وضعیت فعلی محافظت عصبی در بیماری مادرزادی قلب قسمت 1

خلاصه:

وجود DNA نابجا در سیتوپلاسم باعث التهاب و مرگ سلولی می شود. به طور گسترده گزارش شده است که نشت DNA هسته ای به سیتوپلاسم را می توان عمدتاً توسط سیکلیک GMP-AMP سنتاز (cGAS) حس کرد.

DNA مولکولی است که اطلاعات ژنتیکی هر فرد را مشخص می کند و در هر یک از سلول های ما یافت می شود. تحقیقات اخیر نشان می دهد که DNA می تواند از طریق مسیرهای خاصی به سیتوپلاسم نشت کند و بر حافظه ما تأثیر بگذارد.

این پدیده در افراد مسن و افراد دارای اختلال شناختی رایج است. هنگامی که DNA به داخل سیتوپلاسم نشت می کند، با عملکردهای طبیعی درون سلول تداخل می کند و خطر از دست دادن حافظه و اختلال شناختی را افزایش می دهد.

با این حال، لازم نیست در این مورد احساس افسردگی و ناامیدی کنیم. راه های زیادی برای بهبود حافظه و توانایی های شناختی وجود دارد که به ما کمک می کند مغزی سالم داشته باشیم.

ابتدا باید سبک زندگی سالمی داشته باشید. این شامل خوردن یک رژیم غذایی متعادل، خواب کافی، ورزش متوسط ​​و کاهش استرس است. این شیوه‌ها سلامت مغز را ارتقا می‌دهند، در نتیجه از نشت DNA جلوگیری می‌کنند و حافظه را بهبود می‌بخشند.

ثانیاً آموزش شناختی لازم است. این می‌تواند شامل بازی‌های ریاضی، خواندن، یادگیری مهارت‌های جدید و غیره باشد. این فعالیت‌ها می‌توانند به تحریک مغز و ترویج نوروژنز برای جلوگیری از نشت DNA کمک کنند.

در نهایت، نگرش مثبت خود را حفظ کنید. بی ثباتی عاطفی و استرس بیش از حد می تواند باعث تغییراتی در شیمی مغز شود که نشت DNA را افزایش می دهد. بنابراین، ما باید یاد بگیریم که با چالش های زندگی مثبت روبرو شویم و نگرش خوش بینانه را حفظ کنیم.

به طور خلاصه، اگرچه نشت DNA به سیتوپلاسم ممکن است بر حافظه تأثیر بگذارد، اما ما می‌توانیم سلامت مغز را بهبود بخشیم، از نشت DNA جلوگیری کنیم و در نهایت حافظه خود را با اتخاذ سبک زندگی مناسب، درگیر شدن در آموزش شناختی و حفظ ذهنیت مثبت بهبود ببخشیم. حافظه و توانایی های شناختی. مشاهده می شود که ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانچ دسرتیکولا می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد زیرا سیستانچ دسرتیکولا یک ماده دارویی سنتی چینی است که اثرات منحصر به فرد زیادی دارد که یکی از آنها بهبود حافظه است. اثربخشی سیستانش دسرتیکولا از ترکیبات فعال متعددی که شامل تانیک اسید، پلی ساکاریدها، گلیکوزیدهای فلاونوئید و غیره است، ناشی می شود. این مواد می توانند سلامت مغز را از طریق مسیرهای مختلف ارتقا دهند.

روی 10 روش برای بهبود حافظه کلیک کنید

اخیراً گزارش دادیم که DNA دو رشته‌ای سیتوپلاسمی مشتق از میتوکندری (dsDNA) که از تخریب لیزوزومی فرار کرده است باعث ایجاد سمیت سلولی قابل توجهی در سلول‌های کشت‌شده و در داخل بدن می‌شود. فرض بر این است که DNA میتوکندری سیتوپلاسمی در بیماری ها و اختلالات مختلف دخیل است و مقالات بیشتری در تایید این موضوع منتشر شده است. از سوی دیگر، روش فعلی برای ارزیابی DNA میتوکندری در سیتوپلاسم ممکن است کمی نباشد.

