پروتئین فعال کننده Rho-GTPase Myosin MYO9A به عنوان یک ژن کاندید جدید برای گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی تک‌وژنیک شناسایی شد.

joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

Qi Li1، Ashima Gulati2,6، Mathieu Lemaire3،7، Timothy Nottoli4، Allen Bale3 و Alda Tufro1،5

1 گروه اطفال، بخش نفرولوژی، دانشکده پزشکی ییل، نیوهیون، کانکتیکات، ایالات متحده؛ 2 گروه پزشکی داخلی، بخش نفرولوژی، دانشکده پزشکی ییل، نیوهیون، کانکتیکات، ایالات متحده; 3 گروه ژنتیک، دانشکده پزشکی ییل، نیوهیون، کانکتیکات، ایالات متحده; 4 مرکز ویرایش ژن ییل، دانشکده پزشکی ییل، نیوهیون، کانکتیکات، ایالات متحده آمریکا. و 5 گروه فیزیولوژی سلولی و مولکولی، دانشکده پزشکی ییل، نیوهیون، کانکتیکات، ایالات متحده آمریکا

کلمات کلیدی: FSGS; تعامل Myo9A-اکتین-کالمودولین. انواع MYO9A؛ فعالیت RhoA

گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی(FSGS) یک پادوسیتوپاتی است که منجر به نارسایی کلیه می شود، که علت مولکولی آن اغلب حل نشده باقی می ماند. در اینجا، ما یک جهش نادر هتروزیگوت مزخرف از دست دادن عملکرد MYO9A (p.Arg701*) را به عنوان عامل احتمالی بیماری در یک جفت خواهر و برادر با خانواده توصیف می کنیم.FSGS/پروتئینوری انواع MYO9A با اهمیت نامشخص با توالی یابی کل اگزوم در گروهی از 94 بیمار با بیوپسی اثبات شده مبتلا به FSGS شناسایی شدند. MYO9A یک میوزین غیر متعارف با دامنه Rho-GAP است که مونتاژ اتصال سلول های اپیتلیال، اتصالات عرضی و بسته های اکتین را کنترل می کند و پروتئین GTPase کوچک کد شده توسط ژن RHOA را غیرفعال می کند. فعالیت RhoA با تنظیم اسکلت سلولی تشکیل فیبر استرس اکتین و انقباض اکتومیوزین مرتبط است. Myo9A در سلول‌های پادوسیت‌های موش و انسان در شرایط in vitro و in vivo شناسایی شد. موش های Knockin حامل p.Arg701* MYO9A (Myo9AR701X) تولید شده توسط ویرایش ژن

پروتئینوری، رفع پودوسیت وFSGS. کلیه‌ها و پودوسیت‌های موش‌های جهش یافته Myo9AR701X/D نارسایی Myo9A، افزایش فعالیت RhoA، کاهش تعامل Myo9A-اکتین-کالمودولین، اختلال در پیوست پودوسیت و مهاجرت را نشان دادند. نتایج ما نشان می‌دهد که Myo9A یک جزء جدید از دستگاه اسکلت سلولی podocyte است که فعالیت RhoA و عملکرد پودوسیت را تنظیم می‌کند. بنابراین، موش‌های Myo9AR701X/þ فنوتیپ پروباند FSGS را خلاصه می‌کنند، نشان می‌دهند که p.R701X Myo9A یک جهش ایجادکننده FSGS در موش‌ها است و نشان می‌دهد که جهش‌های هتروزیگوت با از دست دادن عملکرد MYO9A ممکن است باعث ایجاد یک جهش جدید در انسان شود. FSGS. از این رو، شناسایی بیماری زا MYO9A

انواع در افراد دیگر با خانوادگی یا پراکندهFSGSبرای تعیین سهم ژن در بیماری مورد نیاز است.

بیانیه ترجمه

این کار یک جهش از دست دادن عملکرد میوزین 9A (MYO9A) را در یک خانواده مبتلا به پروتئینوری و اسکلروز گلومرولی سگمنتال کانونی (FSGS) وانواع MYO9Aاهمیت نامشخص در یک گروه FSGS. موش های Myo9A دارای جهش p.Arg701* دچار پروتئینوری وFSGS، بازتولید فنوتیپ probands. این مدل حیوانی جدید بینش‌های مکانیکی جدیدی در مورد عملکردهای Myo9A در سلول‌های پادوسیتی ارائه می‌کند و امکان آزمایش درمان‌های تجربی برای FSGS را فراهم می‌کند. داده‌ها نشان می‌دهند که جهش‌های هتروزیگوت از دست دادن عملکرد MYO9A ممکن است در ایجاد آن نقش داشته باشندFSGSپاتوژنز پیشنهاد ما گنجاندن MYO9A در پانل های آزمایش ژنتیکی FSGS است.

گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی(FSGS) یک ضایعه بافت شناسی است که می تواند منجر به بیماری کلیوی در مرحله نهایی شود. مطالعات ژنتیکی نشان می دهد که FSGS عمدتاً یک پودوسیتوپاتی است، زیرا پودوسیت ها بیشتر ژن های جهش یافته ایجاد کننده را بیان می کنند. با این حال، علت مولکولی FSGS ناشناخته است. در بیش از نیمی از موارد. 3 بنابراین، شناسایی ژن های ایجاد کننده FSGS اضافی و پاتوژنز مولکولی آنها از نظر بالینی مرتبط است. در اینجا ما میوزین 9A (MYO9A) را به عنوان یک ژن کاندید جدید برای FSGS انسانی با توالی یابی کل اگزوم (WES) شناسایی می کنیم. هدف کلی این مطالعه تعیین این است که آیا نوع نادر MYO9A شناسایی شده در بیماران، عملکرد سلول های بدن را تغییر می دهد و باعث ایجاد FSGS در داخل بدن می شود. MYO9A یک میوزین غیر متعارف و غیر عضلانی را رمزگذاری می‌کند که قبلاً با بیماری کلیوی انسان مرتبط نبوده است. 4 جهش MYO9A در بیماران آرتروگریپوز و سندرم میاستنی مادرزادی گزارش شده است. توابع، از جمله تنظیم حرکت و شکل، قاچاق اندامک، و سیگنال دهی.7-9 جهش های میوزین IIA (MYH9) و میوزین 1E (MYO1E) گزارش شده است که باعث بیماری گلومرولی و اتوزومال مغلوب FSGS می شود. کلاس 10-12{23}} میوزین‌ها شامل MYO9A و MYO9B هستند که به ترتیب توسط سلول‌های اپیتلیال و ایمنی بیان می‌شوند.9،13 ویژگی‌های متمایز آنها یک سر منفرد پردازشی است که روی F-اکتین حرکت می‌کند و یک دامنه دنباله پروتئین فعال کننده رو-گوانوزین تری فسفاتاز (Rho-GAP) که غیرفعال می‌شود. RhoA. mRNA Myo9A در اپیتلیوم اپاندیم مغز و در اپیتلیوم بیضه، ریه و کلیه بیان می شود. 4 موش حذفی Myo9A دچار هیدروسفالی پیشرونده، هیدرونفروز خفیف و توبولوپاتی می شوند. 9 نکته مهم این است که Myo9A برای اتصال متقاطع و بسته بندی رشته های اکتین که باعث ایجاد شبکه های اکتین می شود کافی است.

RhoA دینامیک اکتین پودوسیت را تعدیل می کند و نفوذپذیری گلومرولی را حفظ می کند. اختلالات فعالیت رو-گوانوزین تری فسفاتاز (Rho-GTPase) در پودوسیت ها منجر به بیماری گلومرولی می شود (در Mouawad et al.18 بررسی شده است). جهش عوامل پایین‌دست (INF2)19 و تنظیم‌کننده‌های Rho-guanosine disociation-inhibitor alpha (ARHGDIA)3 و Rho-GAP24 (ARHGAP24) 20 باعث پروتئینوری و FSGS می‌شوند. بنابراین، تنظیم دقیق ازفعالیت Rho-GTPaseبرای حفظ یک فنوتیپ پودوسیت طبیعی در داخل بدن بسیار مهم است. 18

در اینجا ما گزارش می‌کنیم که MYO9A یک پروتئین پودوسیت جدید است که وقتی در موش‌ها جهش پیدا می‌کند منجر به پروتئینوری، حذف فرآیند پا (FPE) و FSGS می‌شود که فنوتیپ انسانی مرتبط با نوع p.Arg701* MYO9A را تکرار می‌کند. یافته‌های ما ارتباط Myo9A را در سلول‌های پودوسیت نشان می‌دهد، نشان می‌دهد که Myo9A پودوسیت RhoA را تنظیم می‌کند و اولین شواهدی را ارائه می‌کند که p.Arg701* Myo9A با ناتوانی در تنظیم منفی RhoA و کاهش تعامل Myo9A-اکتین-کالمودولین باعث اختلال عملکرد سلول‌های بدن می‌شود.

