جنین گورخرماهی به عنوان مدلی برای آزمایش اثرات محافظتی ترکیبات آنتی اکسیدانی غذا

پست الکترونیکtina.xiang@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر.

خلاصه:آنتی اکسیدانفعالیت ترکیبات غذایی به دلیل فواید سلامتی و ارتباط آن با پیشگیری از بیماری های مزمن یکی از خواصی است که بیشترین توجه را به همراه دارد. این فعالیت معمولاً با استفاده از روش‌های آزمایشگاهی اندازه‌گیری می‌شود، که نمی‌توانند اثرات یا مکانیسم‌های عمل را در داخل بدن پیش‌بینی کنند. هدف از این مطالعه ارزیابی اثرات حفاظتی در داخل بدن شش ترکیب فنلی (نارینژنین، آپیژنین، روتین، اولئوروپئین، اسید کلروژنیک و کورکومین) و سه کاروتنوئید (لیکوپن B، -کاروتن و آستاگزانتین) بود که به طور طبیعی در غذاهای مصرف‌کننده وجود دارند. مدل جنین گورخرماهی جنین گورخرماهی با هر یک از 9 ترکیب آنتی اکسیدانی پیش تیمار شد و سپس در معرض ترت بوتیل هیدروپراکسید (tBOOH) قرار گرفت، یک القاء کننده شناخته شدهاسترس اکسیداتیودر گورخرماهی تفاوت های معنی داری با مقایسه غلظت-پاسخ کشندگی و بدشکلی ناشی از tBOOH در برابر جنین های از قبل تیمار شده باآنتی اکسیدانترکیبات. اثر محافظتی هر ترکیب، به جز کاروتن، در برابر کشندگی ناشی از استرس اکسیداتیو، پیدا شد. علاوه بر این، آپیژنین، روتین و کورکومین نیز اثرات محافظتی در برابر دیس‌مورفوژنز نشان دادند. از سوی دیگر، کاروتن در مقایسه با تیمار tBOOH به تنهایی، کشندگی و بدشکلی را افزایش داد.

کلید واژه ها: استرس اکسیداتیو؛ جنین گورخرماهی; اثر آنتی اکسیدانی؛ پلی فنول ها؛ کاروتنوئیدها

1. مقدمه

گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و گونه‌های نیتروژن فعال (RNS) در طول متابولیسم سلولی ایجاد می‌شوند. آنها برای یک وضعیت فیزیولوژیکی طبیعی ضروری هستند، اما در فرآیندهای پاتولوژیک در صورت بیش از حد شرکت می کنند [1]. موجودات هوازی دفاعی برای جلوگیری از آسیب اکسیداتیو ناشی از ROS دارندآنتی اکسیدانآنزیم ها و/یا مکانیسم های غیر آنزیمی، از جمله ترکیبات آنتی اکسیدانی تولید شده درون زا یا مصرف آنتی اکسیدان ها در رژیم غذایی [2].
عدم تعادل، زمانی که غلظت گونه های واکنش پذیر بالاتر از میزان باشدآنتی اکسیداندفاع از ارگانیسم نامیده می شوداسترس اکسیداتیو(OS) [3]. عواقب سیستم عامل شامل استخدام ماکروفاژها است. مهار عملکرد طبیعی لیپیدها و پروتئین ها؛ و آسیب میتوکندری، غشاء و DNA [4-7]. این تغییرات با آسیب‌شناسی‌های متعددی مانند سرطان، پیری، دیابت، آرتریت روماتوئید، و بیماری‌های قلبی عروقی و نورودژنراتیو از جمله موارد دیگر مرتبط است [8-11].

چندین مطالعه نشان داده اند که یک ارگانیسم به دریافت آنتی اکسیدان ها از طریق رژیم غذایی برای کاهش آسیب اکسیداتیو [12] در موقعیت های فیزیوپاتولوژیک (به دلیل قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش، سیگار کشیدن، هوای آلوده و غیره) نیاز دارد که ROS اضافی تولید می کند. آنتی اکسیدان های مختلفی مانند ترکیبات فنلی، ویتامین ها، کاروتنوئیدها و ... از طریق رژیم غذایی وارد بدن می شوند.فلاونوئیدها. اصطلاح "ترکیبات فنولی" به هر ماده ای اطلاق می شود که گروه فنلی آن به ساختارهای معطر یا آلیفاتیک متصل باشد. ترکیبات فنلی از گیاهان می آیند و از مهم ترین متابولیت های ثانویه هستند. حضور آنها در قلمرو حیوانات به دلیل مصرف آنها از طریق رژیم غذایی است. از جمله این ترکیبات،فلاونوئیدهامطالعه شده ترین و فراوان ترین هستند. ساختار شیمیایی آنها حاوی الففلاونوئیدهسته ای که از 15 اتم کربن تشکیل شده است که در سه حلقه (C6-C3-C6) مرتب شده اند [13]. مکانیسم های آنتی اکسیدانی آنها شامل مهار آنزیم ها یا کیلاسیون عناصر کمیاب دخیل در تولید رادیکال های آزاد، جذب ROS و محافظت از دفاع آنتی اکسیدانی درون زا است [14]. میانگینفلاونوئیدمیزان مصرف آن 23 میلی گرم در روز تخمین زده می شود [15،16] و منابع اولیه چای سیاه، شراب قرمز، پیاز، سیب و آبجو هستند [17،18].

