مهارکننده پرولیل هیدروکسیلاز عامل القاء کننده هیپوکسی خوراکی انارودوستات با تغییرات در متابولیسم انرژی کلیوی در مراحل اولیه بیماری کلیوی دیابتی مقابله می کند.

تماس: emily.li@wecistanche.com

مقدمه

بخش نفرولوژی و غدد درون ریز، دانشکده پزشکی دانشگاه توکیو، توکیو، ژاپن. بورسیه تحقیقاتی برای دانشمندان جوان، انجمن ترویج علم ژاپن، توکیو، ژاپن؛ آزمایشگاه های تحقیقات بیولوژیکی و فارماکولوژیک،

موسسه تحقیقات دارویی مرکزی، شرکت توتون ژاپن، تاکاتسوکی، ژاپن؛ گروه فارماکولوژی سیستم ها، دانشکده پزشکی دانشگاه توکیو، توکیو، ژاپن. آزمایشگاه بیولوژی مصنوعی، مرکز RIKEN برای تحقیقات دینامیک بیوسیستم، سوئیتا، ژاپن. و مرکز تحقیقات بین المللی WPI برای هوش عصبی، مؤسسه مطالعات پیشرفته دانشگاه توکیو (UTIAS)، دانشگاه توکیو، توکیو، ژاپن.

مهارکننده های پرولیل هیدروکسیلاز فاکتور القایی هیپوکسی (HIF) که به عنوان تثبیت کننده های HIF نیز شناخته می شوند، تولید اریتروپویتین درون زا را افزایش می دهند و به عنوان عوامل درمانی جدید علیه کم خونی درمزمنکلیهمرض. HIF بیان ژن های مختلف مرتبط با متابولیسم انرژی را به عنوان یک پاسخ سازگار به هیپوکسی تحریک می کند. با این حال، این مبهم باقی می ماند که چگونه برنامه ریزی مجدد متابولیک بافت داخلی توسط تثبیت HIF بر پاتوفیزیولوژی بیماری تاثیر می گذارد.کلیه بیماری ها. مطالعات قبلی نشان می دهد که اختلالات متابولیک سیستمیک مانند هیپرگلیسمی و دیس لیپیدمی باعث تغییر در متابولیسم کلیه می شود که منجر به اختلال عملکرد کلیه از جمله بیماری کلیوی دیابتی می شود. در اینجا، ما اثرات انارودوستات (JTZ-951)، یک تثبیت کننده HIF خوراکی، بر متابولیسم انرژی کلیوی در مراحل اولیه بیماری کلیوی دیابتی را با استفاده از موش های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین و موش های دیابتی ناشی از آلوکسان تجزیه و تحلیل می کنیم. تجزیه و تحلیل رونوشت نشان داد که انارودوستات با تغییرات متابولیسم کلیوی دیابتی مقابله می کند. تجزیه و تحلیل رونوشت نشان داد که متابولیسم اسیدهای چرب و اسیدهای آمینه در بافت کلیوی دیابتی تنظیم مثبت شده و توسط انارودوستات کاهش می یابد، در حالی که متابولیسم گلوکز افزایش می یابد. این تغییرات متقارن با تجزیه و تحلیل متابولوم تایید شد. در حالی که متابولیت های چرخه گلیکولیز و تری کربوکسیلیک اسید در بافت کلیوی حیوانات دیابتی انباشته شده و اسیدهای آمینه کاهش می یابد، این اختلالات متابولیک توسط انارودوستات کاهش می یابد. علاوه بر این، انارودوستات باعث افزایش نسبت گلوتاتیون به گلوتاتیون دی سولفید و کاهش استرس اکسیداتیو در بافت کلیه حیوانات دیابتی شد. بنابراین، تثبیت HIF با تغییرات در متابولیسم انرژی کلیوی که در مرحله اولیه رخ می دهد، مقابله می کنددیابتیکلیهمرض.

سیستانچ برای عملکرد کلیه بسیار مفید است

بیانیه ترجمه

مهارکننده های پرولیل هیدروکسیلاز فاکتور القای هیپوکسی (HIF) (همچنین به عنوان تثبیت کننده های HIF شناخته می شوند) تولید اریتروپویتین درون زا را افزایش می دهند و به عنوان عوامل درمانی جدید در برابر کم خونی عمل می کنند.مزمنکلیهمرض. تحلیل‌های رونوشت و متابولوم بافت کلیوی ما در مدل‌های دیابتی موش و موش نشان داده است که انارودوستات (JTZ{0}})، یک تثبیت‌کننده خوراکی HIF، با تغییرات متابولیسم انرژی کلیوی در مراحل اولیه بیماری کلیوی دیابتی مقابله می‌کند. نتایج داده‌های مهمی را برای برون‌یابی اثرات تثبیت‌کننده‌های HIF بر متابولیسم انرژی کلیوی در محیط‌های بالینی فراهم می‌کنند، اگرچه مطالعات بیشتری برای روشن شدن اینکه چگونه این برنامه‌ریزی مجدد متابولیسم کلیوی توسط تثبیت‌کننده‌های HIF بر پیشرفت بیماری تأثیر می‌گذارد، مورد نیاز است.دیابتیکلیهمرض.

