یک پروتکل پاکسازی و تورم سریع و ساده برای تصویربرداری سه بعدی در محل از کلیه در مقیاس

edmund.chen@wecistanche.com

در سال‌های اخیر، پروتکل‌های میکروسکوپی نوری زیادی برای تجسم ساختارهای نانومقیاس منتشر شده است.کلیه.این پروتکل‌ها ابزارهای جدیدی را برای ارزیابی آناتومی و افاسمان فرآیند پا و همچنین توزیع پروتئین در فرآیندهای پا، شکاف دیافراگم و در غشای پایه گلومرولی به محققان ارائه می‌دهند. با این حال، این پروتکل ها یا شامل استفاده از میکروسکوپ های مختلف با وضوح فوق العاده پیچیده یا پروتکل های طولانی آماده سازی نمونه هستند. در اینجا، ما یک روش سریع و ساده و پنج ساعته برای تجسم سه بعدی ارائه می دهیمکلیهمورفولوژی در تمام مقیاس های طولی این پروتکل مفاهیم پاکسازی نوری و انبساط بافت را برای ایجاد تورم خفیف ترکیب می کند که برای حل ساختارهای نانومقیاس با استفاده از یک میکروسکوپ کانفوکال معمولی کافی است. ما نشان می‌دهیم که این پروتکل می‌تواند برای تجسم طیف گسترده‌ای از ویژگی‌های پاتولوژیک هم در موش و هم در انسان اعمال شودکلیه ها. بنابراین، پروتکل سریع و ساده ما می تواند برای ارزیابی میکروسکوپی مرسوم مفید باشدکلیهیکپارچگی بافت هم در تحقیقات و هم احتمالاً در روال بالینی آینده.

CISTANCHE عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

پروتکل های نوری متعددی برای تصویربرداری از ساختارهای نانومقیاس درکلیهدر سال‌های اخیر ارائه شده‌اند. I- قدرت این تکنیک‌های جدید به عنوان ابزاری برای تعیین کمیت آناتومی و آسیب‌شناسی سد فیلتراسیون در نشریات اخیر گروه ما و دیگران نشان داده شده است. میکروسکوپ پراش نامحدود پیشرفته یا شامل معرفی شیمی پلیمری پیچیده به نمونه برای کاهش و/یا گسترش فیزیکی آن است. بسیاری از پروتکل ها نیز زمان بر هستند و به مقدار قابل توجهی کار عملی نیاز دارند. این لایه پیچیدگی اضافی ممکن است چیزی باشد که این روش‌های جدید را هم توسط محققان و هم آسیب‌شناسان بالینی به‌طور معمول مورد استفاده قرار ندهند. علاوه بر این، بسیاری از پروتکل‌ها به تصویربرداری عمیق 3-بعدی (3 بعدی) از فرآیندهای پا (FPs) فراتر از عمق 5-15 م.-1، 7،8 دسترسی ندارند. بنابراین، هدف ما این بود که یک پروتکل تمام نوری بسیار ساده و سریع ایجاد کنید که پاکسازی و متورم شدن فضاییکلیهنمونه‌های بافت به اندازه‌ای هستند که امکان تجزیه و تحلیل سه بعدی با وضوح بالا در محل را فراهم کنندکلیهآناتومی و آسیب شناسی با استفاده از یک میکروسکوپ معمولی محدود با پراش که تقریباً در تمام موسسات علوم زیستی و آسیب شناسی موجود است.ساده‌سازی‌های پروتکل قبلی نشان داده‌اند که معرفی پلیمرهای آکریل آمید به نمونه‌های تثبیت‌شده با پارافورمالدئید را می‌توان به طور کامل حذف کرد و در عین حال یکپارچگی بافت را در پاکسازی سدیم دودسیل سولفات (SDS) حفظ کرد. مطالعه دیگری نشان داده است که نمونه‌های بافت را می‌توان با استفاده از یک پروتکل ساده بدون پلیمر بر اساس غوطه‌وری در محلول‌های آبی مختلف، بیش از ضریب 2 منبسط کرد. محیط جاسازی نمونه برای ایجاد تورم خفیف (1.3-خطی برابر)کلیهنمونه های بافت همچنین با بهینه‌سازی پارامترهای تصویربرداری، با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال مرسوم، به وضوح مؤثر بالایی برای تجسم سه‌بعدی FPs podocyte و غشای پایه گلومرولی (GBM) دست یافتیم.

