سلول های تومور قادر به ارائه اپی توپ های محدود شده با MHC-II نمی باشند که از انکوژن ها به سلول های CD{1}} T

سلول های CD{0}} از طریق شناسایی آنتی ژن های پپتیدی ارائه شده در MHC کلاس II (MHC-II) نقش مهمی در ایمنی ضد توموری ایفا می کنند. اگرچه برخی از سرطان‌های جامد می‌توانند برای بیان MHC-II تحریک شوند، اما میزان شناسایی مستقیم سلول‌های T CD{4} اختصاصی تومور مشخص نیست. ما گیرنده‌های آنتی‌ژن سلول T (TCRs) را از سلول‌های CD{5}} طبیعی اولیه مخصوص 2 انکوپروتئین، HPV{7}} E6 و جهش فعال‌کننده KRASG12V از بیماران مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن جدا و مشخص کردیم. و آدنوکارسینوم مجرای لوزالمعده، به ترتیب، و توانایی خود را در تشخیص اتولوگ یا سلول های تومور بیان کننده آنتی ژن لکوسیت انسانی همسان با آنتی ژن لکوسیتی تعیین کردند. ما در هر دو مورد دریافتیم که TCR ها قادر به شناسایی سلول های هدف پپتیدی هستند که سلول های ارائه دهنده آنتی ژن MHC-II یا سلول B (APCs) مربوطه را بیان می کنند، زمانی که آنتی ژن ها به صورت درون زا بیان شده و به مسیر آندوزوم هدایت می شوند اما موفق به شناسایی تومور نمی شوند. سلول هایی که پروتئین منبع را بیان می کنند حتی پس از القای بیان سطحی MHC-II توسط IFN- یا ترانسداکشن با CIITA. این نتایج نشان می‌دهد که پرایمینگ و شناسایی عملکردی یک انکوپروتئین هسته‌ای (E6) و یک انکوپروتئین مرتبط با غشاء (KRAS) عمدتاً به APC‌های متقاطع محدود می‌شود و نه از طریق شناسایی مستقیم سلول‌های تومور القا شده برای بیان MHC-II.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

معرفی

دگرگونی بدخیم سلول‌های سوماتیک با عمل انکوژن‌های فعال شده آغاز می‌شود که مسیرهای رشد سلولی را نامنظم می‌کنند و منجر به تکثیر کنترل نشده می‌شوند (1). در مورد سرطان های مرتبط با HPV، بیان ژن های اولیه HPV E6 و E7 با مهار ژن های سرکوبگر تومور p53 و Rb به ترتیب به انکوژن کمک می کند (2). روش دیگر، فعال سازی انکوژن سازنده ممکن است از طریق جهش سوماتیک در ژن های تنظیم کننده مسیرهای رشد و تکثیر سلولی، مانند خانواده RAS، رخ دهد. در واقع، جهش های فعال کننده KRAS مانند KRASG12V معمولاً در بیماران مبتلا به سرطان پانکراس، روده بزرگ و ریه یافت می شود (3). اگرچه انکوژن ها بیماری را ترویج می کنند، اما می توانند اهدافی را برای سیستم ایمنی میزبان نیز فراهم کنند. در سال های اخیر، نقش سیستم ایمنی در کنترل سرطان های مرتبط با HPV به طور گسترده ای شناخته شده است. سلول‌های CD{9}} و CD{10}} که HPV E6 و E7 را شناسایی می‌کنند، و همچنین سایر پروتئین‌های HPV، هم در خون محیطی و هم در لنفوسیت‌های نفوذکننده تومور (TILs) از بیماران مرتبط با HPV شناسایی شده‌اند. سرطان ها (4-6). ایمونوتراپی هایی که این آنتی ژن ها را هدف قرار می دهند، از جمله واکسن های سرطان درمانی و درمان سلولی پذیرفته شده (ACT) با TILs یا سلول های T مهندسی شده با TCR، یک حوزه فعال تحقیقات بالینی و بالینی هستند (2). پاسخ سلول های T در برابر جهش های انکوژنیک نیز به طور گسترده توصیف شده است (7-9). علاوه بر این، شواهد بالینی مستقیمی وجود دارد که نشان می‌دهد ACT با TILs که KRAS جهش یافته را هدف قرار می‌دهد، می‌تواند پاسخ‌های عینی را ارتقا دهد (10). اگرچه سلول‌های CD{23}} که اپی توپ‌های مشتق شده از انکوژن‌ها را شناسایی می‌کنند، واسطه سمیت سلولی مستقیم علیه سلول‌های تومور هستند (11-13)، نقش سلول‌های CD{26}} در ایمنی ضد توموری کمتر شناخته شده است. مطالعات اخیر زیرمجموعه‌ای از سلول‌های CD{27}} را که نشانگرهای سیتوتوکسیک را بیان می‌کنند، مانند گرانزیم B (GrzmB)، در سرطان‌های انسانی برجسته کرده‌اند (14، 15). ویژگی های آنتی ژن این سلول ها، و در نتیجه پتانسیل درمانی آنها، تا حد زیادی ناشناخته باقی می ماند. علاوه بر این، برای اینکه این سلول‌های سیتوتوکسیک CD{30}} سلول‌های تومور را شناسایی کرده و از بین ببرند، نه تنها باید سلول تومور MHC-II را بیان کند، بلکه آنتی‌ژن‌های مربوطه نیز باید به مسیر ارائه مناسب هدایت شوند. در این مطالعه، ما ظرفیت سلول‌های CD{32}} اختصاصی برای انکوپروتئین‌های HPV-16 E6 و KRASG12V را برای شناسایی سلول‌های تومور بیان‌کننده آنتی‌ژن بررسی کردیم. اگرچه هر دو TCR قادر به تشخیص مستقیم آنتی ژن های پردازش شده و ارائه شده درون زا بودند که به محفظه آندوزوم سلول های B همسان HLA هدایت می شوند، هیچ کدام قادر به تشخیص سلول های تومور بیان کننده آنتی ژن با بیان القایی MHC-II نبودند. به طور کلی، نتایج ما نشان می‌دهد که فقط آنتی‌ژن‌های خاصی مستقیماً روی سلول‌های تومور MHC-II+ ارائه می‌شوند، که ممکن است مجموعه سلول‌های CD{42}} T را که قادر به شناسایی و حذف مستقیم سلول‌های تومور هستند، محدود کند.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

نتایج

شناسایی پاسخ‌های HPV-16 E6-ویژه CD4+ و CD{3}} T از TILهای کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن. ما مجموعه‌ای از کشت‌های TIL جدا شده از قطعات تومور 2 تا 4 میلی‌متری از یک بیمار (Hu-56) مبتلا به HPV{7}} کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن (HNSCC) را غربال کردیم (جدول تکمیلی 1؛ مواد تکمیلی). با این مقاله به صورت آنلاین در دسترس است؛ https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) توسط سنجش IFN-ELISPOT برای شناسایی پاسخ های سلول T علیه انکوپروتئین های ویروسی HPV{14}} E6 و E7، با استفاده از استخرهای پپتیدی شامل 15-مرهای همپوشانی که طول پروتئین های E6 و E7 را در بر می گیرند. قابل توجه است که قطعات TIL 12 و 29 هنگام تحریک مجدد با مخزن پپتید E6 تعداد قابل توجهی از لکه ها را در پس زمینه ایجاد کردند و حاوی سلول های CD{23}} و CD{24}} T بودند (شکل 1A و شکل تکمیلی 1A). برای شناسایی زیرمجموعه‌های سلول T مربوطه، این کشت‌های TIL را با استفاده از سنجش ترشح سیتوکین تجزیه و تحلیل کردیم. این قطعه TIL نشان داد 29 (F29) حاوی سلول‌های T واکنش‌پذیر E6-CD{30}} بود، در حالی که قطعه ۱۲ (F12) حاوی سلول‌های CD{33}} و CD{34}} بود که قادر به شناسایی مخزن پپتید E6 (شکل 1B). هیچ یک از سلول‌های CD{37}} در پاسخ به تحریک مجدد E6، IL-5 تولید نکردند، که فنوتیپ مشابه Th1-را تأیید می‌کند. برای تعیین کلونالیته TCR E{41}}TIL های خاص، سلول های T منفرد CD{43}} ترشح کننده IFN را از F12 و سلول های CD{45}} T از F12 و F29 مرتب کردیم. توالی یابی TCR یک TCR منفرد را نشان داد که توسط سلول های T ترشح کننده IFN- (n {50}} از 31 سلول توالی یابی شده) و همچنین یک کلون TCR منفرد توسط CD ترشح کننده IFN بیان می شود. }} سلول های T از هر دو F12 و F29 (n=40 از 41 و 37 سلول از 38 سلول، به ترتیب توالی یابی شدند) (جدول تکمیلی 2). این نتایج نشان می‌دهد که سلول‌های T مونوکلونال CD{61}} و CD8+ واکنش‌پذیر به E6 در TILهای این بیمار وجود دارند. HLA-A*02:01-محدود شده CD{67}} سلول های T از TIL ها E6 ارائه شده توسط یک رده سلولی تومور مشتق از بیمار را تشخیص می دهند. TILها از F29 هنگامی که با پپتید E{72}} مجدداً تحریک می‌شوند، IFN- تولید می‌کنند، که نشان می‌دهد F29 TCR این اپی‌توپ محدود شده HLA-A*02:01 را که قبلاً توصیف شده بود، تشخیص داد (شکل تکمیلی 1B) (11). این توسط مطالعات اتصال به تترامر با استفاده از E{80}}/HLA-A*02:01 برای نشان‌گذاری سلول‌های J76 دارای کمبود TCR که CD8 انسانی را بیان می‌کنند و با استفاده از TCR اختصاصی E{87}} که قبلاً توصیف شده بود به عنوان یک مثبت تأیید شد. کنترل (شکل 2A) (11). هر دو TCR سطوح مشابهی از علاقه عملکردی را نشان دادند، همانطور که با تنظیم مثبت نشانگر فعال سازی حاد CD69 در J76 پس از تحریک با رده های سلولی لنفوبلاستوئید B اتولوگ (B-LCLs) پالس شده با غلظت های تیتر شده از پپتید E{93}} نشان داده شد (شکل 2، ب و ج). این داده‌ها وجود یک کلون سلول T CD{95} را خاص برای اپی توپ شناخته شده E6 با ویژگی‌های عملکردی مشابه با TCR که در یک محیط بالینی آزمایش شده است تأیید می‌کند (16). ما بعداً به دنبال تعیین اینکه آیا E{98}}CD خاص8+ TCR می‌تواند آنتی‌ژن‌های بیان شده درون‌زا را تشخیص دهد و در نتیجه سمیت سلولی ضد تومور را واسطه‌ای کند، تلاش کردیم. برای انجام این کار، از HLA-A*02:{103}} HPV{104}} خط تومور، CaSki، و همچنین یک رده سلولی تومور اتولوگ، HNSCC{105}} که از طریق برنامه ریزی مجدد سلولی بافت تومور اولیه همانطور که قبلاً توضیح داده شد (17) برای سنجش سمیت سلولی آزمایشگاهی. تجزیه و تحلیل RNA-Seq بیان ژنهای اولیه HPV{108}}، از جمله E6، را هم توسط نمونه تومور اولیه و هم رده سلولی اتولوگ تأیید کرد (شکل تکمیلی 1C). سلول‌های T اولیه CD{111}} انسانی که F29 TCR را بیان می‌کنند، می‌توانند در کشتن سلولی CaSki و HNSCC{113}} در طیفی از نسبت‌های مؤثر به هدف در شرایط آزمایشگاهی واسطه شوند (شکل 2، D و E). با هم، این داده ها تایید می کنند که F29 TCR آنتی ژن E6 بیان شده درون زا را تشخیص می دهد. شناسایی سلول T با محدودیت HLA-DQ، E{120}}CD خاص{121}} از TILها. برای گسترش E{122}}TILهای خاص برای تجزیه و تحلیل عملکردی بیشتر، از پروتکل کشت گسترش سریع که قبلاً توضیح داده شد با OKT{123}} و PBMCهای آلوژنیک تابش شده برای گسترش TILها از F12 استفاده کردیم. اگرچه کشت اولیه F12 در ابتدا حاوی سلول‌های CD{126}} و CD{127}} T با واکنش‌پذیری E6 بود، محصول سلولی نهایی پس از گسترش سریع حاوی 99 درصد سلول‌های CD{130}} T بود که تقریباً 38.33 از آن‌ها بود. % واکنش پذیری در برابر E6 نشان داد، همانطور که با رنگ آمیزی سیتوکین داخل سلولی برای IFN- نشان داده شد (شکل 3A).

