القای ایمنی محیطی آموزش دیده در پانکراس فعالیت ضد توموری را برای کنترل پیشرفت سرطان پانکراس تحریک می کند قسمت 2

بحث

در حالی که قاچاق -گلوکان قبلاً مشخص شده است، گرایش خاص -گلوکان به لوزالمعده قبلاً گزارش نشده است. ما نشان می‌دهیم که ذرات -گلوکان می‌تواند مستقیماً به لوزالمعده منتقل شود و همچنین می‌تواند توسط ماکروفاژها فاگوسیتوز شود که سپس به پانکراس منتقل می‌شوند. رابطه بین حفره صفاق و پانکراس به خوبی تعریف نشده است، و مطالعات مربوط به پاتوفیزیولوژی پانکراتیت حاد (AP) مشخص کرده اند که ماکروفاژهای صفاقی عامل اصلی پاسخ التهابی در AP هستند، بنابراین از ارتباط بین صفاق حمایت می کنند. و پانکراس 38.

داده های تصویربرداری ما در واقع نشان می دهد که ماکروفاژهای صفاقی که WGP برچسب ایزوتوپی را فاگوسیتوز می کنند، عمدتاً به پانکراس می روند. مطالعات بر روی آسیب کبد بیشتر از این مدل از تبادل دینامیک سلول‌ها بین حفره صفاق و اندام‌های جامد که مستقل از گردش خون است حمایت کرده است. و حفره صفاقی که می تواند در محیط ذرات -گلوکان مورد استفاده قرار گیرد.

ماکروفاژها بخش مهمی از سیستم ایمنی ذاتی بدن انسان هستند و عملکردهای قدرتمندی در شناسایی، فاگوسیتاسیون و حذف باکتری ها و مواد خارجی دارند. پریودنتیت، یک بیماری عفونی مزمن که با التهاب لثه و از دست دادن استخوان آلوئول مشخص می شود، علت اصلی از دست دادن دندان در بزرگسالان است. اکنون مشخص شده است که تخریب بافت پریودنتیت ناشی از پاسخ ایمنی میزبان به عفونت است و ماکروفاژها به عنوان بخش مهمی از پاسخ ایمنی میزبان، نقش مهمی در بروز و توسعه التهاب دارند.

بنابراین، ما باید ایمنی را در زندگی روزمره خود تقویت کنیم. در تحقیقات خود متوجه شدیم که سیستانچ می تواند ایمنی را تقویت کند. افزودن سیستانچ به آب جوش برای تهیه چای سیستانچ و نوشیدن آن 1-2 بار در روز می تواند عملکرد ایمنی بدن را تقویت کند زیرا حاوی مواد فعالی مانند پلی ساکاریدها، فلاونوئیدها، آلکالوئیدها و غیره است که می تواند باعث بهبود عملکرد سیستم ایمنی بدن شود. عملکرد ایمنی بدن در عین حال، افزودن سیستانچ به سوپ یا فرنی، یک یا دو بار در هفته می تواند ایمنی را تقویت کند.

برای شناخت محصول سیستانچ خالص کلیک کنید

در حالی که این مطالعه ذرات -گلوکان WGP را بررسی می‌کند، ممکن است بررسی اینکه آیا گلوکان مشتق شده از مخمر محلول یک مکانیسم و ​​مکانیسم سیگنال دهی مشابه را در پانکراس نشان می‌دهد یا خیر، جالب باشد. مشخص شده است که ذرات -گلوکان مستقیماً از طریق دکتین سیگنال می‌دهند، در حالی که تصور می‌شود گلوکان‌های محلول از طریق یک مسیر وابسته به CR عمل می‌کنند تا خواص ضد توموری خود را اعمال کنند40،41. یک مطالعه نشان داد که تجویز IP گلوکان محلول منجر به قاچاق به خون محیطی و APCها در صفاق، طحال و مغز استخوان می شود، که نشان می دهد علیرغم مکانیسم های سیگنال دهی مولکولی مختلف، توانایی مشابهی برای فعال کردن ایمنی آموزش دیده ممکن است امکان پذیر باشد. با این حال، با توجه به اینکه داده‌های ما نشان می‌دهد که این قاچاق وابسته به دکتین-1 است، فقط ذرات -گلوکان ممکن است قاچاق مستقیم به لوزالمعده را از طریق ذرات و محلول نشان دهد و ممکن است مکانیسم‌های ایمنی آموزش دیده را آغاز کند.

بعلاوه، مطالعات قبلی که قاچاق گلوکان محلول تزریقی داخل وریدی را مشخص می‌کند، قاچاق به طحال، کلیه و کبد را نشان می‌دهد، هرچند اشاره‌ای به تروپیسم به پانکراس نشده است. از آنجایی که قبلا تصور نمی شد لوزالمعده هدف قاچاق گلوکان باشد، مشخص نیست که آیا لوزالمعده به سادگی هرگز مورد مطالعه قرار نگرفته است یا اینکه آیا قاچاق پانکراس رخ نمی دهد.

مطالعات آینده باید به توزیع زیستی گلوکان محلول و ذرات معلق در مسیرهای مختلف تجویز بپردازد.

- قاچاق گلوکان به لوزالمعده تأثیر چندعاملی بر جمعیت های ایمنی موجود در پانکراس دارد. اول، رسیدن گلوکان به لوزالمعده به طور مستقیم بر جمعیت ماکروفاژهای مقیم M2 سرکوب کننده سیستم ایمنی موجود در لوزالمعده تأثیر می گذارد که در ترویج تومورهای پانکراس مهم هستند. داده‌های CyTOF و scRNA-Seq ناپدید شدن تقریباً کامل جمعیت ماکروفاژهای ساکن را 7 روز پس از تجویز WGP نشان داد. جالب توجه است، ناپدید شدن جمعیت ماکروفاژهای ساکن مستقیماً با ظاهر متقابل جمعیت ماکروفاژهای Ly6Clo همزمان است. این جمعیت ماکروفاژ Ly6Clo نشانگرهای فنوتیپی مشابهی با جمعیت ساکن دارد، اگرچه بیشتر به سمت فنوتیپ M1 گرایش دارد.

بنابراین این احتمال وجود دارد که ماکروفاژهای ساکن با -گلوکانی که به لوزالمعده قاچاق شده است تماس پیدا کنند و این سلول ها دوباره قطبی شوند، بنابراین فنوتیپ سلولی متفاوتی به خود می گیرند که منجر به تشکیل یک خوشه منحصر به فرد می شود. دوم، ورود -گلوکان به لوزالمعده منجر به تقویت سیگنال‌های گیرنده کموکاین/کموکاین می‌شود که ماکروفاژهای مشتق شده از مونوسیت را از محیط به پانکراس نفوذ می‌کند Ly6CHi. بیست و چهار ساعت پس از تجویز WGP، سطح CCL2 در لیزهای کامل پانکراس 30- برابر افزایش یافته است. بر این اساس، ما نشان می‌دهیم که هجوم سلولی قوی وابسته به گلوکان به پانکراس به CCR2 وابسته است.

در حالی که ما بر روی پویایی محفظه میلوئید به دلیل اهمیت مشاهده شده سیگنال دهی CCR2/CCL2 تمرکز می کنیم، یک افزایش اولیه جالب توجه در خوشه 11 در روز 3 و سپس ناپدید شدن تا روز 7 پس از درمان WGP وجود داشت. خوشه 11 بر اساس بیان چندین نشانگر مانند KLRG1، IL{8}}، IL{9}} و ICOS به عنوان ILC2 مشخص شد. ILC2 ها به عنوان سلول های ساکن بافت طولانی مدت شناخته شده اند. مطالعات اخیر نشان داده اند که فعال شدن ILC2 های موضعی توسط آلارمین های بافتی خاص باعث تکثیر آنها، مهاجرت غدد لنفاوی و انتشار خون می شود. نشان داده شده است که ILC2 از چندین بافت، مانند روده و ریه، با اکستروژن از این بافت های آشفته وارد خون شده و به بافت های دیگر مانند کبد 44-46 مهاجرت می کند.

چنین مکانیزمی می تواند افزایش اولیه و سپس ناپدید شدن ILC2s در پانکراس را توضیح دهد. با توجه به اینکه ILC2 ها اخیراً در پاسخ تومورهای پانکراس به ایمونوتراپی نقش دارند، تحقیقات بیشتری برای بررسی تأثیر WGP و شروع ایمنی آموزش دیده بر جمعیت ILC2 پانکراس ضروری است.

اگرچه شروع هجوم سلول های ایمنی پیش التهابی به لوزالمعده به خودی خود مهم است، اما این نفوذ CCR2 به همراه Ly6CHi به جمعیت ماکروفاژهای مشتق از مونوسیت از ویژگی های نمایش پیرامونی ایمنی آموزش دیده است که مهمترین پیامدها را به عنوان القای بیماری به همراه دارد. ایمنی محیطی آموزش دیده در پانکراس هنوز مشخص نشده است. این ایمنی آموزش دیده القایی نیز با برنامه ریزی مجدد متابولیک و اپی ژنتیکی مرتبط است.

در حالی که CCR2 به عنوان یک گیرنده مهم در استخدام مونوسیت ها شناخته شده است، این اولین نشانه ای است که سیگنال دهی CCR2 روی مونوسیت ها برای ایجاد ایمنی آموزش دیده محیطی لازم است. اشاره شده است که CCR2 به علاوه مونوسیت ها/ماکروفاژها با متاستاز و پیشرفت تومور مرتبط هستند48،49. با این حال، داده‌های ما نشان می‌دهد که به‌کارگیری CCR2 برنامه‌ریزی‌شده و آموزش‌دیده به‌علاوه مونوسیت‌ها/ماکروفاژها، اثرات ضد توموری قوی دارند.

این به طور مستقیم با آزمایش مخلوط ما نشان داده می‌شود که در آن موش‌هایی که CCR2 به همراه سلول‌های میلوئیدی از موش‌های آموزش دیده با WGP دریافت کردند، در مقایسه با موش‌هایی که سلول‌های میلوئیدی CCR{2}} را از همان موش آموزش‌دیده دریافت کردند، بار تومور را کاهش دادند.