مقدمه

مهارکننده‌های پرولیل هیدروکسیلاز فاکتور القای هیپوکسی (HIF) تولید اریتروپویتین درون‌زا را افزایش می‌دهند و به عنوان عوامل درمانی جدید در برابر کم‌خونی در بیماران مزمن عمل می‌کنند.کلیهمرض. سلول ها دارای مکانیسم دفاعی در برابر هیپوکسی هستند و HIF تنظیم کننده اصلی این دفاع است. کلیه ها از نظر فیزیولوژیکی در معرض هیپوکسی قرار دارند و هیپوکسی مزمن به عنوان آخرین مسیر مشترک منجر به بیماری کلیه در مرحله نهایی شناخته می شود. با توجه به اینکه HIF بیان ژن‌های مختلف مرتبط با پاسخ‌های هیپوکسی را القا می‌کند، تثبیت‌کننده‌های HIF ممکن است اثرات پلیوتروپیک بر پیشرفت بیماری داشته باشند.کلیهبیماری هاو همچنین بهبود کم خونی در مزمنکلیهمرض. جالب توجه است که HIF بیان ژن‌های گلیکولیتیک و پیروات دهیدروژناز کیناز را القا می‌کند، که پیرووات دهیدروژناز را از استفاده از پیرووات برای سوخت چرخه اسید تری کربوکسیلیک میتوکندری (TCA) مهار می‌کند. برای سازگاری سلول های در معرض محیط های هیپوکسیک. با این حال، این مبهم باقی می ماند که چگونه برنامه ریزی مجدد متابولیک بافت کلیه توسط تثبیت HIF بر پاتوفیزیولوژی بیماری تاثیر می گذارد.کلیه بیماری ها. بیماری کلیوی دیابتی (DKD) علت اصلی بیماری کلیه در مرحله نهایی است. اختلالات متابولیک سیستمیک مانند هیپرگلیسمی و دیس لیپیدمی باعث تغییرات متابولیسم کلیه می شود که منجر به اختلال عملکرد کلیه از جمله DKD می شود. مطالعات قبلی افزایش شار متابولیک و تجمع متابولیت‌های چرخه گلوکز و TCA را در بافت قشر کلیه دیابتی نشان داده‌اند که ممکن است با اختلال عملکرد میتوکندری و پیشرفت DKD مرتبط باشد. ما فرض کردیم که تثبیت کننده های HIF ممکن است تغییرات متابولیسم را در بافت قشر کلیه دیابتی معکوس کنند، با توجه به اینکه HIF، به عنوان یک پاسخ تطبیقی ​​به هیپوکسی، شار متابولیک در سلول ها را برای سرکوب مصرف اکسیژن کاهش می دهد. بنابراین، با استفاده از تجزیه و تحلیل ترانس کریپتوم و متابولوم، ما یک مطالعه اثبات مفهوم انجام دادیم تا به طور جامع درک کنیم که چگونه انارودوستات (JTZ{3}})، یک تثبیت کننده خوراکی HIF، بر تغییرات متابولیسم کلیوی که در مراحل اولیه DKD رخ می دهد، تأثیر می گذارد.

نتایج: Enarodustat برنامه ریزی مجدد متابولیک را از چرخه TCA به گلیکولیز در سلول های لوله پروگزیمال کلیه القا می کند.

از آنجایی که قشر کلیوی عمدتاً از لوله های پروگزیمال تشکیل شده است، ابتدا اثرات انارودوستات را بر روی شار متابولیک سلول های لوله پروگزیمال کلیه در شرایط آزمایشگاهی بررسی کردیم. ابتدا، تست استرس میتو (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) و سنجش میزان گلیکولیتیک (Agilent) در سلول‌های HK{0}} کشت داده شده، یک رده سلولی اپیتلیال لوله پروگزیمال انسانی (شکل 1a) انجام شد. Enarodustat به طور قابل توجهی تنفس میتوکندری (چرخه TCA) را کاهش داد و گلیکولیز پایه را افزایش داد، که نشان دهنده برنامه ریزی مجدد متابولیک از چرخه TCA به گلیکولیز است (شکل 1؛ شکل تکمیلی S1). ما همچنین آزمایشی را با استفاده از RNA مداخله گر کوچک (siRNA) برای HIF-1 انجام دادیم (شکل 2؛ شکل تکمیلی S2). کاهش HIF{7}} توسط siRNA تغییرات متابولیکی (تنفس پایه، حداکثر تنفس، ظرفیت تنفسی اضافی و تولید آدنوزین تری فسفات [ATP]) ناشی از انارودوستات را معکوس کرد، که نشان داد برنامه‌ریزی مجدد متابولیک عمدتاً از طریق HIF انجام می‌شود{8} تثبیت (شکل 2؛ شکل تکمیلی S2). فعالیت پیرووات دهیدروژناز، عامل مهمی برای سلول‌ها برای استفاده از پیرووات برای سوخت چرخه TCA، نیز توسط انارودوستات کاهش یافت (شکل 2f)، که با مشاهدات منتشر شده قبلی سازگار بود.