گیاه چینی سیستانچ گیاه ضد تومور

علاوه بر IFN-، TILهای تحریک شده E6-CD خاص4+ می‌توانند TNF- را ترشح کنند، اما نه IL-2 (شکل تکمیلی 2A). اگرچه فرکانس کل سلول‌های GrzmB+ با تحریک آنتی‌ژن افزایش نمی‌یابد، دروازه‌سازی روی سلول‌های ترشح‌کننده TNF نشان داد که TIL‌های CD اختصاصی E{9}} حاوی GrzmB درون سلولی ذخیره‌شده بیشتری نسبت به TIL‌های غیراختصاصی هستند (شکل تکمیلی 2B). ). IFN-- ترشح کننده CD{12}} TILها همچنین نشانگر همزمان مهاری مرگ سلولی برنامه ریزی شده 1 (PD{14}})، مطابق با امضاهای منتشر شده CD{16}} TIL های واکنش دهنده به تومور (شکل تکمیلی 2C) را بیان می کنند ( 18، 19). E{20}}CD اختصاصی{21}} TILها تمایل عملکردی بالایی را نشان دادند زیرا این سلول‌ها می‌توانند سیتوکین‌ها را در غلظت‌های پپتید کمتر از 1 ug/mL ترشح کنند (شکل 3B). برای تعیین ویژگی فرهنگ F12 TIL، ما B-LCLهای اتولوگ را با پپتیدهای منفرد مربوط به هر یک از 37 پپتید موجود در مخزن E6 اصلی پالس کردیم (جدول تکمیلی 3). CD{29}} TILهای F12 هنگامی که با پپتیدهای E{32}} و E{33}} تحریک می‌شوند، IFN- ترشح می‌کنند، که توالی هسته‌ای ۱۱-اسید آمینه را به اشتراک می‌گذارند (شکل 2D تکمیلی). آزمایش‌های هم‌فرهنگ در حضور Abs مسدودکننده HLA نشان داد که ترشح IFN به‌طور قابل‌توجهی توسط TILها کاهش می‌یابد، زمانی که B-LCL با Abs ضد HLA-DQ مسدود می‌شود، اما نه ضد HLA-DR یا Abs کنترل ایزوتیپ (شکل 3C). برای تعیین اینکه کدام آلل های HLA-DQ مسئول ارائه این اپی توپ هستند، B-LCL هایی را که آلل های HLA-DQ شناخته شده را بیان می کنند (جدول تکمیلی 4) با E{46}} پالس کردیم و دریافتیم که سلول های KAS011 بیان کننده HLA-DQA1*01 :02 and DQB1*05:02, but not Hu{55}} B-LCLs بیان کننده DQA1*05:05 and DQB1*03:01، می تواند آنتی ژن را به TILها به روشی قابل مقایسه با هو اتولوگ ارائه دهد{63} } B-LCL (شکل 3D). در نهایت، ما به دنبال تأیید این بودیم که توالی TCR شناسایی شده قبلاً در واقع مسئول تشخیص E6 است. بیان TCR F12 در سلول‌های T اهداکننده اولیه انسان سالم برای ارتقای تشخیص پپتید E{69}} کافی بود، همانطور که با تنظیم مثبت CD69 و PD{71}} مشهود است (شکل 3E ). در مجموع، این نتایج شناسایی یک اپی توپ محدود شده با HLA-DQ از E6 را نشان می‌دهد که توسط CD{75}} TILهای مونوکلونال شناسایی شده است. سلول‌های T E{76}}اختصاصی CD{77}} سلول‌های تومور اتولوگ بیان‌کننده MHC-II را نمی‌شناسند یا نمی‌کشند. مطالعات اخیر نشانه های ژنتیکی CD{79}} TILهای سیتوتوکسیک را در برخی از سرطان های انسانی شناسایی کرده اند (14، 15). با این حال، اینکه آیا سلول‌های T سیتوتوکسیک در سرطان‌های ناشی از HPV نقش دارند یا خیر، ناشناخته است. برای تعیین اینکه آیا سلول‌های T{84}}ویژه CD4+ از TILها می‌توانند مستقیماً HNSCC-56 را تشخیص دهند، ابتدا وضعیت بیان MHC-II آن را بررسی کردیم. اگرچه سلول های تومور هیچ سطح قابل شناسایی MHC-II را در کشت بیان نکردند، درمان با IFN- به مدت 72 ساعت برای القای تنظیم مثبت MHC-II کافی بود (شکل 4A). سپس، HNSCC-56 را با CD{94}} F12 TIL کشت کردیم. نکته مهم این است که سلول های تومور MHC-II+ که با IFN- پیش شرط شده بودند، قادر به تحریک CD{99}} TIL های اندازه گیری شده با ترشح IFN- نبودند (شکل 4B).

شکل 1. شناسایی E6-CD واکنشی4+ و CD{3}} TIL از HPV-16+ HNSCC. (آ)

شکل 2. ویژگی های عملکردی HLA-A*02:01-محدود، E{4}}TCR خاص از Hu-56 TIL. (آ)

با این حال، رده‌های سلولی تومور درمان‌شده با IFN که با E{1}} قبل از افزودن TILs پالس شده بودند، قادر به تحریک پاسخ سلول T بودند، که نشان می‌دهد که بیان سطحی آلل‌های محدودکننده HLA-DQ در یک رده سلولی که به صورت درون‌زا بیان می‌شود. E6 برای تشخیص تومور کافی نبود اما نیاز به بارگذاری اگزوژن پپتید هدف داشت. همان نیاز بارگذاری پپتید هدف خارجی با سلول‌های تومور تبدیل شده با CIITA (HNSCC{5}} CIITA) مشاهده شد، که به طور اساسی سطوح بالایی از سطح MHC-II را بیان می‌کنند (شکل 4B). برای آزمایش اینکه آیا TIL های CD{8}} می توانند یک نسخه پردازش شده و ارائه شده درون زا از اپی توپ E6 را در یک APC تشخیص دهند، ما B-LCL های اتولوگ را با ساختار بیانی کد کننده 50 اسید آمینه اول E6 که با MHC- ذوب شده اند را به صورت رتروویروسی تبدیل کردیم. دامنه گذرا غشایی I (E{14}}MITD)، که باعث محلی سازی توالی اسید آمینه ذوب شده در غشای پلاسمایی می شود و از ارائه MHC-II از طریق قاچاق آندوزومی پشتیبانی می کند (20). B-LCLهایی که ساختار E{18}}MITD را بیان می‌کنند، می‌توانند TILهای E{19}}CD خاص{20}} را تحریک کنند، که نشان می‌دهد اپی توپ پپتیدی شناسایی شده توسط این TIL‌ها می‌تواند به طور طبیعی پردازش شده و در MHC-II ارائه شود. به مسیر مناسب هدایت می شود (شکل 4C).