گروه دیگری از ترکیباتی که به دلیل فعالیت آنتی اکسیدانی مورد مطالعه قرار گرفته اند، کاروتنوئیدها هستند. آنها رنگدانه‌هایی هستند که ساختار آنها شامل یک سری پیوندهای C=C مزدوج (پلی‌ن) است که به آنها اجازه می‌دهد با رادیکال‌های آزاد تعامل داشته باشند. بنابراین، آنها می توانند به عنوان آنتی اکسیدان موثر عمل کنند [19]. کاروتنوئیدها به طور گسترده در سیستم های طبیعی توزیع می شوند و نقش آنها در پیشگیری از بیماری های مختلف، عمدتاً برای ترکیبات موجود در رژیم غذایی مانند کاروتن، لوتئین و لیکوپن مورد مطالعه قرار گرفته است [18،20،21].

شناسایی نقش هایآنتی اکسیدان هادر بیماری ها و اختلالات مرتبط با فرآیندهای اکسیداتیو برای تجزیه و تحلیل اثرات محافظتی در داخل بدن ضروری است. به همین دلیل، آزمایشگاه ما یک مدل جنین گورخرماهی (ZF) برای ارزیابی اثرات محافظتی این جنین ایجاد کرده است.آنتی اکسیدانترکیبات [22].استرس اکسیداتیوبا استفاده از ترت بوتیل هیدروپراکسید (tBOOH) القا می شود. tBOOH رادیکال های بوتوکسیل را از طریق واکنش فنتون تولید می کند [23]. رادیکال‌های تشکیل‌شده به نفع کاهش درون سلولی گروه‌های تیول و ذخایر گلوتاتیون هستند و افزایش قابل‌توجهی در کشندگی و بدشکلی در جنین‌های گورخرماهی در معرض دید ایجاد می‌کنند. این مدل امکان مقایسه بین منحنی‌های اثر غلظت کشندگی و بدشکلی جنین‌های گورخرماهی در معرض tBOOH و منحنی‌های جنین‌های پیش تیمار شده با آنتی‌اکسیدان‌ها را فراهم می‌کند. تجزیه و تحلیل آماری را می توان برای کشف اثر محافظتی ترکیب آنتی اکسیدانی آنالیز شده انجام داد.

هدف از کار حاضر ارزیابی اثرات حفاظتی ترکیبات غذایی با فعالیت آنتی اکسیدانی در برابر سمیت رشدی ناشی از اکسیدان در جنین گورخرماهی بود.

2. نتایج

2.1. منحنی های اثر غلظت برای tBOOH در جنین گورخرماهی

گروه تحقیقاتی ما قبلا یک جنین ZF را توسعه داده و تایید کرده بوداسترس اکسیداتیومدلی که با آن می توان فعالیت حفاظتی را ارزیابی کردآنتی اکسیدانمواد (22).

جنین گورخرماهی در معرض ترت بوتیل هیدروپراکسید (tBOOH) قرار می گیرد تا منحنی های کشندگی و بدشکلی به دست آید. جنین های گورخرماهی 24 تا 48 ساعت پس از لقاح (hpf) در غلظت های مختلف، از 1 تا 3.5 میلی مولار در معرض tBOOH قرار می گیرند (شکل 1). غلظت کشنده 50 (LC50) 2.1 میلی مولار کشف شد، در حالی که غلظت موثر 50 برای دیس‌مورفوژنز (EC50) 1.7 میلی‌مولار بود. منحنی‌های ذکر شده در بالا برای مقایسه جنین‌های گورخرماهی که قبلاً در معرض ترکیبات آنتی‌اکسیدانی قرار گرفته‌اند یا نه، مورد استفاده قرار گرفتند و پس از آن در معرض tBOOH قرار گرفتند.

2.2. شناسایی اثرات حفاظتی ترکیبات آنتی اکسیدانی در جنین گورخرماهی

مدل گورخرماهی که قبلا توضیح داده شد برای ارزیابی اثرات محافظتی شش پلی فنل و سه کاروتنوئید موجود در غذا استفاده شد.

از شش پلی فنل، سه پلی فنول بودندفلاونوئیدها: نارینژنین (20 میکرومولار)، آپیژنین (10 میکرومولار) و روتین (10 میکرومولار). سهفلاونوئیدهارانش قابل توجهی در منحنی غلظت-پاسخ برای کشندگی ایجاد کرد. علاوه بر این، آپیژنین و روتین اثرات محافظتی در برابر دیس‌مورفوژنز نشان دادند، در حالی که نارینژنین هیچ اثر محافظتی در برابر بدشکلی از خود نشان نداد (شکل 2).

اولئوروپین (15 میکرومولار)، اسید کلروژنیک (20 میکرومولار) و کورکومین (15 میکرومولار) نیز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. این پلی فنل ها منجر به رانش قابل توجهی در منحنی غلظت-پاسخ برای کشندگی شدند. فقط کورکومین اثر محافظتی در برابر بدشکلی از خود نشان داد (شکل 3).

علاوه بر این، کاروتنوئیدهای لیکوپن (20 میکرومولار)، آستاگزانتین (20 میکرومولار) و -کاروتن (25 میکرومولار) مورد ارزیابی قرار گرفتند. لیکوپن و آستاگزانتین منجر به رانش قابل توجهی در منحنی غلظت-پاسخ برای کشندگی شدند. در مقابل، هیچ یک از کاروتنوئیدها اثر محافظتی در برابر دیس‌مورفوژنز نشان ندادند (شکل 4). علاوه بر این، کاروتن منجر به رانش به سمت چپ در منحنی‌ها برای کشندگی و بدشکلی می‌شود که می‌تواند یک اثر پرواکسیدانی احتمالی را نشان دهد.