سیستانچمی تواندرمان بیماری کلیهبهتر کردنعملکرد کلیه

مواد و روش ها

WES

WES نمونه‌های DNA از 2 خواهر و برادر مبتلا و 94 آزمودنی همگروه از کارآزمایی بالینی گلومرولواسکلروزیس سگمنتال کانونی (FSGS-CT؛ NCT00135811) در مرکز ییل برای تجزیه و تحلیل ژنوم و آزمایشگاه بالینی DNA Yale بر روی پلتفرم‌های Illumina انجام شد.21-SG2 مجموعه داده‌های WES گروه CT برای شناسایی مورد بازجویی قرار گرفتانواع MYO9Aبا برش فرکانس آللی جزئی #{{0}}.01 درصد برای انواع هتروزیگوت و #0.1 درصد برای انواع هموزیگوت و هتروزیگوت مرکب، با استفاده از امتیازات MetaSVM، 27 SIFT، 28، و CADD29 بیوانفورماتیک ارزیابی شد. انواع MYO9A با توالی یابی Sanger تایید شد. پانل ژنی متشکل از 64 ژن ایجاد کننده FSGS بر اساس OMIM، وراثت مندلی آنلاین در انسان، پایگاه داده (omim.org) و ادبیات مرتبط با "FSGS"، "پروتئینوری گلومرولی" یا "سندرم نفروتیک" (یا ترکیبی از این اصطلاحات) برای شناسایی انواع مرتبط استفاده شد.

نسل موش های knockin Myo9AR701X

ما موش‌های ضربه‌ای Myo9AR701X را با CRISPR/Cas{3}}ویرایش ژن با واسطه ایجاد کردیم. 30 روش‌های کامل در روش‌های تکمیلی گنجانده شده‌اند. Myo9AR701X knockin و نوع وحشی، نر و ماده، طبق پروتکل‌های تایید شده کمیته استفاده و مراقبت از حیوانات مرکز تحقیقات حیوانات Yale مورد استفاده قرار گرفت.

بافت شناسی / IF

بیوپسی کلیه انسان و کلیه های موش برای بافت شناسی، ایمونوفلورسانس (IF) و میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) همانطور که توضیح داده شد پردازش شدند. 31،32 IF در بخش های منجمد کلیه موش و پودوسیت های کشت انجام شد. آنتی بادی های اولیه ضد MYO9A موش (کلون 4C11؛ آبنوا، تایپه، تایوان)، ضد پودوسین خرگوش (P0372؛ سیگما، سنت لوئیس، MO)، ضد لامینین خرگوش (L9393؛ سیگما)، خرگوش ضد آکواپورین2 (PAS) بودند. -78809؛ Invitrogen، Carlsbad، CA)، و ضد مگالین خرگوش؛ 33 آنتی بادی ثانویه Alexa Fluor{15}} و 594-کونژوگه (Invitrogen) بودند. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال Olympus IX71 (Olympus Corp، Shinjuku، ژاپن) یا Leica SP{18}}Spectral (Leica Camera، Wetzlar، آلمان) گرفته شد.

ایمونوبلوت/ رسوب ایمنی

پروتئین ها با الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید تجزیه شدند و همانطور که قبلاً توضیح داده شد، ایمونو بلات شدند؛ 31،32 با anti-MYO9A (کلون 4C11)، اکتین (A2066؛ سیگما)، کالمودولین (EP799Y؛ Abcam، Cambridge، UK{glycer) 9}} آنتی بادی های اولیه فسفات دهیدروژناز (6C5؛ Millipore Corp، Burlington، MA)، RhoA (67B9؛ Cell Signaling Technology، Beverly، MA). رسوب همزمان به روشی که توضیح داده شد، با آنتی بادی پلی کلونال خرگوش ضد MYO9A (A{18}}AM؛ Bethyl Laboratories، Montgomery، TX) انجام شد، و سپس ایمونوبلات انجام شد.

cistanche برای گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی

PCR کمی

RNA کل با استفاده از کیت سنتز cDNA iScript (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) رونویسی معکوس شد، با پرایمرهای iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) و Myo9A واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR): 50 TCTGAGAAGTAGCAGGAATG و 50- AGCAACCACAGCTCTGAAA-30 با استفاده از CFX96-Touch-Real-Time-PCR (Bio-Rad). همانطور که شرح داده شد، mRNA Myo9a با روش 2-DDCt به mRNA ژن GAPDH نرمال شد.

میکروسکوپ TEM/ایمونوالکترون

TEM همانطور که توضیح داده شد انجام شد. 32 برای EM immunogold، کلیه موش نوع وحشی ثابت شد، انجمادهای بسیار نازک خاموش شدند، مسدود شدند، و با آنتی بادی اولیه ضد MYO9A موش (کلون 4C11) انکوبه شدند. آنتی بادی ثانویه خرگوش ضد موش IgG بود، مزدوج طلا طلای 10 نانومتری بز ضد خرگوش بود. برش‌ها پس از تثبیت، رنگ‌آمیزی و بر روی FEI Tecnai Biotwin (LaB6، 80 kV) TEM مورد بررسی قرار گرفتند.

جداسازی پودوسیت اولیه و سنجش عملکردی

پودوسیت ها از کلیه های نوع وحشی و Myo9AR701X/þ همانطور که توضیح داده شد با تغییرات اندکی جدا شدند. 37،38 سنجش چسبندگی همانطور که شرح داده شد انجام شد و با استفاده از رنگ‌آمیزی کریستال ویولت اندازه‌گیری شد.

ناک دان Myo9A

نابودی Myo9A (Myo9AKD) در سلول‌های پودوسیت موش جاودانه‌شده نوع وحشی با استفاده از RNA مداخله‌گر کوچک Myo9A (siRNA) (L-006539-ON-TARGETplus، Dharmacon؛ Horizon Discovery، کمبریج، انگلستان) به دنبال دستورالعمل‌های سازنده ایجاد شد. پودوسیت‌های ترانسفکت‌نشده و پودوسیت‌های ترانسفکت‌شده با siRNA غیرهدف‌گیر (D-001810-10-ON-TARGETplus Non-Targeting-Control، Dharmacon) به‌عنوان کنترل عمل کردند.

Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>جهش T مشترک توسط proband، خواهر و مادر (بالا، نشان داده شده با *) و توالی نوع وحشی (WT) از پدر (پایین)، بر اساس دنباله مرجع MYO9A انسانی NM_006901.4. (ب) بیوپسی کلیه از پروباند FSGS و ارتشاح بینابینی خفیف را نشان می دهد (رنگ آمیزی اسید-شیف دوره ای، بزرگنمایی اصلی X 400). (ج) شجره نامه خانواده تفکیک ژنوتیپ-فنوتیپ را نشان می دهد: افراد مبتلا به پروتئینوری/FSGS و گونه MYO9A p.R701X (نمادهای جامد)، نوع وحشی (نماد خالی)، یا ژنوتیپ ناشناخته MYO9A (با نشان داده شده با #). (د) دامنه‌های پروتئینی نوع وحشی MYO9A (NP{11}}.2): دامنه حرکتی (خاکستری) شامل حلقه 2 (زرد) و محل اتصال به کالمودولین (قرمز)، دامنه گردن (آبی)، دامنه دم (صورتی) ) از جمله دامنه پروتئین های فعال کننده رو-گوانوزین تری فسفاتاز (Rho-GAP) (سبز). مرزهای دامنه با شماره باقی مانده اسید آمینه نشان داده می شود. P.R701X MYO9A پیش‌بینی‌شده به محل اتصال کالمودولین در حلقه 2 ختم می‌شود، فاقد حوزه‌های گردن و دم است، ستاره‌ها نشان‌دهنده محل نادرست است.انواع MYO9Aبا اهمیت ناشناخته شناسایی شد. (ه) حفاظت تکاملی باقی مانده‌های اسید آمینه تغییر یافته توسط Missense MYO9A (ادامه)

شکل 1|(ادامه) جهش های شناسایی شده در بیماران مبتلا به FSGS: باقی مانده های تغییر یافته MYO9A p.D156G (p.Asp156) و p.E765D (p.Glu765) (فلش های قرمز) به شدت از طریق فیلوژنی حفظ می شوند. شماره های دسترسی: H. sapiens (NP_008832.2)، M. musculus (NP_766606.2)، R. norvegicus (NP_599162.1)، G. gallus (XP _015134553.1)، D. rerio (E7EZG2.1)، و X. tropicalis (XP_002934596.2) برای همترازی توالی چندگانه MYO9A با Clustal Omega، EMBL-EBI (European Molecular Biology) استفاده شدند. آزمایشگاه – موسسه بیوانفورماتیک اروپایی، https://www.ebi.ac.uk/ Tools/MSA/clustalo/). برای مشاهده بهینه این تصویر، لطفاً نسخه آنلاین این مقاله را در www.kidney-international.org ببینید.

فعالیت RhoA

RhoA فعال با روش Rho-activation pulldown assay (Millipore) و طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. RhoA فعال با ایمونوبلات شناسایی شد.

تحلیل آماری

داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism 8 (San Diego, CA) با آزمون t-paired Student با تصحیح Welch یا تحلیل واریانس Welch در صورت لزوم مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. P < 0.05="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

نتایج

شناسایی انواع MYO9A در بیماران مبتلا به پروتئینوری و FSGS

WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T، p.Arg701* گونه MYO9A، نشان دهنده وراثت اتوزومال غالب جهش است (شکل 1c). ژنوتیپ از عموی مادر مبتلا به بیماری مزمن کلیوی در دسترس نیست. انتظار می‌رود که MYO9A p.Arg701* (p.R701X) منجر به از دست دادن عملکرد به دلیل فروپاشی mRNA با واسطه بی‌معنی یا برش در حلقه 2 دامنه سر MYO9A (شکل 1d) شود که برای Myo9A برای پیوند متقابل اکتین لازم است. 0.16 جدول تکمیلی S1 همه انواع به اشتراک گذاشته شده توسط خواهر و برادر را نشان می دهد. هیچ جهشی در FSGS یا ژن های ایجاد کننده سندرم نفروتیک گزارش شده تا به امروز در هیچ یک از خواهر و برادرها شناسایی نشده است (جدول تکمیلی S2). طبق دانش ما، این اولین گزارشی است که جهش از دست دادن عملکرد MYO9A را به بیماری کلیوی انسان مرتبط می کند.

Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18؛ 27-29، 3 نوع دیگر نادرست بر اساس 3 امتیاز پیش‌بینی بیوانفورماتیک، خوش‌خیم تلقی می‌شوند. اسیدهای آمینه جایگزین شده در انواع p.Asp156Gly و p.Glu765Asp احتمالاً عملکرد مرتبطی دارند زیرا این باقیمانده ها در طول تکامل حفظ می شوند (شکل 1e). ما همچنین 1 بیمار حامل یک نوع MYO9A (p.Arg2283His) را شناسایی کردیم که با معیارهای فرکانس آللی جزئی که قبلاً در سندرم میاستنی مادرزادی گزارش شده بود، مطابقت نداشت. ) در 5 فرد مبتلا به واریانت MYO9A شناسایی شدند.

بیان MYO9A در پودوسیت ها و بیماری گلومرولی

بیان پروتئین Myo9A با بلات در کلیه‌های موش و سلول‌های پادوسیت موش و انسان شناسایی شد (شکل 2a). ایمونوسیتوشیمی بیان سیتوپلاسمی MYO9A را در پودوسیت های انسانی تایید کرد (شکل 2b). Immunoreactive Myo9A توسط میکروسکوپ IF در گلومرول‌های موش شناسایی می‌شود، جایی که تا حدی با پودوسین کلوکالیزه می‌شود (شکل 2c). دوبرچسب‌گذاری و میکروسکوپ کانفوکال، محلی‌سازی Myo9A را در امتداد جنبه خارجی غشای پایه گلومرولی (GBM) کاملاً بهم پیوسته یا با پودوسین (شکل 2d) و لامینین (شکل 2e) مشخص می‌کند. Immunogold EM محلی سازی دقیق Myo9A را نشان می دهد. ذرات طلا در سیتوپلاسم فرآیند پا و بدن سلولی پودوسیت توزیع می شوند (شکل 2f و g، شکل تکمیلی S1B و D). دیافراگم های شکاف به طور یکنواخت بدون برچسب هستند. سلول های مزانژیال و اندوتلیال هیچ برچسب قابل توجهی نشان نمی دهند. ذرات طلا نیز در سلول های لوله پروگزیمال شناسایی می شوند (شکل تکمیلی S1C).

برای ارزیابی اینکه آیا بیان Myo9A در بیماری‌های گلومرولی مختل می‌شود، ما 2 مدل موش مرتبط با پروتئینوری محدوده نفروتیک را بررسی کردیم. به طور مشابه، گلومرولی Myo9A در موش‌های مبتلا به گلومرولواسکلروز دیابتی پیشرفته با واسطه استرپتوزوتوسین ناشی از بیان بیش از حد Vegfa، 32 در مقایسه با Myo9A که در موش‌های دیابتی که بیش از حد Vegfa را بیان نمی‌کنند (شکل 3b) و موش‌های غیردیابتی (شکل 2) کاهش می‌یابد. محلی سازی فرآیند پادوسیت Myo9A و کاهش Myo9A گلومرولی در هر دو مدل بیماری پروتئینوری نشان می دهد که Myo9A ممکن است در عملکرد سد فیلتراسیون گلومرولی نقش داشته باشد.

جدول 1|انواع Missense MYO9A در گروه بیماران FSGS-CT شناسایی شد

p.D156G، p.Asp156Gly; p.E765D، Glu765Asp; p.M2384V, p.Met2384Val; p.P17{10}}4S، p.Pro1704Ser; p.T389M, Thr389Met. انواع با فرکانس آللی جزئی #0.01 درصد، n ¼ 94 نمونه پس از حاشیه نویسی ANNOVAR فیلتر شدند.

موش‌های MYO9AR701X با ویرایش ژنی برای توسعه FSGS

برای تعیین اینکه آیا جهش مزخرف p.Arg701* (p.R701X) MYO9A باعث بیماری گلومرولی در موش‌ها می‌شود یا خیر، موش‌های p.Arg701* (در اینجا Myo9AR701X نامیده می‌شود) توسط ویرایش ژن با واسطه CRISPR/Cas{7}را ایجاد کردیم.30 Heterozy. موش های جهش یافته Myo9AR701X/þ (شکل 4a) توله های جهش یافته زنده به روش مندلی تولید می کنند که نشان می دهد جهش از نظر جنینی کشنده نیست. جهش یافته های هموزیگوت دچار هیدروسفالی پیشرونده (شکل S2 تکمیلی)، آتاکسی و تشنج می شوند و تقریباً همگی قبل از 3 هفتگی می میرند، که یادآور موش های Myo9A-null است. تا بزرگسالی

همه موش های جهش یافته Myo9AR701X به FPE و پروتئینوری مبتلا می شوند، البته در سنین مختلف. جهش یافته های هموزیگوت Myo9AR701X/R701X گلومرول های بدشکلی، اتساع لوله ای و قالب های پروتئینی را در میکروسکوپ نوری در سن 2 هفتگی نشان می دهند (شکل 4b، شکل تکمیلی S3A). TEM کلیه های جهش یافته Myo9AR701X/R701X یک هفته ای FPE گسترده، GBM ضخیم و نامنظم و فقدان شکاف دیافراگم را نشان می دهد که با اتصالات چسبنده جایگزین شده است (شکل 4d). در مقابل، جهش یافته‌های هتروزیگوت Myo9AR701X/þ یک هفته‌ای، بافت‌شناسی کلیوی طبیعی و فراساختار سد فیلتراسیون گلومرولی را نشان می‌دهند (شکل 4c و e)، که از همنوعان وحشی قابل تشخیص نیستند (شکل 4f)، همانطور که توسط کمی‌سازی فرآیندهای پا تأیید می‌شود. (FP/mm GBM) (شکل 4g). آلبومینوری در نمونه‌های ادرار موش‌های جهش یافته هتروزیگوت و هموزیگوت Myo9AR701X توسط الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (شکل 4h) در سن 2 هفتگی تشخیص داده می‌شود.

در 4 ماهگی، موش‌های هتروزیگوت Myo9AR701X/þ FSGS را در میکروسکوپ نوری نشان می‌دهند (شکل 5a و g) و TEM FPE (فلش‌های سفید)، دیافراگم‌های شکاف غیرعادی (فلش‌های سیاه کوتاه)، GBM نامنظم و انبساط مزانژیال را نشان می‌دهد (شکل) . کمی سازی فرآیندهای پا FPE قابل توجهی را در Myo9AR701X/þ در مقابل کلیه های بالغ نوع وحشی نشان می دهد (شکل 5c). این فنوتیپ گلومرولی به طور قابل ملاحظه ای شبیه به آن چیزی است که در بیوپسی کلیه پروباند مشاهده شده است (شکل 1b). موش های جهش یافته Myo9AR701X/þ هتروزیگوت بالغ نسبت آلبومین به کراتینین ادرار به طور قابل توجهی بالاتر از موش های نوع وحشی همسان با سن هستند (شکل 5d) و هیچ شواهدی از پلی اوری یا کاهش وزن نشان نمی دهند (شکل 5e و f). در معاینه دوره‌ای اسید-شیف، کلیه‌های Myo9AR701X/þ بزرگسالان FSGS با شدت‌های مختلف (فلش‌ها، شکل 5g) و عدم وجود آتروفی لوله‌ای و اتساع یا ارتشاح بینابینی را نشان می‌دهند. برچسب گذاری دوگانه و میکروسکوپ کانفوکال Myo9A را در لوله های پروگزیمال، در محیطی به مگالین (سر پیکان، شکل 5h و k) شناسایی می کند، در حالی که Myo9A در بخش های نفرون دیستال که آکواپورین2 را بیان می کنند، شناسایی نمی شود (شکل 5h و i). برچسب زدن هر دو نشانگر لوله ای در Myo9AR701X/þ بالغ با میکروسکوپ کانفوکال از کلیه های نوع وحشی قابل تشخیص نیست (شکل 5h و k و i و l). در مقابل، رنگ‌آمیزی Myo9A در لوله‌های پروگزیمال و گلومرول‌ها در Myo9AR701X/þ (شکل 5h و i) در مقابل کلیه‌های نوع وحشی کاهش می‌یابد (شکل 5k و l). این یافته‌ها با هم نشان می‌دهند که p.Arg701* یک جهش Myo9A ایجادکننده FSGS در موش است که فنوتیپ و وراثت اتوزومی غالب گونه هتروزیگوت MYO9A p.Arg701* شناسایی شده در پروباند را خلاصه می‌کند.