شکل 3. ویژگی های عملکردی TIL های CD اختصاصی E6-به صورت کلونی گسترش یافته، HLA-DQ محدود شده است. (آ)

در مرحله بعد، ما به دنبال تعیین اینکه آیا F12 E{1}}CD{2}} TILهای خاص قادر به سمیت سلولی تومور مستقیم هستند یا خیر. مطابق با داده‌های حاصل از سنجش‌های تشخیص ما، E{3}}CD خاص4+ TIL‌ها قادر به محدود کردن رشد سلول‌های تومور HNSCC-56 نیستند که MHC-II را بیان نمی‌کنند (شکل 4D) . علاوه بر این، سلول‌های تومور HNSCC-56 CIITA نیز در حضور CD{9}} TILها بدون مهار رشد کردند. با این حال، رشد سلول‌های تومور HNSCC{10}} CIITA با پپتید E{11}} به روشی وابسته به دوز سلول‌های مؤثر مهار شد. به طور کلی، این داده‌ها نشان می‌دهند که اگرچه HNSCC{13}} می‌تواند اپی توپ‌های E6 را به سلول‌های CD{15}} نشان دهد، TIL‌های E{16}}CD{17}} خاص قادر به تشخیص مستقیم و لیز MHC- نیستند. سلول های تومور اتولوگ II+. ژن های دخیل در ارائه آنتی ژن اغلب در سرطان ها جهش می یابند که می تواند از شناسایی توسط سلول های T جلوگیری کند (21). برای تعیین اینکه آیا سلول‌های تومور HNSCC{21} حاوی جهش‌های سوماتیکی هستند که مانع ارائه آنتی‌ژن در MHC-II می‌شوند، ما توالی‌یابی کل اگزوم سلول‌های تومور و PBMCs از Hu{24}} را به عنوان نمونه مرجع انجام دادیم. از 104 جهش سوماتیک غیرمترادف شناسایی شده، هیچ جهش آشکاری در اجزای مسیر ارائه MHC-II، از جمله HLADMA، HLADMB، و CD74 وجود نداشت (جدول تکمیلی 5). شناسایی یک TCR اختصاصی به KRASG12V با HLA-DRB5*01:01 محدود شده از خون بیمار مبتلا به آدنوکارسینوم مجرای پانکراس. به دنبال این نتایج، ما تعیین کردیم که آیا ناتوانی سلول های تومور در ارائه آنتی ژن در MHC-II برای سایر انکوژن ها صادق است یا خیر. با توجه به اینکه سلول های T خاص تومور در گردش در بیماران انسانی مبتلا به سرطان شناسایی شده است (8، 22)، ما PBMCs را از یک بیمار (Hu{39}}) مبتلا به آدنوکارسینوم مجرای پانکراس (جدول تکمیلی 1) با مجموعه ای از پپتیدها تحریک کردیم. مربوط به جهش های انکوژنیک رایج (جدول تکمیلی 6) به مدت 14 روز قبل از تحریک مجدد با پپتیدهای منفرد برای شناسایی پاسخ سلول های T مربوطه توسط ELISPOT. این نتایج نشان دهنده وجود یک پاسخ سلول T علیه KRASG12V بود، همانطور که با افزایش تعداد لکه های IFN در پس زمینه در پاسخ به اسیدهای آمینه KRASG12V 1-15 مشهود است (شکل 5A). برای شناسایی TCR های مرتبط با این پاسخ، ما دوباره از روش ترشح سیتوکین برای مرتب سازی سلول های ترشح کننده IFN استفاده کردیم. سنجش ترشح سیتوکین تولید خاص IFN- توسط سلول‌های T CD{53}} را در پاسخ به تحریک مجدد با KRASG12V نشان داد (شکل 5B). مقایسه زنجیره‌های TCR از سلول‌های ترشح‌کننده IFN طبقه‌بندی شده با آن‌هایی که در PBMC‌های منبسط نشده این بیمار وجود دارند، یک کلونوتیپ TCR را نشان داد که با بالاترین فراوانی در بین هر دو جمعیت وجود دارد (شکل 5C و جدول تکمیلی 2). این نتایج نشان می‌دهد که فرکانس این کلون سلول T در ابتدا در PBMCs گسترش یافته است، که نشان‌دهنده یک پاسخ طبیعی در داخل بدن به جای پرایمینگ آزمایشگاهی در فرهنگ گسترش ما است. برای تأیید ویژگی آنتی ژنی این TCR، ما آن را در سلول‌های CD{60} T اولیه انسان با انتقال رتروویروسی بیان کردیم و این سلول‌ها را با B-LCLهای اتولوگ که با KRASG12V جهش یافته یا پپتید WT متناظر پالس شده بودند، کشت دادیم. سلول‌های T مهندسی‌شده وقتی با پپتید جهش‌یافته، اما نه WT، KRAS تحریک می‌شوند، IFN- ترشح می‌کنند و تأیید می‌کنند که این TCR برای KRASG12V خاص است (شکل 5D). مطابق با نتایج ما از E6 TCR، سلول‌های T مهندسی شده که TCR اختصاصی KRASG12V را بیان می‌کنند همچنین قادر به تشخیص B-LCLهایی بودند که قطعه‌ای از KRASG12V را بیان می‌کنند، اما نه WT KRAS را که با گنجاندن MITD به آندوزوم هدایت می‌شوند، نشان می‌دهند که این TCR آنتی ژن پردازش شده و ارائه شده درون زا را تشخیص می دهد (شکل 5D).

شکل 4. سلول های تومور اتولوگ E{1}} درون زا را روی سلول های T MHC-II به CD{3}} نشان نمی دهند. (آ)

شکل 5. شناسایی یک TCR اختصاصی به KRASG12V با HLA-DRB5*01:01 محدود شده از خون بیمار مبتلا به آدنوکارسینوم مجرای پانکراس. (آ)

برای شناسایی آلل محدودکننده HLA، این آزمایش‌های تحریک پپتید را با استفاده از B-LCL که ترکیب‌های مختلف ژن‌های HLA را بیان می‌کنند، تکرار کردیم. B-LCLهایی که هاپلوتیپ مشترک HLA-B7-DR15-DQ6 را بیان می‌کنند می‌توانند سلول‌های T مهندسی‌شده را تحریک کنند، در حالی که B-LCL‌های بدون این آلل‌ها نمی‌توانند (شکل 5E). در نهایت، تحریک این سلول ها توسط IHW03304 پالس پپتیدی، یک رده سلولی DAP3 موش ترانسفکت شده با HLA-DRB5*01:01 انسانی، این را به عنوان مولکول HLA محدودکننده تأیید کرد (شکل 5F). سلول های تومور MHC-II+ NCI-H2444 و DAN-G اپی توپ مشتق از KRASG12V را به سلول های CD{23}} ارائه نمی کنند. در مرحله بعد، ظرفیت سلول های تومور را برای ارائه مستقیم اپی توپ های مشتق شده از KRASG12V در MHC-II بررسی کردیم. برای تولید رده‌های سلولی MHC-II+ HLA برای این مطالعات، رده‌های سلولی KRASG12V+ NCI-H2444 و DAN-G را که به ترتیب از سرطان‌های ریه و پانکراس انسان مشتق شده‌اند، با CIITA و ساختاری که HLA-DRB5*01 را کد می‌کند، تبدیل کردیم: 01 با یک ژن گزارشگر CD34 کوتاه شده (شکل 6A). مطابق با نتایج قبلی ما، سلول‌های تومور MHC-II+ که آلل HLA محدودکننده را بیان می‌کنند قادر به تحریک سلول‌های T مهندسی‌شده با TCR نیستند، مگر اینکه سلول‌های هدف ابتدا با پپتید اگزوژن پالس شوند (شکل 6B). نکته مهم این است که هیچ جهش سوماتیکی در ژن های ارائه MHC-II (یعنی HLADMA، HLADMB، CD74) برای NCI-H2444 یا DAN-G در داده های توالی یابی در دسترس عموم وجود ندارد (23). سلول های NCI-H2444 CIITA بدون مهار در حضور سلول های T مهندسی شده با TCR رشد کردند، در حالی که سلول های NCI-H2444 CIITA با پپتید KRASG12V، رشد تومور با تاخیر را تجربه کردند (شکل 6C). مطابق با نتایج به‌دست‌آمده برای HNSCC{58}}، سلول‌های CD{59}} T که HLA-A*03:01– محدود شده، TCR اختصاصی KRASG12V (24) را بیان می‌کنند، قادر به تشخیص سلول‌های NCI-H2444 بودند اما نه سلول های CaSki که HLA-A*03:01 را بیان می کنند اما KRASG12V را بیان نمی کنند (شکل 6D). این نتایج نشان می دهد که یک انکوژن متمایز موجود در سیتوزول نیز نمی تواند توسط سلول های تومور MHC-II+ علیرغم اینکه به طور موثر در MHC-I ارائه می شود، ارائه شود. بیان لیگاندهای همزمان مهاری مانند لیگاند مرگ سلولی برنامه ریزی شده 1 (PD-L1) توسط سلول های تومور، سیگنال دهی TCR را در سلول های T محدود می کند (25). برای تعیین اینکه آیا این مکانیسم ممکن است از شناسایی سلول‌های تومور MHC-II+ توسط سلول‌های T CD{82}} جلوگیری کند، سلول‌های CD{83}} را کشت دادیم که TCR اختصاصی KRASG12V یا E{86}}خاص ما را بیان می‌کنند. F12 TCR با NCI-H2444 CIITA و HNSCC{90}} CIITA، به ترتیب، با یا بدون ABS ضد PD-L1. مسدود کردن فعل و انفعالات PD-L1/PD{95}} برای ترویج تشخیص سلول تومور کافی نبود (شکل تکمیلی 3). به طور مشابه، افزودن آگونیست ضد CD28 Ab، تشخیص سلول تومور را تعدیل نکرد. این نتایج نشان می دهد که فقدان ارائه آنتی ژن، به جای وجود یا عدم وجود سیگنال های همزمان یا همزمان، مسئول این فنوتیپ است. برخی از مطالعات نشان می دهد که پروتئین های درون زا درونی شده از غشای پلاسمایی در مقایسه با سایر بخش های درون سلولی ترجیحاً بر روی MHC-II برای نمایش بارگذاری می شوند (26). اگرچه پروتئین‌های KRAS اغلب از طریق تغییرات لیپیدی با غشاها مرتبط می‌شوند، اما دامنه گذر غشایی را بیان نمی‌کنند و این فعل و انفعالات پایدار نیستند (3، 27). بنابراین، ما استدلال کردیم که لنگر انداختن قطعه ایمونوژن KRASG12V به غشای پلاسمایی سلول‌های تومور ممکن است تشخیص مستقیم آنتی ژن توسط سلول‌های T CD{103}} را ممکن کند. با این حال، سلول‌های توموری که ساختار KRASG12V-MITD را بیان می‌کنند، همانطور که با بیان یک گزارشگر EGFP مرتبط با P2A مشهود است، به طور مشابه قادر به تحریک سلول‌های T CD{109}} مهندسی شده با TCR نبودند (شکل تکمیلی 4). این نتایج نشان می دهد که محلی سازی انکوژن درون سلولی تنها عامل تعیین کننده ارائه مستقیم MHC-II توسط سلول های تومور نیست. علاوه بر این، این نتایج نشان می دهد که بیان بیش از حد آنتی ژن برای ترویج ارائه MHC-II کافی نیست. نتایج ما تاکنون نشان می‌دهد که سلول‌های CD{114} T اختصاصی تومور ممکن است آنتی ژن‌های ارائه شده توسط APCها را بیشتر از خود سلول‌های تومور تشخیص دهند. بنابراین، ظرفیت HLADRB5*01:{117}} DCها را برای ارائه آنتی‌ژن‌های مشتق‌شده از پروتئین‌های اگزوژن ارزیابی کردیم. DCهای همسان با HLA تولید شده در شرایط آزمایشگاهی قادر به تحریک سلول‌های CD{120}} مهندسی TCR بودند که TCR اختصاصی KRASG12V را بیان می‌کردند، زمانی که DCهای نابالغ یا با پپتید KRASG12V 20-مر پالس می‌شدند یا پروتئین کامل KRASG12V تغذیه می‌شدند. پروتئین KRAS WT نیست (شکل 6E). این نتایج نشان می دهد که اگرچه TCR نمی تواند آنتی ژن های درون زا ارائه شده توسط سلول های تومور را تشخیص دهد، اما می تواند آنتی ژن های اگزوژن متقاطع ارائه شده را در زمینه DCها تشخیص دهد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