داده های پس زمینه موش های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین

از نتایج آزمایش‌های آزمایشگاهی، ما فرض کردیم که تثبیت‌کننده‌های HIF ممکن است تغییرات متابولیسم را در بافت قشر کلیه دیابتی از طریق برنامه‌ریزی مجدد متابولیک از چرخه TCA تا گلیکولیز کاهش دهند. ما ابتدا موش‌های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین (STZ) را به‌عنوان مدلی برای آزمایش اثبات مفهوم انتخاب کردیم تا فرضیه فوق‌الذکر را آزمایش کنیم. در این مدل، دیابت به سرعت القا می شود و به ما اجازه می دهد تا اثرات خالص دیابت و تثبیت کننده های HIF را بر متابولیسم انرژی در بافت کلیه در مدت زمان کوتاهی مشاهده کنیم. پروتکل مطالعه و داده های اولیه از آزمایشات در موش های دیابتی ناشی از STZ در شکل 3a نشان داده شده است. ما موش‌ها را به 3 گروه تقسیم کردیم: گروه A (شم)، گروه B (DKD) و گروه C (DKD þ enarodustat). سطح گلوکز پلاسمای خون، هموگلوبین گلیکوزیله HbA1c، تری گلیسیرید و کلسترول تام در روز 14 در گروه های دیابتی در مقایسه با گروه A به طور قابل توجهی افزایش یافت، در حالی که تفاوت معنی داری بین گروه B و C وجود نداشت (شکل 3d-g). اگرچه سطح کراتینین پلاسما بین گروه ها تفاوتی نداشت، دفع آلبومین ادراری به طور قابل توجهی افزایش یافت و گلومرولومگالی در گروه B در مقایسه با گروه A قابل توجه بود و انارودوستات تمایل به معکوس کردن این تغییرات داشت (شکل 4). سطح نیتروژن اوره خون در گروه های دیابتی بالاتر بود که نشان دهنده کم آبی بدن به دلیل دیابت است. به طور خلاصه، کلیه های موش های تحت درمان با STZ در مطالعه ما نشان دهنده مراحل اولیه DKD است. آنالیز رونوشت و متابولوم با استفاده از بافت قشر کلیوی این موش‌ها انجام شد.

تجزیه و تحلیل رونوشت بافت قشر کلیه

نتایج تجزیه و تحلیل رونوشت بافت قشر کلیه در شکل های 5 و 6 نشان داده شده است. تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی و تجزیه و تحلیل خوشه بندی سلسله مراتبی نشان داد که گروه های A، B و C به ترتیب به خوشه های مختلف جدا شدند (شکل 5a و b). ژن‌های بیان شده متفاوت توسط │log2 fold-change (FC) │ بزرگتر یا مساوی با 0.5 و مقدار Q <0.05 انتخاب="" شدند.="" هستی="" شناسی="" ژن="" و="" تجزیه="" و="" تحلیل="" مسیر="" متعارف="" نشان="" داد="" که="" ژن="" های="" مربوط="" به="" متابولیسم="" اسیدهای="" چرب="" در="" گروه="" b="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" a="" تنظیم="" مثبت="" شد.="" در="" مقابل،="" ژن="" های="" مربوط="" به="" متابولیسم="" گلوکز="" و="" پاسخ="" هیپوکسی="" از="" جمله="" شبکه="" hif{9}}="" در="" گروه="" c="" در="" مقایسه="" با="" آن="" تنظیم="" مثبت="" شد.="" با="" گروه="" b="" (شکل="" 5ج="" و="" د).="" ما="" همچنین="" تجزیه="" و="" تحلیل="" غنی‌سازی="" مجموعه="" ژنی="" (gsea)="" را="" با="" استفاده="" از="" داده‌های="" رونویسی="" انجام="" دادیم="" (شکل="" 6،="" جداول="" 1="" و="" 2).="" مجموعه="" ژن="" متابولیسم="" اسیدهای="" چرب="" و="" آمینو="" اسید="" در="" گروه="" b="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" a="" افزایش="" یافت="" (شکل="" 6).="" در="" مقابل،="" این="" مجموعه‌های="" ژنی="" کاهش="" یافتند،="" و="" مجموعه‌های="" ژنی="" متابولیسم="" گلوکز="" در="" گروه="" c="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" b="" افزایش="" یافت،="" که="" نشان="" می‌دهد="" انارودوستات="" تغییرات="" متابولیسم="" ناشی="" از="" دیابت="" را="" معکوس="" می‌کند="" (شکل="" 6).="" علاوه="" بر="" این،="" مجموعه‌های="" ژنی="" چرخه="" tca="" در="" گروه="" c="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" b="" کاهش="" یافت="" (جدول="" 2)،="" که="" با="" مفهوم="" برنامه‌ریزی="" مجدد="" متابولیک="" ناشی="" از="" انارودوستات="" در="" لوله‌های="" پروگزیمال="" مشاهده‌شده="" در="" مطالعه="" آزمایشگاهی="" ما="" سازگار="" است.="" به="" طور="" خلاصه،="" انارودوستات="" با="" تغییرات="" متابولیسم="" کلیوی="" دیابتی="" از="" دیدگاه="" ترانسکریپتومیک="" مقابله="">

