مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

کمبود فاکتور رونویسی A میتوکندری هدفمند اپیتلیال کلیه منجر به تخلیه پیشرونده میتوکندری مرتبط با بیماری شدید کیستیک می شود--بخش اول

کن ایشی^1,2,11 و همکاران

عملکرد غیر طبیعی میتوکندری یک ویژگی به خوبی شناخته شده حاد و مزمن استکلیه بیماری ها. برای به دست آوردن بینش در مورد نقش میتوکندری درکلیههموستاز و پاتوژنز، ما فاکتور رونویسی میتوکندری A (TFAM) را هدف قرار دادیم، یک پروتئین مورد نیاز برای تکثیر و رونویسی DNA میتوکندری که نقش مهمی در حفظ توده و عملکرد میتوکندری ایفا می کند. برای بررسی پیامدهای اختلال عملکرد میتوکندری درکلیهسلول های اپیتلیال، TFAM را در هومئوباکس مربوط به سینوس چشم غیر فعال کردیم 2-کلیهسلول های پیش ساز کمبود TFAM منجر به کاهش قابل توجه بیان ژن میتوکندری، کاهش میتوکندری، مهار بلوغ نفرون و ایجاد بیماری کیستیک شدید پس از تولد شد که منجر به مرگ زودرس شد. این با مورفولوژی غیر طبیعی میتوکندری، کاهش مصرف اکسیژن و افزایش شار گلیکولیتیک همراه بود. علاوه بر این، ما دریافتیم که بیان TFAM در موش و انسان کاهش یافته استکلیه های پلی کیستیک، که با تخلیه میتوکندری همراه بود. بنابراین، داده های ما نشان می دهد که اختلال در بیان TFAM و کاهش میتوکندری از ویژگی های مولکولی هستند.کلیهبیماری کیستیک که ممکن است در پاتوژنز آن نقش داشته باشد.

کلمات کلیدی: گلیکولیز. رشد کلیه؛ میتوکندری؛بیماری کلیه پلی‌کیستیک; TFAM

سیستانچخوب است برایبیماری کلیه پلی‌کیستیک

بیانیه ترجمه

ما از ژنتیک موش برای درک نقش اختلال عملکرد میتوکندری استفاده کرده ایمکلیههموستاز غیرفعال سازی فاکتور رونویسی میتوکندری A (TFAM) در سلول های پیش ساز اپیتلیال هومئوباکس 2 مرتبط با سینوس oculis منجر بهکلیهشکستبه دلیل شدیدکلیه پلی کیستیک مرض. یافته های ما نشان می دهد که اختلال پیشرونده میتوکندری با تمایز اپیتلیال معیوب وکلیهسیستوژنز علاوه بر این، ما ثابت کردیم که بیان TFAM و تعداد میتوکندری در انسان کاهش یافته استکلیه پلی کیستیکبافت. مطالعات ما نشان می دهد که استراتژی های درمانی، که با هدف بهبود سلامت میتوکندری، ممکن است در درمان بیماران مبتلا به اتوزومال غالب مفید باشد.کلیه پلی کیستیکمرض.

اختلال عملکرد میتوکندری (mt) یک ویژگی پاتولوژیک رایج است که به خوبی شناخته شده است.کلیه بیماری هاو می تواند باعث آسیب سلولی، التهاب و فیبروز شودکلیهسلول‌های اپیتلیال لوله‌ای به شدت به آدنوزین تری فسفات (ATP) تولید شده از فسفوریلاسیون اکسیداتیو (OXPHOS) وابسته هستند، زیرا آنها چندین عملکرد انتقال اپیتلیال انرژی‌بر را انجام می‌دهند. بنابراین، تولید کارآمد Mt ATP برای عملکرد طبیعی کلیه و هموستاز الکترولیت سیستمیک ضروری است. علاوه بر این، شواهد اخیر نشان می‌دهد که میتوکندری‌ها نقش عمده‌ای در تنظیم ژن، سیگنال‌دهی سلولی و تمایز سلولی از طریق تولید متابولیت‌های واسطه و گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) دارند.کلیهبیماری هابه خوبی درک نشده است.