بحث

هدف از این مطالعه تعیین اینکه آیا TCR های جدا شده از سلول های T به طور طبیعی اولیه به دست آمده از بیماران مبتلا به سرطان می توانند سلول های توموری بیان کننده انکوژن را تشخیص دهند یا خیر. با توجه به کلاس I (HLA-A*02:01) محدود شده، HPV{3}} E629-38 TCR به‌دست‌آمده از HNSCC TILs، تشخیص، شاید به‌طور شگفت‌آوری برای هر دو رده سلولی تومور اتولوگ تأیید شد. و یک سلول تومور با HLA تطبیق و بیان کننده E{7}به خوبی مشخص شده، CaSki (به شکل مهم، به شکل 2 مراجعه کنید). همان TILها (شکل 1) همچنین حاوی تعداد قابل توجهی از سلولهای T E{11}}اختصاصی CD{12}} تولیدکننده IFN (شکل 3) بودند، که در مقابل، E{14}} را تشخیص نمی‌دادند. بیان سلول های تومور، حتی زمانی که آنها برای بیان سطح وسیع MHC کلاس II آلل ارائه کننده صحیح (DQA1*01:02/DQB1*05:02) توسط درمان IFN یا انتقال CIITA القا شدند (شکل 4). بیان CIITA نه تنها بیان سطحی پروتئین‌های MHC-II بلکه HLA-DM و مولکول‌های زنجیره ثابت را نیز القا می‌کند که برای پردازش و ارائه آنتی‌ژن مورد نیاز است (28). در مقابل، سلول‌های B منطبق با HLA، زمانی که آنتی ژن به مسیر MHC-II هدایت شد، توسط این TCR شناسایی شدند. وضعیت مشابهی در مورد TCR محدود شده با HLA-DRB5*01:01 مخصوص KRASG12V مشاهده شد که می‌توانست سلول‌های B همسان با HLA را تشخیص دهد، اما سلول‌های تومور بیان‌کننده MHC-II را تشخیص نمی‌دهد، زمانی که آنتی‌ژن به سمت مسیر ارائه MHC-II. هر دو TCR دارای اشتیاق عملکردی کافی برای واسطه در شناخت آنتی ژن‌های بیان شده درون زا تحت شرایطی بودند که در بالا توضیح داده شد، و هر دو می‌توانند سمیت سلولی سلول‌های هدف مملو از پپتید را واسطه کنند. این مشاهدات اخیر منعکس کننده شرایط ارائه شده در چندین گزارش در مورد سلول های T سیتوتوکسیک است، اگرچه داده های ما با نشان دادن اینکه بیان درون زا آنتی ژن منبع و القای MHC-II توسط IFN- بعید است زمینه این مشاهدات را گسترش می دهد. برای ایجاد یک هدف فیزیولوژیکی روی سلول های تومور مشتق از اپیتلیال برای TCR ها علیه آنتی ژن های هسته ای یا مرتبط با غشاء. مطالعات اخیر سرطان مثانه و ملانوم انسان، امضاهای ژنتیکی مربوط به سلول‌های سیتوتوکسیک CD{42}} را در میان TILها شناسایی کرد (14، 15). از نظر عملکردی، این سیتوتوکسیک CD{45}} TILها قادر به تشخیص مستقیم تومور وابسته به MHC-II هستند، که در نهایت منجر به لیز هدف توسط گرانزیم ها به شیوه ای مشابه با همتایان CD{47}} آنها می شود. با این حال، ترجمه درمانی این یافته ها ممکن است با این واقعیت محدود شود که تعداد کمی از تومورهای جامد MHC-II را بیان می کنند. در واقع، نتایج 2 مطالعه مستقل نشان داد که تنها تقریباً یک سوم بیماران مبتلا به ملانوم دارای سلول های تومور MHC-II+ هستند و فراوانی این سلول ها در داخل تومور اغلب کمتر از 10٪ است (15، 29). در عوض، به نظر می رسد منبع سلولی غالب MHC-II در ریزمحیط تومور، لکوسیت های نفوذ کننده باشد (26).

شکل 6. سلول های تومور MHC-II+ KRASG12V+ اپی توپ های مشتق از KRASG12V را در سلول های CD{7}} نشان نمی دهند. (آ)