3. بحث

اکسیژن برای زندگی انسان ضروری است. با این حال، در همان زمان، مواد سمی، مانند رادیکال های آزاد و گونه های اکسیژن فعال (ROS) تولید می کند. این مواد اکسید کننده، ناپایدار و واکنش پذیر هستند. علاوه بر این، آنها می توانند با هر درشت مولکولی واکنش نشان دهند و باعث آسیب سلولی شوند [24]. برای مقابله با این مواد اکسید کننده، بدن از آنزیم های آنتی اکسیدانی مانند سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز و ترکیبات آنتی اکسیدانی به دست آمده از رژیم غذایی استفاده می کند. بنابراین، مطالعه ظرفیت آنتی اکسیدانی ترکیبات در چند سال گذشته مورد توجه قرار گرفته است. چندین تکنیک در شرایط آزمایشگاهی برای تعیین فعالیت آنتی اکسیدانی وجود دارد، اگرچه آنها از نقطه نظر تغذیه محدودیت هایی دارند زیرا هیچ یک موقعیت فیزیولوژیکی را بازتولید نمی کند [25]. به همین دلیل، روشی که شامل تکنیک‌های in vivo می‌شود منجر به نتایج تأثیرگذارتری می‌شود، زیرا استرس اکسیداتیو مستلزم مکانیسم‌هایی است که به بسیاری از شرایط سیستم، به‌ویژه بخش‌های جنبشی واکنش‌ها بستگی دارد. تیم ما از یک مدل جنین ZF [22] استفاده کرد که می‌تواند روشی ارزشمند در داخل بدن باشد تا اثرات محافظتی نه ترکیب آنتی‌اکسیدانی را که به طور گسترده در شرایط آزمایشگاهی مورد مطالعه قرار گرفته‌اند، آزمایش کند. ما شش ترکیب فنلی و سه کاروتنوئید را ارزیابی کردیم. ترکیبات فنلی نقش مهمی در پتانسیل آنتی اکسیدانی رژیم غذایی انسان دارند. از میان این ترکیبات، فلاونوئیدها بیشترین مطالعه و فراوانی را دارند. فعالیت آنتی اکسیدانی فلاونوئیدهای آپیژنین، روتین و نارینژنین مورد مطالعه قرار گرفت. این فلاونوئیدها ترکیبات زیست فعالی هستند که عمدتاً در میوه‌ها، گیاهان و سبزیجات مختلف، آجیل و پیاز یافت می‌شوند. مطالعات آزمایشگاهی نشان داده اند که این فلاونوئیدها به طور موثر رادیکال های هیدروکسیل، سوپراکسید، پراکسید هیدروژن، رادیکال های اکسید نیتریک، DPPH و پراکسیداسیون لیپیدی را خنثی می کنند [26-29]. چن و همکاران، در سال 2012 [30]، تجزیه و تحلیل QSAR را با استفاده از مدل لارو ماهی گورخری برای ارزیابی ظرفیت‌های ROS مهار پانزده فلاونوئید، از جمله روتین، در برابر سمیت نوری ناشی از UV انجام دادند. مطابق با مطالعات قبلی، آنها به اهمیت دو گروه هیدروکسیل و موقعیت آنها، با حداقل دو گروه هیدروکسیل برای یک فعالیت بیولوژیکی قوی، نتیجه گرفتند [30،31]. علاوه بر این، مشخص شد که گروه‌های هیدروکسیل در موقعیت‌های C3، C5، و C7 پایداری و فعالیت فلاون بهتری را ایجاد می‌کنند [31]. نتایج ما یک اثر محافظتی در برابر کشندگی ناشی از tBOOH برای سه فلاونوئید نشان داد. آپیژنین و روتین نیز اثرات محافظتی در برابر دیس‌مورفوژنز نشان دادند. با این حال، نارینژنین هیچ اثری در برابر دیس‌مورفوژنز نشان نداد.

علاوه بر فلاونوئیدها، اثرات آنتی اکسیدانی اولئوروپئین، اسید کلروژنیک و کورکومین نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. مطالعات in vitro و in vivo نشان داده است که این

سه ترکیب فنلی دارای اثرات آنتی اکسیدانی مهمی هستند [32-34]. اولئوروپئین یک بیوفنول است که در برگ زیتون، روغن زیتون فوق بکر و برخی از گونه های خانواده Oleaceae یافت می شود [32]. اسیدهای کلروژنیک (CGAs) استرهایی هستند که بین اسیدهای کافئیک و کوینیک تشکیل می شوند و نشان دهنده گروهی از پلی فنول های موجود در رژیم غذایی انسان هستند [35]. چندین مطالعه نشان داده اند که نوشیدن نوشیدنی های حاوی CGA مانند قهوه، چای، شراب و آب میوه های مختلف خطر ابتلا به بیماری های مزمن مختلف را کاهش می دهد [36-38]. یکی از دلایل این کاهش ظرفیت آنتی اکسیدانی CGA ها است که اتم های هیدروژن را برای کاهش رادیکال های آزاد و مهار واکنش های اکسیداسیون اهدا می کنند [35]. کورکومین یک پلی فنول است که برای رنگ آمیزی و چاشنی در محصولات غذایی استفاده می شود. فعالیت آنتی اکسیدانی آن در چند سال گذشته مورد مطالعه قرار گرفته است و یک مطالعه نشان می دهد که می تواند از غشاهای زیستی در برابر آسیب پراکسیداتیو محافظت کند [39]. با استفاده از مدل جنین ZF، مشاهده شد که پیش تیمار با اولئوروپئین، اسید کلروژنیک، یا کورکومین اثر مرگ و میر ناشی از استرس اکسیداتیو ناشی از tBOOH را کاهش داد. با این حال، یک اثر حفاظتی قابل توجهی در برابر بدشکلی تنها برای کورکومین مشاهده شد.