تجزیه و تحلیل متابولوم بافت قشر کلیه

ما غلظت مطلق 116 متابولیت مرتبط با انرژی را در بافت قشر کلیوی موش‌ها (n =4، برای هر گروه) به‌طور تصادفی از هر گروه اندازه‌گیری کردیم (جدول تکمیلی S1؛ شکل تکمیلی S3). تجزیه و تحلیل تفکیک حداقل مربعات جزئی (PLS-DA) برای ارزیابی اهمیت تبعیض طبقاتی انجام شد (شکل 7). ما تجزیه و تحلیل غنی‌سازی متابولیت (MSEA) را با استفاده از متابولیت‌هایی با اهمیت متغیر PLS-DA در طرح‌بندی (VIP) امتیاز 1 دلار انجام دادیم. تفاوت در متابولیسم اسیدهای آمینه، مانند گلیسین، سرین، متیونین، آسپارتات، گلوتامات، آرژنین، پرولین، و ب-آلانین بین گروه های A و B مشخص شد. تفاوت‌هایی در متابولیسم اسید آمینه بین گروه‌های B و C نیز مشاهده شد. علاوه بر این، فرآیندهای متابولیسم گلوکز، مانند گلیکولیز و گلوکونئوژنز، روندهای متفاوتی را بین گروه‌های B و C نشان دادند (شکل 7).

تجسم داده‌های رونوشت و متابولوم روی نقشه مسیر متابولیک انرژی

ما داده‌های رونوشت و متابولوم را برای درک جامع تغییرات متابولیسم انرژی تجسم کردیم (شکل 8). متابولیت‌های گلیکولیز و چرخه TCA در گروه B در مقایسه با گروه A انباشته شده‌اند، که ممکن است به دلیل ورود بیش از حد گلوکز و تنظیم مثبت متابولیسم اسید چرب در DKD باشد. غلظت آمینو اسید در گروه B در مقایسه با گروه A کاهش یافت که منعکس کننده افزایش متابولیسم اسید آمینه است (شکل 8a). در مقابل، تجمع متابولیت های گلیکولیز توسط انارودوستات به دلیل تسهیل جریان گلیکولیز کاهش یافت. Enarodustat همچنین تغییرات ناشی از دیابت را در متابولیت های چرخه TCA و اسیدهای آمینه معکوس کرد (شکل 8b). علاوه بر این، انارودوستات تجمع گلوتاتیون دی سولفید (GSSG) را در بافت کلیوی دیابتی کاهش داد و بنابراین نسبت گلوتاتیون/GSSG بالاتری را نشان داد، که نشان می‌دهد انارودوستات استرس اکسیداتیو را در DKD کاهش می‌دهد (شکل 8a و b). کاهش استرس اکسیداتیو توسط سطوح نشانگر پراکسیداسیون لیپیدی مالون دی آلدئید در بافت قشر کلیه تایید شد: انارودوستات تجمع مالون دی آلدئید را در بافت قشر کلیه دیابتی معکوس کرد (شکل تکمیلی S4). به طور خلاصه، ادغام داده های ترانس کریپتوم و متابولوم نشان داده است که انارودوستات با تغییرات متابولیسم انرژی کلیوی که در مراحل اولیه DKD رخ می دهد، مقابله می کند.

تغییرات متقارن متابولیسم (دیابت در مقابل انارودوستات) در یک مدل جایگزین تایید شده است.

ما آنالیز رونوشت را در موش های دیابتی القاء شده با آلوکسان، مدل حیوانی دیگری از دیابت، انجام دادیم تا یافته های خود را در مدل موش تایید کنیم. پروتکل های مطالعه و داده های پس زمینه برای مدل موش در شکل 9 نشان داده شده است. دفع آلبومین ادراری در گروه B به طور قابل توجهی در مقایسه با گروه A افزایش یافت که توسط انارودوستات معکوس شد (شکل 9d). علاوه بر این، ما از تجزیه و تحلیل ابعادی جامع 3- (کوکتل‌های تصویربرداری مغز/بدن شفاف، بدون مانع، و تحلیل محاسباتی [CUBIC]– کلیه)16 برای تجسم گلومرول‌ها در کلیه استفاده کردیم. گلومرولومگالی در گروه B در مقایسه با گروه A قابل توجه بود که با انارودوستات معکوس شد (شکل 9e). تجزیه و تحلیل رونوشت بافت کلیه در موش های دیابتی القاء شده با آلوکسان تغییرات متقارن متابولیسم (دیابت در مقابل انارودوستات) را به همان روشی که در مدل موش صحرایی دیابتی ناشی از STZ نشان داد (شکل 10): متابولیسم اسید چرب توسط دیابت تنظیم شد، در حالی که گلوکز تنظیم شد. متابولیسم توسط انارودوستات تنظیم شد. علاوه بر این، متابولیسم اسید آمینه توسط دیابت تنظیم شده و توسط انارودوستات کاهش یافت. بنابراین، انارودوستات با تغییرات متابولیسم انرژی کلیوی که در مراحل اولیه DKD در مدل موش دیابتی القاء شده با آلوکسان و همچنین در مدل موش دیابتی ناشی از STZ رخ می‌داد، مقابله کرد.