در اینجا، ما به طور مفصل روشی را برای ارزیابی سلول‌های DNA میتوکندری نابجا معرفی می‌کنیم. این روش در تحقیقات پایه و همچنین در مطالعه پیری، بیماری پارکینسون، بیماری آلزایمر، نارسایی قلبی، بیماری های خودایمنی، سرطان و سایر شرایط مفید است.

کلمات کلیدی: DNA نابجا. DNA میتوکندری؛ فاکتور رونویسی میتوکندری A (TFAM)؛ بیماری پارکینسون.

1. معرفی

DNA حاوی اطلاعات مهمی برای بقا و وراثت است و باید در برابر عوامل استرس زای مختلف از جمله اکسیدان ها و جهش زاها محافظت شود. سلول های یوکاریوتی حاوی میتوکندری هستند که به همراه تعداد زیادی از گونه های اکسیژن فعال از طریق تنفس هوازی انرژی تولید می کنند.

بنابراین، در سلول یوکاریوتی، DNA در هسته یا میتوکندری، به ترتیب در داخل غشای هسته یا غشای میتوکندری وجود دارد. با این حال، DNA می تواند تحت شرایط خاصی در سیتوپلاسم وجود داشته باشد، مانند عفونت های ویروسی یا غیر ویروسی [1- 4].

حتی در برخی شرایط غیر عفونی (به عنوان مثال، پیری یا اختلالات مرتبط با سن یا سرطان)، DNA ممکن است از هسته یا میتوکندری به داخل سیتوپلاسم نشت کند [5-7].

DNA در سیتوپلاسم می تواند برای سلول ها التهابی و سمی باشد. به طور گسترده گزارش شده است که نشت DNA هسته ای به سیتوپلاسم باعث التهاب، سمیت سلولی و فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری (SASP) می شود، عمدتاً از طریق محرک چرخه ای GMP-AMP سنتاز (cGAS) مسیر ژن های اینترفرون (STING). 5،6].

ما اخیراً گزارش دادیم که DNA دو رشته‌ای سیتوزولی (dsDNA) با منشأ میتوکندریایی که از تخریب لیزوزومی فرار می‌کند، باعث ایجاد سمیت سلولی و تخریب عصبی در مدل‌های سلولی بیماری پارکینسون می‌شود [8]. افزایش حضور در چنین DNA نابجا اغلب با تصاویر میکروسکوپی و شواهد شرایطی نشان داده شد، نه با افزایش خود نشت DNA.

انتظار می رود که ارزیابی این DNA نابجا نه تنها برای تحقیقات پایه بلکه برای تحقیقات در مورد پیری و سایر بیماری ها مانند بیماری پارکینسون، بیماری آلزایمر، اسکلروز جانبی آمیوتروفیک، نارسایی قلبی، بیماری های خودایمنی، دیابت، اهمیت بیشتری پیدا کند. استئاتوهپاتیت غیر الکلی (NASH) و سرطان ها. گزارش شده است که مسیر cGAS-STING نه تنها در پیری، بلکه در پاتوژنز این بیماری ها نیز بسیار مهم است [8-17].

احتمالاً به دلیل شرایط اکسیداتیو اطراف میتوکندری و فقدان یک سیستم کارآمد ترمیم DNA برای DNA میتوکندری، DNA میتوکندری بسیار بیشتر از DNA هسته ای در معرض جهش یا آسیب است [18،19].