گروه دیگری با خواص آنتی اکسیدانی، کاروتنوئیدها هستند، گروهی از رنگدانه های ایزوپرنوئید که در همه جا حاضر هستند. آنها خاموش کننده اکسیژن منفرد و جمع کننده ROS هستند [40]. مکانیسم های مولکولی زیربنایی فعالیت ضد و پرواکسیدانی کاروتنوئیدها هنوز به طور کامل شناخته نشده است. از جمله کاروتنوئیدهای مورد مطالعه، لیکوپن و کاروتن هستند. اینها را می توان به وفور در گوجه فرنگی، سس گوجه فرنگی، میوه های مختلف، جلبک ها و سبزیجات یافت [18،41]. هنگام ارزیابی اثرات محافظتی این کاروتن ها، مشخص شد که لیکوپن دارای فعالیت آنتی اکسیدانی با اثر محافظتی در برابر کشندگی جنینی است. با این حال، هیچ اثری در برابر بدشکلی یافت نشد. از سوی دیگر، -کاروتن بروز مرگ و میر و بدشکلی در جنین ZF را در مقایسه با اثر اکسیدان به تنهایی افزایش داد. این مطابق با مطالعاتی است که نشان داده‌اند که دوزهای بالای کاروتن دارای اثرات آنتی‌اکسیدانی است که به دنبال آن یک اثر پرواکسیدانی در تنش اکسیژن بالا می‌آید که ممکن است با اثرات نامطلوب آن مرتبط باشد [42]. علاوه بر این، یک مطالعه نشان داد که مکمل کاروتن در مقایسه با دارونما هیچ اثر محافظتی بر مرگ و میر کلی مردان سیگاری دیابتی ندارد [43]. کاروتنوئید دیگری که مورد ارزیابی قرار گرفت، آستاگزانتین بود. این یک کاروتنوئید زانتوفیل است که در جلبک ها، مخمر، ماهی قزل آلا، کریل، میگو و خرچنگ یافت می شود. این یک رنگدانه آنتی اکسیدانی قرمز و محلول در چربی است که هیچ فعالیت پرو ویتامین A ندارد [44]. در مطالعه ما، آستاگزانتین یک اثر محافظتی در برابر کشندگی نشان داد، اما هیچ اثری در برابر دیس‌مورفوژنز یافت نشد.

در نتیجه، هشت مولکول از نه مولکول ارزیابی شده فعالیت آنتی اکسیدانی با اثرات محافظتی در برابر کشندگی جنینی ZF نشان دادند. فقط آپیژنین (10 میکرومولار)، روتین (10 میکرومولار)، و کورکومین (15 میکرومولار) علاوه بر این اثرات محافظتی در برابر بدشکلی ناشی از استرس اکسیداتیو ناشی از tBOOH نشان دادند. در مقابل، مشخص شد که کاروتن اثر معکوس ایجاد می‌کند و میزان مرگ‌ومیر و بدشکلی را افزایش می‌دهد زیرا مقادیر LC50 و EC50 را کاهش می‌دهد. تعادل و زمان‌بندی نیروهای اکسیداتیو و آنتی‌اکسیداتیو کلید تنظیم و زمان‌بندی مناسب رشد جنینی است [45]. تفاوت در سینتیک یا مکانیسم اثر این آنتی اکسیدان ها می تواند دلیل اصلی ظرفیت های محافظتی مختلف در برابر بدشکلی باشد. مطالعات بیشتری مورد نیاز است تا بررسی شود که چرا فقط برخی از ترکیبات اثرات محافظتی بر مورفوژنز در طول رشد جنینی نشان دادند. در این مطالعه سعی شد بین اثر جنینی (کشندگی) و اثر بدشکلی (تراتوژنیسیتی) تمایز قائل شود. در برخی موارد، ناهنجاری ها ممکن است قبل از آن ایجاد شوند و منجر به مرگ شوند. در موارد دیگر، کشندگی و ناهنجاری ممکن است به دلایل مختلف باشد. استقلال این دو تظاهرات مشکوک خواهد بود اگر ترکیبی جدایی بین منحنی های غلظت-پاسخ کشنده و بدشکلی را افزایش دهد. تمام ترکیبات آنتی اکسیدانی آزمایش شده در مطالعه ما اثر تراتوژنیک را بیش از دوز کشنده بیش از دو بار افزایش ندادند. بنابراین، پتانسیل تراتوژنیک افزایش یافته برای هیچ ترکیب آنتی اکسیدانی مشاهده نشد [46].

در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که این مدل جنین ZF ابزار ارزشمندی برای تجزیه و تحلیل اثرات محافظتی مولکول‌های آنتی‌اکسیدان تشکیل‌دهنده غذا است. برای تعیین دلایل شیمیایی-ساختاری که آپیژنین، روتین و کورکومین بالاترین اثرات محافظتی را در مطالعه ما نشان دادند، تجزیه و تحلیل‌های بیشتری ضروری است. به عنوان مثال، برای تعیین روابط کمی ساختار-فعالیت (QSARs).

4. مواد و روش ها

4.1. بیانیه اخلاقی

رویه‌های مربوط به لارو و جنین گورخرماهی توسط کمیته اخلاق حیوانات دانشگاه بارسلونا، شماره مجوز یا پروتکل 7971 وزارت دام و شیلات دولت کاتالونیا (ProcedureDAAM 7971) مجاز بود.

4.2. مواد شیمیایی و محلول

آماده سازی ترت بوتیل هیدروپراکسید (tBOOH، شماره CAS: 75-91-2) و ترکیبات آنتی اکسیدانی از TCI اروپا تهیه شد. tBOOH در بافر Danieau's 0 حل شد. (NO3)2؛ 1.5 میلی مولار HEPES (N-({20}}هیدروکسی اتیل) پیپرازین-N{22}}(2-اتان سولفونیک اسید؛ pH 7.4).