همانطور که نشان می‌دهیم ایمنی آموزش‌دیده محیطی در پانکراس ایجاد شده است، می‌پرسیم که آیا این سلول‌ها می‌توانند توسط سلول‌های تومور یا عوامل ترشح شده آن‌ها دوباره فعال شوند. قرار گرفتن مجدد سلول های میلوئید پانکراس آموزش دیده با WGP در داخل بدن با محیط های شرطی شده با تومور نشان داده شد که به شدت پاسخ آموزش دیده ای را ایجاد می کند. کلافتی و همکاران اخیراً نقش گرانولوسیت‌ها را در مکانیسم‌های ضد توموری آموزش‌دیده مبتنی بر ایمنی نشان داده است، با این حال، با توجه به استفاده از مدل‌های زیر جلدی سرطان، مطالعه گزارش‌شده در حال حاضر اولین نمونه است که نشان می‌دهد سلول‌های میلوئیدی در یک اندام خاص می‌توانند برای واکنش مستقیم به آن آموزش ببینند. سلول های تومور همان اندام

به خوبی ثابت شده است که سلول های میلوئیدی قادر به کشتن مستقیم سلول های تومور از طریق مکانیسم های فاگوسیتوز و تولید ROS 50-54 هستند، و در اینجا نشان می دهیم که تمرین WGP به طور قابل توجهی عملکردهای مستقیم ضد تومور فاگوسیتوز افزایش یافته سلول های تومور و سمیت سلولی با واسطه ROS را تنظیم می کند. سلول های تومور

علاوه بر این، در حالی که ما تاکید می کنیم که رسانه های شرطی شده با تومور می توانند سلول های میلوئیدی آموزش دیده را دوباره فعال کنند، ما همچنین یک عامل خاص، MIF را در رسانه های شرطی تومور که در این فعال سازی دخیل است، شناسایی می کنیم. این داده ها نشان می دهد که القای ایمنی آموزش دیده می تواند در مکانیسم های نظارت ایمنی تومور شرکت کند. به عنوان مثال، در مراحل اولیه توسعه تومور، تومورها عوامل محلولی ترشح می‌کنند که می‌توانند سلول‌های ذاتی آموزش‌دیده را دوباره تحریک کنند و منجر به ریشه‌کنی این سلول‌های تومور شوند.

سپس این درک از پتانسیل ضد توموری سلول‌های میلوئیدی ذاتی آموزش‌دیده را که وارد لوزالمعده می‌شوند به مدل‌های ارتوتوپی PDAC ترجمه می‌کنیم، جایی که شاهد کاهش چشمگیر بار تومور و افزایش بقای موش‌ها با تنها یک بار مصرف هستیم. WGP. ما همچنین نشان می‌دهیم که سلول‌های مسئول کنترل تومور عمدتاً CCR2 و سلول‌های مشتق شده از میلوئید آموزش دیده هستند. برخلاف سایر مدل‌های پیشنهادی کنترل تومور که به نظر می‌رسد کاملاً با القای ایمنی آموزش‌دیده مرکزی در BM21 هدایت می‌شوند، در عوض، در این مدل، قاچاق اولیه WGP به پانکراس و تولید در نتیجه CCL2 در پانکراس، افراد آموزش دیده سلول های CCR2 به علاوه سلول های میلوئیدی از محیط که عمدتاً مسئول اثرات ضد تومور هستند. قاچاق WGP به طور مستقیم به پانکراس همچنین ماکروفاژهای M2-مانند بافت را به سمت ماکروفاژهای M1- که ممکن است پیشرفت تومور را نیز مهار کنند، مجدداً قطبی می‌کند.

در حالی که کاهش تومور مشاهده شده در موش‌های کاشته‌شده با تومورهای KPC که با سلول‌های CCR2 به علاوه سلول‌های آموزش‌دیده مخلوط شده بودند، قابل توجه بود، به اندازه موش‌هایی که IP WGP داده بودند، قابل توجه نبود. این نشان می دهد که اثرات ضد توموری IP WGP دو برابر است. به کارگیری سلول های میلوئیدی ضد تومور CCR2 به همراه آموزش دیده به پانکراس و رپلاریزاسیون ماکروفاژهای ساکن پروتومورزا به طور هماهنگ برای برانگیختن پاسخ های ذاتی ضد تومور که منجر به کاهش بار تومور در مدل های PDAC می شود، کار می کند.

ما همچنین به بیان بالای MHCII در این مونوسیت/ماکروفاژهای آموزش‌دیده اشاره می‌کنیم که احتمالاً نقشی در پردازش آنتی‌ژن تومور و ارتباط با سلول‌های T برای برانگیختن پاسخ‌های ایمنی تطبیقی ​​علیه تومور دارد. جالب توجه است، در حالی که ما تأیید کردیم که این مکانیسم‌های ضد تومور به پاسخ‌های ایمنی تطبیقی ​​وابسته نیستند، افزایش قابل توجهی در سلول‌های CD8 به علاوه T موجود در CCR2 به همراه تومورهای مخلوط مشاهده کردیم. علاوه بر این، با توجه به اینکه سلول‌های میلوئیدی در تومورها مشاهده شد که سطوح بالایی از PD-L1 را نشان می‌دهند و به نظر می‌رسد که حضور سلول‌های CCR2 به علاوه آموزش‌دیده در لوزالمعده سلول‌های CD8 به علاوه T را جذب می‌کند، ما استدلال کردیم که WGP ممکن است اثرات ضد را تشدید کند. درمان -PD-L1.

طبق ادبیات، درمان ضد PD-L1 mAb به تنهایی هیچ مزیتی برای بقا نداشت در حالی که ترکیب WGP و anti-PD-L1 برای ایجاد نتایج بقای بهتر از WGP به تنهایی همکاری می‌کند. این نشان می‌دهد که سلول‌های ایمنی ذاتی آموزش‌دیده ممکن است سلول‌های ایمنی تطبیقی ​​را در TME فعال کنند، با این حال، ریزمحیط سرکوب‌کننده ایمنی احتمالاً باید بیشتر با اثرات همزمان ضد PD-L1 غلبه کند. نکته مهم، علیرغم بهبود بقا، همه موش‌ها در نهایت تسلیم تومور شدند، بنابراین تحقیقات آتی در مورد بهینه‌سازی این درمان از نظر دوز و تعداد درمان‌ها ضروری است.

سلول های میلوئیدی سرکوب کننده سیستم ایمنی نقش مهمی در ایجاد TME سرکوب کننده ایمنی در PDAC دارند. در اینجا، ما توانایی درگیر کردن این سلول‌های میلوئیدی را در تنظیم PDAC از طریق القای ایمنی ذاتی آموزش‌دیده در پانکراس نشان می‌دهیم.

نکته مهم، ما همچنین نشان می‌دهیم که توانایی شروع ایمنی آموزش‌دیده در لوزالمعده، اثرات درمانی ایمونوتراپی مانند درمان محاصره ایمونو بازرسی ضد PD-L1 را تقویت می‌کند. با استفاده از کاربرد بالینی بیشتر به این یافته ها، ما همچنین نشان می دهیم که القای ایمنی آموزش دیده در محیط کمکی می تواند اندازه تومور را کاهش داده و بقا را طولانی کند. این یافته‌ها بر پتانسیل استفاده از گلوکان برای هدف‌گیری درمانی سلول‌های میلوئید در TME تاکید می‌کنند و تاکید می‌کنند که القای ایمنی تمرین‌شده محیطی در پانکراس می‌تواند نقش مهمی در برنامه‌ریزی مجدد TME سرکوب‌کننده PDAC داشته باشد که می‌تواند منجر به افزایش عمر بیماران شود. با این بدخیمی کشنده تشخیص داده شد.

مواد و روش ها

بیانیه اخلاقی

تمام آزمایش‌های مربوط به حیوانات بر اساس دستورالعمل‌های اخلاقی تعیین‌شده توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات نهادی دانشگاه لوئیزویل انجام شد. آزمایش ها بر اساس پروتکل های مصوب 19471 و 19536 انجام شد.

موش.

در تمام آزمایش‌ها از موش‌های نر و ماده شش تا هشت هفته‌ای استفاده شد. موش های نوع وحشی (WT) C57BL/6 J از آزمایشگاه جکسون (بار هاربر، ME، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند یا در مرکز حیوانات بدون پاتوژن خاص (SPF) دانشگاه لوئیزویل پرورش داده شدند. موش‌های C57BL/6 Dectin{10}} ناک اوت (Dectin{11}-/-) قبلاً شرح داده شده بودند56. موش های ناک اوت جهانی CCR2 از آزمایشگاه جکسون خریداری شدند. موش های آلبینو C57BL/6 توسط دکتر جاناتان واراوا در دانشگاه لوئیزویل ارائه شد. موش های NOD/SCID/IL2r Null (NSG) از آزمایشگاه جکسون خریداری شدند. حداکثر اندازه تومور مجاز توسط IUCAC بیش از 2000 میلی متر مکعب نبود. موش ها روزانه از نظر رشد تومور تحت نظر قرار گرفتند و زمانی که بار تومور از اندازه محدود فراتر رفت، معدوم شدند. موش‌ها در یک چرخه تاریکی/روشنایی 12- ساعت در دمای اتاق با رطوبت کنترل‌شده (حدود ۵۵ درصد) نگهداری شدند.

همه حیوانات در یک تاسیسات مانع نگهداری شدند و فقط موش های سالم برای آزمایش استفاده شدند. همه موش‌ها حداقل 6 هفته سن داشتند، و تمام آزمایش‌های مربوط به حیوانات مطابق با تمام قوانین مرتبط و دستورالعمل‌های سازمانی ارائه‌شده توسط مرکز پرورش جوندگان (RRF) و تأیید شده توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی (IACUC) انجام شد. از دانشگاه لوئیزویل

تهیه گلوکان

ذرات بسیار خالص -گلوکان به شکل ذرات کامل -گلوکان (WGP) جدا شده از ساکارومایسس سرویزیه توسط Biothera ارائه شد. قبل از استفاده، WGP به آرامی به مدت 15 ثانیه، دو بار با استفاده از Qsonica Q{3}} Q55 Sonicator (کول-پارمر) سونیکاتور شد تا اطمینان حاصل شود که سنگدانه ها شکسته شده اند.

تهیه و استفاده از DTAF-WGP.

DTAF (سیگما آلدریچ) در 2 میلی گرم در میلی لیتر با سوسپانسیون 20 میلی گرم در میلی لیتر WGP در بافر بورات (PH 10.8) مخلوط شد. این در دمای اتاق به مدت 8 ساعت با مخلوط کردن مداوم انکوبه شد. پس از انکوباسیون، WGP سانتریفیوژ شد و با DPBS استریل سرد بدون اندوتوکسین (سیگما-آلدریچ) پنج بار یا تا زمانی که مایع رویی دیگر حاوی DTAF قابل مشاهده نباشد، شسته شد. غلظت به 10 میلی گرم در میلی لیتر در DPBS عاری از اندوتوکسین برای ذخیره سازی تنظیم شد. حدود 1 میلی‌گرم از DTAF-WGP IP به موش‌های C57BL/6 و دکتین{14}-/- تزریق کرده است و اندام‌ها 3 روز بعد برداشت شدند.