برخلاف DNA هسته ای، DNA میتوکندری در چندین نسخه در یک سلول وجود دارد و در صورت نیاز سنتز می شود. بنابراین، DNA میتوکندری ممکن است شانس بیشتری برای نشت به داخل سیتوپلاسم در طول پیری یا در شرایط بدخیم مانند اختلالات مرتبط با افزایش سن، اختلال عملکرد میتوکندری داشته باشد. ، یا سرطان ها

تشخیص و اندازه گیری چنین DNA سیتوپلاسمی میتوکندریایی می تواند در درک پاتوژنز بیماری های مختلف و پیری مهم باشد و می تواند به یک نشانگر زیستی و یک هدف درمانی تبدیل شود.

یک روش نیمه کمی برای ارزیابی نشت DNA میتوکندری نابجا به داخل سیتوپلاسم ایجاد کردیم، و در اینجا روش را به تفصیل شرح می دهیم. این مقاله ارزیابی عینی نشت DNA میتوکندری را امکان پذیر می کند و در مطالعه پاتولوژی های مختلف بیماری مفید است.

2. مواد و روشها

2.1. خطوط سلولی، درمان siRNA و تجزیه و تحلیل کمی PCR (qPCR).

سلول‌های HeLa از سلول‌های سرطان دهانه رحم از یک بیمار زن (ATCC,CCL-2) مشتق شدند. سلول‌های HeLa در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تحت 5 درصد CO2 در محیط Eagle Modified Dulbecco (DMEM) (Nacalai Tesque، کیوتو، ژاپن) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (Biowest، Nuaillé، فرانسه) و محلول پنی‌سیلین-استرپتومایسین (محلول پنی‌سیلین-استرپتومایسین) کشت داده شدند. 100 واحد در میلی لیتر پنی سیلین G و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین سولفات، واکو، اوزاکا، ژاپن).

یک روز قبل از ترانسفکشن، سلول‌های HeLa با تراکم 600 سلول در میکرولیتر کاشته شدند. بیان ژن‌های مورد علاقه در سلول‌های HeLa با استفاده از Stealth RNAi siRNA خاموش شد (فاکتور رونویسی میتوکندری A، TFAM: HSS144251، گلوکوسربروزیداز، GBA: HSS178140، Thermo FisherScientific، Waltham، MA، ایالات متحده) در LipofectiaXernateScientificaXernA. دستورالعمل سازنده (غلظت نهایی RNA 10 نانومولار).

سه روز پس از حذف siRNA، RNA سلولی کل با استفاده از TRIzolreagent طبق دستورالعمل سازنده (Thermo Fisher Scientific) جدا شد. الگوهای cDNA از RNA خالص شده با استفاده از کیت سنتز ProtoScript II First StrandcDNA (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) با پرایمرهای oligo (dT)20 سنتز شدند. qPCR با استفاده از TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusat) انجام شد. ، ژاپن) و در یک تاس Cycler Thermal Cycler Dice System Lite (Takara Bio) تجزیه و تحلیل شد. پرایمرهای PCR مورد استفاده در این مطالعه عبارت بودند از GBA فوروارد (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC)، GBA معکوس (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC)، TFAM فوروارد (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC)، TFAM معکوس (GCATCTGGGTCTGAGCTTTTA)، گلیسرالدئیدرالدئیدرالدهید (GCATCTGGGGTTCTGAGCTTTA) ATCATCAGCA)، و GAPDH معکوس (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism نسخه 9.3.1 (نرم افزار GraphPad, San Diego, CA, USA) انجام شد. برای مقایسه میانگین های حسابی بین دو گروه از آزمون t دو طرفه Student استفاده شد. داده ها به عنوان میانگین و ± خطاهای استاندارد میانگین ارائه می شوند.

2.2. تشخیص ایمونوفلورسانس DNA میتوکندری نابجا و تجزیه و تحلیل تصویر

یک روز قبل از ترانسفکشن، سلول‌های HeLa با تراکم 600 سلول در میکرولیتر کاشته شدند. بیان ژن‌های مورد علاقه در سلول‌های HeLa با استفاده از Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) در معرف ترانسفکشن Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) خاموش شد. دستورالعمل سازنده (غلظت RNA نهایی 10 نانومولار).