برای بررسی تابع mt درکلیههموستاز و پاتوژنز، ما فاکتور رونویسی میتوکندری A (TFAM) را هدف قرار دادیم. TFAM یک فاکتور رمزگذاری شده هسته ای برای عملکرد mt، حفظ تعداد کپی mt و پایداری ساختاری mt DNA ضروری است زیرا همانند سازی و رونویسی ژنوم mt را با خم کردن DNA پروموتور تنظیم می کند. که زیر واحدهای پروتئینی مجموعه زنجیره تنفسی، 22 RNA انتقالی و 2 RNA ریبوزومی را رمزگذاری می کنند. MT-CYB)، سیتوکروم c اکسیداز زیر واحد 1 (MT-CO1) و زیرواحد غشای سنتاز ATP کدگذاری شده با میتوکندری 6 (MTATP6).3،5 بدون TFAM، سلول ها توانایی خود را برای تولید ATP از طریق OXPHOS از دست نمی دهند. ROS، و به تدریج از میتوکندری تهی می شود. مطالعات ژنتیکی نشان داده اند که TFAM برای جنین زایی طبیعی ضروری است زیرا غیرفعال سازی Tfam هموزیگوت جهانی منجر به داخل رحمی می شود. کشندگی در روز جنینی 10.5، در حالی که کمبود هتروزیگوت، اگرچه تعداد کپی mt را تا 40 درصد کاهش داد و منجر به کمبود زنجیره تنفسی شد، منجر به مرگ جنینی نشد. بنابراین، هدف‌گیری ژنتیکی TFAM یک استراتژی تجربی مفید برای بررسی نقش است. اختلال پیشرونده mt در تمایز سلولی و هموستاز بافتی غیرفعال سازی شرطی نوع سلولی خاص Tfam نشان داد که تولید OXPHOS و/یا mt ROS برای تمایز سلولی، عملکرد و فیزیولوژی طبیعی حیاتی است.6-10

اختلالات اولیه mt ناشی از جهش‌های ژن هسته‌ای یا mt ممکن است همراه باشدکلیه مرضاغلب به صورت آسیب توبولو بینابینی یا اختلال عملکرد لوله ای جدا شده ظاهر می شود. اگرچه در پاتوژنز برخی بیماری های انسانی مانند اختلالات عصبی دخیل است، اما 13 جهش خاص در TFAM باعث ایجادکلیهبیماری گزارش نشده است. اخیراً کاهش بیان TFAM با مزمن مرتبط شده استکلیهمرض. از دست دادن یکپارچگی mt به دلیل غیرفعال شدن Tfam باعث بیماری توبولو بینابینی وکلیه شکستدر موش‌ها، که تا حدودی به دلیل فعال‌سازی واکنش‌های التهابی وابسته به ژن‌های اینترفرون (STING) است.

در اینجا ما گزارش می‌دهیم که موش‌هایی با غیرفعال‌سازی شرطی Tfam در هوموباکس 2 (SIX2) که سلول‌های پیش‌ساز نفرون را بیان می‌کنند، مبتلا به بیماری کیستیک شدید شده و زودتر از موعد می‌میرند.کلیهشکستبه عنوان موش های جوان.Tfam^-/- موش ها با نقص در بلوغ نفرون مشخص شدند که با کاهش mt، کاهش OXPHOS و تغییر متابولیک به سمت گلیکولیز در ارتباط بود.Tfam^-/- کلیهاپیتلیوم با توجه به شدت بیماری کیستیک درTfam^-/- ما 2 مدل موش را مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیمکلیه پلی کیستیکمرض(PKD)، که از جهش در هر یک از پلی سیستین-1 (PKD(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)1) یا سیستین-1 (Cys1)، و همچنین بافت های انسانی از بیماران مبتلا به بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب (ADPKD). ما آن را برقرار می کنیمTfam^-/- در کیست های PKD موش و انسان بی نظم است(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)، بافت ها در مجموع، مطالعات ما نشان می دهد که اختلال در تنظیم TFAM و کاهش mt از ویژگی های مشخصه آن هستندکلیهبیماری های کیستیک و ممکن است در پاتوژنز آنها نقش داشته باشد.