آماده سازی 89Zr-WGP.

WGP (100 میلی‌گرم) با DeferoxamineSCN (2.7 میلی‌گرم، در 0.8 میلی‌لیتر DMSO) مخلوط شد و در 10 میلی‌لیتر بافر کربنات سدیم (0.1 M، pH 9.4) در طول شب به حالت تعلیق درآمد. در دمای اتاق در تاریکی با تکان دادن ملایم. سپس WGP نشاندار شده با دفروکسامین با آب DI (10×40 میلی‌لیتر) شسته شد و 30 میلی‌گرم از WGP نشاندار شده با دفروکسامین با 3 mCi اگزالات 89Zr در 2 میلی‌لیتر بافر Tris•HCl (0.5 M، pH 7.5) مخلوط شد. سپس در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 60 دقیقه با تکان دادن انکوبه شد. سپس 89Zr-WGP سانتریفیوژ شد و با 3 میلی لیتر PBS استریل شسته شد. رادیواکتیویته 89Zr-WGP توسط کالیبراتور دوز اندازه گیری شد و برای مطالعات in vitro و in vivo استفاده شد.

توزیع زیستی و اسکن PET/CT با استفاده از 89Zr-WGP.

تصویربرداری توموگرافی انتشار پوزیترون (PET)/توموگرافی کامپیوتری (CT) در موش‌های C57BL/6 و Dectin-1-/- 48 ساعت پس از تزریق IP 1 میلی‌گرم 89Zr-WGP خالص یا تزریق 106 × 1 صفاقی انجام شد. ماکروفاژهایی که با 25 میکروگرم در میلی لیتر 89Zr-WGP به مدت 2 ساعت همزمان کشت شده بودند و سپس به آرامی شسته شده بودند تا 89Zr-WGP اضافی حذف شود. موش ها به مدت 15 دقیقه با یک میکروپت زیمنس R4 و سپس 10 دقیقه سی تی اسکن اسکن شدند. برای بدست آوردن و بازسازی سیگنال PET از نرم افزار IAW زیمنس و برای ادغام و تجزیه و تحلیل داده های تصویربرداری از نرم افزار IRW زیمنس استفاده شد.

در پایان مطالعه تصویربرداری، موش‌ها کشته شدند و اندام‌های مورد نظر برداشت شدند. برای توزیع زیستی، 50 میکرولیتر خون محیطی با استفاده از روش خونریزی رتروبولبار جمع آوری شد. مغز، قلب، ریه‌ها، کبد، طحال، کلیه‌ها، لوزالمعده، روده بزرگ، روده کوچک، معده، استخوان ران، تکه‌ای از پوست از پهلوی موش‌ها و عضله رکتوس فموریس برداشت، وزن شدند و در یک دستگاه قرار گرفتند. گاما شمارنده اتوماتیک 2470 Wizard (PerkinElmer) برای اندازه گیری رادیواکتیویته هر بافت. مقادیر CPM با استفاده از نرم افزار Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) محاسبه شد.

پردازش پانکراس

پس از کشته شدن، پانکراس موش برداشت شد و با استفاده از قیچی استریل به آرامی به قطعات کوچکتر بریده شد. آنها در یک لوله 15 میلی لیتری در محیط کامل (RPMI) با بافر هضم 1X متشکل از 300 U/ml کلاژناز I، 60 U/ml هیالورونیداز و 80 U/ml DNase (سیگما) معلق شدند. آنها در انکوباتور چرخشی در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 به مدت 15-20 دقیقه قرار داده شدند. سپس بافر هضم با RPMI 1640 کامل سرد یخ خاموش شد و شسته شد. سلول ها از یک فیلتر سبد 40 میکرومتری نایلونی استریل عبور داده شدند و قطعات کوچک هضم نشده بافت با استفاده از درپوش سرنگ استریل برای تولید یک سوسپانسیون تک سلولی خرد شدند. اگر تعداد قابل توجهی گلبول قرمز (RBC) در نمونه مشاهده شد، لیز RBC با افزودن 2 میلی لیتر ACK 10x استریل (Thermo Fisher Scientific) انجام شد.

مدیریت WGP در داخل بدن.

به موش‌ها یک دوز داخل صفاقی 1 میلی‌گرم از WGP به آرامی سونیک‌شده، دانه‌های پلی استایرن 3 میکرومتر (Sigma-Aldrich) یا 3 میکرومتر میکروسفرهای فلورسنت (Polysciences) داده شد (همه 1 میلی‌گرم در 2{7}}{11}} ul of PBS استریل) یا 200 میکرولیتر PBS استریل در روز 0. برای مطالعات ایمنی معمولاً آموزش دیده، 7 روز پس از دوز اولیه IP، موش ها با استفاده از CO2 معدوم شدند و پانکراس به همراه سایر بافت های مورد علاقه برداشته و پردازش شدند. برای مطالعات تیتراسیون دوز، 0.5، 1، و 2 میلی گرم WGP در 200 uL PBS استریل به صورت IP تحویل داده شد. برای مطالعات تیتراسیون زمانی، 1 میلی گرم WGP به موش ها تزریق شد و پانکراس پس از 24 ساعت، 48 ساعت، 3، 7، 10، 16 و 30 روز بعد برداشت شد.

تحریک مجدد Ex vivo

برای ارزیابی فنوتیپ آموزش‌دیده سلول‌های تک هسته‌ای در موش‌های تحت درمان با WGP یا PBS ex vivo، پس از پردازش پانکراس، سوسپانسیون‌های سلولی پانکراس در پلیت‌های 24 چاهی کاشته شدند و با LPS (10 نانوگرم در میلی‌لیتر)، مایع رویی از کشت KPC و Pan02 تحریک شدند. سلول ها (40 درصد)، و MIF نوترکیب (rMIF) (10 نانوگرم در میلی لیتر). MIF هدیه سخاوتمندانه ای از سوی دکتر رابرت میچل در دانشگاه لوئیزویل بود و به عنوان متحد پروکاریوتی بیان شد، خالص شد و همانطور که قبلاً توضیح داده شد57. سلول ها در DMEM کشت داده شدند و در 37 درجه با 5 درصد CO2 به مدت 5-6 ساعت در حضور 1X برفلدین A (BioLegend) انکوبه شدند. سپس سلول ها با استفاده از یک خراش دهنده سلولی برداشت شدند، شسته شدند، پلت شدند و سپس برای بیان سیتوکین درون سلولی رنگ آمیزی شدند.

آموزش در شرایط آزمایشگاهی و سنجش تحریک مجدد.

ماکروفاژهای صفاقی یا سلول‌های CD11b به‌علاوه دسته‌بندی‌شده از پانکراس موش به مدت 2 ساعت در یک صفحه چاهک به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 قرار گرفتند تا امکان اتصال سلول‌ها به صفحات فراهم شود، پس از آن سلول‌های شناور به آرامی قرار گرفتند. آسپیره شده سلول های متصل به آرامی با PBS استریل شسته شدند و سپس در 1 میلی لیتر DMEM حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین مجدداً معلق شدند.

برای تمرین اولیه سلول‌ها، 25 میکروگرم بر میلی‌لیتر ذرات WGP، 25 میکروگرم بر میلی‌لیتر از دانه‌های میکروذره پلی استایرن 3 میکرومتری (سیگما آلدریچ)، یا 100 میکرولیتر PBS به چاه مناسب اضافه شد و به مدت 24 ساعت انکوبه شد. پس از 24 ساعت، چاهک ها به آرامی برای حذف محرک اولیه شسته شدند و DMEM تازه اضافه شد و سلول ها با 5 درصد CO2 در دمای 37 درجه به مدت 7 روز انکوبه شدند. پس از 7 روز، محیط آسپیره شد و با محیط تازه جایگزین شد و سلول‌ها با LPS (100 نانوگرم در میلی‌لیتر)، مایع رویی سلول‌های KPC یا Pan02 (40 درصد)، یا PBS به‌عنوان کنترل دوباره تحریک شدند. 24 ساعت پس از تحریک، سوپرناتانت‌ها برداشت و در ELISA برای TNF- و IL استفاده شد.

رسانه های مشروط به تومور

حدود 1 × 106 سلول KPC یا Pan02 در یک صفحه شش چاهی در 4 میلی لیتر DMEM کامل در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 کشت داده شدند. پس از 3 روز، سوپرناتانت‌ها برداشت و در دمای 80- درجه برای استفاده به‌عنوان یک محیط تهویه‌شده با تومور ذخیره شدند. به عنوان شاهد، پانکراس موش C57BL/6 به یک سوسپانسیون تک سلولی پردازش شد و 106×1 از این سلول ها در یک صفحه شش چاهی در 4 میلی لیتر DMEM کامل و در 37 درجه و 5 درصد CO2 کشت داده شدند. مواد رویی نیز پس از 3 روز جمع آوری شد. به عنوان شاهد، پانکراس موش‌های ساده به یک سوسپانسیون تک سلولی پردازش شد و به مدت 1 روز در یک صفحه شش چاهی قرار داده شد. سلول‌های غیرچسبنده شسته شدند و این سلول‌ها به مدت 3 روز کشت داده شدند و مایع رویی برداشت شد.

اکتساب ماکروفاژهای صفاقی.

موش ها معدوم شدند و 5 میلی لیتر RPMI استریل با استفاده از سرنگ گیج به صفاق تزریق شد. برای آزادسازی ماکروفاژهای صفاقی، شکم ماساژ داده شد. یک برش کوچک ایجاد شد و از یک پیپت انتقال برای برداشتن سوسپانسیون استفاده شد. سپس حفره صفاقی چندین بار با RPMI سرد شسته شد و سلول‌ها با غلظت 458 × گرم پلت شدند.

فلوسیتومتری.

سوسپانسیون های تک سلولی در PBS با 1 درصد FBS با بلوک Fc موشی (ضد CD16/CD32) در دمای 4 درجه به مدت 15 دقیقه مسدود شدند. آنتی بادی های نشاندار شده با فلوروکروم برای زنده ماندن (APC/Cy7) و نشانگرهای سطحی CD45، CD11b، F4/80، Ly6G، Ly6C، MHCII، CD3، CD4، CD8، NK1.1، Ki67 (Biolegend) و CCR2 (سیستم های تحقیق و توسعه) استفاده شده. اطلاعات مربوط به تمام Abs جریان در جدول تکمیلی 3 خلاصه شده است. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در تاریکی در 4 درجه، سلول ها با PBS سرد شسته شده و از طریق فیلتر مش 40 میکرومتر فیلتر شدند. نمونه ها با استفاده از سیتومتر FACSCanto II (BD Biosciences) تهیه و با استفاده از نرم افزار FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) آنالیز شدند. نرم افزار FACSDiva نسخه 6 در FACSCanto برای به دست آوردن تمام داده ها استفاده شد.