کلید واژه ها:گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی؛ نفروپاتی IgA؛ پودوسیت؛ بیوپسی کلیه؛ آسیب شناسی کلیه؛ کلیه

نتایج

پاکسازی نوری و تورم خفیف بافت کلیهپروتکل ساده dearing/swelling به صورت شماتیک در شکل la نشان داده شده است. توجه داشته باشید که مرحله حذف چربی SDS اساساً برای شفافیت نوری اضافه نشده است، بلکه برای اطمینان از تورم کافی نمونه ها اضافه شده است. ما نشان می‌دهیم که کاهش سریع چربی در دمای 70 درجه به مدت 1 ساعت، بدون اینکه تخریب نمونه در دماهای بالاتر اتفاق بیفتد، نتایج خوبی ایجاد کرد (شکل تکمیلی S1B). همانطور که توسط موراکامی و همکاران گزارش شده است، مولکول های اوره و شبه اوره می توانند به طور موثر نمونه های بافتی را متورم کنند و در نتیجه قدرت تفکیک مکانی موثر را افزایش دهند. بنابراین ما 4 مولار اوره را در مخلوطی با 80 درصد (وزنی/وزنی) فروکتوز (به نام FRUIT) اضافه کردیم که منجر به ضریب تورم خطی -1.3 شد (شکل lb).

برای کوتاه‌تر کردن زمان برچسب‌گذاری، از آنتی‌بادی‌های اولیه کونژوگه با رنگ استفاده کردیم. در ابتدا، هنگام استفاده از آنتی‌بادی‌های نفرین کونژوگه با رنگ در یک بافر رنگ‌آمیزی استاندارد (سالین بافر فسفات با Tween 20)، کارایی سیگنال و برچسب‌گذاری به اندازه کافی بالا نبود که بتوان FP‌های فردی را مشخص کرد. با این حال، با استفاده از یک بافر رنگ‌آمیزی جایگزین، HEPES-TSC، کیفیت رنگ‌آمیزی به میزان رضایت‌بخشی افزایش یافت (شکل تکمیلی S1C). در مقایسه با پروتکل‌های منتشر شده قبلی با استفاده از میکروسکوپ معمولی، پروتکل ساده و سریع 5-ساعت ما در چندین پارامتر اساسی از آنها بهتر عمل کرد (شکل lc-f). پروتکل ارائه شده توسط پولمن و همکاران. به طور کلی کمی سریع‌تر است، اما دارای معایبی است که نیاز به میکروسکوپ روشنایی ساختاریافته با وضوح فوق‌العاده و استفاده از برودت‌های نازک دارد که دسترسی به اعماق تصویربرداری بزرگ را ممانعت می‌کند. شایان ذکر است، پروتکل ما نسبت به تعبیه پارافین استاندارد یا برودت کردن زمانی که تمام پارامترهای ارزیابی شده در نظر گرفته می شود، پیچیدگی کمتری دارد.

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

بهینه سازی و اعتبار سنجی پروتکل ما برای حل فرآیندهای پااز آنجایی که پروتکل ما فقط ضریب تورم متوسط ​​1.3 می دهد، پارامترهای تصویربرداری کانفوکال باید برای دستیابی به قدرت تفکیک کافی برای تصویربرداری از FP ها بهینه می شدند. موشکلیهنمونه ها طبق پروتکل تیمار شده و با استفاده از فلوروفورهای مختلف از نظر نفرین رنگ آمیزی شدند. وضوح یک میکروسکوپ کانفوکال هم به اندازه سوراخ و هم به طول موج نور تحریک/انتشار بستگی دارد. بنابراین، ما از قطر سوراخ کوچکتر 0 استفاده کردیم. 3 واحد هوا (AU) همراه با یک تابش سبز رنگ، Alexa Fluor 488، و از این طریق به وضوح کافی برای حل FP ها در ماوس نوع وحشی (WT) دست یافت.کلیه ها(شکل 2 الف). بنابراین، هر زمان که قرار است FP های موش تجسم شوند، از فلوروفورها با حداکثر طول موج تحریک 488 نانومتر استفاده می شود. تحت این شرایط تصویربرداری بهینه، ما توانستیم کل گلومرول های موش را به صورت سه بعدی با وضوح موثر -115 نانومتر تجسم کنیم، که به اندازه کافی برای حل تک تک FP ها خوب است (شکل 2b-e). علاوه بر این، ما نشان می دهیم که عمق نفوذ آنتی بادی حداقل 70 میکرومتر با برچسب زدن سریع (شکل تکمیلی S2A-C) به دست می آید. استفاده از یک هدف گلیسرول با یقه اصلاحی، دسترسی به عمق Z بزرگتر از هر یک از پروتکل های توسعه یافته قبلی را فراهم می کند، به استثنایپروتکل پاکسازی/تحریک کاهش انتشار از آنجایی که وضوح محوری یک میکروسکوپ کانفوکال تقریباً 3 برابر بدتر از وضوح جانبی است، مویرگ ها باید در صفحه xy جهت تفکیک بهینه FP ها قرار گیرند. ما نشان می‌دهیم که با پروتکل خود، می‌توانیم (حداکثر 25) ناحیه برای تصویربرداری در هر گلومرول پیدا کنیم (شکل تکمیلی S2D)، که به ما امکان می‌دهد تا مقادیر زیادی داده را جمع‌آوری کنیم تا تغییرات ظریف در ساختارهای مانع نفوذ را نیز تشخیص دهیم. این اهمیت دسترسی به بعد عمق را هنگام انجام تجزیه و تحلیل های کمی با توان بالا سلامت گلومرولی نشان می دهد. مهمتر از همه، ما همچنین پروتکل را برای حل و فصل FPها در مواد بیمار انسانی تایید کردیم (شکل 2f و g)، که در مقایسه با موشها به دلیل ابعاد بزرگتر FPهای انسانی چالش برانگیزتر است. علاوه بر این، با استفاده از آگلوتینین (WGA) لکتین جوانه گندم با میل ترکیبی به گلیکوکالیکس FPs، ما همچنین توانستیم FP ها را به صورت مقطعی در هر دو نمونه موش و انسان حل کنیم (شکل 2h و i). علاوه بر این، ما برای نفرین، با محلی سازی مورد انتظار در غشای شکاف، رنگ آمیزی کردیم، که نشان می دهد می توانیم علاوه بر اطلاعات مورفولوژیک، داده هایی را در مورد محلی سازی پروتئین نیز دریافت کنیم.

