) در Brassica rapa ssp. pekinensis Pathogens 2020, 9, 111. [CrossRef]

52. اسپول، ش. کورنیف، ا. Claessens, SM; کورزلیوس، جی پی؛ ون پلت، جی. مولر، ام جی. بوچالا، ای جی; Metraux، JP; براون، آر. کازان، ک. و همکاران NPR1 گفتگوی متقابل بین مسیرهای دفاعی وابسته به سالیسیلات و جاسمونات را از طریق یک عملکرد جدید در سیتوزول تعدیل می کند. سلول گیاهی 2003، 15، 760-770. [CrossRef]

53. Xin، XF; او، SY Pseudomonas syringae pv. گوجه فرنگی DC3000: یک پاتوژن مدل برای بررسی حساسیت بیماری و سیگنال دهی هورمونی در گیاهان. آنو. کشیش فیتوپاتول. 2013، 51، 473-498. [CrossRef] [PubMed]

54. ژانگ، ایکس. وانگ، سی. ژانگ، ی. سان، ی. Mou, Z. زیرواحد کمپلکس واسطه آرابیدوپسیس 16 به طور مثبت مقاومت اکتسابی سیستمیک با واسطه سالیسیلات و مسیرهای دفاعی ناشی از جاسمونات/اتیلن را تنظیم می کند. سلول گیاهی 2012، 24، 4294-4309. [CrossRef] [PubMed]

55. Doares, SH; ناروائز واسکز، ج. کونکونی، ا. Ryan, CA اسید سالیسیلیک از سنتز مهارکننده های پروتئیناز در برگ های گوجه فرنگی ناشی از سیستمین و اسید جاسمونیک جلوگیری می کند. فیزیول گیاهی 1995، 108، 1741-1746. [CrossRef] [PubMed]

56. پیترز، سی ام; لئون-ریس، آ. ون در انت، اس. Van Wees، SC شبکه‌سازی توسط هورمون‌های مولکولی کوچک در ایمنی گیاه. نات. شیمی. Biol. 2009، 5، 308-316. [CrossRef]

57. Penninckx، IA; توما، BP; بوچالا، ع. Métraux، JP; Broekaert، WF فعالسازی همزمان مسیرهای پاسخ جاسمونات و اتیلن برای القای ژن دیفنسین گیاهی در Arabidopsis مورد نیاز است. سلول گیاهی 1998، 10، 2103-2113. [CrossRef]

58. نیش، دبلیو. Bidochka، MJ بیان ژن های دخیل در جوانه زنی، کونیدیوژنز و پاتوژنز در Metarhizium anisopliae با استفاده از RT-PCR زمان واقعی کمی. مایکول. Res. 2006، 110، 1165-1171. [CrossRef]

59. گوریرو، جی. لیگای، اس. بیان ژن سنتاز سلولز هاسمن، JF یونجه تحت استرس غیرزیستی: راهنمای هیچ‌چیکر برای عادی‌سازی RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]

60. یانگ، ی. ژانگ، ی. لی، بی. یانگ، ایکس. دونگ، ی. Qiu, D. A Verticillium dahliae pectate lyase پاسخ ایمنی گیاه را القا می کند و به حدت کمک می کند. جلو. علوم گیاهی 2018، 9، 1271. [CrossRef]

61. لیواک، کج; Schmittgen، TD تجزیه و تحلیل داده های بیان ژن نسبی با استفاده از PCR کمی زمان واقعی و روش 2 (-Delta C(T)). Methods 2001, 25, 402-408. [CrossRef]