نارینگنین (20 میکرومولار) (شماره CAS: 67604-48-2)، اولئوروپئین (15 میکرومولار) (شماره CAS:32619-42-4)، روتین (10 میکرومولار) (شماره CAS) : 207671-50-9)، اسید کلروژنیک (20 میکرومولار) (شماره CAS: 327-97-9)، آپیژنین (10 میکرومولار) (شماره CAS: 520-36-5)، کورکومین (15 میکرومولار) (شماره CAS: 458-37-7)، لیکوپن (20 میکرومولار) (شماره CAS: 502-65-8)، آستاگزانتین (20 میکرومولار) (شماره CAS: 472-61-7)، و -کاروتن (25 میکرومولار) (شماره CAS: 7235-40-7) از Sigmar-Aldrich® خریداری شدند. آنتی اکسیدان ها در 100 درصد دی متیل سولفوکسید (DMSO، Sigma Aldrich، مادرید، اسپانیا) حل شدند و متعاقباً در بافر 0.3× Danieau تا غلظت نهایی DMSO 0.05 درصد (v/v) رقیق شدند. آنتی اکسیدان ها در غلظت های مختلف، بسته به بالاترین غلظتی که در آن هیچ اثری بر کشندگی یا رشد جنینی مشاهده نشد، استفاده شد (حداکثر غلظت قابل تحمل، MTC)

4.3. نگهداری ماهی زبرافی و تولید تخم مرغ

گورخرماهی بالغ نوع وحشی در شرایط استاندارد نگهداری شد. جنین‌ها جمع‌آوری، تمیز و بر اساس قابلیت زنده‌مانی انتخاب شدند. جنین های بارور شده با آب استاندارد شده بر اساس استانداردهای سازمان بین المللی استاندارد (ISO) 7346-1 و 7346-2 (ISO، 1998؛ 2 میلی مولار CaCl2·2H2O، 0.5 میلی مولار MgSO4) تیمار شدند. ·7H2O، 0.75 میلی مولار NaHCO3، و 0.07 میلی مولار KCl). تخم‌های بارور شده بر اساس مطالعات قبلی کیمل و همکاران، 1995 [47] مرحله‌بندی شدند و برای قرار گرفتن در معرض بعدی تحت یک استریومیکروسکوپ کالبد شکافی انتخاب شدند (Motic SMZ168، Motic China Group، LTD.، Luwan، شانگهای، چین). جنین های ماهی در ویال های شیشه ای در دمای کنترل شده 1 ± 27 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

4.4. قرار گرفتن جنین گورخرماهی در معرض استرس اکسیداتیو (ترت بوتیل هیدروپراکسید)

برای تهیه منحنی tBOOH از روش Boix 2020 پیروی شد. این روش مبتنی بر به دست آوردن منحنی پاسخ غلظت-کشندگی (LC50) و بدشکلی (EC50) با قرار دادن جنین های ZF در معرض یک القاء کننده استرس اکسیداتیو، ترت بوتیل هیدروپراکسید (tBOOH) است. هنگامی که جنین گورخرماهی به دست آمد، آنها در محیط 0.3X Danieau از 0 تا 24 اسب بخار نگهداری می شوند. از 24 تا 48 hpf، جنین ها در معرض محلول های tBOOH در غلظت های مختلف، 1، 1.5، 2، 2.5، 3 و 3.5 میلی مولار قرار می گیرند. جنین از 3 کلاچ مختلف گورخرماهی در سه تکرار استفاده شد (شکل 5A).

4.5. تعیین اثرات حفاظتی ترکیبات آنتی اکسیدانی

برای تعیین اینکه آیا یک ترکیب اثر محافظتی در برابر استرس اکسیداتیو دارد، جنین های گورخرماهی ابتدا در معرض ترکیب آنتی اکسیدانی از 0 تا 24 hpf قرار گرفتند. غلظت ها بسته به سنجش حداکثر غلظت قابل تحمل محاسبه شد. سپس از 24 تا 48 hpf، جنین ها در معرض القا کننده استرس tBOOH قرار گرفتند. پس از آن، هر گروه از جنین ها در هر یک از غلظت های tBOOH مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 5B). برای تعیین اینکه آیا تفاوت معنی داری وجود دارد، منحنی قرار گرفتن در معرض tBOOH به تنهایی و منحنی پیش از قرار گرفتن در معرض ترکیب آنتی اکسیدانی مقایسه شد.

ده تخم بارور شده در معرض 2.5 میلی لیتر برای هر ماده و غلظت قرار گرفتند. سه تکرار مستقل با استفاده از تخم‌های مربوط به رویدادهای تخم‌ریزی مختلف انجام شد. جنین های ZF به مدت 24 ساعت از قبل در معرض ترکیبات آنتی اکسیدانی قرار گرفتند، سپس محلول آنتی اکسیدان حذف شد، شستشو با استفاده از محیط Danieau انجام شد و جنین های ZF در معرض غلظت های مختلف tBOOH قرار گرفتند. میزان کشندگی پس از 48 ساعت بررسی شد و میانگین جنین های مرده پس از سنجش مناسب محاسبه شد. برای ارزیابی بدشکلی، ما از سیستم امتیازدهی توصیف شده توسط Teixido و همکاران پیروی کردیم. [48] ​​برای محاسبه دیسمورفوژنز جنین در حدود 48 hpf. ما نه ویژگی مورفولوژیکی را انتخاب کردیم که در جدول 2 شرح داده شده است. فراوانی جنین های غیر طبیعی برای هر غلظت و گروه تیمار شده محاسبه شد (به عنوان جنین هایی با امتیاز 1 در هر ویژگی مورفولوژیکی تعریف می شود).