چگونه p . جهش Arg701* Myo9A باعث القای FSGS می شود؟

ما از موش‌های Myo9AR701X knock-in برای بررسی پاتوژنز مولکولی FSGS ناشی از جهش p.Arg701* MYO9A استفاده کردیم. بیان Myo9A در کلیه های knockin Myo9AR701X به طور قابل توجهی در هتروزیگوت ها کاهش می یابد و در هموزیگوت ها توسط IF (شکل 6a) و ایمونوبلات (شکل 6b و c) شناسایی نمی شود. ما PCR کمی انجام دادیم تا ارزیابی کنیم که آیا هاپلو ناکافی ناشی از واپاشی بی معنی mRNA42 در جهش‌یافته Myo9AR701X/þ رخ می‌دهد یا خیر. بیان mRNA Myo9A در کلیه‌های Myo9AR701X/þ 50 درصد کمتر از کلیه‌های نوع وحشی است (48.3 ± 5.6 درصد؛ 0.0001 < p)="" (شکل="" 6d)،="" که="" با="" هاپلو="" ناکافی="" بودن="" مطابقت="">

کاهش Myo9A تعامل آن با اکتین و کالمودولین را کاهش می دهد

ما بررسی کردیم که آیا هاپلو ناکافی Myo9A برهمکنش Myo9A-اکتین-کالمودولین را تغییر می‌دهد. آزمایش‌های رسوب همزمان با مقایسه کلیه‌ها و پودوسیت‌های نوع وحشی و Myo9AR701X/þ برهم‌کنش Myo9A با اکتین و کالمودولین را تأیید می‌کند و نشان می‌دهد که برهم‌کنش Myo9A با هر دو پروتئین به میزان w50 درصد در کلیه‌های جهش یافته Myo9AR701X/þ و سلول‌های پودوسیت کاهش می‌یابد. مشابه Myo9A تمام قد. در مقابل، سطوح بیان اکتین و کالمودولین دست نخورده باقی می مانند (ورودی، شکل 6e، و f). برای تجزیه و تحلیل فعل و انفعالات Myo9A در تنظیم بیان کاهش یافته، ما w50 درصد Myo9AKD را با استفاده از siRNA در پودوسیت‌های موش نوع وحشی جاودانه القا کردیم، که توسط PCR کمی و بلات ایمنی (شکل 7a و b) ارزیابی شد، سپس آزمایش‌های رسوب همزمان را انجام دادیم. Myo9AKD تعامل Myo9A-اکتین-کالمودولین را متناسب با بیان Myo9A کاهش می دهد (شکل 7c). با هم، یافته‌های رسوب همزمان نشان می‌دهد که جهش هتروزیگوت p.Arg701* Myo9A و Myo9AKD فراوانی Myo9A و در نتیجه تعامل آن با اکتین و کالمودولین را کاهش می‌دهند. از آنجایی که Myo9A اکتین را با نسبت مولی 1:1 به هم متصل می‌کند، داده‌های ما نشان می‌دهد که کاهش Myo9A در پودوسیت‌های هتروزیگوت Myo9AR701X/þ ممکن است پیوند متقابل و بسته‌بندی اکتین با واسطه Myo9A را مختل کند.

شکل 2|(ادامه دارد) به podocin (سبز) در سمت GBM آن (سر پیکان). Inset ها بزرگنمایی بیشتری را نشان می دهند. میله‌ها=25 میلی‌متر. (ه) میکروسکوپ کانفوکال رنگ آمیزی Myo9A را نشان می دهد که نزدیک به هم یا با لامینین (سبز) در امتداد قسمت بیرونی GBM (درج و نوک پیکان) به هم پیوسته است. میله‌ها=25 میلی‌متر. (f,g) مکان یابی Myo9A با میکروسکوپ الکترونی ایمونوگلد در گلومرول های کلیه موش نوع وحشی: ذرات طلا (فلش های سیاه) در بدن سلولی podocyte (POD) مشاهده می شود و پا سیتوپلاسم (FP) را پردازش می کند، برخی از ذرات طلا دیده می شوند. در پایه FP در کنار غشای پایه گلومرولی اما نه در دیافراگم های شکاف. میله‌ها ¼ 500 نانومتر. برای مشاهده بهینه این تصویر، لطفاً نسخه آنلاین این مقاله را در www.kidney-international.org ببینید.

جهش Myo9AR701X فعالیت Rho-A را افزایش می دهد

ما فعالیت RhoA را با استفاده از روش pull-down در موش‌های جهش‌یافته و نوع وحشی Myo9AR701X، با تمرکز بر هتروزیگوت Myo9AR701X/þ اندازه‌گیری کردیم تا بینشی مکانیکی در مورد فنوتیپ p.Arg701* MYO9A انسانی ارائه دهیم. RhoA فعال به طور قابل توجهی در کلیه های کامل Myo9AR701X/þ (شکل 8a)، گلومرول های جدا شده (شکل 8b) و پودوسیت های اولیه (شکل 8c) در مقایسه با نمونه های کنترل نوع وحشی مربوطه افزایش یافته است. میزان افزایش GTP-RhoA در نمونه‌های Myo9AR701X/þ از w60 درصد در گلومرول‌های جدا شده تا w{18} برابر در کل کلیه‌ها و در سلول‌های پادوسیت متغیر است (شکل 8a-c). RhoA فعال در کلیه های هموزیگوت کمی بیشتر از کلیه های جهش یافته هتروزیگوت است اما این تفاوت معنی دار نیست (شکل 8a). این آزمایش‌ها با هم نشان می‌دهند که Myo9AR701X باعث افزایش فعالیت RhoA می‌شود

جهش Myo9AR701X/D و Myo9AKD رفتار پودوسیت را تغییر می دهند

برای ارزیابی اثر اختلال در تعامل Myo9A-اکتین و افزایش فعالیت RhoA شناسایی شده در پودوسیت‌های جهش یافته Myo9AR701X/þ بر عملکرد آن‌ها، چسبندگی و تحرک پودوسیت‌ها را با استفاده از سنجش اتصال و مهاجرت اندازه‌گیری کردیم، و سلول‌های پودوسیت اولیه نوع وحشی و جهش یافته را در شرایط کنترل و در شرایط کنترل مقایسه کردیم. مهار سیگنال دهی RhoA با مهارکننده کیناز مرتبط با Rho Y27632. این آزمایش‌ها به وضوح نشان می‌دهند که Myo9AR701X/þ تحرک پودوسیت (شکل 8d؛ شکل تکمیلی S4) و چسبندگی پودوسیت (شکل 8e) را به شیوه‌ای وابسته به فعالیت RhoA مختل می‌کند. برای ارزیابی مستقیم اثر نارسایی Myo9A بر عملکرد سلول‌های پودوسیت، سنجش اتصال و مهاجرت را با مقایسه سلول‌های پادوسیت موش نوع وحشی با پودوسیت‌های Myo9AKD انجام دادیم که mRNA و پروتئین w50 درصد Myo9A را بیان می‌کنند (شکل 7a و b). پودوسیت‌های درمان‌شده با siRNA غیر هدف به‌عنوان یک کنترل اضافی عمل کردند. Myo9AKD به طور قابل توجهی اتصال و مهاجرت پودوسیت را کاهش می دهد، همان نقصی که در پودوسیت های Myo9AR701X/þ مشاهده شد (شکل 8f و g). در مجموع، داده‌های مکانیکی نشان می‌دهند که جهش هتروزیگوت p.Arg701* Myo9A منجر به نارسایی Myo9A می‌شود که منجر به کاهش تعامل Myo9A-اکتین-کالمودولین و افزایش RhoA فعال در کلیه، به‌ویژه در سلول‌های پودوسیت می‌شود. ما تفسیر می کنیم که با هم، این مکانیسم ها عملکرد پودوسیت را مختل می کنند، که با کاهش چسبندگی و تحرک در شرایط آزمایشگاهی و با حضور پروتئینوری در داخل بدن نشان داده می شود.

بحث

این مطالعه Myo9A را به عنوان یک جزء جدید از دستگاه اسکلت سلولی پودوسیت شناسایی می‌کند که با تنظیم منفی فعالیت RhoA بر عملکرد پودوسیت تأثیر می‌گذارد. ما یک جهش مزخرف نادر MYO9A (p.Arg701*) مرتبط با

FSGS/proteinuria خانوادگی و نشان می دهد که این جهش باعث ایجاد ضایعات FSGS مانند در موش ها می شود و بینشی در مورد مکانیسم بیماری ارائه می دهد.