اگرچه برخی از سلول‌های تومور جامد MHC-II سازنده یا القایی را بیان می‌کنند، نتایج ما نشان می‌دهد که علی‌رغم وجود سلول‌های CD{3}} T اختصاصی انکوژن در میان TILs و PBMCs، این سلول‌ها نمی‌توانند مستقیماً بیانگر آنتی‌ژن را شناسایی و لیز کنند. سلول های تومور MHC-II+، در حالی که اپی توپ هایی از همان پروتئین ممکن است به طور موثر به سلول های CD{7}} T در MHC-I ارائه شوند (13). این نشان می‌دهد که بیان یک آنتی ژن هدف ممکن است برای شناسایی زیرمجموعه تومورهایی که MHC-II توسط سلول‌های CD{10}} T را ایجاد می‌کنند کافی نباشد. علاوه بر این، به نظر می‌رسد که این نتایج در انواع مختلف تومور سازگار است، زیرا رده‌های سلولی مورد بررسی در این مطالعه شامل مواردی است که از HNSCC، آدنوکارسینوم ریه و سرطان پانکراس مشتق شده‌اند. شناسایی مستقیم سلول‌های CD{12}} T رده‌های سلولی ملانوما که MHC-II را به طور طبیعی یا پس از انتقال CIITA بیان می‌کنند، در 2 مطالعه گزارش شده است (30، 31). با این حال، در هر دوی این مطالعات، بخش قابل توجهی از TCR های آزمایش شده، سلول های تومور را مستقیماً شناسایی نکردند. مشخص نیست که آیا این TCR ها نمایانگر کلونوتیپ های "دیدگاه" هستند که آنتی ژن های تومور را تشخیص نمی دهند یا TCR های اختصاصی تومور که به دلیل کمبودهای ارائه آنتی ژن مانند موارد برجسته شده در این مطالعه، قادر به تشخیص آنتی ژن همزاد خود نیستند. اولیویرا و همکاران (31) نشان داد که تشخیص مستقیم توسط سلول‌های CD{19}} به 2 ملانوم با بار جهشی تومور بسیار بالا محدود می‌شود، که نشان می‌دهد این فنوتیپ ممکن است تغییرات لازم اضافی را ایجاد کند که امکان ارائه MHC-II آنتی ژن‌های تومور را فراهم کند. اگرچه اتصال MITD به قطعه ایمونوژن KRASG12V منجر به شناسایی مستقیم سلول‌های تومور توسط سلول‌های T CD{23}} نمی‌شود، مطالعات سوگیری را برای پپتیدهای درون‌زای مشتق از پروتئین‌های متصل به غشاء و احتمالاً از MHC-II توصیف کرده‌اند. به دلیل بازیافت غشا (26، 32). آنتی ژن Trp1 ملانوما در غشای پلاسمایی وجود دارد که ممکن است ارائه مستقیم به سلول‌های CD{29}} T توسط سلول‌های تومور B16 را تسهیل کند (33). یکی دیگر از آنتی ژن های مرتبط با ملانوم، gp100، توسط سلول های تومور به سلول های CD{34}} T به روشی وابسته به دامنه غشایی gp100 ارائه می شود (34). در کار اخیر بررسی نقش سلول‌های T CD{38} اختصاصی نئوآنتی ژن در مدل سارکوم موشی، اپی توپ‌های مشتق‌شده از یک زیرواحد اینتگرین جهش‌یافته، همچنین یک پروتئین متصل به غشاء، از MHC-II روی تومور انتقال‌یافته با CIITA شسته شدند. سلول (35). نتایج ما نشان می‌دهد که اگرچه پروتئین‌های متصل به غشاء ممکن است ترجیحاً به آندوزوم‌ها برای ارائه مستقیم در MHC-II منتقل شوند، اما وجود یک پروتئین غشایی ایمنی‌زا به تنهایی برای ترویج این نمایش کافی نیست. سایر مسیرهای تظاهر غیرکلاسیک توصیف شده است که ممکن است به پروتئین‌های سیتوزولی یا هسته‌ای اجازه دسترسی به MHC-II را بدهد، از جمله ارائه پروتئین‌های درون سلولی مرتبط با اتوفاژی و انتقال‌دهنده مرتبط با پردازش آنتی‌ژن - ارائه وابسته به سلول‌های CD{48}}، که به موجب آن آنتی ژن احتمالاً پپتیدها از MHC-I به MHC-II در طی بازیافت غشا منتقل می شوند (36، 37). شناسایی مستقیم وابسته به MHC-II سلول های تومور اتولوگ توسط سلول های CD{54}} اختصاصی برای اپی توپ های E7 گزارش شده است (38، 39). با این حال، این مطالعات هر دو مربوط به پروتئین‌های E7 هستند که توسط زیرگروه‌های سرطان‌زای HPV کمتر شایع (یعنی HPV{59}} و HPV{-59) ارائه شده توسط سلول‌های سرطان دهانه رحم بر روی مولکول‌های HLA-DR بیان می‌شوند. بنابراین، ممکن است که زیرگروه HPV، بافت شناسی تومور، و آلل های محدود کننده HLA نیز ممکن است عوامل مرتبط در ارائه متفاوت آنتی ژن های HPV هسته ای بر روی سلول های تومور MHC-II+ باشند. اگرچه داده‌های ما نشان می‌دهد که سمیت سلولی مستقیم تومور مکانیسم محتمل سلول‌های T CD4+ اختصاصی E6- و KRASG12V نیست، مکانیسم‌های ضد توموری دیگر سلول‌های CD4+ T توصیف شده‌اند، و انتقال اقتباسی سلول‌های CD{70}} اختصاصی تومور در بیماران مبتلا به سرطان فعالیت ضد توموری را نشان داده است (7، 40، 41). بنابراین، TCR های محدود شده با MHC-II مانند موارد شناسایی شده در این مطالعه، ممکن است برای ACT در بیماران انسانی مفید باشند، با توجه به هدف قرار دادن چنین TCR ها از اپی توپ های مشتق شده از انکوپروتئین های محرک محدود به هاپلوتیپ های HLA که در حدود 1.27٪ و 16.10٪ از سفید ایالات متحده تخمین زده می شود. جمعیت، به ترتیب، برای HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 و HLA-DRB5*01:01 (42). قابل‌توجه، سلول‌های CD{90}} با صدور مجوز DCهای حاوی آنتی‌ژن به روشی وابسته به CD40L، به پرایمینگ سلول‌های T CD{92} اختصاصی تومور کمک می‌کنند (43-45). ما نشان می‌دهیم که TCR اختصاصی KRASG12V شناسایی‌شده در این مطالعه، آنتی‌ژن‌های ارائه‌شده متقاطع را در زمینه DCها تشخیص می‌دهد، که نشان می‌دهد این سلول‌ها ممکن است بتوانند از طریق این عملکرد به ایمنی ضد تومور کمک کنند. سلول‌های CD{100}} T همچنین ممکن است با ترشح سیتوکین‌هایی مانند IL{102}} و IFN-، کمک موضعی به سلول‌های CD{101}} T در تومورها، پشتیبانی از بقای سلول‌های CD{104}} و T استخدام برای تومور (46). علاوه بر این، CD{106} TILها ممکن است آنتی ژن‌ها را در ریزمحیط تومور روی سلول‌های میلوئیدی مانند ماکروفاژها تشخیص دهند. در واقع، مطالعات پیش‌بالینی نشان داده‌اند که در غیاب MHC-II روی سلول‌های تومور، سلول‌های Trp1 CD{109}} منتقل‌شده به‌طور اقتباسی همچنان می‌توانند ایمنی ضد توموری وابسته به IFN- اعمال کنند و با افزایش فعالیت سیتوتوکسیک ماکروفاژها مرتبط باشند (47). با این حال، به نظر می رسد که این پدیده به ترشح آنتی ژن تومور وابسته است، که ما همچنین حدس می زنیم که در مورد اکثر انکوژن ها حداقل است. به طور کلی، مطالعه ما انتخاب‌پذیری ارائه مستقیم آنتی‌ژن‌های درون‌زا توسط سلول‌های توموری MHC-II+ را برجسته می‌کند و نشان می‌دهد که نه بیان CIITA و نه حضور یک آنتی‌ژن متصل به غشاء به تنهایی برای ترویج تشخیص مستقیم سلول‌های تومور توسط CD کافی نیست{115} } سلول های T. مطالعات بیشتری لازم است تا مشخص شود کدام آنتی‌ژن ممکن است مستقیماً توسط سلول‌های تومور MHC-II+ تحت چه شرایطی ارائه شود تا به طور کامل نقش سلول‌های T CD{119}} وابسته به بافت در سرطان را درک کنیم.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