سیستانچخوب است برایبیماری کلیه پلی‌کیستیک

نتایج

غیرفعال شدن Tfam در سلول های دودمان SIX2 باعث بیماری کیستیک شدید و در نتیجه آن می شودکلیهشکستبه منظور بررسی تابع mt درکلیهاپیتلیوم، ما Tfam را در شش2-سلول‌های پیش ساز بیانگر غیرفعال کردیم، که همه بخش‌های نفرون را به‌جز مجرای جمع‌آوری (CD) ایجاد می‌کنند.15 برای این، آلل Tfam را با موش‌های تراریخته کروموزوم مصنوعی باکتریایی که بیان می‌کنند، عبور دادیم. یک پروتئین فیوژن فلورسنت سبز/Cre recombinase پروتئین (eGFP/Cre) تحت کنترل رونویسی از پروموتر Six2 (شکل 1a).شش2-eGFP/Cretg/^{تی جی پلاس}; Tfam^fl/fl) از اینجا به بعد به عنوان شش نامیده می شود2-Tfam^-/- جهش یافته ها شش2-Tfam^-/- موش‌ها در نسبت‌های مندلی مورد انتظار متولد شدند و با بازرسی بصری در بدو تولد از کنترل‌های همزاد Cre متمایز نشدند. با این حال، تفاوت در وزن بدن بین شش2-Tfam^-/- جهش‌یافته‌ها و کنترل‌های همزاد Cre تا روز پس از تولد (P) 14 آشکار شدند (5.7 به علاوه -0.3 گرم برای جهش‌یافته در مقابل 7.5 به علاوه -0.3 گرم برای کنترل، n=4 هر کدام، P =0.004؛ جدول تکمیلی S1). شش{13}}Tfam^-/- موش های جهش یافته با بزرگ شدن مشخص شدندکلیه هادر مقایسه با کنترل ها (کلیهنسبت وزن بدن 1.45 درصد به علاوه -0.19 درصد برای جهش یافته ها در مقابل 0.60 درصد به علاوه - 0.02 درصد برای کنترل، n {{8} } هر کدام، P < 0.001;="" شکل="" 1b،="" جدول="" تکمیلی="" s1)="" و="" بین="" سنین="" p20="" و="" p30="" فوت="" کرد="" (شکل="" 1b).="" مرگ="" و="" میر="" نوجوانان="" در="" گروه="" جهش="" یافته="" همراه="">کلیهشکستاز بیماری شدید کیستیک با سطوح نیتروژن اوره خون 68.40 به اضافه -5.32 mg/dl برای موش‌های جهش یافته در مقابل 16.8 2.0 mg/dl برای گروه شاهد ( n= 6 و 7، به ترتیب؛ P < 0.0001؛="" شکل="" 1b="" و="" c).="" علاوه="" بر="" این،="" شش{12}}tfam="" جهش="" به="" آلبومینوری="" قابل="" توجهی="" (نسبت="" آلبومین/کراتینین="" ادرار="" 43.58="" به="" اضافه="" -362.475.18="" میلی="" گرم="" در="" گرم="" در="" شش2-tfam="" جهش="" در="" مقابل="" 3.39="" میلی="" گرم="" در="" گرم="" در="" گروه="" کنترل="" مبتلا="" شدند.="" در="" p14،="" n{22}}="" و="" 10="" به="" ترتیب؛="" p=""><0.0001). این="" با="" الگوی="" بیان="" cre="" recombinase="" در="" سلول="" های="" پیش="" ساز="" نفرون="" six2،="" که="" منجر="" به="" ایجاد="" کلاهک="" مشتق="" شده="" از="" مزانشیم="" می="" شود،="" سازگار="">کلیهتوبول ها و پودوسیت ها.15 در مقابل شش2-Tfam^-/- موتان های جهش یافته، موش هایی با کمبود Tfam هتروزیگوت در سلول های پیش ساز SIX2 به طور طبیعی رشد کردند، بارور بودند و آشکار رشد نکردند.کلیهمرض(شکل تکمیلی S1).