یافته‌های ما از این ایده حمایت می‌کند که MYO9A یک ژن کاندید FSGS است و p.Arg701* MYO9A یک نوع دخیل در FSGS انسان است، بر اساس دستورالعمل‌های کالج ژنتیک پزشکی آمریکا برای نسبت دادن علیت با استفاده از الگوریتم‌های پیش‌بینی ژن، فرکانس‌های آللی، مدل‌های حیوانی تجربی. و سنجش های عملکردی. 43،44 خواهر و برادر پروباند دارای p.Arg701* MYO9A هیچ جهشی در ژن های ایجاد کننده FSGS شناخته شده تا به امروز ندارند و هیچ مدرکی دال بر دلایل ثانویه FSGS نشان نمی دهند. این گونه در یک خویشاوند کوچک به دنبال یک الگوی توارث غالب اتوزومی با بیان متغیر متمایز می شود. MYO9A p.Arg701* پیش‌بینی می‌شود که یک نوع از دست دادن عملکرد باشد، در اگزوم‌های کنترل وجود ندارد و دارای فرکانس آللی است.<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">

غربالگری WES از گروه بزرگی از کودکان و بزرگسالان جوان FSGS نامرتبط41، 2 بیمار را با انواع نادرست هتروزیگوت MYO9A شناسایی کرد (p.Asp156Gly و p.Glu765Asp). هر دو نوع Missense MYO9A شامل باقیمانده‌های بسیار حفاظت‌شده هستند، فرکانس‌های آللی جزئی دارند.<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">

شکل 3|بیان گلومرولی Myo9A در مدل‌های موش بیماری گلومرولی (الف) سندرم نفروتیک رشدی ناشی از بیان بیش از حد Vegfa31: ایمونوفلورسانس Myo9A (قرمز) را در گلومرول‌های موش‌های 2- هفته‌ای عادی و غیرالقا شده نشان می‌دهد و به وضوح بیان Myo9A را در گلومرول‌های موش‌های نفروتیک با بیان بیش از حد Vegfa (در حالی که podocin) کاهش می‌دهد. بدون تغییر است. (ب) دیابت ناشی از استرپتوزوتوسین با یا بدون بیان بیش از حد Vegfa32: ایمونوفلورسانس Myo9A (سبز) را در گلومرول‌های ناشی از کلیه‌های دیابتی القا نشده (کنترل DM) شناسایی می‌کند و Myo9A واکنش‌پذیر را به طور قابل‌توجهی در گلومرول‌های موش‌های دیابتی با بیان بیش‌ازحد بیان می‌کند. 40،6-دیامیدینو{13}}فنیلندول (DAPI) (آبی) هسته‌های هر دو بخش را با گلومرول‌های مشخص (خط سفید تفکیک شده) نشان می‌دهد. میله‌ها=50 میلی‌متر. برای مشاهده بهینه این تصویر، لطفا نسخه آنلاین این مقاله را در www. کلیه - بین المللی

Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>جهش T جایگزین CGA می شود که Arg (R) را توسط TGA رمزگذاری می کند، یک کدون توقف که پایان ترجمه را در اسید آمینه 7 پیش بینی می کند. (ب) رنگ آمیزی پریودیک اسید-شیف از کلیه جهش یافته Myo9AR701X/R701X یک هفته ای هموزیگوت، گلومرول های غیرطبیعی، اتساع لوله ای و قالب های پروتئینی را نشان می دهد. نوار{6}} میلی متر. (ج) رنگ آمیزی اسید پریودیک-شیف از کلیه هتروزیگوت Myo9AR701X/þ 2- هفته ای بافت شناسی طبیعی را نشان می دهد. نوار{11}}میلی متر. (د) میکروسکوپ الکترونی عبوری از گلومرول یک هفته‌ای Myo9AR701X/R701X نشان‌دهنده محو شدن فرآیند عظیم پا (فلش‌های سفید)، عدم وجود دیافراگم‌های شکاف، جایگزینی اتصالات چسبنده (فلش‌های سیاه) و قاعده گلومر ضخیم‌شده است. غشاء (GBM). نوار =1 میلی متر. (ه) میکروسکوپ الکترونی عبوری نماینده از گلومرول هتروزیگوت Myo9AR701X/þ هفته‌ای {{18} روندهای طبیعی پا (فلش‌های نازک سیاه) و دیافراگم‌های شکاف طبیعی (فلش‌های نازک سفید) را نشان می‌دهد. نوار =1 میلی متر. (و) میکروسکوپ الکترونی عبوری از همزاد WT یک هفته‌ای سد فیلتراسیون گلومرولی طبیعی را نشان می‌دهد: فرآیندهای پای نازک که توسط دیافراگم‌های شکافی، سلول‌های اندوتلیال سوراخ‌دار (ECs) و GBM نازک به هم مرتبط شده‌اند. نوار =1 میلی متر. (ز) کمیت افاسمان فرآیند پا در سن 2 هفتگی: کلیه‌های هموزیگوت Myo9AR701X/R701X کمتر از نیم پا (FPs)/mm GBM نسبت به WT یا هتروزیگوت Myo9AR701X/þ نشان می‌دهند که نشان‌دهنده افاسه شدن شدید فرآیند پا است. P <0.0001 (تحلیل="" واریانس).="" (h)="" رنگ="" آبی="" کوماسی="" سدیم="" دودسیل="" سولفات-پلی="" آکریل="" آمید="" با="" الکتروفورز="" نمونه="" های="" ادراری="" که="" با="" الکتروفورز="" حل="" شد،="" آلبومینوری="" (alb)="" را="" در="" هر="" دو="" myo9ar701x/r701x="" (+="" )="" و="" myo9ar701x/þ="" (þ/="" plus)="" نشان="" می="" دهد،="" در="" حالی="" که="" ادرار="" wt="" فاقد="" آلبومین="" است.="" آلبومین="" سرم="" گاوی="" (10="" میلی="" گرم)="" به="" عنوان="" کنترل="" وزن="" مولکولی="" عمل="" می="" کند.="" pod،="" پودوسیت.="" برای="" مشاهده="" بهینه="" این="" تصویر،="" لطفاً="" نسخه="" آنلاین="" این="" مقاله="" را="" در="" www.kidney-international.org="">

شکل 5|تجزیه و تحلیل فنوتیپ موش‌های هتروزیگوت Myo9AR7{{2{25}}}}1X/D. (الف) رنگ آمیزی پریودیک اسید-شیف (PAS) از کلیه {3}ماهه Myo9AR701X/þ یک گلومرول با اسکلروز گلومرولی سگمنتال کانونی گسترده و تکثیر مزانژیال را نشان می‌دهد. نوار=50 میلی‌متر (ب) میکروسکوپ الکترونی عبوری از کلیه 4-ماهی Myo9AR701X/þ نشان‌دهنده ریزش گسترده فرآیند پا (فلش‌های سفید)، جایگزینی جزئی دیافراگم‌های شکاف (فلش‌های سیاه نازک) توسط اتصالات چسبنده (فلش های سیاه ضخیم). نوار =2 میلی‌متر (ج) کمیت لایه‌برداری فرآیند پا در موش‌های جهش یافته Myo9AR701X/þ بالغ: 4 ماهه هتروزیگوت (Het) Myo9AR701X/þ نشان می‌دهد 2.2±0.06 FP/mm، در مقایسه با نوع وحشی (WT) ) 3.7±0.13 FP/mm. ****پ<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">

Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0.001. (ه) حجم ادرار (24 ساعت) و (f) وزن بدن در موش WT (n=18) و Myo9AR701X/þ (Het، n=16) متفاوت نیست. (g,j) رنگ آمیزی PAS از کلیه‌های Myo9AR701X/þ (g) و WT (j): (g) اسکلروز کانونی اولیه (فلش) و تکثیر مزانژیال را در 2 گلومرول نشان می‌دهد، توبول‌های پشت به پشت نرمال و بدون ارتشاح. (j) گلومرول ها و لوله های طبیعی را در کلیه WT نشان می دهد. میله‌ها{10}} میلی‌متر. (h,k) میکروسکوپ کانفوکال Myo9A/Megalin ایمونوفلورسانس: (h) کلیه Myo9AR701X/þ سیگنال محدود Myo9A (قرمز) (سر پیکان) را در سلولهای لوله پروگزیمال نشاندار شده با مگالین (سبز) نشان می دهد، لوله های پروگزیمال گشاد نشده اند. (k) کلیه WT Myo9A (سر پیکان) فراوان تری را که به مگالین در سلول های توبول پروگزیمال مجاور است نشان می دهد. میله‌ها{16}} میلی‌متر. (i،l) میکروسکوپ کانفوکال ایمونوفلورسانس Myo9A/Aquaporin2 (AQP2): (i) کلیه Myo9AR701X/þ محدود Myo9A (قرمز) را در گلومرول (سر پیکان) نشان می‌دهد، Myo9A در بخش‌های نفرون دیستال که با AQP برچسب‌گذاری شده است شناسایی نمی‌شود. که گشاد نمی شوند. (ل) کلیه WT رنگ آمیزی Myo9A در گلومرول و رنگ آمیزی AQP2 در بخش های نفرون دیستال را نشان می دهد. میله‌ها{27}} میلی‌متر. EC، سلول اندوتلیال؛ FP، پا سیتوپلاسم را پردازش می کند. GBM، غشای پایه گلومرولی. برای مشاهده بهینه این تصویر، لطفاً نسخه آنلاین این مقاله را در www.kidney-international.org ببینید.

شکل 6|بیان Myo9A و تعامل Myo9A-اکتین-کالمودولین در Myo9AR701X در کلیه ها و سلول های پادوسیت. (الف) ایمونوفلورسانس گلومرولی Myo9A و پودوسین را تشخیص می‌دهد: رنگ‌آمیزی گلومرولی Myo9A (قرمز) در کلیه‌های نوع وحشی (WT) قوی است، در گلومرول‌های Myo9AR701X/þ به‌طور قابل‌توجهی کاهش می‌یابد و در Myo9AR701X/R701X/R701 شناسایی نمی‌شود. پودوسین (سبز) در تمام موش‌ها به سلول‌های پادوسیت تبدیل می‌شود. colocalization جزئی podocyte-Myo9A با ادغام (زرد) نشان داده شده است. میله‌ها{18}} میلی‌متر. (ب) ایمونوبلات: بیان دست نخورده Myo9A (280 کیلو دالتون) تقریباً در کلیه‌های Myo9AR701X/þ (هتروزیگوت [Het]) به نصف کاهش می‌یابد و در کلیه‌های Myo9AR701X/R701X (هموزیگوت [Hom])، کلیه‌ها (باند کوچک‌تر) شناسایی نمی‌شود.<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >2-کاهش برابری بیان Myo9A توسط آرایه DNA در موش‌های دیابتی زوکر گزارش شده است.49 با هم، داده‌های بیان Myo9A نشان می‌دهد که Myo9A ممکن است در سد فیلتراسیون گلومرولی نقش داشته باشد.