آسیب شناسی سد فیلتراسیون در نمونه های موشهمانطور که قبلاً گزارش شد، تصویربرداری FP از دیافراگم شکاف -، 5،6،9،10 به آسانی می تواند برای تجسم و تعیین کمیت از بین بردن FP استفاده شود. ما تأیید می‌کنیم که این رویکرد همچنین می‌تواند با پروتکل جدید ما با استفاده از یک مدل موش اخیراً منتشر شده برای گلومرولواسکلروزیس سگمنتال کانونی (FSGS) اعمال شود (شکل 3). با رنگ آمیزی نفرین، الگوی دیافراگم شکاف را می توان در 3 بعد در کل گلومرول موش های WT و جهش یافته مشاهده کرد (شکل 3a و b). همانطور که قبلاً گزارش شد، 5، طول دیافراگم شکاف در هر ناحیه را می توان به صورت نیمه خودکار تعیین کرد، و این تجزیه و تحلیل نتیجه ای مطابق با آنچه قبلاً برای این خط ماوس منتشر شده است ارائه می دهد (شکل 3c). علاوه بر این، مویرگ های گلومرولی در مقاطع عرضی تصویربرداری شدند که هم از بین رفتن FP ها و هم تغییرات در GBM را نشان می دهد (شکل 3d-f). برای جزئیات اندازه گیری GBM به روش های تکمیلی و شکل S3 مراجعه کنید.

آسیب شناسی سد فیلتراسیون در نمونه های انسانیبرای تأیید بیشتر پروتکل خود برای استفاده بالینی احتمالی، ما آن را در بافت انسانی بیمارانی که انواع مختلف آن تشخیص داده شده بودند، اعمال کردیم.بیماری کلیوی. دو بیمار مبتلا به سندرم نفروتیک مادرزادی، یا با یک جهش هموزیگوت در ژن NPHS1 (کدکننده نفرین)، یا جهش‌های ترانس مرتبط در ژن‌های TRPC6 و NPHS2 (کدکننده کانال TRPC6 و پودوسین). ما همچنین 2 بیمار مبتلا به FSGS و بیماری حداقل تغییر را تجزیه و تحلیل کردیم. ما می‌توانیم مشخصه‌های معمولی را تجسم و کمیت کنیمبیماری کلیویمانند FP effacement و همچنین تغییرات GBM (شکل 4). تصاویر را می توان هم در صورت (شکل 4a-e) و هم از طرف (شکل 4g-k) به دست آورد. علاوه بر این، ما عدم وجود نفرین مورد انتظار را در دیافراگم شکافی بیمار با جهش NPHS1 مشاهده کردیم (شکل 4b و h). همانطور که برای نمونه های موش وجود دارد.

(شکل 3)، داده های تصویربرداری را می توان به صورت کمی ارزیابی کرد (شکل 4f و l و شکل تکمیلی S4A و B).