رنگ آمیزی داخل سلولی برای بیان سیتوکین ها

پس از تحریک، سلول ها برای نشانگرهای سطح مورد نظر همانطور که در بالا توضیح داده شد رنگ آمیزی شدند. سپس سلول ها با PBS سرد شسته شدند و 500 ul بافر تثبیت (Biolegend) به لوله ها اضافه شد، برای مدت کوتاهی گرداب شد و در تاریکی در دمای اتاق به مدت 20 دقیقه انکوبه شد. سپس حدود 1 میلی‌لیتر از بافر نفوذپذیری (Biolegend) اضافه شد و نمونه‌ها در 458 × گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند و سپس یک بار شستشوی دیگر با استفاده از 1 میلی‌لیتر بافر نفوذپذیری انجام شد. سلول‌ها در 200 میکرولیتر بافر نفوذپذیری معلق شدند و سلول‌ها با آنتی‌بادی‌های ضد TNF-، Ki67، Granzyme-B، IL12، IL{12}} و IFN یا کنترل ایزوتیپ مربوطه در طول شب در دمای 4 درجه رنگ‌آمیزی شدند. سپس سلول ها شسته، فیلتر شدند و داده ها با استفاده از فلوسایتومتر به دست آمد.

جداسازی FACS CD11b به علاوه ماکروفاژها برای تمرین در شرایط آزمایشگاهی.

همانطور که در بالا توضیح داده شد، پانکراس به یک سوسپانسیون تک سلولی تبدیل شد. سلول ها با 1 میلی لیتر PBS شسته شدند و با بلوک Fc به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه و سپس رنگ آمیزی با رنگ زنده (APC-Cy7)، CD45 (PerCPcy5) و CD11b plus (APC) به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه انکوبه شدند. سلول ها با PBS شسته و در بافر سرد MACS Running (Miltenyi Biotech) مجدداً معلق شدند. سلول های ViabilityCD45 به علاوه CD11b پلاس با استفاده از FACS Aria III (BD Biosciences) مرتب شدند. سلول ها در 50 درصد FBS، 40 درصد PBS و 10 درصد HEPES (Corning) جمع آوری شدند. پس از مرتب سازی سلول ها با PBS شسته و سپس برای تمرین در شرایط آزمایشگاهی، همانطور که در بالا توضیح داده شد، پوشش داده شدند.

الایزا.

سوپرناتانت از سلول های آموزش دیده آزمایشگاهی همراه با استانداردها با استفاده از کیت های الایزای TNF- و IL{1}} موش (BioLegend) آنالیز شد. سنجش طبق دستورالعمل سازنده انجام شد و تمام شرایط در سه تکرار انجام شد. یک کیت ELISA برای rMIF (سیستم‌های R و D) نیز طبق دستورالعمل‌های سازنده برای تعیین کمیت rMIF در محیط‌های آماده‌شده با تومور Pan02 و KPC و مایع رویی از سلول‌های پانکراس درمان‌نشده استفاده شد. برای کمی سازی تغییرات هیستون، کیت های ELISA (کیت کمیت تری متیل هیستون H3K4، کیت کمی سازی استیل هیستون H3K27، کیت کمی سازی تری متیل هیستون H3K27 و کیت کمیت هیستون کل H3) از اپی جنتک خریداری شد و سنجش ها بر اساس سازندگان انجام شد. دستورالعمل ها. لاکتات توسط کیت I سنجش L-Lactate (Eton Bioscience) اندازه گیری شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سلول های CD11b پلاس از موش های تزریق شده با PBS یا WGP (24 ساعت) با استفاده از میکروبیدهای CD11b (Miltenyi Biotech) جدا شدند. هیستون طبق دستورالعمل سازنده (Active Motif, Inc.) استخراج شد و غلظت پروتئین با استفاده از کمی سازی برادفورد تعیین شد. پروتئین‌های هیستون توسط ژل‌های SDS-PAGE 15 درصد Tris-HCl جدا شده و روی غشاهای PVDF (Millipore) منتقل شدند. غشاء با 5 درصد BSA در دمای اتاق به مدت 1 ساعت مسدود شد و یک شبه در 4 درجه با آنتی بادی های اولیه از جمله تری متیل هیستون H3 (lys4) mAb خرگوش، استیل هیستون H3 (lys27) XP Rabbit mAb، تری متیل انکوبه شد. -histone H3 (Lys27) خرگوش mAb، و هیستون H3 XP خرگوش mAb (فناوری سیگنالینگ سلولی)، سپس با آنتی بادی های ثانویه کونژوگه HRP (GE Healthcare) در دمای اتاق به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. این غشاء با آمرسشم ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) ساخته شد و از طریق پردازشگر فیلم پزشکی (Konica Minolta Medical & Graphic) شناسایی شد. Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards به عنوان نشانگر پروتئین استاندارد (Bio-Rad) استفاده شد.

qRT-PCR.

پس از جداسازی سلول های CD11b پلاس از پانکراس موش در موش های تحت درمان با WGP و درمان نشده، سلول ها در TRIzol ذخیره شدند. RNA ها با استفاده از تقویت Reverse Transcription Reagents TaqMan (qRTPCR) با استفاده از سیستم تشخیص تک رنگی RT-PCR Bio-Rad MyiQ جدا و رونویسی معکوس شدند. به طور خلاصه، cDNA در مخلوط واکنش 25 uL متشکل از SYBR Green PCR super-mix (Bio-Rad)، 100 نانوگرم الگوی DNA مکمل، و پرایمرهای انتخابی (200 نانومولار) با استفاده از شرایط چرخه توصیه شده تکثیر شد.

H به علاوه E.

هفت روز پس از تزریق با دانه‌های PBS/ریزذره یا WGP، پانکراتا برداشت و در فرمالین 4 درصد به مدت 1 هفته ثابت شد و سپس طبق روش‌های استاندارد در پارافین جاسازی شد. بافت‌های تعبیه‌شده با پارافین به بخش‌هایی به ضخامت 5 میلی‌متر بریده و برای آنالیز مورفولوژیکی با هماتوکسیلین و ائوزین (H & E) رنگ‌آمیزی شدند.

اندازه گیری آمیلاز سرم

آمیلاز سرم موش با استفاده از کیت سنجش فعالیت آمیلاز (میلیپور سیگما) اندازه گیری شد و طبق دستورالعمل سازنده مورد استفاده قرار گرفت. به طور خلاصه، موش‌ها با WGP تزریق شدند و 7 روز بعد، خون از موش‌ها با استفاده از تکنیک خونریزی رتروبولبار جمع‌آوری شد. از این نمونه ها برای سنجش آمیلاز سرم استفاده شد.

کاهش سلول های T در داخل بدن

سلول‌های T با استفاده از mAb anti-CD4 به تنهایی، antiCD8 mAb به تنهایی یا anti-CD4 و anti-CD8 با هم تخلیه شدند. آنتی بادی ها در داخل ساخته شدند. در این روش تخلیه، موش ها IP با WGP را در روز 1 تزریق کردند و همچنین 200 میکروگرم از mAbs در روز اول و روز 4 در طول دوره درمان به آنها تزریق شد. موش ها در روز 7 معدوم شدند. (CD4 clone GK1.5, CD8 clone 53-6.72). کارایی تخلیه در روز 7 تأیید شد.

تخلیه سلولی NK در داخل بدن

سلول‌های NK از طریق تزریق داخل صفاقی 0 میکروگرم PK136 mAb (تولید شده در آزمایشگاه دکتر جون یان در دانشگاه لوئیزویل) در روزهای 1- و 5 در طول دوره درمان تخلیه شدند. WGP در روز صفر تزریق شد و روز هفتم حیوانات معدوم شدند و کارایی تخلیه سلول‌های NK با رنگ‌آمیزی بافت‌های پانکراس برای NK1.1 ارزیابی شد.

تخلیه Ly6G

نوتروفیل ها با تزریق 3{18}}0 میکروگرم mAb anti-Ly6G (Bio X Cell) یا IgG2a موش کنترل ایزوتیپ (Bio X Cell) در روزهای 1-، 2 و 6 در طول درمان تخلیه شدند. حدود 1 میلی گرم WGP IP در روز 1 تزریق شد. موش ها در روز 7 معدوم شدند و پانکراس از نظر کارایی تخلیه ارزیابی شد. در تومور، به موش‌های مدل 300 میکروگرم mAb ضد Ly6G یا IgG2a کنترل ایزوتیپ موش صحرایی در روزهای 2-، 4، 10 و 16- تزریق شد. 7. موش ها در روز 21 معدوم شدند و بافت های پانکراس با Ly6G رنگ آمیزی شدند تا کارایی تخلیه گرانولوسیت در آن زمان ارزیابی شود.

آماده سازی نمونه سیتومتری جرمی CyTOF.

آنتی‌بادی‌های ماس سیتومتری یا از Fluidigm خریداری شده‌اند یا با استفاده از کیت‌های MaxPar X8 Polymer یا MCP9 Polymer (Fluidigm) آنتی‌بادی‌های خالص‌شده موجود در بازار به ایزوتوپ‌های فلزی مناسب ایجاد شده‌اند. نمونه‌های پانکراس از سه موش PBS و سه موش WGP {3} روزه در یک محلول تک سلولی پردازش شدند و تحریک خارج از بدن همانطور که در بالا توضیح داده شد انجام شد. سلول ها با استفاده از یک اسکراپر سلولی استریل به آرامی از صفحات جدا شدند، با PBS شسته شدند و در یک لوله کشت استریل قرار داده شدند. حدود 2 × 106 سلول در هر نمونه استفاده شد. سلول ها ابتدا برای زنده ماندن با 5 uM سیس پلاتین (Fluidigm) در RPMI 1640 بدون سرم به مدت 5 دقیقه در RT رنگ آمیزی شدند. سپس سلول ها با RPMI 1640 حاوی 10 درصد FBS به مدت 5 دقیقه در گرما 300 شسته شدند. سلول ها با آنتی بادی های سطحی به مدت 30 دقیقه در RT رنگ آمیزی شدند و دو بار با بافر رنگ آمیزی Maxpar Cell (Fluidigm) شستشو شدند.