شکل 1|غیرفعال شدن Tfam در سلول های دودمان SIX2 منجر به بیماری شدید کیستیک و نارسایی کلیوی می شود. (الف) شماتیکی که رویکرد آزمایشی و مکان توالی های هدف را در آلل فلکس شده Tfam نشان می دهد. تجزیه و تحلیل واکنش زنجیره ای پلیمراز DNA کل ژنومی کلیه جدا شده از کنترل همزاد (Cre ) و Six2-Tfam^-/-موش در سن روز پس از تولد (P) 7; آلل غیرترکیبی Tfam floxed با 2-lox (2) نشان داده می شود. آلل نوترکیب شده توسط 1-lox، آلل نوع وحشی با wt. þ یا - وجود یا عدم وجود ترانس ژن Six2-eGFP/Cre را نشان می دهد. (ب) پانل سمت چپ، عکس‌های کلیه‌ها از Cre control و Six2-Tfam^-/- موش در سن P20. وزن کلیه (KWs) به عنوان درصدی از وزن بدن (BW) بیان می شود (n= 4-14). پانل سمت راست، سطوح نیتروژن اوره خون (BUN) در Cre littermate control (co) و Six2-Tfam^-/-موش در سن P7 (n=7 و 6، به ترتیب) و منحنی بقا Kaplan-Meier برای کنترل Cre و شش2-Tfam^-/- موش ها در مقایسه با آزمون log-rank (n=10-13). (ج) تصاویری از مقاطع کلیه فیکس شده با فرمالین و پارافین از Cre control and Six2-Tfam^-/-موش‌ها در سنین P7 و P29 با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ‌آمیزی شدند و توسط ایمونوهیستوشیمی برای اکتین عضله صاف (ACTA2) و تمایز خوشه‌ای (CD) آنتی‌ژن 31 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. میله‌ها ¼ 1 میلی‌متر برای تمام مقاطع کلیه، 1{13}}0 میلی‌متر برای تصاویر H&E با قدرت بالا و 50 میلی‌متر برای تصاویر IHC. داده‌ها به صورت میانگین به علاوه - SEM بیان می‌شوند و با استفاده از آزمون t-test دانشجوی 2-تحلیل شدند. ***P <0.001. برای="" مشاهده="" بهینه="" این="" تصویر،="" لطفاً="" نسخه="" آنلاین="" این="" مقاله="" را="" در="" www.kidney-international.org="">

تجزیه و تحلیل شش2-Tfam^-/- موش‌هایی که آلل گزارشگر ROSA26-ACTB-tdTomato،-eGFP Cre را نیز بیان می‌کنند، که در اینجا به عنوان Six2-mT/mG نامیده می‌شود.Tfam^-/- موش، نشان می دهد که اکثریت قریب به اتفاق ساختارهای کیستیک درTfam^-/- کلیه‌ها از سلول‌هایی با سابقه بیان شش2-eGFP/Cre مشتق شده‌اند (شکل S2 تکمیلی). کیست در شش2-Tfam^-/- کلیه هاشواهدی از تکثیر را نشان داد که با حضور Ki{0}}سلول های اپیتلیال پوشش کیست مثبت (به طور متوسط ​​w40 درصد از تمام سلول های اپیتلیال پوشش کیست) نشان داد، در حالی که سلول های مثبت برای کاسپاز 3 شکافته شده در داخل کیست ها شناسایی نشد (شکل تکمیلی S3). ). این یافته ها با افزایش فسفریله کیناز سیگنال تنظیم شده خارج سلولی (p-ERK) و سطوح b-catenin در شش مطابقت دارد{7}}Tfam^-/- بافت کلیه (شکل تکمیلی S3). روی هم، داده های ما نشان می دهد که شش2-Tfam^-/- کلیه ها ویژگی های مولکولی را نشان می دهند که اغلب با آنها مرتبط استکلیهبیماری های کیستیک

شکل 3 |Tfam^-/-کیست ها نشانگرهای مشترک بخش نفرون را بیان نمی کنند. (الف) تصاویری از بخش‌های کلیه فیکس شده با فرمالین و پارافین از Six2-mT/mG.Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 میلی متر. (ب) تصاویری از بخش‌های کلیه فیکس شده با فرمالین و پارافین از Six2-mT/mG.Tfam^-/-موش در سن P14 برای eGFP و uromodulin توسط IF رنگ آمیزی شدند. ستاره ها کیست هایی را با uromodulin داخل مجرا نشان می دهند. حضور اورومودولین داخل مجرا در کیست هایی با حداکثر قطر 50-100 مورد بررسی قرار گرفت.μمتر یا در کیست های بزرگتر از 100 میلی متر در حداکثر قطر. میله‌ها=(a,b) 100 mm. برای مشاهده بهینه این تصویر، لطفاً نسخه آنلاین این مقاله را درwww.kidney-international.org.