برای درک ارتباط جهش مزخرف p.Arg701* MYO9A در داخل بدن، ما موش های Myo9AR701X را با ویرایش ژن تولید کردیم. جهش یافته های هموزیگوت Myo9AR701X/R701X دچار هیدروسفالی پیشرونده می شوند که منجر به مرگ تا 3 هفتگی شبیه موش های Myo9A-null می شود. و کمبود شکاف دیافراگم و لوله های گشاد شده، همراه با آلبومینوری. موش های بالغ Myo9A-null توبولوپاتی پروگزیمال، پلی اوری و پروتئینوری با وزن مولکولی پایین را نشان داده اند. متأسفانه، هیچ داده فراساختاری گلومرولی در گزارش گنجانده نشده است؛ به طور شگفت انگیزی 3- تا 6-Myo9A یک ماهه موش‌های پوچ همانطور که قبلاً توضیح داده شد تسلیم هیدروسفالی پیشرونده نشدند. از آنجایی که موتانت‌های هموزیگوت Myo9AR701X/R701X تا بزرگسالی زنده نمی‌مانند، ما فقط می‌توانیم فنوتیپ گلومرولی اولیه را که در اینجا توضیح داده شده است، مشخص کنیم. اتساع لوله ای مشاهده شده در جهش یافته های Myo9AR701X/R701X یک هفته ای ممکن است شواهد اولیه ای از توبولوپاتی توصیف شده در موش های بالغ Myo9A-null را نشان دهد.

Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2-برابر در پودوسیت‌های اولیه (c)، وسترن بلات نماینده n=3 تا 4 آزمایش مستقل، لیزات جمع‌آوری شده از 3 موش، کمی‌سازی (میانگین± انحراف معیار)، آنالیز واریانس (ANOVA) ) یا آزمون t جفت نشده (b,c). *پ<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">

یکی از یافته‌های کلیدی این مطالعه این است که موش‌های هتروزیگوت Myo9AR701X/þ در بدو تولد از نظر فنوتیپی طبیعی هستند، اما در 4 ماهگی دچار آلبومینوری، FSGS و Podocyte FPE می‌شوند که نشان می‌دهد p.Arg701* Myo9A یک جهش ایجادکننده FSGS است. موش های بالغ به طور قابل‌توجهی، تغییرات بافت‌شناسی و فراساختاری کلیه‌های جهش یافته Myo9AR701X/þ ویژگی‌های تشخیصی بیوپسی کلیه پروباند را خلاصه می‌کند. علاوه بر این، موش‌های جهش یافته Myo9AR701X/þ به آلبومینوری قابل‌توجهی نسبت به آلبومینوری عظیم مبتلا می‌شوند، که پروتئینوری غیر نفروتیک مشاهده شده در خواهر و برادر پروباند و در بسیاری از بیماران مبتلا به FSGS با شروع بزرگسالان را بازتولید می‌کند. .15 میوزین های غیر متعارف در جذب مجدد آلبومین توسط توبول های پروگزیمال از طریق تعامل آنها با Dab2 و cubilin نقش دارند، اما دخالت Myo9A در این فرآیند نشان داده نشده است. یا توزیع غیر طبیعی نشانگرهای لوله پروگزیمال یا دیستال در موشهای بالغ هتروزیگوت Myo9AR701X/þ. این داده‌ها این فرضیه را تایید نمی‌کنند که FSGS مشاهده شده در موش‌های Myo9AR701X/þ ناشی از انسداد یا نقص لوله‌ای است.

از نظر مکانیکی، ما تعیین کردیم که mRNA Myo9A و پروتئین تمام قد Myo9A به میزان w50 درصد کاهش می‌یابد، که قویاً نشان می‌دهد که جهش منجر به نارسایی Myo9A به دلیل واپاشی mRNA با واسطه بی‌معنی می‌شود. مقررات از قوانین استاندارد پوسیدگی mRNA با واسطه بی معنی برای برش جهش های واقع در بالادست قبل از آخرین اگزون پیروی می کند. کاهش 50 درصدی بیان پروتئین Myo9A در کلیه‌های جهش یافته Myo9AR701X/þ و پودوسیت‌های اولیه و همچنین در پودوسیت‌های جاودانه‌شده Myo9AKD به طور متناسب برهم‌کنش بین Myo9A، اکتین و کالمودولین را کاهش می‌دهد. این یافته‌ها این تفسیر را تایید می‌کنند که هاپلو ناکافی Myo9A مبنای کاهش تعامل Myo9A-اکتین-کالمودولین است که در جهش‌یافته Myo9AR701X/þ مشاهده شده است.

یک یافته مهم این کار این است که p.Arg701* Myo9A باعث از دست دادن عملکرد Rho-GAP می‌شود که منجر به افزایش RhoA فعال در کلیه‌های کامل Myo9AR701X، گلومرول‌های جدا شده و پودوسیت‌های اولیه می‌شود. علاوه بر این، پودوسیت‌های جهش یافته Myo9AR701X/þ نشان‌دهنده کاهش چسبندگی و تحرک وابسته به RhoA هستند. سیگنال دهی Myo9A-GAP RhoA فعال را کاهش می دهد و تأثیر کمی بر Rac1 و Cdc42.9،53 Rho-GAP کاهش عملکرد را افزایش می دهد.فعالیت Rho-GTPaseو منجر به آسیب پودوسیت، پروتئینوری و FSGS می شود. بنابراین، رفتار غیر طبیعی پودوسیت های جهش یافته Myo9AR701X/þ ممکن است در طول زمان در ایجاد FPE و FSGS در موش های Myo9AR701X/þ کمک کند. داده های ما با اثر گزارش شده اختلال در تنظیم RhoA بر عملکرد سلول های بدن در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی سازگار است. 54-56

از آنجایی که Myo9A با اکتین و کالمودولین در فواصل زمانی منظم 36- نانومتری تشکیل بسته‌های اکتین را ایجاد می‌کند، استوکیومتری برهمکنش آنها بسیار مهم است. بنابراین، نارسایی Myo9A محتمل است. برای کاهش پیوندها و بسته‌های متقابل اکتین با واسطه Myo9A، ایجاد مکان‌های کمتری در امتداد رشته‌های اکتین که در آن غیرفعال‌سازی RhoA رخ می‌دهد، در نتیجه پویایی اکتین در مجاورت و رفتار پودوسیت در سطح سلولی را تغییر می‌دهد. مهارکننده کیناز مرتبط با Rho تا حدی نقص اتصال و مهاجرت ناشی از Myo9AR701X/þ را ترمیم کرد، و نشان می‌دهد که افکتورهای RhoA پایین‌دست اضافی، مانند mDia1، درگیر هستند. از طرف دیگر، کاهش پیوندهای متقابل اکتین در Myo9AR701X/þ ممکن است مستقیماً در ایجاد اختلال در اتصال و مهاجرت پودوسیت نقش داشته باشد. ناکافی بودن Myo9A ممکن است بر مکانیسم‌های قاچاق نیز تأثیر بگذارد. مکانیسم‌های مولکولی دقیقی که به موجب آن Myo9A دینامیک اکتین پودوسیت را تنظیم می‌کند، هنوز مشخص نیست. به طور خلاصه، ما Myo9A را به عنوان یک جزء جدید از دستگاه اسکلت سلولی پادوسیت و یک جهش مزخرف MYO9A شناسایی کردیم که MYO9A را به عنوان یک ژن کاندید برای FSGS انسانی، با بازتولید فنوتیپ پروتئینوری/FSGS انسانی در Myo9AR7nock by mio9AR701X و autosomel. هم تفکیک غالب فنوتیپ در یک خویشاوند کوچک. در مجموع، داده‌ها قویاً نشان می‌دهند که ناکافی بودن Myo9A مبنای مولکولی برای فنوتیپ مشاهده‌شده در موش‌های بالغ Myo9AR701X/þ است. ما نشان دادیم که دلبستگی و مهاجرت در پودوسیت‌های جهش‌یافته knockin Myo9AR701X/þ مختل می‌شود که شامل افزایش فعالیت RhoA و کاهش تعامل Myo9A-اکتین-کالمودولین می‌شود. با توجه به اینکه Myo9A باعث ایجاد پیوند متقابل و بسته‌بندی اکتین در نسبت مولی 1:1 می‌شود و مشاهدات ما مبنی بر اینکه Myo9AR701X/þ منجر به نارسایی هاپلو، حذف سلول‌های سلولی و اضافه کاری FSGS می‌شود، ما حدس می‌زنیم که Myo9A ممکن است برای سایر آکین پودوسیت‌های پودوسیت طبیعی حیاتی باشد. پروتئین های متصل شونده به اکتین (ACTN4، INF2) که در صورت جهش، باعث ایجاد FSGS اتوزومی غالب در بزرگسالان می شوند. مطالعات بیشتری برای روشن شدن نحوه تعامل Myo9A با پودوسیت RhoA، پروتئین‌های اسکلت سلولی و شکاف دیافراگم و اینکه آیا نقص‌های ناشی از Myo9A در ایجاد پیوند متقاطع و تشکیل بسته‌های اکتین مستقیماً ساختار اسکلت سلولی podocyte را تغییر می‌دهد، ضروری است. محدودیت‌های این مطالعه برای ایجاد علیت شامل ناتوانی در گسترش شجره ژنوتیپ proband و عدم وجود خویشاوندان اضافی با جهش مشابه است. مطالعات بیشتر برای تایید یافته های WES ما در بیماران اضافی با FSGS خانوادگی یا پراکنده قبل از p.Arg701* ضروری است.نوع MYO9Aمی تواند عامل بیماری در نظر گرفته شود و از این اطلاعات می توان برای تصمیم گیری بالینی استفاده کرد.