برای رنگ‌آمیزی روی سیتوکین‌های داخل سلولی، سلول‌ها سپس با 1 میلی‌لیتر بافر 1X Maxpar Fix I به مدت 30 دقیقه در RT تثبیت شدند و سپس دو بار با 2 میلی‌لیتر بافر 1X Maxpar Perm-S به مدت 5 دقیقه در 800 × گرم شسته شدند. سپس کوکتل آنتی بادی سیتوپلاسمی/ ترشح شده اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در RT با سلول ها انکوبه شد. پس از انکوباسیون، سلول ها با 1 میلی لیتر بافر 1X Maxpar Perm-S به مدت 5 دقیقه در 800 × گرم شسته شدند و به آرامی لکه دار شدند تا تمام مایع از لوله خارج شود.

برای رنگ آمیزی آنتی ژن های هسته ای، سلول ها سپس در 1 میلی لیتر بافر رنگ آمیزی آنتی ژن هسته ای 1X Maxpar به مدت 30 دقیقه در RT معلق شدند. سپس کوکتل آنتی بادی آنتی ژن هسته ای اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در RT انکوبه شد. سلول ها دو بار به مدت 5 دقیقه در گرما 800 با 2 میلی لیتر بافر نفوذپذیری رنگ آمیزی آنتی ژن هسته ای شسته شدند. در نهایت، سلول ها با فرمالدئید 1.6 درصد به مدت 10 دقیقه در RT تثبیت شدند، سپس به مدت یک شب در 125 نانومتر IntercalatorIridium (Fluidigm) در دمای 4 درجه انکوبه شدند.

جمع آوری داده های CyTOF

پس از آماده شدن سلول‌ها برای جمع‌آوری، نمونه‌ها دو بار با بافر رنگ‌آمیزی سلولی (Fluidigm) شسته شدند و روی یخ نگه‌داشته شدند. مستقیماً قبل از اکتساب، سلول ها در محلول 1:9 از محلول سلول اکتسابی: دانه های کالیبراسیون عنصر EQ 4 (Fluidigm) معلق شدند. از یک سیستم Helios CyTOF استفاده شد و به دنبال مراحل راه اندازی و تنظیم مناسب، نمونه ها با سرعت کمتر یا مساوی 500 رویداد در ثانیه تا 300،{5}} رویداد اجرا شدند. با استفاده از نرم افزار CyTOF، فایل های FCS نرمال سازی شدند.

تجزیه و تحلیل داده های CyTOF

داده‌های CyTOF با استفاده از FlowJo، بسته نرم‌افزار CytoBank58، و گردش کار CyTOF59 که شامل مجموعه‌ای از بسته‌های موجود در R (r-project.org)60-63 است، تجزیه و تحلیل شد. برای تجزیه و تحلیل انجام شده در گردش کار CyTOF، فایل های فضای کاری FlowJo که از Flow Workspace و CytoML صادر شده بودند استفاده شد.

تعیین توالی RNA: استخراج و جداسازی RNA.

هفت روز پس از تجویز PBS یا WGP IP، پانکراتا برداشت شد، به یک سوسپانسیون تک سلولی پردازش شد، برای زنده ماندن، CD45 و CD11b رنگ آمیزی شد و با استفاده از FACS Aria III مرتب شد. برای هر گروه آزمایشی نمونه ها در سه تکرار تهیه شد. پس از جداسازی این سلول های میلوئیدی، سلول ها 2 بار با PBS سرد یخ شسته و سپس با تریزول (Invitrogen) لیز شدند. RNA ها با استفاده از کیت QIAGEN RNAeasy (QIAGEN) استخراج شدند.

RNA جدا شده از نظر یکپارچگی با استفاده از سیستم Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) بررسی شد و با استفاده از روش فلورومتری کیوبیت (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) اندازه‌گیری شد. کتابخانه‌های mRNA-Seq غنی‌شده با Poly-A با استفاده از 10 نانوگرم RNA کل با پروتکل استاندارد کیت mRNASeq Universal Plus (Tecan Genomics، Redwood City، CA) تهیه شدند.

همه نمونه ها با آداپتورهای Illumina و به صورت جداگانه بارکد شدند. عدم وجود دایمرهای آداپتور و اندازه کتابخانه ثابت ~ 300 جفت باز با استفاده از Agilent Bioanalyzer 2100 تأیید شد. غلظت کتابخانه و رفتار توالی یابی در مورد یک سنبله استاندارد شده PhIX با استفاده از یک سلول جریان توالی یابی Nano MiSeq از Illumina ارزیابی شد. ساعت 1.8 بعدازظهر از کتابخانه‌های ادغام‌شده با 1 درصد spike-in PhiX روی یک سلول جریان توالی یابی NextSeq 500/550 75 چرخه High Output Kit v2 بارگیری شد و روی توالی‌سنج Illumina NextSeq 500 با هدف 60 M 1x75 bp نمونه‌گیری شد.

توالی یابی RNA

کتابخانه ها با استفاده از کیت Universal Plus mRNA-seq با کمی سازی کتابخانه NuQuant® (NuGen) تهیه شدند. شش نمونه در چهار خط توالی در یک اجرا پخش شدند. 24 فایل توالی خام تک پایانی (.fastq)64 از BaseSpace65 Illumina در سرور KBRIN برای تجزیه و تحلیل دانلود شدند. کنترل کیفیت (QC) داده‌های توالی خام با استفاده از FastQC (نسخه 0.10.1)66 انجام شد. توالی ها با استفاده از STAR (نسخه 2.6)67 با ژنوم مرجع موش mm1{19}} تراز شدند و فایل های تراز را در قالب bam ایجاد کردند. بیان دیفرانسیل رونوشت های کد کننده پروتئین ENSEMBL با استفاده از DESeq268,69 انجام شد. شمارش خام از فایل‌های با فرمت bam با STAR با استفاده از HTSeq (نسخه 0.10.0)70 به‌دست آمد. شمارش خام با استفاده از روش بیان گزارش نسبی (RLE) نرمال شد و سپس برای حذف ژن‌های با تعداد کمتر از ده در نمونه‌ها فیلتر شد. داده های RNA-seq با الحاق GEO GSE187464 سپرده شدند.

توالی یابی RNA: تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن.

تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن (GSEA) برای توصیف بیشتر بیولوژی ژن های شامل شرایط WGP در مقابل PBS و تفاوت های آنها استفاده شد. مجموعه‌های ژنی از پایگاه داده امضاهای مولکولی (MSigDB) برای فرآیندهای بیولوژیکی هستی‌شناسی ژن (GO) و مسیرهای Reactome به‌دست آمد. برای هر مجموعه ژن، همه مکان‌های ژن آزمایش‌شده در مقایسه موش‌های کنترل تحت درمان با WGP در مقابل PBS از بالاترین به پایین‌ترین اهمیت با استفاده از مقادیر p مرتب شدند. این رویکرد اجازه می دهد تا ژن های بسیار مهم بالا و پایین تنظیم شده در هر مجموعه ژن گنجانده شوند، رویکردی که شرایط را در یک مسیر بیولوژیکی با دقت بیشتری منعکس می کند. برای این تجزیه و تحلیل، جدولی از مجموعه‌های غنی‌شده با نمودار غنی‌سازی دنبال می‌شود که نمایه امتیاز غنی‌سازی (ES) و موقعیت اعضای مجموعه ژن را در فهرست مرتب‌شده نشان می‌دهد.

توالی یابی تک سلولی: جداسازی سلول های منفرد و توالی یابی RNA.

سلول های زنده CD45 پلاس از پانکراتای موش دسته بندی شدند، شسته شدند و در 1x PBS (بدون کلسیم و منیزیم) حاوی 0.04 درصد BSA مجدداً معلق شدند. سلول‌های منفرد گرفته شدند و طبق دستورالعمل‌های سازنده، کتابخانه‌های cDNA بارکد شده با استفاده از کیت معرف تک سلولی 3ʹ Chromium Next GEM (v3.1، 10X Genomics) و کنترل‌کننده کروم ساخته شدند. کتابخانه ها با استفاده از پیکربندی 28 bp × 8 bp × 125 bp برای read1 × i7 index x read2 ادغام شدند و توالی یابی شدند.

از زمان توالی یابی سلولی: پروفایل بیان ژن.

فایل‌های Bcl با استفاده از نرم‌افزار CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{1{11}}}}) به فایل‌های fastq تبدیل شدند. تعداد کل قرائت های متوالی 506,913,062 بود. همانطور که توسط FastQC66 تعیین شده است، خواندن از کیفیت خوبی برخوردار بود. تعداد ژن ها با استفاده از CellRanger "count" با استفاده از cell ranger-mm{9}}.0.0 مرجع ژنوم برای موش اندازه گیری شد. یک ماتریس شمارش برای هر نمونه و یک نمونه انباشته با تعداد سلول مورد انتظار 5000 تولید شد.

داده های شمارش خام تعیین شده توسط CellRanger به عنوان ورودی به خط لوله تجزیه و تحلیل سفارشی در R استفاده شد که از انواع ابزارهای تجزیه و تحلیل تک سلولی مبتنی بر Seurat استفاده می کند. نمودار زانو (شکل 7 ب تکمیلی) نموداری را نشان می دهد که تعداد UMI رتبه بندی شده برای هر بارکد سلولی را برای داده های جمع آوری شده در سه گروه نشان می دهد. سلول های بالای نقطه عطف نشان دهنده دوتایی های احتمالی هستند در حالی که سلول های زیر زانو نشان دهنده سلول های پس زمینه هستند. معیارهای کنترل کیفیت سلول با استفاده از Seurat v373 تجزیه و تحلیل شدند و بارکدهای سلولی با ویژگی‌های زیر از تجزیه و تحلیل حذف شدند: تعداد کم (سلول‌های پس‌زمینه احتمالی) با قطع FDR 0.01 از تابع DropletUtils74 "emptyDrops"، تعداد زیاد (سلول های دوتایی احتمالی) با تعداد بیشتر از نقطه عطف نمودار زانو، محتوای میتوکندری بیش از 30 درصد و محتوای ریبوزومی بیشتر از 40 درصد. ژن (ویژگی ها) بیشتر فیلتر شدند تا شناسه های ژن بازنشسته و ژن هایی که حداقل در دو سلول بیان نشده بودند حذف شوند. برای مشاهده تعداد اولیه و فیلتر شده بارکد سلولی و ژن، شکل تکمیلی 7a، b را ببینید.