سیستانچخوب است برایکلیه

بلوغ نفرون در Six2-Tfam معیوب است^-/-موش

از آنجایی که ممکن است چندین هفته طول بکشد تا موش هایی با غیرفعال سازی Tfam بافتی خاص دچار آسیب شناسی شوند، ما در ادامه دوره زمانی را بررسی کردیم.کلیهتوسعه بیماری در شش2-Tfam^-/-موش. ما کلیه‌ها را از موش‌های کنترل و جهش یافته در سنین P{0}}، P7 و P14 جمع‌آوری کردیم و از روش‌های بافت‌شناسی، رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس (IF) و تجزیه و تحلیل بیان ژن به طور کامل استفاده کردیم.کلیهعصاره برای ارزیابی رنگ‌آمیزی IF برای SIX2 و E-cadherin در سن P{2}} نشان داد که کلیه‌ها از کنترل و شش2-Tfam^-/-از نظر بافت شناسی مشابه بودند. تشکیل ساختارهای ناحیه نفروژنیک قشر مغز، مانند مزانشیم کلاهک SIX2þ، نوک حالب بیانگر E-cadherin، و ساختارهای نفرون در حال تولد مانندکلیهوزیکول ها و بدن های کاما و S شکل در شش مسدود نشد2-Tfam^-/-کلیه ها (شکل 2a). این یافته‌های بافت‌شناسی با سطوح بیان ژن‌های کدکننده نشانگرهای نفروژنیک سازگار بود. سطوح mRNA سیکس2، جعبه جفت 2 (Pax2)، پروتئین هومئوباکس LIM 1 (Lhx1) و سطح mRNA فاکتور رونویسی splt مانند 1 (Sall1) بین شاهد و شش تفاوت معنی داری نداشتند{9}}Tfam^-/- در کل موش هاکلیههمگن از P0کلیه ها(شکل 2 ب). این نشان می‌دهد که غیرفعال شدن TFAM در اجداد نفرون SIX2 تأثیر قابل‌توجهی بر تشکیل ساختارهای نفروژنیک ندارد.

اگرچه تشکیل ساختار نفرون نوپا مهار نشد، اما رنگ‌آمیزی با آلسیان بلو/اسید پریودیک-شیف و لکتین تتراگونولوبوس نیلوفر آبی نشان‌دهنده بلوغ نفرون انتهایی معیوب در شش بود2-Tfam^-/-موش در سن P{{0}}. آلسین بلو/اسید پریودیک-شیف، که غشای پایه لوله‌ای و مرز قلم مو را رنگ می‌کند، و لکتین تتراگونولوبوس نیلوفر آبی، که الیگوساکاریدهای خاص را در مرز برس سلول‌های لوله پروگزیمال شناسایی می‌کند، هر دو در کلیه‌های جهش یافته کاهش یافتند. شکل 2c رنگ آمیزی آلسیان آبی/اسید دوره ای- شیف را در نقاط زمانی P{6}}، P7 و P14 نشان می دهد. هیستوشیمی لکتین لوتوس تتراگونولوبوس و رنگ آمیزی IF برای پروتئین ویلمز تومور 1 در نقاط زمانی P{{1{0}}، P7 و P14 در شکل تکمیلی S4 نشان داده شده است. در سن P{15}}، ناحیه نسبی که با لکتین تتراگونولوبوس نیلوفر آبی رنگ‌آمیزی مثبت داشت 2.10 درصد، 0.51 درصد و {{30}}}.39 درصد بود. 0.1 درصد در سن P7 در مقابل 6.25 درصد 0.28 درصد و 6.2 درصد 1.1 درصد برای گروه کنترل، به ترتیب (n ¼ 3-4، P ¼ 0.0004 و 0.0007، به ترتیب، شکل تکمیلی S4). مطابق با این یافته‌های بافت‌شناسی، کاهش قابل‌توجه در بیان ژن‌های کدکننده نشانگرهای گلومرولی و قطعه نفرون اختصاصی پودوسین، نفرین، آکواپورین 1 (Aqp1)، کوترانسپورتر فسفات سدیم 2a (NaPi2a)، اورومودولین، کوترانسپورتلرورید سدیم-پتاسیم2 Nkcc2) و هم انتقال دهنده کلرید سدیم حساس به تیازید (Ncc) در Six{45}}Tfam^-/-موش ها (شکل 2b). روی هم رفته، این داده ها نشان می دهد که شش2-Tfam^-/- کلیه هاکاهش تدریجی تعداد بخش‌های نفرون پروگزیمال بالغ و گلومرول‌ها را نشان می‌دهند.