افشای

همه نویسندگان هیچ علاقه رقیبی را اعلام نکردند.

قدردانی

این کار توسط کمک های مالی مؤسسه ملی بهداشت به AT (NIH-RO1DK109434) و مرکز ییل برای ژنومیکس مندلی (NIH-U{4}}HG006504) پشتیبانی شد.

ما از M. Saleem (دانشگاه بریستول، انگلستان) برای ارائه سلول های پودوسیت انسانی جاودانه، G. Moeckel (دانشکده پزشکی ییل، گروه آسیب شناسی) برای ارائه تصاویر بیوپسی، آزمایشگاه S. Ishibe (دانشکده پزشکی ییل، گروه پزشکی/) تشکر می کنیم. نفرولوژی) برای مشاوره در مورد جداسازی پودوسیت و سنجش چسبندگی، T. Ardito (دانشکده پزشکی ییل، گروه آسیب شناسی) و V. Kakade (دانشکده پزشکی ییل، گروه پزشکی/نفرولوژی) برای مشارکت در IF

و تصویربرداری کانفوکال، SueAnn Mentone (دانشکده پزشکی ییل، گروه فیزیولوژی سلولی و مولکولی) برای کمک به مطالعات EM،گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونیبیماران و خانواده ها، و موسسه ملی دیابت و بیماری های گوارشی و کلیوی (FSGS-CT، NCT00135811) برای ارائه نمونه های DNA.

مواد تکمیلی

فایل تکمیلی (PDF)

روشهای تکمیلی تجزیه و تحلیل داده‌های WES و بیوانفورماتیک، تولید موش‌های knockin Myo9AR701X و سایر روش‌های دقیق.

شکل S1. Immuno-EM بیان Myo9A را در پودوسیت‌های گلومرولی موش و اپیتلیوم لوله‌ای موضعی می‌کند.

شکل S2. Myo9AR701X/R701X باعث هیدروسفالی پیشرونده نوزاد می شود.

شکل S3. بافت شناسی کلیه پس از تولد در موش های جهش یافته Myo9AR701X

شکل S4. سنجش مهاجرت پودوسیت (آزمایش زخم).

جدول S1. فهرست همه انواع به اشتراک گذاشته شده توسط خواهر و برادر proband.

جدول S2. فهرست 64 ژن FSGS-proteinuria-NS که در گروه FSGS-CT مورد بررسی قرار گرفته است. مراجع تکمیلی

منابع

1. Wiggins RC. طیف پودوسیتوپاتی ها: دیدگاهی متحد کننده از بیماری های گلومرولی کلیه های داخلی 2007؛ 71: 1205-1214.

2. Sadowski CE, Lovric S, Ashraf S, et al. علت تک ژنی در 29.5 درصد موارد سندرم نفروتیک مقاوم به استروئید است. جی ام سوک نفرول. 2015؛ 26: 1279-1289.

3. Gee HY, Saisawat P, Ashraf S, et al. جهش های ARHGDIA از طریق سیگنال دهی ناقص RHO GTPase باعث ایجاد سندرم نفروتیک می شوند. جی کلین سرمایه گذاری. 2013؛ 123: 3243-3253.

4. Gorman SW, Haider NB, Grieshammer U, et al. شبیه سازی و بیان تکاملی میوزین غیر متعارف IXA (MYO9A) یک ژن در ناحیه سندرم باردت-بیدل (BBS4) در کروموزوم 15q22- q23. ژنومیک. 1999؛ 59: 150-160.

5. Bayram Y، Karaca E، Coban Akdemir Z، و همکاران. اتیولوژی مولکولی آرتروگریپوز در چندین خانواده با منشاء عمدتا ترکی جی کلین سرمایه گذاری. 2016؛ 126:762-778.

6. O'Connor E, Töpf A, Müller JS, et al. شناسایی جهش در ژن MYO9A در بیماران مبتلا به سندرم میاستنی مادرزادی. مغز. 2016؛ 139:2143-2153.

7. Masters TA, Kendrick-Jones J, Buss F. Myosins: سازماندهی دامنه، خواص حرکتی، نقش های فیزیولوژیکی، و عملکردهای سلولی. Handb Exp Pharmacol. 2017؛ 235:77-122.

8. لیو کی سی، چنی RE. میوزین ها در اتصالات سلولی معماری زیستی 2012؛ 2:158-170.

9. Omelchenko T، Hall A. Myosin-IXA با هدف قرار دادن فعالیت RhoGAP به اتصالات سلولی، مهاجرت سلول های اپیتلیال جمعی را تنظیم می کند. Curr Biol. 2012؛ 22:278-288.

10. Sekine T, Konno M, Sasaki S, et al. بیماران مبتلا به سندرم اپشتین-فکتنر به دلیل جهش های MYH9 R702 دچار بیماری کلیوی پروتئینوری پیشرونده می شوند. کلیه های داخلی 2010؛ 78:207-214.

11. Mele C، Iatropoulos P، Donatelli R، و همکاران. جهش های MYO1E و گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی خانوادگی دوران کودکی N Engl J Med. 2011؛ ​​365:295-306.

12. کرندل ام، کیم اس وی، ویلینگر تی، و همکاران. اختلال در میوزین 1e باعث آسیب پودوسیت می شود. جی ام سوک نفرول. 2009؛ 20: 86–94.

13. Bähler M, Elfrink K, Hanley PJ, et al. عملکردهای سلولی میوزین های کلاس IX در اپیتلیوم و سلول های ایمنی. Biochem Soc Trans. 2011؛ ​​39:1166-1168.

14. Abouhamed M, Grobe K, San IV, et al. میوزین IXa تمایز اپیتلیال را تنظیم می کند و کمبود آن منجر به هیدروسفالی می شود. مول بیول سلول. 2009؛ 20:5074-5085.

15. Thelen S, AbouhamedM, Ciarmboli G, et al. RhoGAPmyosin IXa تنظیم کننده عملکرد توبول کلیه است. Am J Physiol Renal Physiol. 2015؛ 309: F501–F513.

16. Saczko-Brack D, Warchol E, Rogez B, et al. خود سازماندهی شبکه های اکتین توسط یک میوزین مونومر. Proc Natl Acad Med US A. 2016؛ 113: E8387–E8395.

17. Asanuma K، Yanagida-Asanuma E، Faul C، و همکاران. Synaptopodin سازماندهی اکتین و تحرک سلولی را از طریق تنظیم سیگنال دهی RhoA هماهنگ می کند. Nat Cell Biol. 2006؛ 8:485-491.

18. Mouawad F، Tsui H، Takano T. نقش Rho-GTPases و پروتئین های تنظیم کننده آنها در عملکرد پودوسیت گلومرولی. Can J Physiol Pharmacol. 2013؛ 91:773-782.

19. Brown EJ, Schlöndorff JS, Becker DJ, et al. جهش در ژن فرمین INF2 باعث گلومرولواسکلروزیس سگمنتال کانونی می شود. نات ژنت. 2010؛ 42:72-76.

20. آکیله س، سلیمان ح، یو اچ، و همکاران. Arhgap24 Rac1 را در پودوسیت‌های موش غیرفعال می‌کند و یک فرم جهش یافته با گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی خانوادگی همراه است. جی کلین سرمایه گذاری. 2011؛ ​​121: 4127-4137.

21. Choi M، Scholl I، Ji W، و همکاران. تشخیص ژنتیکی با گرفتن کل اگزوم و توالی یابی DNA موازی. Proc Natl Acad Sci US A. 2009؛ 106:19096-19101.

22. Choi M، Scholl UI، Yue P، و همکاران. جهش های کانال Kþ در آدنوم های تولید کننده آلدوسترون آدرنال و فشار خون ارثی. علوم پایه. 2011؛ ​​331: 768-772.

23. بامشاد ام جی، شندور ج.ا، واله دی، و همکاران. مراکز ژنومیک مندل: یک ابتکار در مقیاس بزرگ جدید برای شناسایی ژن‌های زمینه‌ساز شرایط نادر مندلی. Am J Med Gen. 2012؛ 158A: 1523-1525.

24. Li H, Durbin R. تراز خواندن کوتاه سریع و دقیق با تبدیل Burrows-Wheeler. بیوانفورماتیک. 2009؛ 25:1754-1760.

25. McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. جعبه ابزار تجزیه و تحلیل ژنوم: چارچوب MapReduce برای تجزیه و تحلیل داده های توالی یابی DNA نسل بعدی. ژنوم Res. 2010؛ 20: 1297-1303.