مواد و روش ها

کشت سلولی TILها همانطور که قبلا توضیح داده شد برداشت و کشت شدند (48). به طور خلاصه، بافت تومور اولیه به قطعات 2-3 میلی متری تشریح شد، که در یک 24-صفحه چاه قرار داده شد و در RPMI{4}} تکمیل شده با 1{{{1{02}}% کشت داده شد. سرم AB انسانی، پنی سیلین-استرپتومایسین، HEPES، جنتامایسین، و 6،{8}} IU/ml IL-2. TIL های خارج شده توسط جایگزین های نیمه رسانه هر 2 تا 3 روز کشت داده شدند. سلول های T اولیه انسان از خون محیطی در محیط 5{119}}:50 متشکل از 50% AIM V به اضافه 50% RPMI{17}} همراه با 10% سرم AB انسانی، پنی سیلین-استرپتومایسین (100 U/) کشت داده شدند. هر میلی لیتر؛ Gibco، Thermo Fisher Scientific)، 300 IU/mL IL{22}}، 5 ng/mL IL-7 و 5 ng/ml IL-15. رده های سلولی تومور مشتق از بیمار تولید و همانطور که قبلاً توضیح داده شد کشت داده شدند (17). به طور خلاصه، بافت تومور اولیه به قطعات کوچکتر از 2 میلی متر بریده شد و با استفاده از GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) جدا شد. سلول های تومور در F-Media حاوی 5 میکرومولار مهارکننده Rho کیناز مجدداً تعلیق شدند و روی بستری از فیبروبلاست های 3T3 تابیده شده (30 گری) قرار گرفتند. پس از کشت اولیه، سلول‌های تومور در ترکیبی 3:1 از محیط تهویه‌شده 3T و F-Media حاوی 5 میکرومولار مهارکننده روکیناز تکثیر شدند. CaSki (ATCC)، NCI-H2444 (ATCC)، DAN-G (ATCC)، J76 Jurkat (ATCC)، 3T{46}CD40L، و B-LCLs در محیط RPMI حاوی ال-گلوتامین و HEPES نگهداری شدند. 10 میلی‌مولار؛ Gibco، Thermo Fisher Scientific)، 10% FBS، 1 میلی‌مولار سدیم پیروات (Gibco، Thermo Fisher Scientific)، 1× MEM اسیدهای آمینه غیر ضروری (Gibco، Thermo Fisher Scientific) و پنی‌سیلین-استرپتومایسین (100 U/ هر میلی لیتر؛ Gibco). ما 293GP (ATCC) را در مکمل محیطی DMEM با 10٪ FBS و پنی سیلین-استرپتومایسین (100 U/ml هر کدام؛ Gibco، Thermo Fisher Scientific) حفظ کردیم. سلول های IHW03304، GM3107، KAS011، D8 و D66 هدایایی از الساندرو ست (موسسه ایمونولوژی لا جولا) بودند. سنجش ELISPOT TILها یا PBMCها در 100،{67}} سلول در هر چاهک در صفحات ELISPOT پوشش داده شده با antiIFN– Abs (1-D1K، Mabtech) اندود شدند. سلول‌ها با استخرهای پپتیدی HPV{70} E6 و E7 PepMix (JPT)، استخرهای پپتیدی که جهش‌های انکوژنی انتخاب شده را نشان می‌دهند، یا پپتیدهای منفرد را در غلظت 5 میکروگرم در میلی‌لیتر برای استخرها یا 10 میکروگرم در میلی‌لیتر برای پپتیدها به مدت 22 ساعت قبل از ایجاد مجدد تحریک کردند. صفحات ELISPOT طبق دستورالعمل سازنده (Mabtech). برای کنترل مثبت، 5 میکروگرم در میلی لیتر فیتوهماگلوتینین-L استفاده شد. فرهنگ گسترش ex vivo. PBMC ها با یک استخر پپتیدی نشان دهنده جهش های انکوژنی انتخاب شده در غلظت 5 میکروگرم در میلی لیتر اندود شدند. محیط تازه حاوی 10 IU/ml IL{80}} در روزهای 4، 7 و 10 اضافه شد. در روز 14، PBMC ها برای استفاده در ELISPOT یا سنجش ترشح سیتوکین مجدداً تحریک شدند. توالی یابی TCR TIL ها یا PBMC ها با 5 ug/mL HPV{86}} E6 PepMix (JPT) یا پپتید KRASG12V مجدداً تحریک شدند و سلول های ترشح کننده IFN با استفاده از کیت سنجش ترشح IFN انسانی مطابق دستورالعمل سازنده (Miltenyi) به صورت فلورسنت برچسب گذاری شدند. . سلول‌های تک IFN{91}} با استفاده از FACSAria (BD Biosciences) در یک صفحه چاهی دسته‌بندی شدند و RNA-Seq با استفاده از Illumina Miseq برای شناسایی TCR و زنجیره‌های جفت انجام شد. برای شناسایی کلون TCR CD اختصاصی E{94}، سلول‌های ترشح کننده IFN طبق بالا مرتب شدند و توالی‌های TCR و TCR با PCR تودرتو و مالتی پلکس، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تقویت شدند (49). محصولات PCR برای توالی یابی Sanger (ETON Biosciences) ارسال شد. برای تجزیه و تحلیل فرکانس TCR، PBMC ها قبل و بعد از 14- روز گسترش ex vivo با پپتیدهای مشخص شده به Adaptive Biotechnologies ارسال شدند. تجزیه و تحلیل بیان HPV RNA از سلول‌های تومور اولیه Hu{99} و رده سلولی تومور جدا شد و برای RNA-Seq حجیم ارسال شد. خواندن توالی‌های زوجی با استفاده از BWA (v0.7.12) (50) به ژنوم کامل HPV (GenBank accession no. NC{106}}.2) و رونوشت متناظر آن نگاشت شد. فایل نقشه هم ترازی دنباله به دست آمده به یک نقشه تراز باینری مرتب شده تبدیل شد و نمایه شد و سپس با استفاده از SAMtools (v1.2) تعداد قرائت های نقشه برداری شده را شمارش کرد (50). توالی اگزوم کل. توالی یابی کل اگزوم و RNA-Seq به ترتیب با استفاده از کیت های Agilent whole-exome capture و Illumina در موسسه La Jolla for Immunology Sequence Core انجام شد. نمونه‌های زیستی FFPE توسط مرکز سرطان Moores به Tempus برای توالی‌یابی نسل بعدی همراه با DNA مرجع مطابق با استفاده از نمونه‌های خون محیطی توزیع شد. توالی خوانده شده از توالی یابی اگزوم تومور و نمونه های طبیعی با ژنوم مرجع GRCh38 با استفاده از SpeedSeq Align (v0.1.0) تراز شدند (51). انواع Exome با استفاده از SpeedSeq Somatic شناسایی شدند و انواع با استفاده از SNPeff (v4.3i) حاشیه نویسی شدند (52). داده های توالی RNA-Seq و کل اگزوم برای این دست نوشته در NCBI BioProject، شماره دسترسی PRJNA924789 بارگذاری شده است. انتقال رتروویروسی سلول T توالی های نوکلئوتیدی TCR با استفاده از BioXP 3200 (Codex) در ستون فقرات رتروویروس MSGV1 سنتز و کلون شدند. توالی کدون برای بیان در سلول های انسانی بهینه شد. نواحی ثابت TCR انسانی با نواحی ثابت TCR موش با جانشینی برای افزایش بیان سطح و ارتقای جفت ترجیحی مبادله شد (53، 54). PBMC های انسانی از پوشش های بافی جدا شدند. سلول‌های T CD{131}} یا CD{132}} با انتخاب مغناطیسی حذف شدند و کسر منفی حاوی تمام لنفوسیت‌های باقی‌مانده در محیط سلول T با 50 نانوگرم در میلی‌لیتر ضد CD3 Ab (OKT3) به مدت 2 کشت داده شد. روزها.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