داده‌های بیان با استفاده از SCTransform75 نرمال‌سازی شدند که در آن ژن‌های چرخه سلولی، محتوای ریبوزومی و محتوای میتوکندریایی پسرفت شدند. سپس سلول ها خوشه بندی شدند و کاهش ابعاد با استفاده از UMAP76 انجام شد. نام‌های اولیه خوشه با استفاده از تکنیک امتیاز غنی‌سازی اصلاح‌شده GSVA77،78 اختصاص داده شد. برای هر یک از این خوشه ها، ژن های نشانگر برتر شناسایی شدند. ژن‌های بیان شده متفاوت که هر خوشه را با هر خوشه دیگر مقایسه می‌کنند (همه مقایسه‌های زوجی) با استفاده از Seurat73 و MAST79 تعیین شدند. داده‌های scRNA-seq با الحاق GEO GSE187464 سپرده شدند.

شناسایی خوشه های تولید شده با scRNA-Seq.

خوشه های غیر مشتق از میلوئید به طور کلی به عنوان سلول های B (MS4A1)، سلول های پلاسما (SDC1)، سلول های CD8 به علاوه سلول های T (CD3e، C8a)، سلول های CD4 به علاوه T (CD3e، CD4)، سلول های T-تنظیمی (T) طبقه بندی شدند. -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), سلولهای T δ (CD3e, TRGC1, TRGC2,IL7Ra) و سلولهای ایمنی ذاتی نوع 2 (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg,GATA3, IL{29} ، IL{30}}، ICOS و Rxrg)80–82. نوتروفیل ها از طریق بیان MMP9، Csf3r، S100A8، S100A8، و ADAM8 شناسایی شدند، اگرچه ممکن است در این تجزیه و تحلیل ها به دلیل محتوای RNA کم و سطوح بالای RNases83 ذاتی کمتر ارائه شوند. سلول‌های دندریتیک معمولی (cDCs) از طریق بیان ITGAX و ITGAE شناسایی شدند و DCهای پلاسماسیتوئید (pDCs) توسط ITGAX و Siglech شناسایی شدند.

طبقه بندی خوشه های میلوئیدی از scRNA-Seq.

خوشه 5 ITGAMINtADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- را بیان می کند و TNFAIP2 را بیان نمی کند، که نشان می دهد این سلول ها ماکروفاژهای ساکن هستند. Cluster10 ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H{12}}Ab1Int Ly6C2- را بیان کرد. خوشه های 3 و 4 ITGAMINt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi را بیان می کنند، که نشان می دهد هر دو زیرمجموعه مونوسیت ها/ماکروفاژهای نفوذی هستند، اگرچه ژن های التهابی تقویت شده بیان شده در خوشه 3 برای شناسایی مونوکروفیته شدن در خوشه 3 مورد استفاده قرار گرفتند. .

سنجش فاگوسیتوز

پانکراس موش‌های تزریق‌شده با PBS/ریزذره و موش‌های آموزش‌دیده با WGP در داخل بدن 7 روز پس از تزریق برداشت شد و همانطور که قبلاً در یک سوسپانسیون سلولی توضیح داده شد پردازش شد. حدود 2×106 با رقیق‌های HEPES 50 برابر در RPMI 1640 شسته شد و سپس در 100 میکرولیتر از این محلول به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد تا سلول‌ها فعال شوند. Invitrogen سبز S را ترویج می کند.

کیت فاگوسیتوز Aureus BioParticlesTM برای فلوسیتومتری (Thermo Fisher Scientific) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. حدود 100 میکرولیتر از ذرات بازسازی شده یا 1 × 106 GFP به علاوه سلول های تومور KPC به سلول های پانکراس فعال شده اضافه شد و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد. نمونه ها هر 15 دقیقه به آرامی گرداب شدند. واکنش با افزودن 1 میلی لیتر PBS سرد متوقف شد. نمونه ها با Fc Block به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه انکوبه شدند، برای زنده ماندن، CD45، CD11b و F4/80 به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه رنگ آمیزی شدند و سپس با استفاده از BD FACSCanto آنالیز شدند. برای تجزیه و تحلیل، پس از دروازه‌سازی روی سلول‌های زنده و CD45، سلول‌هایی که در کانال FITC فلورسان می‌کردند فاگوسیتز بودن مشخص شد.

سنجش سمیت سلولی

پانکراس از موش‌های تحت درمان با WGP و PBS برداشت شد و جمعیت‌های CD11b پلاس با استفاده از CD11b مغناطیسی به‌علاوه MicroBeads (Miltenyi Biotec) و جداکننده AutoMACS Pro (Miltenyi Biotec) جدا شدند. سلول‌های CD11b پلاس خالص سپس شسته و شمارش شدند و این سلول‌ها با نسبت 1:20 تومور: سلول‌های مؤثر در یک صفحه چاهی قرار گرفتند. تمام نمونه های تجربی در سه تکرار اجرا شدند. پس از آبکاری سلول‌های CD11b پلاس، مهارکننده‌های ROS N-acetyl-Lcysteine ​​(NAC) (1 میلی‌مولار، سیگما-آلدریچ)، ترولوکس (5 میکرومولار، سیگما-آلدریچ)، یا DFO (50 میکرومولار، فارماکوپه اروپایی) به یکی اضافه شدند. مجموعه ای از سلول های مشتق شده از PBS و WGP برای 1 ساعت قبل از افزودن 5000 KPC بیانگر لوسیفراز به همراه سلول های تومور پانکراس به همه چاه ها. پس از 24 ساعت کشت همزمان، پلیت ها سانتریفیوژ شدند و 20 میکرولیتر از مایع رویی با 100 میکرولیتر از معرف سنجش لوسیفراز (Promega) مخلوط شد. فعالیت لوسیفراز اندازه‌گیری‌شده در مایع رویی با سلول‌های توموری که توسط سلول‌های مؤثر کشته شده‌اند همبستگی داشت و با استفاده از یک لومینومتر اندازه‌گیری شد (Femtomaster FB 12، Zylux Corporation). سیگنال لوسیفراز خود به خود از سلول های تومور اندود شده از اندازه گیری مایع رویی کم شد. مقادیر لوسیفراز به عنوان واحدهای نور نسبی (RLUs) نشان داده می شوند.

مدل‌های تومور داخل بدن سرطان پانکراس

یک خط سلولی KPC بر روی پس‌زمینه C57BL/6 مشتق شده از LSL-KrasG12D/ plus. LSL-Trp53R172H/ plus ; مدل موس Pdx1-Cre (KPC) از Ximbio خریداری شد. این سلول‌ها و سلول‌های Pan02 که هدیه‌ای سخاوتمندانه از سوی دکتر یونگ لو در دانشگاه ویک فارست بود، در مدل ارتوتوپی سرطان پانکراس استفاده شد. یک خط KPC ترانسفکت شده با GFP و لوسیفراز (KPCGFP به علاوه Luc plus) نیز کمک بزرگی از دکتر مایکل دوینل در کالج پزشکی ویسکانسین بود. این سلول‌ها منحصراً در موش‌های آلبینو C57BL/6 مورد استفاده قرار گرفتند.

برای کاشت تومور، موش ها با استفاده از ایزوفلوران بیهوش شدند و شکم موش ها با بتادین آماده شد و به روش استریل پوشانده شد. لاپاراتومی خط وسط 2 سانتی متری با استفاده از تکنیک آسپتیک با ابزار استریل انجام شد. پس از لاپاراتومی، پانکراس و طحال خارج شدند. سلول های تومور در PBS سرد یخی معلق شدند و به نسبت 1:1 با ماتریکس غشای پایه ماتریژل (کورنینگ) مخلوط شدند. 0.1 × 106 سلول تومور در 5{13}} uL محلول PBS-ماتریژل با استفاده از سرنگ انسولین {9}}به دم پانکراس تزریق شد. تشکیل یک حباب کوچک نشان دهنده کاشت موفقیت آمیز بود. صفاق با استفاده از نخ بخیه قابل جذب 5/0 بافته شده با اسید پلی گلیکولیک پوشش داده شده و با نخ 5/0 غیرقابل جذب ابریشم بافته شده بسته شد. (CP Medical). بوپرنورفین برای کنترل درد تا 72 ساعت پس از جراحی تجویز شد و موش ها تحت نظر قرار گرفتند.

تصویربرداری in vivo

موش‌های کاشته‌شده به‌صورت ارتوتوپی با سلول‌های تومور GFP به‌علاوه لوسیفراز به‌علاوه KPC، به‌صورت IP با 150 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن در 100 میکرولیتر XenoLight D-Luciferin-K به‌علاوه بستر بیولومینسسنت نمک (پرکین المر) تزریق شدند. پس از 10 دقیقه، موش ها با ایزوفلوران بیهوش شدند و در داخل یک تصویربرداری فوتون آزمایشگاه زیست فضایی قرار گرفتند، که یک روش نوری اختصاصی در سطح نور کم در داخل بدن برای تصویربرداری بیولومنسانس و فلورسنت است. تصاویری از موش ها گرفته شد و برای اندازه گیری اندازه و رشد تومور استفاده شد.

مدل تومور ترکیبی

موش‌ها با 1 میلی‌گرم WGP آموزش دیدند و 7 روز بعد، جمعیت‌های CD11b به‌علاوه CCR2 پلاس و CD11b به‌علاوه CCR2- مرتب شدند و 1:1 با سلول‌های تومور KPC 1 × 105 سلول تومور مخلوط شدند. سلول ها به صورت ارتوتوپی در موش های WT کاشته شدند و 3 هفته بعد موش ها کشته شدند و اندازه تومور ارزیابی شد.

درمان ترکیبی با ضد PD-L1 mAb.

موش های C57BL/6 با WGP در روز 7- تحت درمان قرار گرفتند و تومورهای پانکراس ارتوتوپی KPC در روز 0 کاشته شدند. موش ها با 200 میکروگرم ضد موش ضد PD-L1 mAb (Bio X Cell) یا کنترل ایزوتیپ IgG2b موش صحرایی (Bio X Cell) در روزهای 3، 7 و 11 تحت درمان قرار گرفتند. سپس موش ها برای بقا تحت نظر قرار گرفتند.

WGP به عنوان یک درمان

موش‌های C57BL/6 با تومورهای پانکراس ارتوتوپی KPC در روز 0 کاشته شدند و در روزهای 4 و 11 به موش‌ها 1 میلی‌گرم IP WGP یا PBS داده شد. سپس موش ها برای زنده ماندن تحت نظر قرار گرفتند.

تحلیل آماری.

همه نتایج حداقل سه بار مستقل برای تأیید تکرار شدند مگر اینکه خلاف آن مشخص شده باشد. نتایج نماینده نشان داده شده است. نتایج به صورت میانگین ± SEM نشان داده شده است. داده ها با استفاده از آزمون t-test دانشجویی دو طرفه یا U-test Mann-Whitney مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقایسه‌های چند گروهی با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه یا دوطرفه و سپس آزمون‌های مقایسه‌های چندگانه توکی انجام شد. تجزیه و تحلیل همبستگی با استفاده از ضریب همبستگی پیرسون (توزیع نرمال) انجام شد. معنی‌داری آماری در p < 0.05 تنظیم شد. تمام تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism نسخه 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA) انجام شد.