تغییر منحنی غلظت-پاسخ به سمت راست به دلیل قرار گرفتن قبل از قرار گرفتن در معرض آنتی اکسیدان ها نشان دهنده یک اثر محافظتی در برابر القاء کننده استرس اکسیداتیو است زیرا برای به دست آوردن نتایج مشابه با نتایجی که تنها با tBOOH مواجه شده اند، غلظت بالاتری از القاء مورد نیاز است. به دلیل قرار گرفتن قبل از قرار گرفتن در معرض آنتی اکسیدان ها، جابجایی به سمت چپ منحنی غلظت-پاسخ به معنای افزایش استرس اکسیداتیو است.

4.6. تجزیه و تحلیل آماری

منحنی های غلظت-پاسخ برای مرگ و میر و بدشکلی با استفاده از نرم افزار GraphPad 7.02 Inc. محاسبه و مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمون مجموع مربعات F اضافی برای مقایسه برازش پارامترهای هر گروه داده منحنی استفاده شد. فاصله اطمینان به 95 درصد تنظیم شد.

5. نتیجه گیری ها

این مطالعه از جنین گورخرماهی به عنوان ارگانیسم مدل برای آزمایش ظرفیت حفاظتی شش ترکیب فنلی و سه کاروتنوئیدی که معمولاً در غذاها یافت می‌شود، استفاده کرد. تمام ترکیبات، به جز کاروتن، اثرات محافظتی در برابر کشندگی ناشی از استرس اکسیداتیو نشان دادند. علاوه بر این، آپیژنین، روتین و کورکومین نیز اثرات محافظتی در برابر بدشکلی ناشی از tBOOH نشان دادند. ما پیشنهاد می کنیم که یک آزمایش جنین گورخرماهی، همانطور که در اینجا ارائه شده است، می تواند برای ارزیابی اثرات محافظتی در داخل بدن اجزای غذایی فعال زیستی جدید با ظرفیت آنتی اکسیدانی بالقوه استفاده شود.

کریستینا آرتیاگا 1،20، نوریا بوکس 13، الیزابت تیکسیدو 13⑤، فرناندا ماریزاند 2، سانتیاگو کادنا 4 و آلبرتو بوستیلوس 5،*

1 واحد سم شناسی، گروه فارماکولوژی، سم شناسی و شیمی درمانی، دانشکده داروسازی،

دانشگاه بارسلونا، آودا جوآن XXIIs/n,08028 بارسلونا، اسپانیا؛

2 دانشکده علوم بهداشتی، تغذیه و رژیم غذایی، دانشگاه فنی آمباتو، آمباتو 180207، اکوادور.

3 مؤسسه تحقیقاتی تغذیه و ایمنی غذایی INSA-UB، پردیس غذا و تغذیه Torribera،

دانشگاه بارسلونا، Prat de la Riba 171، 08921 Santa Coloma de Gramenet، اسپانیا

4 دانشکده علوم کاربردی، دانشگاه بین المللی SEK، کیتو 170134، اکوادور.