از آنجایی که فعالیت شش2-eGFP/Cre منجر به بخش‌های نفرون مشتق از مزانشیم کلاهک با کمبود TFAM می‌شود، پیش‌بینی کردیم که بلوغ سلول‌های اپیتلیال CD، که مشتق از جوانه حالب هستند، در Six تحت تأثیر قرار نمی‌گیرد{{2} }Tfam^-/-کلیه ها. مطابق با این تصور این است که رنگ‌آمیزی با آگلوتینین Dolichos biflorus، که با N-استیل-D-گالاکتوز در توبول دیستال و CD واکنش می‌دهد، نشان‌دهنده وجود بیش از حد نسبی ساختارهای آگلوتینین مثبت Dolichos biflorus در Six است2-Tfam^-/-کلیه ها. در سن 7 P، نواحی رنگ‌آمیزی مثبت برای آگلوتینین Dolichos biflorus 13.91 درصد 0.9 درصد از کل منطقه برای جهش‌یافته‌ها در مقابل 1.93 درصد 0.1 درصد برای کنترل (n ¼ 3، P ¼ {) را تشکیل می‌دهد. {10}}.0002؛ شکل تکمیلی S4). بیان mRNA زیرواحد آلفا اپیتلیال 1 کانال سدیم (Scnn1a) یا آکواپورین 2 (Aqp2)، که هر دو در سلول های اپیتلیال CD بیان می شوند، در مقایسه با شاهد کاهش معنی داری نداشتند (شکل 2b). در مقابل شش2-Tfam^-/-کلیه ها، غیرفعال شدن Tfam در سلول های پیش ساز هومئوباکس B7 (HOXB7)، که منجر به ایجاد سلول های اپیتلیال CD می شود، که منجر به از بین رفتن بیان نشانگر نفرون CD و اتساع خفیف لوله می شود، اما سیستوژنز انجام نمی شود (شکل تکمیلی S5). روی هم رفته، داده‌های ما نشان می‌دهد که از دست دادن عملکرد TFAM در سلول‌های پیش‌ساز SIX2 مانع از توسعه ساختارهای نفرون در حال تولد نمی‌شود، اما بلوغ نفرون نهایی را مهار می‌کند.

Tfam^-/-کیست ها در نشانگرهای قطعه نفرون مشترک کمبود دارند

برای مشخص کردن منشا هیستوژنتیکیTfam^-/- کلیهکیست، ما آنالیز IF را انجام دادیمTfam^-/- کلیه هاat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 میلی متر با رسوبات داخل مجرای uromodulin مشخص شد، که نشان می دهد منشاء بخش های نفرون دیستال به لوله پروگزیمال و حلقه نزولی هنله (شکل 3b).

ناهنجاری های پیشرونده در عملکرد mt و مورفولوژی درTfam^-/- سلول های اپیتلیال

برای مشخص کردن دوره زمانی پیامدهای متابولیکی حذف Tfam، ابتدا سطوح mRNA Tfam و mt-Co1، mt-Cyb و mt-Atp6 تنظیم شده با TFAM را بررسی کردیم.Tfam^-/- کلیه هادر سنین P{0}}، P7 و P14. همانطور که انتظار می رفت، سطوح mRNA Tfam، mt-Co1، mt-Cyb و mt-Atp6 به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 4a).Tfam^-/-سلول های اپیتلیال برچسب گذاری شده با eGFP (شش{0}}mT/mG؛ Tfam / موش) کاهش قابل توجهی در بیان پروتئین MT-CO1 نشان دادند (شکل تکمیلی S7). تعداد کپی DNA mt 63 درصد کاهش یافت، که با کاهش mt، نشانه کمبود TFAM مطابقت دارد (شکل 4a). در مقابل، بیان ژن های هسته ای کد کننده نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید: یوبی کینون اکسیدوردوکتاز زیرواحد هسته 3 (Ndufs3) و سوکسینات دهیدروژناز کمپلکس زیر واحد فلاوپروتئین A (Sdha) در سن P0 تحت تاثیر قرار نگرفت اما در سن P7 و P14a کاهش یافت (شکل). این یافته‌های حاصل از تجزیه و تحلیل ژن و پروتئین mt با کاهش تدریجی تعداد کپی mt در Tfam / اپیتلیوم مطابقت دارد.

ما بعداً اثرات متابولیکی غیرفعال‌سازی Tfam را در سلول‌های اپیتلیال لوله پروگزیمال اولیه (PTECs) جدا شده در سن P7 بررسی کردیم.Tfam^-/- PTECها کاهش قابل توجهی در میزان مصرف اکسیژن پایه نشان دادند (40.{1}}.10 برای جهش یافته ها در مقابل 61.75 5.18 pmol/min/104 سلول برای کنترل، n=3 هر کدام، P =0.034), ATP-linked respiration (33.{12}}.91 for mutants vs. 46.{15}}.91 pmol/min/104cells for controls, n{18} } هر کدام، P{19}}.093)، حداکثر تنفس (116.{22}}.19 برای جهش یافته ها در مقابل 225.5 13.55 pmol/min/104 سلول برای کنترل، n{{{ 28}} هر کدام، P{29}}.005)، و ظرفیت تنفسی مازاد (76.{32}}.18 برای جهش یافته ها در مقابل 163.{35}}.61 pmol/min/104 سلول برای کنترل , n =3 هر کدام، P=0.003؛ شکل 4b).