سوپرناتانت های رتروویروسی TCR با ترانسفکشن همزمان سلول های 293GP با وکتور MSGV1 حاوی توالی TCR مربوطه و پلاسمید RD113 تولید شد. دو روز پس از ترانسفکشن، سوپرناتانت رتروویروسی برداشت شد و به صورت تازه یا منجمد در دمای 8- درجه استفاده شد. ترانسداکشن ها بر روی صفحات پوشش داده شده با RetroNectin (Takara) انجام شد، همانطور که قبلاً توضیح داده شد (5). بیان ناحیه ثابت TCR موش توسط فلوسیتومتری برای تعیین کارایی انتقال ارزیابی شد. سلول های T مهندسی شده با TCR زودتر از روز 7 پس از تحریک اولیه مورد استفاده قرار گرفتند. سنجش عملکردی سلول T ما 5 × 1{183}}4 TIL، سلول‌های T transduced یا سلول‌های J76 Jurkat را با 1 × 105 B-LCL در طول شب با غلظت‌های مشخص‌شده پپتید یا 5 × 103 سلول‌های توموری که روز قبل در {16} کاشته شدند، کشت کردیم. }به ترتیب بشقاب های پایین U یا کف صاف. در جایی که نشان داده شد، آگونیست ضد CD28 (کلون CD28.2، BioLegend) یا مسدودکننده ضد PD-L1 (کلون 29E.2A3، BioLegend) Abs به ترتیب با غلظت های 5 و 10 میکروگرم در میلی لیتر به کشت سلول های T و تومور اضافه شد. برای سنجش سیتوکین و نشانگر فعال سازی، کوکتل فعال سازی سلولی 1× (BioLegend) حاوی PMA و یونومایسین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. برای مطالعات انسداد HLA، 20 میکروگرم در میلی لیتر از Abs زیر به B-LCLهای پالس پپتیدی حداقل 2 ساعت قبل از افزودن سلول های T اضافه شد: anti-HLA-DQ (Tü169، BioLegend)، anti-HLA-DR (L243، BioLegend)، یا کنترل ایزوتیپ IgG2a موش (MOPC{39}}، BioLegend). در جایی که نشان داده شد، قبل از افزودن سلول های T، سلول های تومور به مدت 72 ساعت با 10 نانوگرم در میلی لیتر IFN- نوترکیب کشت داده شدند. مواد رویی پس از 18 تا 24 ساعت برداشت شدند، IFN- با روش ELISA (Thermo Fisher Scientific) اندازه‌گیری شد و گلوله‌های سلولی برای فلوسیتومتری رنگ‌آمیزی شدند. سنجش سمیت سلولی با کشت همزمان سلول‌های T با سلول‌های تومور در نسبت‌های اثرگذار به هدف مشخص شده انجام شد. به طور خلاصه، 5 × 103 سلول تومور کاشته شدند و قبل از افزودن سلول‌های T در نسبت‌های مشخص شده، یک شبه کشت داده شدند. لیز سلول هدف با استفاده از تحلیلگر سلولی Real-Time xCELLigence (ACEA Biosciences) تعیین شد که امپدانس الکتریکی ناشی از چسبندگی سلول را هر 30 دقیقه تا پایان آزمایش ارزیابی می کرد. داده ها با استفاده از بسته نرم افزاری xCELLigence RTCA تجزیه و تحلیل شدند و نتایج به عنوان شاخص سلولی در زمانی که سلول های T اضافه شدند به 1 نرمال شد گزارش شد. سنجش ارائه MHC-II. ساختارهای DNA مصنوعی که موارد زیر را کد می‌کنند، با استفاده از BioXP 3200 (Codex) در MSGV1 کلون شدند: 25 اسید آمینه N ترمینال ژن HLA-B انسانی، و به دنبال آن 50 اسید آمینه اول HPV-16 E6 یا 25 اسید آمینه KRASG12V با 55 اسید آمینه C ترمینال HLA-B انسانی، یک عنصر خود شکاف T2A و دنباله کد کننده EGFP ترکیب شده است. سوپرناتانت های ویروسی همانطور که در بالا توضیح داده شد تولید شدند و B-LCL های اتولوگ پس از تحریک یک شبه بر روی بستری از سلول های تابیده شده (0.5 گری) 3T3 که CD40L (3T3-CD40L) انسانی را بیان می کردند، روی صفحات پوشش داده شده با RetroNectin انتقال داده شدند. کارایی ترانسدوشن با تعیین کمیت فلوسایتومتری بیان EGFP ارزیابی شد. B-LCLهای تبدیل شده با 3T3-CD40L در حضور 200 IU/mL IL نوترکیب انسانی (PeproTech) برای 2 دور متوالی 2-3 روز قبل از کشت همزمان با TILهای اتولوگ تحریک شدند. تولید DCها برای سنجش نمایش آنتی ژن. DCها با استفاده از روش چسبندگی پلاستیک تولید شدند. PBMC های منجمد ذوب شده و در محیط DC (RPMI{88}} حاوی ال-گلوتامین، 5% سرم انسانی AB غیرفعال شده با حرارت و 100 واحد بر میلی لیتر پنی سیلین-استرپتومایسین) به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه قرار گرفتند. سلول های غیر چسبنده با شستشو با PBS گرم حذف شدند و سلول های چسبنده در محیط DC حاوی 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) و 500 U/mL IL{99}} (PeproTech) به مدت 6 روز کشت داده شدند. . ما 1 ug/mL پپتید KRASG12V یا 20 ug/mL پروتئین KRASG12V یا WT KRAS (Abcam) را مستقیماً یک شبه به DCهای نابالغ اضافه کردیم. روز بعد، DCها جمع آوری و با سلول های T مهندسی شده با TCR با نسبت 1:1 در طول شب قبل از ارزیابی دخول CD137 توسط فلوسیتومتری، کشت شدند. انتقال رتروویروسی سلول های تومور. توالی کد کننده CIITA انسانی (تکنولوژی های DNA یکپارچه) سنتز شد و توسط Gibson Assembly در MSGV1 کلون شد. توالی‌های کدکننده HLADRB5*01:01 و زنجیره‌های جدا شده توسط یک توالی P2A سنتز شدند (تکنولوژی‌های DNA یکپارچه) و در یک ناقل لنتی ویروسی pHAGE اصلاح‌شده در بالادست یک توالی T2A و به دنبال آن یک توالی گزارشگر CD34 کوتاه توسط مجمع گیبسون کلون شدند. رویی رتروویروسی با MSGV1 تولید شد، همانطور که در بالا توضیح داده شد. سوپرناتانت های لنتی ویروسی با ترانسفکشن همزمان سلول های 293T با پلاسمیدهای pHAGE، tat، rev، gag/pol و vsv-g تولید شدند. سوپرناتانت های ویروسی 24 ساعت بعد جمع آوری و با سانتریفیوژ در لوله های Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma) تغلیظ شدند. سلول های تومور اندود شدند و 1 روز بعد، محیط با مایع رویی رتروویروسی یا لنتی ویروسی که با 10 میکروگرم در میلی لیتر پلی برن تکمیل شده بود، جایگزین شد. چهار ساعت بعد، مایع رویی حاوی ویروس آسپیره شد و با محیط کشت جایگزین شد. سلول‌های تومور MHC-II+ و CD{126}} با استفاده از یک مرتب‌کننده سلول فیوژن FACS (BD Biosciences) مرتب شدند. فلوسیتومتری. سلول ها با Abs مونوکلونال کونژوگه با فلوروکروم به آنتی ژن های زیر نشاندار شدند: CD3-PE ضد انسانی (OKT3، Tonbo، Cytek Biosciences)، CD4-PE-Cyanine7 (SK3، Tonbo، Cytek Biosciences)، CD8-APC (Hit8a، Tonbo). , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B{144}}, Miltenyi Biotec), PD{145} –BV650 (EH12.2H7، BioLegend)، HLA-II–APC (Tü39، BioLegend)، و ضد موش TCR -APC (H57-597، Tonbo، Cytek Biosciences). سلول های مرده با DAPI یا LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific) رنگ آمیزی شدند. E{154}– HLA-A*02:01–تترامر PE توسط مرکز هسته تترامر NIH مونتاژ و برچسب‌گذاری شد. سلول ها با 1 ug/mL تترامر به مدت 1 ساعت روی یخ رنگ آمیزی شدند. رنگ آمیزی Ab برای آنتی ژن های سطحی به مدت 15 دقیقه روی یخ انجام شد. برای رنگ‌آمیزی سیتوکین درون سلولی (ICS)، سلول‌های T با APC‌های پالس پپتیدی به مدت 4 تا 6 ساعت در حضور برفلدین A کشت داده شدند. سلول‌ها پس از سطح، نفوذپذیر شدند و برای سیتوکین‌های داخل سلولی با کیت Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) رنگ‌آمیزی شدند. ، طبق دستورالعمل سازنده. Abs کنژوگه با فلوئوروکروم زیر برای رنگ‌آمیزی سیتوکین استفاده شد: IFN--APC (4S.B3، BioLegend)، IL{168}}-FITC (MQ{169}}H12، BioLegend)، TNF--BV785 (Mab11) ، BioLegend)، و Granzyme B-PE (QA16A02، BioLegend). داده ها با فلوسایتومتر FACSCelesta (BD Biosciences) جمع آوری و با نرم افزار FlowJo v10.7 تجزیه و تحلیل شدند. آمار. تجزیه و تحلیل های آماری با Prism 8 (نرم افزار GraphPad) انجام شد. برای مقایسه ICS، از آزمون t-tailed 2-جفت نشده استفاده شد. برای مقایسه سرکوب سیگنالینگ سلول T با واسطه Ab-Ab مسدودکننده HLA، از روش ANOVA 2- استفاده شد. P <0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. تایید مطالعه نمونه‌های انسانی شناسایی‌شده مورد استفاده در این مطالعه با رضایت آگاهانه از طریق پروتکل UCSD IRB 101391CX، "فنوتیپ‌سازی محیط تومور و جداسازی سلولی" به‌دست آمدند. رضایت کتبی آگاهانه توسط افراد در مطالعه ارائه شد.

منابع

1. Hanahan D، Weinberg RA. علائم سرطان: نسل بعدی سلول. 2011؛ ​​144 (5): 646-674.

2. شمس الدین AA، و همکاران. ایمنی تومور و ایمونوتراپی برای سرطان های مرتبط با HPV. کشف سرطان. 2021؛ 11 (8): 1896-1912.

3. Simanshu DK، و همکاران. مروری بر پروتئین‌های RAS و تنظیم‌کننده‌های آن در بیماری‌های انسانی. سلول. 2017؛ 170 (1): 17-33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ، و همکاران. یک مجموعه پلی کلونال غیرمنتظره بزرگ از سلول های T اختصاصی HPV برای عمل در بیماران مبتلا به سرطان دهانه رحم آماده است. سرطان Res. 2010؛ 70 (7): 2707-2717.

5. استوانوویچ اس، و همکاران. چشم انداز آنتی ژن های تومور ایمونوژنیک در ایمونوتراپی موفق سرطان اپیتلیال ناشی از ویروس علوم پایه. 2017؛ 356 (6334): 200-205.

6. Bhatt KH و همکاران. پروفایل پاسخ‌های اختصاصی سلول‌های T HPV، واکنش‌های آنتی‌ژنی گسترده‌ای را در بیماران مبتلا به سرطان اوروفارنکس نشان می‌دهد. J Exp Med. 2020؛ 217 (10): e20200389.

7. Veatch JR و همکاران. سلول های T CD{4} اختصاصی BRAF V600E نفوذ کننده تومور با پاسخ بالینی کامل در ملانوم ارتباط دارد. جی کلین سرمایه گذاری. 2018؛ 128 (4): 1563-1568.

8. Veatch JR، و همکاران. سلول‌های CD{1} T درون‌زا، نئوآنتی‌ژن‌ها را در بیماران سرطان ریه شناسایی می‌کنند، از جمله جهش‌های انکوژنیک عودکننده KRAS و ERBB2 (Her2). Cancer Immunol Res. 2019؛ 2 (13): 910-922.

9. Cafri G، و همکاران. سلول‌های T حافظه‌ای که جهش‌های انکوژنیک شناسایی شده در خون محیطی بیماران سرطان اپیتلیال را هدف قرار می‌دهند. Nat Commun. 2019؛ 10 (1): 449.

10. Tran E و همکاران. درمان انتقال سلول T با هدف قرار دادن KRAS جهش یافته در سرطان N Engl J Med. 2016؛ 375 (23): 2255-2262.

11. Draper LM، و همکاران. هدف قرار دادن سلول‌های سرطانی اپیتلیال HPV{1} توسط سلول‌های T مهندسی‌شده با ژن TCR علیه E6. Clin Cancer Res. 2015؛ 21 (19): 4431-4439.

12. جین بی، و همکاران. سلول های T مهندسی شده که E7 را هدف قرار می دهند، رگرسیون سرطان های ویروس پاپیلومای انسانی را در یک مدل موش واسطه می کنند. JCI Insight. 2018؛ 3 (8): e99488.

13. Bear AS و همکاران. خصوصیات بیوشیمیایی و عملکردی اپی توپ های KRAS جهش یافته، این انکوپروتئین را برای هدف گیری ایمونولوژیک تایید می کند. Nat Commun. 2021؛ 12 (1): 4365.

14. Oh DY، و همکاران. سلول های T داخل توموری CD{1} واسطه سمیت سلولی ضد تومور در سرطان مثانه انسان هستند. سلول. 2020؛ 181 (7): 1612-1625.

15. Cachot A, et al. سلول های سیتولیتیک CD4 T خاص تومور، ایمنی محافظتی در برابر سرطان انسان را واسطه می کنند. Sci Adv. 2021؛ 7 (9): eabe3348.

16. دوران اس ال، و همکاران. ژن درمانی گیرنده سلول T برای سرطان های اپیتلیال مرتبط با ویروس پاپیلومای انسانی: یک مطالعه اول در انسان، فاز I/II. جی کلین اونکول. 2019؛ 37 (30): 2759-2768.

17. لیو ایکس و همکاران. برنامه ریزی مجدد مشروط و گسترش طولانی مدت سلول های طبیعی و تومور از نمونه های زیستی انسانی. پروتوک Nat. 2017؛ 12 (2): 439-451.