بحث

در این مطالعه، ما نشان دادیم که انارودوستات (JTZ{0}})، یک تثبیت کننده خوراکی HIF، با تغییرات متابولیسم انرژی کلیوی که در مراحل اولیه DKD در مدل‌های دیابتی موش و موش رخ می‌دهد، مقابله می‌کند. آنالیزهای ترانسکریپتوم و متابولوم تغییرات متقارن متابولیسم را در بافت کلیه نشان داده اند (دیابت در مقابل انارودوستات): متابولیسم اسیدهای چرب و آمینو اسید در DKD تنظیم مثبت شد، در حالی که انارودوستات این مسیرها را کاهش داد و متابولیسم گلوکز را نیز تنظیم کرد (شکل 5-10).

به طور کامل مشخص نشده است که آیا تثبیت HIF اثرات محافظتی بر پاتوفیزیولوژی DKD دارد یا خیر. مطالعات قبلی نشان داده است که بافت کلیوی دیابتی در معرض هیپوکسی 17 قرار دارد و بیان HIF در بافت کلیه دیابتی برای پاسخ به شرایط هیپوکسیک آنها که تا حدی ناشی از استرس اکسیداتیو است، کافی نیست. تثبیت HIF توسط کلرید کبالت باعث بهبود وضعیت استرس اکسیداتیو و کاهش پروتئینوری می شود. آسیب توبولو بینابینی در DKD.19 ناشی از STZ نتایج مطالعه حیوانی همچنین نشان داد که تثبیت HIF در برابر ایجاد چاقی محافظت می کند، 20 حساسیت به انسولین را بهبود می بخشد، 20 و سطح کلسترول سرم را کاهش می دهد. DKD. در مقابل، تثبیت HIF سوپرافیزیولوژیک با حذف فون هیپل-لینداو برای القای فیبروز کلیوی گزارش شده است. نقش تثبیت HIF در پیشرفت DKD ممکن است با توجه به اثرات پلیوتروپیک HIF و وجود فنوتیپ های مختلف DKD وابسته به زمینه باشد. هدف از این مطالعه روشن کردن اثرات خالص تثبیت HIF بر متابولیسم انرژی در کلیه دیابتی بود. گزارش های قبلی نشان داده اند که تغییرات متابولیسم انرژی در DKD رخ می دهد. Sas و همکاران 10 افزایش شار متابولیک انرژی و تجمع متابولیت های گلوکز را در بافت قشر کلیه دیابتی نشان دادند که ممکن است با اختلال عملکرد میتوکندری مرتبط باشد. شما و همکاران 23 گزارش کردند که فومارات، یک متابولیت چرخه TCA، در بافت کلیوی دیابتی تجمع یافته و به طور مستقیم در پیشرفت DKD نقش داشته است. ما قبلاً نشان داده‌ایم که متابولیت‌های چرخه TCA در بافت کلیوی دیابتی تجمع می‌یابند که با مهار هم‌ترانسپورتر سدیم-گلوکز 2 یا محدودیت کالری معکوس شده است. در بیماران دیابتی نوع 1 بدون DKD در مقایسه با بیماران مبتلا به DKD تنظیم مثبت شد. فعال‌سازی PKM2 تجمع متابولیت‌های گلیکولیز را معکوس کرد و عملکرد میتوکندری را تا حدی با افزایش شار گلیکولیتیک بازیابی کرد. این گزارش‌های قبلی نشان می‌دهند که تجمع متابولیت‌های گلیکولیز و چرخه TCA ممکن است بر پیشرفت DKD تأثیر بگذارد، که می‌تواند با تسهیل گلیکوم PK2 کاهش یابد. فعال سازی در مطالعه ما، تثبیت HIF توسط انارودوستات تغییرات متابولیسم انرژی را معکوس کرد و تجمع متابولیت‌های گلیکولیز و چرخه TCA را در بافت قشر کلیوی دیابتی کاهش داد (شکل 8). بیان آنزیم های گلیکولیتیک از جمله PKM2 نیز توسط انارودوستات تنظیم شد (شکل تکمیلی S4B). علاوه بر این، انارودوستات تجمع GSSG را کاهش داد و نسبت گلوتاتیون/GSSG را افزایش داد، که نشان می‌دهد انارودوستات استرس اکسیداتیو را در DKD کاهش می‌دهد (شکل 8). این کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از انارودوستات نیز با تغییرات در سطوح مالون دی آلدئید در بافت قشر کلیه تایید شد (شکل تکمیلی S4A). این نتایج نشان می‌دهد که تثبیت HIF باید نقش محافظتی بر پاتوفیزیولوژی DKD حداقل از دیدگاه متابولیک داشته باشد. مسلم است که ما نمی‌توانیم بررسی کنیم که آیا برنامه‌ریزی مجدد متابولیک توسط تثبیت HIF تأثیر مستقیمی بر پیشرفت DKD دارد، زیرا ممکن است تشخیص اثرات خالص تغییرات متابولیسم بر نتیجه کلیوی به دلیل نقش پلیوتروپیک HIF غیرممکن باشد. با این حال، در مطالعه ما، دفع خفیف آلبومین ادراری و ناهنجاری های پاتولوژیک کلیوی (گلومرولومگالی و ضخیم شدن غشای پایه گلومرولی) ناشی از دیابت توسط انارودوستات، در ارتباط با عادی سازی متابولیسم انرژی کلیوی، کاهش یافت. ما