برای توصیف بیشتر درجه کاهش و آسیب mt، ما بررسی کردیمTfam^-/- کلیه هاتوسط میکروسکوپ الکترونی عبوری و {0}}میکروسکوپ روشنایی ساختاری بعدی (سیم‌کارت سه بعدی). در سن 7 P، میتوکندری ها شکل های نامنظم و بادکنکی از خود نشان دادند که با یافته های قبلی در موش های ناک اوت Tfam مطابقت دارد. تجزیه و تحلیل میکروسکوپی الکترونی عبوری نشان داد که ناهنجاری‌های ساختاری میتوکندری، مانند افزایش اندازه و کریستای غیرطبیعی، پس از تولد پیشرفت می‌کنند، زیرا تفاوت‌های مورفولوژیکی بین جهش‌یافته و گروه کنترل در سن P{27}} کمتر آشکار بوده و با افزایش سن شدیدتر می‌شوند (شکل 4c). ). سیم‌کارت سه بعدی برای بررسی حجم mt و اندازه شبکه در Six2-mT/mG استفاده شد. Tfam / جهش یافته در مقایسه با شش 2-mT/mG موش کنترل در سن 7 P. حجم mt در مقاطع 5 تا 8 توبول در هر بخش اندازه‌گیری شد و 25 تا 40 سلول‌های اپیتلیال قشری eGFP مثبت رنگ‌آمیزی شده برای کانال 1 آنیون انتخابی وابسته به ولتاژ با رنگ‌آمیزی IF مورد بررسی قرار گرفت. ما دریافتیم که حجم کل mt در هر سلول مثبت eGFP به طور قابل توجهی کاهش یافته است (62.{19}}.46 mm3/ سلول برای جهش‌یافته در مقابل 177.{23}}.17 mm3 / سلول برای کنترل، n ¼ 3 برای هر سلول ، P ¼ 0.0289) و با تغییر نسبت حجم کل mt به ازای کل حجم سلول از 0.{30}}.01 در کنترل‌ها به 0 مرتبط بود.{{{{ 33}}.016 در Six2-Tfam / جهش یافته (n ¼ 3 هر کدام، P ¼ 0.0017؛ شکل 4c). حداکثر اندازه شبکه mt، که بزرگترین شبکه mt را که در تمام سلول‌های eGFP مثبت مورد بررسی قرار گرفته است را اندازه‌گیری می‌کند، در شش کاهش یافت{41}}Tfam^-/- کلیه ها(143.2 23.2 mm3 برای جهش یافته ها در مقابل 318.3 49.45 mm3 برای کنترل ها، n ¼ 3 هر کدام، P ¼ 0.0327). در مجموع، یافته های فراساختاری و سیم کارت و یافته های حاصل از تجزیه و تحلیل ژن و پروتئین mt با کاهش تدریجی تعداد کپی mt درTfam^-/- اپیتلیوم

سیستانچخوب است برایبیماری کلیه پلی‌کیستیک

کمبود TFAM متابولیسم اپیتلیال کلیه را به سمت گلیکولیز سوق می دهد

PTEC ها درکلیهاز اکسیداسیون اسید چرب b و OXPHOS برای تولید ATP استفاده کنید و گلوکونئوژنتیک هستند.18 برای به دست آوردن بینش بیشتر در مورد تغییرات متابولیک مرتبط با غیرفعال سازی Tfam، ما آنالیز توالی RNA را انجام دادیم.کلیه هااز شش2-Tfam^-/-و موش‌های Cre littermate در سن 7 سالگی کنترل کردند. ما دریافتیم که ژن‌های تنظیم‌کننده کلیدی درگیر در گلیکولیز، مانند هگزوکیناز 2 (Hk2) و انولاز 2 (Eno2)، تنظیم مثبتی داشتند. در مقابل، بیان بیشتر ژن‌های درگیر در چرخه اسید تری کربوکسیلیک کاهش یافت (به عنوان مثال، ایزوسیترات دهیدروژناز 1 [Idh1])، و همچنین بیان ژن‌های دخیل در اکسیداسیون اسید چرب مانند استیل کوآنزیم A آسیل ترانسفراز 1B کاهش یافت. Acaa1b)، آسیل کوآنزیم A دهیدروژناز با زنجیره متوسط ​​(Acadm) (شکل 5a و b، شکل تکمیلی S8). مطابق با کاهش بیان ژن‌های دخیل در چرخه اسید تری کربوکسیلیک - ژن‌های اکسیداسیون تجمع چربی‌های خنثی بود که با رنگ‌آمیزی O قرمز روغنی در منجمد تشخیص داده شد.کلیهبخش ها در سن P14 (شکل 5c).