سه روز پس از حذف siRNA، سلول‌ها تحت رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس قرار گرفتند. برای تشخیص DNA میتوکندری، آنتی بادی ضد dsDNA (Abcam, Cambridge, UK, clone 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 یا EMD Millipore, Billerica, MA, USA, clone AC{5}} , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) نسبت سیگنال به نویز بهتری نسبت به Hoechst 33258، DAPI یا Picogreen نشان داد. در اینجا ما سه آنتی بادی اولیه را ترکیب کردیم: آنتی بادی ضد dsDNA (35I9 DNA) (Abcam، Cat# ab27156، RRID: AB_470907)، آنتی بادی ضد هیستون-H2B (Abcam، Cat# ab134211)، و ضد گرما- آنتی بادی شوک-پروتئین{23}} (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

آنتی بادی های دیگر را می توان انتخاب کرد یا به صورت فلورسنت با هیستون برچسب گذاری شده است، یا می توان از Hsp60 به صورت جایگزین استفاده کرد، اما لازم است شرایط رنگ آمیزی سه گانه برای هر ترکیب بهینه شود.

سلول ها دو بار با سالین بافر فسفات (PBS) شسته شدند و با متانول سرد به مدت 1{9}} دقیقه در دمای 4 ◦C ثابت شدند. همچنین می توان از 4% پارافورمالدئید (PFA) برای تثبیت استفاده کرد، اما سیگنال های پس زمینه به نظر می رسد. در نمونه های ثابت شده با PFA بسیار بیشتر است. پس از تثبیت، سلول ها سه بار با سالین بافر فسفات با Tween 20 (PBST) به مدت 5 دقیقه شستشو داده شدند. سلول ها با PBS حاوی 0.2% (وزنی) Triton X{11}} به مدت 10 دقیقه نفوذ پذیر شدند.

پس از سه بار شستشو با PBST به مدت 5 دقیقه هر بار، سلول ها با 2% (w/v) آلبومین سرم گاوی (BSA) در PBST به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. سلول ها با یک آنتی بادی تک اولیه، آنتی بادی ضد هیستون-H2B (1/400، Abcam، Cat# ab134211) رقیق شده در 2% (w/v) BSA در PBST O/N در دمای 4◦C انکوبه شدند. پس از شستشوی سه بار با PBST به مدت 5 دقیقه هر بار، سلول‌ها با یک Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17}) انکوبه شدند. }}) در 2% (w/v) BSA در PBST به مدت 1 ساعت در دمای اتاق (RT) رقیق شده است.

پس از سه بار شستشو به مدت 5 دقیقه هر بار با PBST، سلول ها با آنتی بادی های اولیه و آنتی بادی anti-dsDNA (35I9 DNA) (1/800، Abcam، Cat# ab27156، RRID: AB_470907) و آنتی انکوبه شدند. آنتی بادی Hsp60 (1/400، Abcam، Cat# ab46798، RRID: AB{13}}) رقیق شده در 2% (w/v) BSA در PBST به مدت 1 ساعت در RT یا یک شبه (O/N) در 4◦C

پس از شستشوی سه بار با PBST به مدت 5 دقیقه در هر بار، سلول‌ها با فلور الکسا با جذب متقاطع بالا 680-کونژوگه الاغ ضد خرگوش IgG(H+L) (1/200، Thermo Fisher Scientific، Cat# A10043) انکوبه شدند. , RRID: AB_2534018) ​​و Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) رقیق شده در 2% (w/v) BSA در PBST به مدت 1 ساعت در RT.

سلول ها سه بار با PBST به مدت 5 دقیقه در هر بار شسته شدند و نمونه با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال A1R+ (Nikon، توکیو، ژاپن) آنالیز شد.

For more information:1950477648nn@gmail.com