ژن‌هایی را که تغییرات بیان آنها با سطوح آلبومین ادراری (257 پروب؛ 232 ژن) مرتبط بود از داده‌های ریزآرایه در مدل موش دیابتی ناشی از آلوکسان استخراج کردیم و تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر را انجام دادیم (شکل S5 تکمیلی). در نتیجه، مسیرهای مربوط به غشای میتوکندری و انتقال الکترون تنفسی در ارتباط با سطح آلبومین ادراری تنظیم می‌شوند، که نشان می‌دهد بار میتوکندری ارتباط نزدیکی با دفع آلبومین ادرار دارد. بنابراین، این احتمال وجود دارد که عادی سازی متابولیک بافت کلیه دیابتی توسط تثبیت کننده های HIF ممکن است بار میتوکندری را کاهش دهد و پیشرفت DKD را کاهش دهد. داده های ما پاتوفیزیولوژی DKD را از دیدگاه متابولیک به شرح زیر نشان می دهد: هیپرگلیسمی تقاضای انرژی برای بازجذب گلوکز در لوله های پروگزیمال کلیوی ایجاد می کند. بنابراین، چرخه TCA در میتوکندری به اجبار فعال می شود تا نیاز انرژی را در مراحل اولیه DKD (تغییر متابولیسم اسیدهای چرب و آمینو اسید) برآورده کند. و تثبیت کننده های HIF ممکن است این بار میتوکندری را با برنامه ریزی مجدد متابولیک از چرخه TCA تا گلیکولیز (کاهش متابولیسم اسیدهای چرب و آمینو اسید و تنظیم مثبت گلیکولیز) کاهش دهند که ممکن است نقش محافظتی در برابر پیشرفت DKD داشته باشد. مطالعات بیشتر از جمله omics تک سلولی مورد نیاز است تا روشن شود که چگونه بار میتوکندری در بافت کلیه به طور مستقیم بر پاتوفیزیولوژی DKD تأثیر می گذارد. سوال جالب دیگر این است که آیا تثبیت کننده های HIF به طور مستقیم بر جذب گلوکز در لوله های پروگزیمال تأثیر می گذارند؟ داده های آزمایشگاهی ما نشان داد که تولید ATP به طور قابل توجهی توسط انارودوستات از طریق برنامه ریزی مجدد متابولیک از چرخه TCA تا گلیکولیز کاهش می یابد (شکل های 1 و 2). با توجه به اینکه ATP برای بازجذب گلوکز توسط همترانسپورتر 2 سدیم-گلوکز مورد نیاز است، ابتدا فرض کردیم که بازجذب گلوکز ممکن است توسط انارودوستات غیرفعال شود. با این حال، سطح گلوکز ادرار بین گروه B و گروه C در هر دو مدل حیوانی تفاوت معنی‌داری نداشت (شکل S6 تکمیلی). احتمالاً کاهش تولید ATP توسط انارودوستات در شرایط فیزیولوژیکی در مقایسه با تأثیر آن در شرایط آزمایشگاهی بسیار خفیف‌تر است. بنابراین، تثبیت HIF، حداقل در آزمایش‌های حیوانی ما، بر جذب گلوکز از طریق انتقال‌دهنده سدیم-گلوکز 2 تأثیر نمی‌گذارد. مطالعه ما 2 محدودیت داشت. ابتدا، ما از موش‌های دیابتی ناشی از STZ و موش‌های دیابتی ناشی از آلوکسان به عنوان مدل‌های DKD در مراحل اولیه استفاده کردیم و اثرات کوتاه‌مدت شرایط دیابتی را مشاهده کردیم. با این حال، در محیط بالینی، تثبیت کننده های HIF برای بیماران مبتلا به کم خونی در مرحله آخر DKD تجویز می شود. مطالعات بیشتری برای درک اثر تثبیت HIF بر تغییرات متابولیسم کلیه در مرحله آخر DKD مورد نیاز است. دوم، این مطالعه فاقد قدرت آماری کافی با توجه به پراکندگی غلظت متابولیت‌ها در داده‌های متابولوم بود، در حالی که داده‌های رونوشت دارای قدرت آماری کافی برای روشن کردن کل تصویر متابولیسم انرژی بود. از آنجایی که متابولیت‌های زیادی تفاوت معنی‌داری بین گروه‌ها نشان نمی‌دهند، ما PLS-DA را انجام دادیم و متابولیت‌هایی را با امتیاز PLS-DA VIP بزرگ‌تر یا مساوی 1 برای MSEA انتخاب کردیم. اگرچه تأیید متقاطع تغییر متابولیک با استفاده از داده‌های متابولومیک به تنهایی دشوار است، نتایج تجزیه و تحلیل متابولوم با داده‌های ترانسکریپتومی سازگار بود (شکل‌های 7 و 8)، که پشتیبانی بیشتری از اثرات مشاهده‌شده تغییرات رونوشت بر متابولیسم انرژی کلیوی ارائه می‌دهد. در نتیجه، انارودوستات (JTZ-951)، یک تثبیت کننده خوراکی HIF، با تغییرات متابولیسم انرژی کلیوی در مراحل اولیه DKD مقابله می کند. مطالعه ما نشان می دهد که تثبیت HIF ممکن است به عنوان یک مداخله بالقوه عمل کند که متابولیسم انرژی کلیوی نامنظم را در DKD هدف قرار می دهد.