5 دانشکده علوم بهداشت، پزشکی، دانشگاه فنی آمباتو، آمباتو 180207

منابع

1. Tan, BL; نورهایزن، من; لیو، W.-P.-P. مواد مغذی و استرس اکسیداتیو: دوست یا دشمن؟ اکسید. پزشکی سلول. لانگف. 2018, 2018, 9719584. [CrossRef] [PubMed]
2. Sies، H. بیوشیمی استرس اکسیداتیو. آنژو. Chemie Int. اد. انگلیسی 1986، 25، 1058-1071. [CrossRef]
3. Dröge, W. رادیکال های آزاد در کنترل فیزیولوژیکی عملکرد سلول. فیزیول. Rev. 2002, 82, 47-95. [CrossRef] [PubMed]
4. رندرا، ای. ریابوف، وی. Mossel, DM; سواستیانووا، تی. هارمسن، ام سی؛ Kzhyshkowska، J. گونه های فعال اکسیژن (ROS) در فعال سازی و عملکرد ماکروفاژها در دیابت. ایمونوبیولوژی 2019، 224، 242-253. [CrossRef]
5. Lin, MT; بیل، اختلال عملکرد میتوکندری MF و استرس اکسیداتیو در بیماری‌های نورودژنراتیو طبیعت 2006، 443، 787-795. [CrossRef] [PubMed]
6. تروند، P. استرس اکسیداتیو، و آسیب به مولکول های زیستی (لیپیدها، پروتئین ها، DNA). ان فارم. Fr. 2006، 64، 383-389. [CrossRef]
7. ارمک، جی. دیویس، KJA کلسیم و استرس اکسیداتیو: از سیگنال دهی سلولی تا مرگ سلولی. مول. ایمونول. 2002، 38، 713-721. [CrossRef]
8. وادهوا، ر. گوپتا، آر. Maurya، استرس اکسیداتیو PK و پیری تسریع شده در اختلالات عصبی و عصبی. Curr. فارم. دس 2018، 24، 4711–4725. [CrossRef]
9. Maritim، AC; سندرز، RA; Watkins، JB Diabetes، استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدان ها: بررسی. جی بیوشیم. مول. سموم 2003، 17، 24-38. [CrossRef]
10. سینها، ن. Dabla، PK استرس اکسیداتیو، و آنتی اکسیدان ها در فشار خون بالا - یک بررسی فعلی. Curr. فشار خون بالا Rev. 2015, 11, 132-142. [CrossRef]
11. Klaunig، JE استرس اکسیداتیو و سرطان. Curr. فارم. دس 2018، 24، 4771–4778. [CrossRef] [PubMed]
12. Sies، H. استرس اکسیداتیو: مفهومی در زیست شناسی ردوکس و پزشکی. ردوکس بیول. 2015، 4، 180-183. [CrossRef]
13. پیتا، پی.-جی. فلاونوئیدها به عنوان آنتی اکسیدان جی. نات. تولید 2000، 63، 1035-1042. [CrossRef]
14. هالیول، بی. گاتریج، JMC رادیکال های آزاد در زیست شناسی و پزشکی، ویرایش پنجم. انتشارات دانشگاه آکسفورد: آکسفورد، انگلستان، 2015; شابک 9780198717478.
15. هالمن، کامپیوتر; کاتان، MB فلاونوئیدهای رژیمی: مصرف، اثرات سلامتی، و فراهمی زیستی. مواد شیمیایی مواد غذایی سموم بین المللی J. Publ. برادر Ind. Biol. Res. دانشیار 1999، 37، 937-942. [CrossRef]
16. هرتوگ، MG; هالمن، رایانه شخصی؛ Katan, MB; Kromhout، D. مصرف فلاونوئیدهای بالقوه ضد سرطان و عوامل تعیین کننده آنها در بزرگسالان در هلند. Nutr. سرطان 1993، 20، 21-29. [CrossRef]
17. مارتینز، اس. گونزالس، جی. کولبراس، جی. Tuñón، M. Flavonoides: Propiedades y acciones antioxidantes. Nutr. بیمارستان 2002، 17، 271-278.
18. آرتیگا، سی. بوستیلوس، ا. Gómez, J. Migración de neutrófifilos en larvas de pez cebra expuestos a extractos de sofrito de tomate. قوس. Latinoam. Nutr. 2021، 70، 216-224. [CrossRef]
19. جوان، ای جی; Lowe, GL Carotenoids - خواص آنتی اکسیدانی. آنتی اکسیدان ها 2018، 7، 28. [CrossRef] [PubMed]
20. خاویر، AAO; Pérez-Gálvez، A. کاروتنوئیدها به عنوان منبع آنتی اکسیدان در رژیم غذایی. زیر سلول بیوشیمی. 2016، 79، 359-375. [CrossRef] [PubMed]
21. استال، دبلیو. Sies، H. فعالیت آنتی اکسیدانی کاروتنوئیدها. مول. Asp. پزشکی 2003، 24، 345-351. [CrossRef]
22. بوکس، ن. تیکسیدو، ای. پیکه، ای. Llobet، JM; گومز-کاتالان، J. مدولاسیون و اثرات حفاظتی ترکیبات آنتی اکسیدانی در برابر سمیت رشدی ناشی از اکسیدان در گورخرماهی. آنتی اکسیدان ها 2020، 9، 721. [CrossRef]
23. فنتون، HJH اکسیداسیون اسید تارتاریک در حضور آهن. جی. شیمی. Soc. ترانس. 1894، 65، 899-910. [CrossRef]
24. فانیندرا، ا. جستادی، دی.بی. Periyasamy، L. رادیکال های آزاد: خواص، منابع، اهداف، و تأثیر آنها در بیماری های مختلف. هندی جی کلین. بیوشیمی. 2015، 30، 11-26. [CrossRef] [PubMed]
25. فرناندز-پاچون، ام اس; ولانیو، دی. Troncoso، AM؛ García-Parrilla، MC Revisión de los Métodos devaluación de la actividad antioxidant in vitro del vino و valoración de sus efectos in vivo. قوس. Latinoam. Nutr. 2006، 56، 110-122. [PubMed] 26. Cavia-Saiz, M.; بوستو، MD; Pilar-Izquierdo، MC; اورتگا، ن. پرز متئوس، ام. Muñiz، P. خواص آنتی اکسیدانی، فعالیت مهار رادیکال، و ظرفیت حفاظت از بیومولکول فلاونوئید نارینجنین و گلیکوزید نارینجین آن: یک مطالعه مقایسه ای. J. Sci. کشاورزی مواد غذایی 2010، 90، 1238-1244. [CrossRef] [PubMed]
27. پاتل، ک. سینگ، جی.کی. Patel, DK مروری بر جنبه های دارویی و تحلیلی نارینگنین. چانه. جی. اینتگر. پزشکی 2014، 24، 551-560. [CrossRef]
28. رشمی، ر. مگش، SB; Ramkumar، KM; سوریانارایانان، س. Subbarao، MV پتانسیل آنتی اکسیدانی نارینژنین به محافظت از بافت کبد در برابر آسیب های ناشی از استرپتوزوتوسین کمک می کند. Biochem. مول. Biol. 2017، 7، 76-84.
29. شوکلا، ر. پاندی، وی. Vadnere، GP; Lodhi, S. فصل 18-نقش فلاونوئیدها در مدیریت اختلالات التهابی. در غذای زیست فعال به عنوان مداخلات رژیمی برای آرتریت و بیماری های التهابی مرتبط. Watson، RR، Preedy، VR، Eds. مطبوعات آکادمیک: لندن، بریتانیا، 2019؛ صص 293-322; شابک 978-0-12-813820-5.
30. Chen, YH; یانگ، ZS; Wen, CC; چانگ، YS؛ وانگ، BC; Hsiao، CA; Shih، TL ارزیابی رابطه ساختار-فعالیت فلاونوئیدها به عنوان آنتی اکسیدان ها و مواد سمی لارو گورخرماهی. مواد شیمیایی مواد غذایی 2012، 134، 717-724. [CrossRef]
31. کوشمن، م. زو، اچ. Geahlen، RL; Kraker، سنتز AJ و ارزیابی بیوشیمیایی یک سری از امینوففلاوون ها به عنوان مهار کننده های بالقوه پروتئین-تیروزین کیناز p56lck، EGFr، و p60v-src. جی. مد. شیمی. 1994، 37، 3353-3362. [CrossRef]
32. سیوفی، جی. پسکا، ام اس؛ دی کاپراریس، پ. براکا، آ. سورینو، ال. De Tommasi، N. ترکیبات فنولی در روغن زیتون و تفاله زیتون از Cilento (Campania، ایتالیا) و فعالیت آنتی اکسیدانی آنها. مواد شیمیایی مواد غذایی 2010، 121، 105-111. [CrossRef]