خلاصه گزارش

اطلاعات بیشتر در مورد طراحی تحقیق در خلاصه گزارش تحقیقات طبیعت مرتبط با این مقاله موجود است.

در دسترس بودن داده ها

داده های منبع در این مقاله ارائه شده است. داده‌های RNASeq تحت الحاق GEO GSE187464 و داده‌های scRNA-Seq تحت دسترسی GEO در دسترس هستند داده‌های منبع GSE187464 در این مقاله ارائه شده‌اند.

دریافت: 2 آوریل 2021; پذیرش: 17 ژانویه 2022.

منابع

1. ACS. آمار و ارقام سرطان 2020.

2. رهیب، ال و همکاران. پیش بینی بروز سرطان و مرگ و میر تا سال 2030: بار غیرمنتظره سرطان های تیروئید، کبد و پانکراس در ایالات متحده سرطان Res. 74، 2913-2921 (2014).

3. Kommalapati، A.، Tella، SH، Goyal، G.، Ma، WW & Mahipal، A. مدیریت معاصر سرطان پانکراس قابل برداشت موضعی. سرطان ها 10، 24 (2018).

4. Bliss، LA، Witkowski، ER، Yang، CJ & Tseng، JF نتایج در مدیریت جراحی سرطان پانکراس. جی. سرگ. اونکول. 110، 592-598 (2014).

5. Schizas، D. et al. ایمونوتراپی برای سرطان پانکراس: به روز رسانی 2020 درمان سرطان. Rev. 86، 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. بازدارنده های نقطه چک در سرطان پانکراس. درمان سرطان. Rev. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Immune checkpoint inhibitors در سرطان ریه و ملانوم. سمین. اونکول. پرستاران 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ بازدارنده های ایست بازرسی ایمنی برای سرطان سلول سنگفرشی سر و گردن: چشم انداز فعلی و جهت های آینده. سر. Neck 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. تنظیم و تعدیل ایمنی ضد تومور در سرطان پانکراس. نات. ایمونول. 21، 1152–1159 (2020).

10. رویال، RE و همکاران. کارآزمایی فاز 2 Ipilimumab تک عاملی (ضد CTLA{3}}) برای آدنوکارسینوم پانکراس به صورت موضعی پیشرفته یا متاستاتیک. J. Immunother. 33, 828-833 (2010).

11. O'Reilly، EM et al. دوروالوماب با یا بدون ترملیموماب برای بیماران مبتلا به آدنوکارسینوم مجرای پانکراس متاستاتیک: یک کارآزمایی بالینی تصادفی فاز 2. جاما اونکول. 5، 1431–1438 (2019).

12. ویس، جی جی و همکاران. مطالعه فاز Ib/II جمسیتابین، ناب پاکلی تاکسل و پمبرولیزوماب در آدنوکارسینوم پانکراس متاستاتیک. سرمایه گذاری. داروهای جدید 36، 96-102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. in Cancer Pancreatic and Tumor Micro Environment (Es Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (شبکه تحقیقاتی ترانس ورلد، 2012).

14. Karamitopoulou، E. ریزمحیط توموری سرطان پانکراس: چشم انداز ایمنی توسط ویژگی های مولکولی و هیستوپاتولوژیک دیکته می شود. برادر J. Cancer 121، 5-14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarisetty, VG Hypoxia به عنوان مانعی برای ایمونوتراپی در آدنوکارسینوم پانکراس. کلین ترجمه پزشکی 8، 10-10 (2019).

16. وانگ، دبلیو و همکاران. RIP1 کیناز باعث ایجاد تحمل ایمنی تطبیقی ​​با واسطه ماکروفاژها در سرطان پانکراس می شود. سلول سرطانی 38، 585-590 (2020).

17. Netea، MG و همکاران. ایمنی آموزش دیده: برنامه ای از حافظه ایمنی ذاتی در سلامت و بیماری. Science 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering، S. et al. القای متابولیک ایمنی تمرین شده از طریق مسیر موالونات. سلول 172، 135-146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. اپی ژنتیک و ایمنی آموزش دیده. آنتی اکسیدان سیگنال ردوکس 29، 1023–1040 (2018).

20. پریم، بی و همکاران. درمان آموزش دیده با نانوبیولوژی تقویت کننده ایمنی رشد تومور را سرکوب می کند و مهار ایست بازرسی را تقویت می کند. Cell 183, 786–801 e719 (2020).

21. کلافتی، ل و همکاران. آموزش ایمنی ذاتی گرانولپوئز فعالیت ضد توموری را افزایش می دهد. Cell 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. تعدیل پیش سازهای میلوپوئیز جزء جدایی ناپذیر ایمنی آموزش دیده است. Cell 172, 147-161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Trained immunity: برنامه ریزی مجدد ایمنی ذاتی در سلامت و بیماری. Annu Rev. Immunol. 39، 667-693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. توسعه و عملکرد ماکروفاژهای ساکن بافت در موش. سمین. ایمونول. 27, 369-378 (2015). 25. کالدرون، بی و همکاران. آناتومی پانکراس منشاء و خواص ماکروفاژهای ساکن را مشخص می کند. J. Exp. پزشکی 212، 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. فاکتور رونویسی MafB قطبش ضد التهابی M2 و جریان کلسترول را در ماکروفاژها ترویج می کند. علمی Rep. 7, 7591 (2017).

27. کیم، SY و همکاران. اثرات ضد التهابی آپوسینین، یک مهارکننده NADPH اکسیداز، در التهاب راه هوایی. ایمونول. سلول بیول. 90، 441-448 (2012).

28. لیو، ام. و همکاران. فاکتور رونویسی c-Maf یک نقطه بازرسی است که ماکروفاژها را در سرطان ریه برنامه ریزی می کند. جی. کلین. سرمایه گذاری. 130، 2081–2096 (2020).

29. Zimmerman، KA و همکاران. توالی یابی RNA تک سلولی، امضاهای بیان ژن ماکروفاژهای مقیم کلیه را در بین گونه ها شناسایی می کند. مربا. Soc. نفرول. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. et al. CCR2 با تعدیل تبدیل متقابل و عملکرد سلول های T موثر و تنظیم کننده، پاسخ ایمنی را تنظیم می کند. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara، T.، Warr، G.، Loy، J. & Bravo، R. نقص در استخدام ماکروفاژ و دفاع میزبان در موش‌های فاقد گیرنده کموکاین CCR2. J. Exp. پزشکی 186، 1757-1762 (1997).

32. Kuziel، WA و همکاران. کاهش شدید در چسبندگی لکوسیت و خارج شدن مونوسیت در موش های فاقد گیرنده کموکاین CC 2. Proc. Natl Acad. علمی USA 94, 12053–12058 (1997).

33. Kratofil، RM، Kubes، P. & Deniset، JF تبدیل مونوسیت در هنگام التهاب و آسیب. عروقی. ترومب. Vasc. Biol. 37، 35-42 (2017).

34. Funamizu، N. و همکاران. عامل بازدارنده مهاجرت ماکروفاژها انتقال اپیتلیال به مزانشیمی را تحریک می کند، تهاجمی تومور را افزایش می دهد و نتایج بالینی را در آدنوکارسینوم مجرای پانکراس برداشته شده پیش بینی می کند. بین المللی J. Cancer 132, 785-794 (2013).

35. Denz، A. و همکاران. مهار MIF منجر به توقف چرخه سلولی و آپوپتوز در سلول های سرطانی پانکراس می شود. جی. سرگ. Res. 160، 29-34 (2010).

36. سو، ال جی و همکاران. پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از گونه های اکسیژن فعال در آپوپتوز، اتوفاژی و فروپتوز. اکسید. پزشکی سلول Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. گلر، A.، Shrestha، R. & Yan، J. گلوکان مشتق از مخمر در سرطان: استفاده های جدید از یک درمان سنتی. بین المللی جی. مول. علمی 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. نقش اساسی مونوسیت ها و ماکروفاژها در پیشرفت پانکراتیت حاد. World J. Gastroenterol. 16, 3995-4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. مخزنی از ماکروفاژهای حفره بالغ که می توانند به سرعت به اندام های احشایی حمله کنند تا بر ترمیم بافت تأثیر بگذارند. سلول 165، 668-678 (2016).

40. Qi، C. و همکاران. مسیرهای متفاوتی که پاسخ‌های ایمنی ضد توموری ذاتی و تطبیقی ​​را توسط گلوکان‌های مشتق شده از مخمر ذرات و محلول تنظیم می‌کنند. Blood 117, 6825-6836 (2011).

41. گودریج، HS و همکاران. فعال شدن گیرنده ایمنی ذاتی دکتین-1 با تشکیل "سیناپس فاگوسیتیک". Nature 472, 471-475 (2011).

42. ماسودا، ی و همکاران. تجویز خوراکی گلوکان های محلول استخراج شده از Grifola frondosa باعث ایجاد پاسخ ایمنی ضد توموری سیستمیک و کاهش سرکوب سیستم ایمنی در موش های حامل تومور می شود. بین المللی J. Cancer 133، 108-119 (2013).

43. رایس، پی جی و همکاران. فارماکوکینتیک قارچ ({1}})-بتا-D-گلوکان به دنبال تزریق داخل وریدی در موش صحرایی. بین المللی ایمونوفارماکل. 4، 1209-1215 (2004).

44. Huang, Y. et al. قاچاق بین اندامی وابسته به S1P سلول های لنفوئید ذاتی گروه 2 از دفاع میزبان پشتیبانی می کند. Science 359, 114-119 (2018).

45. Mathä, L. et al. مهاجرت سلول های لنفوئید ذاتی ساکن گروه 2 ریه، التهاب آلرژیک ریه و ایمنی کبد را به هم مرتبط می کند. جلو. ایمونول. 12, 67950 (2021).

46. ​​ریکاردو-گونزالس، RR و همکاران. مسیرهای بافتی خاص، ILC2 های فعال شده را برای انتشار ایمنی نوع 2 بیرون می آورند. J. Exp. پزشکی 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. فعال کردن ایمنی ضد تومور با آزاد کردن ILC2. Cell Res. 30، 461-462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW تنوع ماکروفاژها پیشرفت و متاستاز تومور را افزایش می دهد. سلول 141، 39-51 (2010).