مواد و روش ها

تست استرس میتو و سنجش میزان گلیکولیتیک

سلول‌های HK-2 روی یک میکروپلیت چاهی با چگالی 1 * 10 کاشته شدند.⁴سلول/چاه در روز بعد، شار متابولیک در زمان واقعی توسط Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) با استفاده از کیت تست استرس Mito (103015-100؛ Agilent) یا Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100؛ Agilent) اندازه‌گیری شد. غلظت گلوکز، پیروات و گلوتامین در محیط کشت به ترتیب 10 میلی مول در لیتر، 1 میلی مول در لیتر و 2 میلی مول در لیتر بود.

انتقال siRNA

حذف HIF-1 توسط Stealth RNAi برای HIF1A انسانی انجام شد (HSS104774 [#1] و HSS104775 [#2]؛ Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Stealth RNAi siRNA کنترل منفی Med GC Duplex #2 (12935112؛ Thermo Fisher Scientific) به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

وسترن بلاتینگ

آنتی بادی های اولیه مورد استفاده برای رنگ آمیزی آنتی بادی ضد HIF{1}} (پلی کلونال خرگوش، 1:500؛ Novus Biologicals، Littleton، CO) و آنتی بادی ضد اکتین انسانی (پلی کلونال خرگوش، 1:1000؛ Sigma-Aldrich، St. لوئیس، MO). یک آنتی بادی ثانویه آنتی بادی IgG ضد خرگوش کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی بود ({10}}، 1:5000؛ Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

آزمایشات روی حیوانات

Crl: موش CD (Sprague Dawley) و موش Crl: CD1 (موسسه تحقیقات سرطان) از آزمایشگاه Charles River Japan Inc. (یوکوهاما، ژاپن) به دست آمد. همه آزمایش‌ها توسط هیئت بازبینی مؤسسه‌ای دانشگاه توکیو تأیید شد (شماره تأیید P17-110). تمام روش های حیوانی بر اساس دستورالعمل های مؤسسه ملی بهداشت (راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی) انجام شد. پروتکل های مطالعه در شکل های 3 و 9 نشان داده شده است.

تجزیه و تحلیل رونوشت

RNA کل از بافت قشر کلیوی با استفاده از کیت GenElute Mammalian Total RNA Miniprep (RTN7{{1{12}}}}؛ Sigma-Aldrich) جدا شد. RNA کل (100 نانوگرم) با استفاده از کیت برچسب‌گذاری سریع آمپر ورودی کم (Agilent) برچسب‌گذاری شد و سپس به SurePrint G3 Rat GE v{4}}x60K Microarray (برای موش، Agilent) و SurePrint G3 Mouse GE v{7 هیبرید شد. }}میکروآرایه x60K (برای ماوس)، به ترتیب. تمام آزمایشات ریزآرایه توسط DNA Chip Research Inc. (توکیو، ژاپن) انجام شد. داده‌های خام با بسته R در Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) پردازش شدند تا تصحیح پس‌زمینه و نرمال‌سازی داده‌ها با استفاده از روش نرمال‌سازی چندک انجام شود. اثرات دسته ای توسط ComBat (Bioconductor) در آزمایش موش حذف شد. ژن‌های بیان‌شده با │log2 FC│ بزرگتر یا مساوی 0.5 و مقدار Q <0.05 تعیین="" شدند.="" هستی="" شناسی="" ژن="" و="" آنالیزهای="" مسیر="" متعارف="" با="" استفاده="" از="" موتور="" همبستگی="" basespace="" (illumina،="" san="" diego،="" ca)="" انجام="" شد.="" داده‌های="" ریزآرایه="" به‌عنوان="" سری‌های="" gse131221="" (rat)="" و="" gse139317="" (موس)="" در="" مرکز="" ملی="" اطلاعات="" بیوتکنولوژی="" اطلاعات="" ژنی="" omnibus="" ذخیره="">

تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن

GSEA یک روش محاسباتی است که تعیین می‌کند آیا مجموعه‌ای از ژن‌های تعریف‌شده از نظر آماری تفاوت‌های قابل‌توجه و همخوانی را بین دو حالت بیولوژیکی نشان می‌دهد یا خیر. GSEA با استفاده از GSEA v.3 انجام شد.{2}} (Broad Institute, Cambridge, MA). مسیرهای با نرخ کشف نادرست < 0.25="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

تجزیه و تحلیل متابولوم

اندازه گیری متابولوم توسط Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka، ژاپن) انجام شد. غلظت متابولیت با نرمال کردن سطح پیک هر متابولیت با توجه به مساحت استاندارد داخلی و با استفاده از منحنی‌های استاندارد که از کالیبراسیون‌های 3-نقطه‌ای به‌دست آمد، محاسبه شد. همچنین به روش های تکمیلی مراجعه کنید.

تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه متابولیت

تجزیه و تحلیل داده های متابولومیک با استفاده از پلتفرم یکپارچه مبتنی بر وب MetaboAnalyst 4 انجام شد.{2}}. PLS-DA انجام شد و نمرات VIP مرتبط محاسبه شد. متابولیت‌های دارای امتیاز VIP PLS-DA بیشتر یا مساوی 1 برای MSEA استفاده شد.

تعیین کمیت نواحی گلومرولی در آسیب شناسی کلیه

ما به طور تصادفی 3 عکس پاتولوژیک از تصویر رنگ آمیزی اسید پریودیک-شیف هر نمونه گرفتیم و هر ناحیه گلومرولی را به ترتیب با استفاده از فیجی (توزیع ImageJ؛ موسسه ملی بهداشت، Bethesda، MD) اندازه گیری کردیم.

CUBIC- کلیه

طبق مقالات قبلی ما، تصویربرداری 3-بعدی جامع از گلومرول‌ها در بافت کلیه با استفاده از CUBIC انجام شد. به طور خلاصه، کلیه های ثابت موش در CUBIC-L برای حذف چربی غوطه ور شدند و سپس تحت رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس قرار گرفتند. در نهایت، ضریب شکست با قرار دادن نمونه ها در CUBIC-R plus مطابقت داده شد. تصاویر سه بعدی جامع از کلیه های شفاف با میکروسکوپ فلورسانس ورقه نوری سفارشی ساخته شده است (MVX10-LS؛ Olympus، توکیو، ژاپن). آنتی بادی اولیه مورد استفاده برای رنگ آمیزی آنتی بادی ضد پودوسین بود (پلی کلونال خرگوش، 1:100، P0372؛ سیگما آلدریچ). آنتی بادی ثانویه آلکسا آرد 555- کونژوگه الاغ ضد خرگوش IgG بود (1:100، A-31572؛ Invitrogen، Thermo Fisher Scientific).

تحلیل آماری

برای مقایسه‌های چندگانه، {{0}}تحلیل واریانس راه و به‌دنبال آن آزمون‌های مقایسات چندگانه توکی، در صورت لزوم، اعمال شد. تمامی تجزیه و تحلیل های آماری با نرم افزار GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA) انجام شد. P <0.05 از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="" شد.="" داده="" ها="" به="" عنوان="" میانگین="" ±="" انحراف="" معیار="" ارائه="" شده="">

افشای

MN افتخاری، هزینه های مشاوره یا بودجه تحقیقاتی از KyowaHakko-Kirin، Akebia، Astellas، Chugai، GlaxoSmithKline، Japan Tobacco Inc. (JT)، Torii، Tanabe-Mitsubishi، Daiichi-Sankyo، Takeda، Ono، Bayerheimer، Boyering دریافت کرده است. ، و الکسیون. TT از JT کمک هزینه تحقیقاتی دریافت کرده است. Enarodustat (JTZ-951) توسط JT، توکیو، ژاپن ارائه شد. EAS و HRU مخترع اختراعات متعلق به RIKEN هستند. بخشی از این مطالعه با همکاری شرکت Olympus و نرم افزار مهربان پشتیبانی شده توسط Bitplane انجام شد. نویسنده دیگر هیچ علایق رقیبی را اعلام نکرد.

قدردانی

ما از دکتر شوهی یائو و دکتر شینجی تاناکا برای بحث های ارزشمند سپاسگزاریم. ما همچنین از دکتر Tsuyoshi Inoue، دکتر Satoru Fukuda و خانم Kahoru Amitani برای پشتیبانی فنی تشکر می کنیم. این کار تا حدی تحت حمایت مرکز علمی ایزوتوپ، دانشگاه توکیو انجام شد. این کار توسط همکار پژوهشی Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (کمک JSPS KAKENHI 19J11928 به SH)، Grant-in-Aid برای تحقیقات علمی (B) (کمک JSPS KAKENHI 18H02824 به MN) پشتیبانی شد. کمک هزینه برای تحقیقات علمی (C) (کمک JSPS KAKENHI 17K09688 به TT)، و کمک هزینه برای تحقیقات علمی در زمینه های نوآورانه (کمک مالی KAKENHI 26111003 به MN).