18. Veatch JR، و همکاران. سلول‌های CD{2}} اختصاصی نئوآنتی‌ژن در ملانوم انسانی دارای حالت‌های تمایز متنوعی هستند و با سلول‌های CD{3}} T، ماکروفاژها و عملکرد سلول‌های B ارتباط دارند. سلول سرطانی 2022؛ 40 (4): 393-409.

19. Lowery FJ و همکاران. امضای مولکولی سلول‌های T ضد توموری واکنش‌دهنده به نئوآنتی‌ژن از سرطان‌های متاستاتیک انسانی علوم پایه. 2022؛ 375 (6583): 877-884.

20. کریتر اس، و همکاران. افزایش کارایی ارائه آنتی ژن با جفت کردن آنتی ژن ها به سیگنال های قاچاق MHC کلاس I. جی ایمونول. 2008؛ 180 (1): 309-318.

21. Zaretsky JM، و همکاران. جهش های مرتبط با مقاومت اکتسابی به انسداد PD-1 در ملانوم. N Engl J Med. 2016؛ 375 (9): 819-829.

22. گروس A، و همکاران. شناسایی نئوآنتی ژن‌های سرطان دستگاه گوارش انسان توسط لنفوسیت‌های PD{1}} در گردش. جی کلین سرمایه گذاری. 2019؛ 129 (11): 4992-5004.

23. Scholtalbers J, et al. TCLP: یک کاتالوگ رده سلولی سرطان آنلاین که نوع HLA، نئو اپی توپ ها، ویروس و بیان ژن را پیش بینی می کند. ژنوم مد. 2015؛ 7 (1): 118.

24. جونجا وی، چوی جی، مخترعان; BioNTech US Inc.، واگذارنده. ساختار گیرنده سلول T و استفاده از آن. ثبت اختراع ایالات متحده شماره US202103040215A1. 4 نوامبر 2021.

25. شارپ AH، Pauken KE. عملکردهای متنوع مسیر مهاری PD1 Nat Rev Immunol. 2018؛ 18 (3): 153-167.

26. آبلین جی جی، و همکاران. تعریف قوانین پردازش لیگاند و اتصال HLA-II با طیف سنجی جرمی، پیش بینی اپی توپ سرطان را افزایش می دهد. مصونیت. 2019؛ 51 (4): 766-779.

27. سیلویوس جی آر، و همکاران. K-ras4B و پروتئین های پرنیله شده فاقد "سیگنال دوم" به صورت پویا با غشاهای سلولی مرتبط می شوند. مول بیول سلول. 2006؛ 17 (1): 192-202.

28. Chang CH، Flavell RA. ترانس فعال کننده کلاس II بیان ژن های متعدد درگیر در ارائه آنتی ژن را تنظیم می کند. J Exp Med. 1995؛ 181 (2): 765-767.

29. رودیگ اس جی، و همکاران. پروتئین‌های MHC در ملانوم متاستاتیک درمان‌نشده حساسیت متفاوتی به CTLA-4 و PD-1 می‌دهند. Sci Transl Med. 2018; 10 (450): eaar3342.

30. احمدزاده م، و همکاران. سلول‌های T تنظیم‌کننده CD انسان نفوذکننده به تومور، مجموعه TCR مجزایی را نشان می‌دهند و واکنش‌پذیری تومور و نئوآنتی‌ژن را نشان می‌دهند. Sci Immunol. 2019؛ 4 (31): eaao4310.

31. اولیویرا جی، و همکاران. چشم انداز سلول های CD کمکی و تنظیمی ضد تومور CD{1}} در ملانوما. طبیعت. 2022؛ 605 (7910): 532-538.

32. Rock KL، و همکاران. خودت را معرفی کن! توسط مولکول های MHC کلاس I و MHC کلاس II. Trends Immunol. 2016؛ 37 (11): 724-737.

33. Takechi Y و همکاران. پروتئین غشای ملانوزومی یک هدف سطح سلولی برای درمان ملانوما است. Clin Cancer Res. 1996؛ 2 (11): 1837-1842.

34. Lepage S، Lapointe R. توالی‌های هدف‌گیری ملانوزومی از gp100 برای ارائه اپی‌توپ درون‌زای محدود شده با MHC کلاس II و انتقال به محفظه‌های آندوزوم ضروری هستند. سرطان Res. 2006؛ 66 (4): 2423-2432.

35. Alspach E و همکاران. نئوآنتی ژن های MHC-II ایمنی تومور و پاسخ به ایمونوتراپی را شکل می دهند. طبیعت. 2019؛ 574 (7780): 696–701.

36. Dengjel J، و همکاران. اتوفاژی ارائه MHC کلاس II پپتیدهای پروتئین های منبع داخل سلولی را ترویج می کند. Proc Natl Acad Sci US A. 2005؛ 102 (22): 7922-7927.

37. Matsuzaki J, et al. مسیرهای پردازش آنتی ژن غیرکلاسیک برای تشخیص مستقیم تومور محدود شده با MHC کلاس II توسط سلول های T خاص NY-ESO4+ مورد نیاز است. Cancer Immunol Res. 2009؛ 2 (4): 341-350.

38. Höhn H، و همکاران. CD{1}} لنفوسیت های نفوذ کننده تومور در سرطان دهانه رحم، پپتیدهای محدود شده با HLA-DR ارائه شده توسط ویروس پاپیلومای انسانی-E7 را تشخیص می دهند. جی ایمونول. 1999؛ 163 (10): 5715-5722.

39. Höhn H، و همکاران. پپتیدهای ویروس پاپیلومای انسانی نوع 33 E7 که توسط HLA-DR*0402 به سلول‌های T نفوذگر تومور در سرطان دهانه رحم ارائه شده است. جی ویرول. 2000؛ 74 (14): 6632-6636.

40. Lu YC، و همکاران. درمان بیماران مبتلا به سرطان متاستاتیک با استفاده از یک گیرنده سلول T محدود شده با کمپلکس سازگاری بافتی اصلی کلاس II که آنتی ژن MAGE-A3 را هدف قرار می دهد. جی کلین اونکول. 2017؛ 35 (29): 3322-3329.

41. Tran E و همکاران. ایمونوتراپی سرطان بر اساس سلول‌های T CD{2} اختصاصی جهش در بیمار مبتلا به سرطان اپیتلیال. علوم پایه. 2014؛ 344 (6184): 641-645.

42. Gonzalez-Galarza FF، et al. پایگاه داده شبکه فرکانس آللی (AFND) به روز رسانی 2020: طبقه بندی داده های استاندارد طلایی، داده های ژنوتیپ دسترسی آزاد و ابزارهای جستجوی جدید. Nucleic Acids Res. 2020؛ 48 (d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP, et al. کمک سلول های T برای لنفوسیت های T سیتوتوکسیک توسط فعل و انفعالات CD{2}}CD40L انجام می شود. طبیعت. 1998؛ 393 (6684): 480-483.

44. Ahrends T, et al. سلول‌های CD{1}} به ایجاد یک برنامه مؤثر سلول T سیتوتوکسیک از جمله کاهش تنظیم گیرنده همزمان و افزایش تهاجم بافت کمک می‌کنند. مصونیت. 2017؛ 47 (5): 848-861.

45. Ferris ST، و همکاران. cDC1 prime و دارای مجوز سلول‌های CD{2}} برای القای ایمنی ضد توموری هستند. طبیعت. 2020؛ 584 (7822): 624-629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. کمک سلول‌های T CD{1}} در محیط تومور برای به‌کارگیری و عملکرد سیتولیتیک لنفوسیت‌های CD8+ T مورد نیاز است. سرطان Res. 2010؛ 70 (21): 8368-8377.

47. Haabeth OAW، و همکاران. رد سلول های تومور مثبت MHC کلاس II با واسطه سلول های CD{1}} به ترشح آنتی ژن و ارائه غیرمستقیم روی APCs میزبان بستگی دارد. سرطان Res. 2018؛ 78 (16): 4573-4585.

48. دادلی ME، و همکاران. تولید کشت های لنفوسیتی نفوذ کننده تومور برای استفاده در درمان انتقال پذیرفته شده برای بیماران ملانوما. جی ایمونوتر. 2003؛ 26 (4): 332-342.

49. داش پی، و همکاران. تجزیه و تحلیل تک سلولی رپرتوار گیرنده سلول T روش‌ها Mol Biol. 2015؛ 1343: 181-197.

50. لی اچ و همکاران. فرمت تراز/نقشه توالی و ابزارهای SAM. بیوانفورماتیک. 2009؛ 25 (16): 2078-2079.

51. چیانگ سی، و همکاران. SpeedSeq: تجزیه و تحلیل و تفسیر ژنوم شخصی فوق العاده سریع. روش های Nat. 2015؛ 12 (10): 966-968.

52. Cingolani P، و همکاران. برنامه ای برای حاشیه نویسی و پیش بینی اثرات پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی، SnpEff: SNPs در ژنوم سویه مگس سرکه melanogaster w1118. iso-2; iso-3. پرواز (آستین). 2012؛ 6 (2): 80-92.

53. Haga-Friedman A, et al. ادغام جهش‌های آبگریز گذرنده در TCR بیان سطحی و تمایل عملکردی سلول T را افزایش می‌دهد. جی ایمونول. 2012؛ 188 (11): 5538-5546.

54. کوهن سی جی و همکاران. افزایش فعالیت ضد توموری سلول‌های T برای بیان گیرنده‌های سلول T با پیوند دی سولفید دوم مهندسی شده است. سرطان Res. 2007؛ 67 (8): 3898-3903.