کاهش بیان TFAM در بافت‌های PKD موش و انسان با کاهش mt همراه است

چون شش2-Tfam^-/- کلیه هاشباهت زیادی به PKD داشت(بیماری کلیه پلی‌کیستیک) کلیه هاما بعداً بررسی کردیم که آیا TFAM در PKD تنظیم نشده است یا خیر(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)بافت ها ما ابتدا بیان ژن تنظیم شده TFAM و TFAM را در 2 مدل موش PKD ژنتیکی به خوبی تثبیت شده بررسی کردیم. سطوح mRNA Tfam به طور قابل توجهی در همگن کل کلیه از Pkd کاهش یافت^-/- و Cys^cpk/cpkموش‌ها که حامل جهش در هر دو PKD1 هستند(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)یا Cys1. این با کاهش بیان ژن‌های mt از طریق میتوکندری و کدگذاری هسته‌ای و همچنین بیان ژن گلیکولیتیک بی‌نظم همراه بود. مشابه شش2-Tfam^-/-کلیه ها, PKD(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)^-/- و Cys^cpk/cpk کلیه هابا افزایش Eno2 و Hk2 و کاهش قابل توجهی فسفوگلیسرات کیناز (Pgk) 1، پیروات دهیدروژناز کیناز (Pdk) 1 و سطوح رونوشت Pdk4 مشخص شدند (شکل 6a). بیان پروتئین TFAM، همانطور که با رنگ آمیزی IF ارزیابی شد، در سلول های اپیتلیال پوشش کیست در مقایسه با سلول های اپیتلیال از لوله های غیر کیستیک مجاور کاهش یافت (شکل 6b). این با کاهش بیان mt-Co1 و mt-Atp6 توسط هیبریداسیون درجا فلورسانس RNA همراه بود (شکل 6b، شکل تکمیلی S9). حجم mt، همانطور که توسط سیم کارت سه بعدی تعیین شد، در مقایسه با سلول های اپیتلیال از لوله های مجاور، غیر کیستیک یا PTEC از کنترل عادی، 55 درصد کاهش یافت.کلیه ها. تفاوت در حجم mt بین PTECs کنترل عادی و PTECs از لوله های غیر کیستیک یافت نشد (شکل 6c).

برای بررسی اینکه آیا از دست دادن بیان TFAM یک ویژگی مولکولی مشترک PKD انسان است یا خیر(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)ما نمونه‌های نفرکتومی از 5 بیمار ADPKD را با روش ایمونوهیستوشیمی، رنگ‌آمیزی IF، هیبریداسیون درجا فلورسانس RNA و SIM 3 بعدی تجزیه و تحلیل کردیم. کاهش بیان TFAM در 75.2 درصد به اضافه -7.5 درصد مشاهده شدکلیهکیست ها با روش ایمونوهیستوشیمی تجزیه و تحلیل شدند. این با کاهش بیان MT-CO1 و MT-ATP6 توسط هیبریداسیون درجا فلورسانس RNA همراه بود (شکل 7a، شکل تکمیلی S10). حجم mt در سلول های اپیتلیال پوشش کیست تقریباً 70 درصد کاهش یافت که توسط سیم کارت سه بعدی ارزیابی شد (شکل 7b). در مجموع، تجزیه و تحلیل 2 PKD(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)مدل‌های موش و بافت‌های ADPKD انسانی پیشنهاد کردند که کمبود TFAM و کاهش mt یافته‌های رایج در PKD هستند.(بیماری کلیه پلی‌کیستیک)بافت ها و احتمالاً بر پاتوژنز تأثیر می گذاردکلیهبیماری کیستیک

سیستانچ برایبیماری کلیه پلی‌کیستیک

بحث

برای اطلاع از قسمت دوم (بحث) این مقاله اینجا را کلیک کنید.

برگرفته از:کلیهکمبود فاکتور رونویسی میتوکندری هدفمند اپیتلیال A منجر به تخلیه پیشرونده میتوکندری مرتبط با بیماری شدید کیستیک توسط Ken Ishii1,2,11 و همکاران می شود.

---کلیهبین‌المللی (2021) 99، 657–670