26. Yang H، Wang K. حاشیه نویسی و اولویت بندی انواع ژنومی با ANNOVAR و wANNOVAR. پروتوک Nat. 2015؛ 10: 1556-1566.

27. دونگ سی، وی پی، جیان ایکس، و همکاران. مقایسه ادغام روش‌های پیش‌بینی آسیب‌پذیری برای SNV‌های غیرمترادف در مطالعات توالی‌یابی کل اگزوم. هوم مول ژنت. 2015؛ 24:2125-2137.

28. Sim NL، Kumar P، Hu J، و همکاران. وب سرور SIFT: پیش بینی اثرات جایگزینی اسید آمینه بر روی پروتئین ها Nucleic Acids Res. 2012؛ 40: W452–W457.

29. Rentzsch P, Witten D, Cooper GM, et al. CADD: پیش بینی مضر بودن انواع در سراسر ژنوم انسان. Nucleic Acids Res. 2019؛ 47: D886–D894.

30. Yang H، Wang H، Jaenisch R. تولید موش های اصلاح شده ژنتیکی با استفاده از مهندسی ژنوم با واسطه CRISPR/Cas. پروتوک Nat. 2014؛ 9: 1956-1968.

31. Veron D, Bertuccio CA, Marlier A, et al. بیان بیش از حد فاکتور رشد اندوتلیال عروقی Podocyte (Vegf164) باعث گلومرولواسکلروز ندولر شدید در مدل موش دیابت نوع 1 می شود. دیابت شناسی 2011؛ ​​54: 1227-1241.

32. Veron D, Reidy K, Marlier A, et al. القای بیان بیش از حد پودوسیت VEGF164 در مراحل مختلف رشد باعث نفروز مادرزادی یا سندرم نفروتیک مقاوم به استروئید می شود. جی پاتول هستم. 2010؛ 177:2225-2233.

33. Zou Z، Chung B، Nguyen T، و همکاران. پیوند اندوسیتوز با واسطه گیرنده و سیگنال دهی سلولی: شواهدی برای پروتئولیز درون غشایی تنظیم شده مگالین در توبول پروگزیمال. جی بیول شیمی. 2004؛ 279:34302-34310.

34. Bertuccio C, Veron D, Aggarwal PK, et al. تعامل مستقیم گیرنده 2 فاکتور رشد اندوتلیال عروقی با نفرین سیگنال های VEGF-A را به اکتین در پادوسیت های کلیه پیوند می دهد. جی بیول شیمی. 2011؛ ​​286:39933-39944.

35. Veron D، Aggarwal PK، Velazquez H، و همکاران. افزایش عملکرد VEGF اختصاصی پودوسیت باعث ایجاد گلومرولواسکلروز ندولر در موشهای پود eNOS می شود. جی ام سوک نفرول. 2014؛ 25:1814-1824.

36. Reidy KJ, Aggarwal PK, Jimenez JJ, et al. سمافورین{1}}A بیش از حد پودوسیت منجر به بیماری گلومرولی می‌شود که برهم‌کنش پلکسینA{2}}نفرین را شامل می‌شود. جی پاتول هستم. 2013؛ 183: 1156-1168.

37. تیان ایکس، کیم جی جی، مانکلی اس ام، و همکاران. Talin1 مرتبط با پودوسیت برای حفظ سد فیلتراسیون گلومرولی حیاتی است. جی کلین سرمایه گذاری. 2014؛ 124: 1098-1113.

38. Ni L, Saleem M, Mathieson PW. کشت پودوسیت: ترفندهای تجارت. نفرولوژی (کارلتون). 2012؛ 17:525-531.

39. Ren XD، Kiosses WB، Schwartz MA. تنظیم پروتئین Rho کوچک متصل به GTP توسط چسبندگی سلولی و اسکلت سلولی. EMBO J. 1999؛ 18:578-585.

40. Duvall L، Rashmi P، Lopez-Rivera E، و همکاران. تخریب پروتئازومی Nck1 اما نه Nck2 فعال سازی RhoA و دینامیک اکتین را تنظیم می کند. Nat Commun. 2013؛ 4:2863.

41. Kopp JB, Winkler CA, Zhao X, et al. ویژگی های بالینی و بافت شناسی نفروپاتی مرتبط با آپولیپوپروتئین l1- در کارآزمایی بالینی FSGS. جی ام سوک نفرول. 2015؛ 26:1443-1448.

42. کوروساکی تی، ماکوات LE. تجزیه mRNA با واسطه بی معنی در انسان در یک نگاه. J Cell Sci. 2016؛ 129:461-467.

43. MacArthur DG, Manolio TA, Dimmock DP, et al. دستورالعمل هایی برای بررسی علیت انواع توالی در بیماری های انسانی. طبیعت. 2014؛ 508:469-476.

44. ریچاردز اس، عزیز ان، بیل اس، و همکاران. استانداردها و دستورالعمل‌ها برای تفسیر انواع توالی: توصیه مشترک مشترک کالج ژنتیک پزشکی و ژنومیک پزشکی و انجمن آسیب‌شناسی مولکولی. ژنت مد. 2015؛ 17:405-424.

45. Wang M، Chun J، Genovese G، و همکاران. مشارکت انواع ژن های نادر در FSGS خانوادگی و پراکنده. جی ام سوک نفرول. 2019؛ 30:1625-1640.

46. ​​Karczewski KJ، Francioli LC، Tiao G، و همکاران. طیف محدودیت جهشی از تغییرات در 141456 انسان اندازه گیری شد. طبیعت. 2020؛ 581:434-443.

47. Maddirevula S, Alzahrani F, Al-Owain M, et al. تایید اتوزیگوم و توان عملیاتی بالا کاندیداتوری ژن های بیماری. ژنت مد. 2019؛ 21:736-742.

48. O'Connor E, Phan V, Cordts I, et al. کمبود MYO9A در نورون های حرکتی با کاهش ترشح آگرین عصبی عضلانی همراه است. هوم مول ژنت. 2018؛ 27:1434-1446.

49. Sárközy M، Zvara A، Gyémánt N، و همکاران. سندرم متابولیک بر الگوی بیان ژن قلبی در سطح رونوشت در موش‌های صحرایی نر ZDF تأثیر می‌گذارد. دیابت قلبی عروقی. 2013؛ 12:16.

50. لپوری ن، زند ل، ستی س، و همکاران. فنوتیپ بالینی و پاتولوژیک علل ژنتیکی گلومرولواسکلروز فوکال سگمنتال در بزرگسالان. Clin Kidney J. 2018؛ 11:179-190.

51. Eshbach ML، Weisz OA. اندوسیتوز با واسطه گیرنده در لوله پروگزیمال. Annu Rev Physiol. 2017؛ 79:425-448.

52. Bouligand J, Delmer B, Heart AC, et al. ناکافی بودن هاپلون گیرنده گلوکوکورتیکوئیدی خانوادگی به دلیل پوسیدگی mRNA با واسطه غیرمعنا، هیپرپلازی آدرنال و مازاد معدنی کورتیکوئید آشکار. PLoS One. 2010؛ 5. e13563.

53. Yi F، Kong R، Ren J، و همکاران. Myo9b-RhoGAP غیرکانونیکال هیدرولیز RhoA GTP را با مکانیزم دو انگشتی آرژنین تسریع می کند. جی مول بیول. 2016؛ 428: 3043-3057.

54. Tian D, Jacobo SM, Billing D, et al. تنظیم آنتاگونیستی دینامیک اکتین و تحرک سلولی توسط کانال های TRPC5 و TRPC6. سیگنال علمی 2010؛ 26:3. ra77.

55. وانگ ال، الیس ام جی، گومز جی، و همکاران. مکانیسم های پروتئینوری ناشی از Rho GTPases. کلیه های داخلی 2012؛ 81:1075-1085.

56. Kistler AD، Altintas MM، Reiser J. Podocyte GTPases دینامیک فیلتر کلیه را تنظیم می کند. کلیه های داخلی 2012؛ 81:1053-1055.

57. کوری جی. سنجش زخم خراش. روش‌ها Mol Biol. 2011؛ ​​769:25-30.

کلیه بین المللی (2021) 99، 1102-1117; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.12.022

حق نشر ª 2021، انجمن بین المللی نفرولوژی. منتشر شده توسط Elsevier Inc. این مقاله با دسترسی آزاد تحت مجوز CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/) است.

مکاتبات: آلدا توفرو، گروه اطفال/نفرولوژی، دانشکده پزشکی دانشگاه ییل، خیابان سدار، 333، نیوهیون، کانکتیکات 06520، ایالات متحده آمریکا. ایمیل: alda.tufro@yale.edu 6 وابستگی فعلی: نفرولوژی، بیمارستان ملی کودکان، واشنگتن، دی سی، ایالات متحده آمریکا. 7 وابستگی فعلی: نفرولوژی، بیمارستان کودکان بیمار، دانشگاه تورنتو، تورنتو، انتاریو، کانادا. دریافت شده در 21 مه 2020؛ بازبینی شده در 4 دسامبر 2020؛ پذیرش در 10 دسامبر 2020؛ به صورت آنلاین در 4 ژانویه 2021 منتشر شد