33. بولوتا، س. کورادینو، آر. سلانو، ام. داگوستینو، ام. مایولو، جی. اولیوریو، ام. پروکوپیو، ا. ایانونه، م. روتیروتی، دی. Russo, D. اثرات ضد تکثیری و آنتی اکسیدانی روی سلول های سرطان پستان اولئوروپئین و مشتقات نیمه سنتزی هیپراستیله آن. مواد شیمیایی مواد غذایی 2011، 127، 1609-1614. [CrossRef]
34. هان، ج. Talorete، TPN; یامادا، پ. ایزودا، H. اثرات ضد تکثیر و آپوپتوز اولئوروپئین و هیدروکسی تیروزول بر سلول‌های MCF{2}} سرطان سینه انسان. سیتوتکنولوژی 2009، 59، 45-53. [CrossRef] [PubMed]
35. لیانگ، ن. کیتس، DD نقش اسیدهای کلروژنیک در کنترل شرایط استرس اکسیداتیو و التهابی. Nutrients 2015, 8, 16. [CrossRef] [PubMed]
36. Park, S.-Y.; فریدمن، ND; هایمن، کالیفرنیا؛ Le Marchand، L. Wilkens، LR; Setiawan، انجمن VW مصرف قهوه با مرگ و میر کلی و علت خاص در میان جمعیت های غیرسفید پوست. ان کارآموز پزشکی 2017، 167، 228-235. [CrossRef] [PubMed]
37. تاجیک، ن. تاجیک، م. مک، آی. انک، پی. اثرات بالقوه اسید کلروژنیک، اجزای اصلی فنولی در قهوه، بر سلامت: مروری جامع از ادبیات. یورو J. Nutr. 2017، 56، 2215-2244. [CrossRef] [PubMed]
38. پول، آر. کندی، OJ; رودریک، پی. Fallowfifield، JA; هیز، رایانه شخصی؛ Parkes، J. مصرف قهوه و سلامت: بررسی چتر متاآنالیز نتایج سلامت چندگانه. BMJ 2017, 359, j5024. [CrossRef] [PubMed]
39. تنویر، EM; Hossen، MS; حسین، م.ف. افروز، ر. گان، SH; خلیل، MI; کریم، N. خواص آنتی اکسیدانی انواع زردچوبه محبوب (Curcuma longa) از بنگلادش. جی. کیفیت غذا. 2017, 2017, 8471785. [CrossRef]
40. فیدور، ج. Burda, K. نقش بالقوه کاروتنوئیدها به عنوان آنتی اکسیدان در سلامت و بیماری انسان. مواد مغذی 2014، 6، 466-488. [CrossRef]
41. اگرزدورفر، م. Wyss، A. کاروتنوئیدها در تغذیه و سلامت انسان. قوس. بیوشیمی. بیوفیز. 2018، 652، 18-26. [CrossRef]
42. پادمنابان، ص. چیما، ا. Paliyath, G. Solanaceous Fruits Including Tomato, Eggplant, and Peppers, 1st ed.; Elsevier Ltd: لندن، بریتانیا، 2015.
43. Kataja-Tuomola، MK; Kontto، JP; منیستو، اس. آلبانز، دی. Virtamo، JR اثر مکمل آلفا توکوفرول و بتاکاروتن بر عوارض ماکرو عروقی و مرگ و میر کلی ناشی از دیابت: نتایج مطالعه ATBC. ان پزشکی 2010، 42، 178-186. [CrossRef]
44. آمباتی، ر.ر. Moi، PS; راوی، س. Aswathanarayana، RG Astaxanthin: منابع، استخراج، پایداری، فعالیت های بیولوژیکی، و کاربردهای تجاری آن - بررسی. Mar. Drugs 2014، 12، 128-152. [CrossRef] [PubMed]
45. Dennery، PA اثرات استرس اکسیداتیو بر رشد جنینی. بررسی نقص مادرزادی C جنین امروز 2007، 81، 155-162. [CrossRef] [PubMed]
46. ​​Selderslaghs, IWT; بلوست، آر. Witters، HE مطالعه امکان سنجی سنجش گورخرماهی به عنوان یک روش جایگزین برای غربالگری سمیت رشدی و سمیت جنینی با استفاده از مجموعه آموزشی از 27 ترکیب. تولید مجدد سموم 2012، 33، 142-154. [CrossRef]
47. کیمل، سی بی; بالارد، WW; کیمل، اس آر. اولمان، بی. شیلینگ، TF مراحل رشد جنینی گورخرماهی. توسعه دهنده دین 1995، 203، 253-310. [CrossRef] [PubMed]
48. Teixidó، E. پیکه، ای. گومز-کاتالان، جی. Llobet، JM ارزیابی تاخیر رشد در سنجش تراتوژنیسیته جنین گورخرماهی. سموم In vitro 2013, 27, 469-478. [CrossRef] [PubMed]