49. کیان، BZ و همکاران. CCL2 مونوسیت های التهابی را برای تسهیل متاستاز تومور سینه به کار می گیرد. Nature 475, 222-225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK فاگوسیتوز سلول های تومور توسط مونوسیت های انسانی کشت شده در فاکتور تحریک کننده کلنی ماکروفاژ نوترکیب. J. Exp. پزشکی 172، 231-237 (1990).

51. جادوس، ام آر و همکاران. ماکروفاژها سلول های تومور گلیوما T9 حامل ایزوفرم غشایی فاکتور محرک کلنی ماکروفاژ را از طریق یک مسیر وابسته به فاگوسیتوز می کشند. J. Immunol. 160, 361-368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. فاگوسیتوز سلول تومور با واسطه ماکروفاژها: فرصتی برای مداخله نانوپزشکی. Adv. کارکرد. ماتر 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR عملکرد فاگوسیتیک ماکروفاژهای مرتبط با تومور به عنوان یک عامل تعیین کننده کلیدی کنترل پیشرفت تومور: یک بررسی. J. Immunother. Cancer 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE ماکروفاژهای موشی فعال شده از طریق مکانیسم‌های وابسته به اکسید نیتریک یا مستقل، آپوپتوز را در سلول‌های تومور القا می‌کنند. سرطان Res. 54، 2462-2467 (1994).

55. Brahmer, JR et al. ایمنی و فعالیت آنتی بادی ضد PD-L1 در بیماران مبتلا به سرطان پیشرفته N. Engl. جی. مد. 366، 2455-2465 (2012).

56. Saijo, S. et al. دکتین-1 برای دفاع میزبان در برابر پنوموسیستیس کارینی مورد نیاز است اما در برابر کاندیدا آلبیکنس نه. نات. ایمونول. 8، 39-46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. تصفیه، زیست فعالی و تجزیه و تحلیل ساختار ثانویه فاکتور بازدارنده مهاجرت ماکروفاژهای موش و انسان (MIF). Biochemistry 33, 14144-14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: ارائه یک پلت فرم تجزیه و تحلیل برای تجزیه و تحلیل داده های سیتومتری جامعه و همکاری. کر. بالا. میکروبیول. ایمونول. 377، 127-157 (2014).

59. Nowicka، M. و همکاران. گردش کار CyTOF: کشف افتراقی در مجموعه داده های سیتومتری با ابعاد بالا با توان عملیاتی بالا. F1000 Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: ابزاری برای کشف کلاس با ارزیابی اطمینان و ردیابی آیتم. بیوانفورماتیک 26، 1572-1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: زیرساختی برای نمایش و تعامل با مجموعه داده‌های سیتومتری دروازه‌دار و بدون بسته. نسخه Bioconductor (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML برای به اشتراک گذاری داده های سیتومتری متقابل پلت فرم. سیتوم. بخش A: J. Int. Soc. مقعدی سیتول. 93، 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: ابزارهای تجزیه و تحلیل داده های سیتومتری. بسته R نسخه 1.10.3. HelenaLC/CATALYST (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM فرمت فایل Sanger FASTQ برای دنباله هایی با امتیازهای کیفی و انواع Solexa/Illumina FASTQ. Nucleic Acids Res. 38، 1767-1771 (2010).

65. ایلومینا. راهنمای کاربر BaseSpace. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: ابزار کنترل کیفیت برای داده های توالی توان عملیاتی بالا.

67. Dobin, A. et al. STAR: تراز کننده فوق سریع جهانی RNA-seq. بیوانفورماتیک 29، 15-21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. برآورد تعدیل شده تغییر برابر و پراکندگی برای داده های RNA-seq با DESeq2. ژنوم بیول. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. et al. تجزیه و تحلیل بیان ژن دیفرانسیل و رونوشت آزمایش‌های RNAseq با TopHat و Cufflinks. نات. پروتکل 7, 562-578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq – یک چارچوب پایتون برای کار با داده های توالی یابی با توان عملیاتی بالا. بیوانفورماتیک 31، 166-169 (2015).

71. بویل، EI و همکاران. GO::TermFinder–نرم افزار منبع باز برای دسترسی به اطلاعات هستی شناسی ژن و یافتن اصطلاحات هستی شناسی ژن به میزان قابل توجهی غنی شده مرتبط با لیستی از ژن ها. بیوانفورماتیک 20، 3710-3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: کیوتو دایره المعارف ژن ها و ژنوم ها. Nucleic Acids Res. 28، 27-30 (2000).

73. استوارت، تی و همکاران. ادغام جامع داده های تک سلولی سلول 177، 1888-1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC EmptyDrops: تمایز سلول ها از قطرات خالی در داده های توالی یابی RNA تک سلولی مبتنی بر قطره. ژنوم بیول. 20، 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. عادی سازی و تثبیت واریانس داده های RNA-seq تک سلولی با استفاده از رگرسیون دو جمله ای منفی منظم. ژنوم بیول. 20، 1-15 (2019).

76. Becht, E. et al. کاهش ابعاد برای تجسم داده های تک سلولی با استفاده از UMAP. نات. بیوتکنول. 37، 38-44 (2019).

77. دیاز-مجیا، جی جی و همکاران. ارزیابی روش‌های اختصاص برچسب‌های نوع سلول به خوشه‌های سلولی از داده‌های توالی‌یابی RNA تک سلولی. F1000 Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: تجزیه و تحلیل تنوع مجموعه ژن برای داده های ریزآرایه و RNA-seq. اطلاعات زیستی BMC. 14، 7 (2013).

79. فیناک، جی و همکاران. MAST: یک چارچوب آماری انعطاف پذیر برای ارزیابی تغییرات رونویسی و مشخص کردن ناهمگنی در داده های توالی یابی RNA تک سلولی. ژنوم بیول. 16، 1-13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. شناسایی سلولهای لنفوئیدی ذاتی در داده های تک سلولی RNA-Seq. ایمونوژنتیک 69، 439-450 (2017).

81. Entwistle، LJ و همکاران. فنوتیپ سلول لنفوئید ذاتی گروه 2 ریوی به زمینه خاص بستگی دارد: تعیین اثر فشار، مکان و محرک. جلو. ایمونول. 10, 3114 (2020).

82. ریکاردو-گونزالس، RR و همکاران. سیگنال‌های بافتی هویت ILC2 را با عملکرد پیش‌بینی نشان می‌دهند. نات. ایمونول. 19، 1093–1099 (2018).

83. زیلیونیس، آر و همکاران. رونویسی تک سلولی سرطان ریه انسان و موش، جمعیت های میلوئیدی حفظ شده را در افراد و گونه ها نشان می دهد. Immunity 50, 1317-1334.e1310 (2019).

قدردانی

نویسندگان مایلند از دکتر Wolfgang Zacharias، دکتر Mei Zhang و Sabine Waigel از مرکز ژنومیک مرکز سرطان براون برای کمک آنها در RNA-Seq و scRNASeq تشکر کنند. همچنین از دکتر کلینت گلر برای تصحیح نسخه خطی تشکر می کنیم. این کار توسط NIH R01CA213990 و R01AI128818 (JY) پشتیبانی شد. CD و CTW تا حدی توسط NIH P20GM135004 پشتیبانی شدند. بخشی از این کار با کمک UofL Genomics Facility که توسط NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence)، مرکز سرطان قهوه ای و هزینه های کاربر پشتیبانی می شود، انجام شد. CyTOF در Functional Immunomics Core پشتیبانی شده توسط NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI) انجام شد. توالی یابی و پشتیبانی بیوانفورماتیک برای این کار توسط NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) و NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI) ارائه شده است. محتوای این اثر صرفاً بر عهده نویسندگان است و دیدگاه‌های رسمی NIH یا مؤسسه ملی علوم پزشکی عمومی (NIGMS) را نشان نمی‌دهد.

مشارکت های نویسنده

AEG آزمایش‌ها را طراحی و اجرا کرد، داده‌ها را تجزیه و تحلیل کرد، نتایج را تفسیر کرد و دست‌نوشته را نوشت. RS، CD، و HG به طراحی تجربی، اکتساب داده ها و تجزیه و تحلیل داده ها کمک کردند. MRW، XH و MZ در جمع آوری داده ها و آماده سازی مواد کمک کردند. KA و ECR به تجزیه و تحلیل محاسباتی و تفسیر آنالیزهای RNA-Seq و JHC و ECR به تجزیه و تحلیل محاسباتی و تفسیر آنالیزهای ScRNA-Seq کمک کردند. DT و CTW به تجزیه و تحلیل داده های CyTOF کمک کردند. RAM، H.-gZ، و YL به مواد کمک کردند و پروژه را هدایت کردند. RAM یک بررسی انتقادی انجام داد. JY طراحی آزمایشی و مطالعه کلی را هدایت کرد، داده ها را تفسیر کرد، بر تحقیقات نظارت کرد، و در نوشتن و بررسی نسخه خطی کمک کرد.

منافع رقابتی

نویسندگان اظهار کردند که هیچ علاقه ای به رقابت ندارند.

اطلاعات تکمیلی

اطلاعات تکمیلی نسخه آنلاین حاوی مطالب تکمیلی است که در https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4 موجود است.

مکاتبات و درخواست مواد باید به Jun Yan ارسال شود.

اطلاعات بررسی همتایان

Nature Communications از جورج میلر و داور(های) ناشناس دیگر برای مشارکت در بررسی همتایان این اثر تشکر می کند. گزارش های بازبین همتا در دسترس است.

چاپ مجدد و اطلاعات مجوز در http://www.nature.com/reprints موجود است

یادداشت ناشر Springer Nature در مورد ادعاهای قضایی در نقشه های منتشر شده و وابستگی های سازمانی بی طرف باقی می ماند.

دسترسی آزاد این مقاله دارای مجوز Creative Commons Attribution 4 است.0 مجوز بین‌المللی، که اجازه استفاده، اشتراک‌گذاری، اقتباس، توزیع، و تکثیر را در هر رسانه یا قالبی می‌دهد تا زمانی که اعتبار مناسب را به نویسنده اصلی بدهید. (s) و منبع، پیوندی به مجوز Creative Commons ارائه دهید و نشان دهید که آیا تغییراتی ایجاد شده است یا خیر.

تصاویر یا سایر مطالب شخص ثالث در این مقاله در مجوز Creative Commons مقاله گنجانده شده است، مگر اینکه در خط اعتباری مطالب به گونه دیگری ذکر شده باشد. اگر مطالب در مجوز Creative Commons مقاله گنجانده نشده است و استفاده مورد نظر شما توسط مقررات قانونی مجاز نیست یا از استفاده مجاز فراتر می رود، باید مستقیماً از دارنده حق چاپ مجوز دریافت کنید. برای مشاهده یک کپی از این مجوز.

For more information:1950477648nn@gmail.com