نکته قابل توجه، ضخیم شدن خفیف غیرمنتظره GBM در بیماران تشخیص داده شده در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد. کنترل نفرکتومی شدهکلیهدر شکل 4 از یک بیمار مسن تر گرفته شده است، در حالی که بقیه نمونه ها از نوزادان یا کودکان بودند. از آنجایی که ضخامت GBM با افزایش سن افزایش می‌یابد (شکل تکمیلی S5A-E)، احتمالاً ضخیم‌تر شدن قابل‌توجه‌تری در مقایسه با بیماران همتای سنی مشاهده می‌شود. ما همچنین تأیید کردیم که هیچ آرتیفکت تورم وابسته به سن توسط پروتکل ما معرفی نشده است (شکل تکمیلی S5F-H)، و همچنین اینکه یک استراتژی اندازه‌گیری GBM متفاوت نتایج مشابهی را به همراه داشت (شکل تکمیلی S5I و D).

Large-scale pathology in mouse and human samplesزیرا نه تنها مقیاس سد فیلتراسیون، بلکه بافت شناسی نیز تغییر می کندکلیهمورفولوژی، هم برای محققان و هم برای پزشکان بسیار مورد توجه است، ما امکان استفاده از پروتکل خود را برای ارزیابی مورفولوژی در مقیاس بزرگ از طریق تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی مبتنی بر فلورسانس بررسی کردیم. ما نشان می‌دهیم که با استفاده از اهداف بزرگ‌نمایی کمتر، می‌توانیم آسیب‌شناسی در مقیاس بزرگ و تفاوت‌ها در بیان پروتئین را در نمونه‌های انسانی (شکل S6 تکمیلی) و نمونه‌های موش (تصویر تکمیلی S7) شناسایی کنیم.

مشاهده تغییرات پاتولوژیک در بیماران مبتلا به نفروپاتی FSGS و IgAبرای مثال بیشتر استفاده احتمالی از پروتکل در نمونه‌های بیمار، بررسی کردیم که آیا می‌توانیم ویژگی‌های پاتولوژیک FSGS از نوع سلولی را تشخیص دهیم. ما قادر به تجسم بیشتر ویژگی های پاتولوژیک ذکر شده در بیانیه پاتولوژیست بودیم، از جمله تنگی کانونی کل/بخشی، آتروفی توبولی، و سلولی بیش از حد اندوتلیال در مویرگ های گلومرولی در مقایسه با روش های استاندارد طلای فعلی (شکل 5a-j). مقایسه کیفی و کمی کنار هم با میکروسکوپ الکترونی (EM) نتایج مشابهی را با استفاده از هر دو روش نشان داد (شکل 5k و l و شکل تکمیلی S4؛ برای بحث در مورد اندازه‌گیری عرض FP به روش‌های تکمیلی مراجعه کنید).

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

ما همچنین این پروتکل را بر روی یک نمونه بیوپسی از یک بیمار مبتلا به نفروپاتی IgA (IgAN) اعمال کردیم (شکل 6) و توانستیم تجسم بسیاری از ویژگی های تشخیصی را تأیید کنیم. هیچ آسیب شناسی شدیدی در سد فیلتراسیون مشهود نبود (شکل 6a و b)، و یک تجزیه و تحلیل مقایسه ای منجر به تفاوت آشکاری بین EM و پروتکل ما نشد (شکل 6c و d). در مرحله بعد، بافت شناسی کلیه قرضی با هر دو بافت شناسی استاندارد (شکل 6e) و "هیستولوژی فلورسانس" (شکل 6f) ارزیابی شد. ما می‌توانیم تغییرات (یا عدم تغییرات) ذکر شده در بیانیه پاتولوژیست را تجسم کنیم، مانند ارتشاح بینابینی سلول‌ها (شکل 6g و h)، مویرگ‌های گلومرولی طبیعی (شکل 6i)، و گسترش/هیپرسلولی بودن مزانژیال (شکل 6j). رنگ آمیزی ایمنی با استفاده از آنتی بادی IgA به وضوح رسوبات را هم در مقیاس بزرگ (شکل 6k و l) و هم در جزئیات (شکل 6m) با الگویی معادل آنچه در ایمونوفلورسانس استاندارد مشاهده می شود نشان داد (شکل 6n و o). در نهایت، تصویربرداری FP افاسمان جزئی خفیف را نشان داد (شکل 6p و q). ویژگی‌های پاتولوژیکی که می‌توانیم با پروتکل خود تشخیص دهیم در جدول تکمیلی S1 خلاصه شده‌اند.

بحث

در اینجا ما یک پروتکل برای تجسم با توان بالا ارائه می کنیمکلیهساختارهایی در تمام مقیاس های طولی که سریعتر و ساده تر از پروتکل های منتشر شده قبلی برای تجزیه و تحلیل FP و تصویربرداری مانع فیلتراسیون گلومرولی درکلیهما نشان می‌دهیم که وضوحی که به دست می‌آوریم به اندازه‌ای بالا است که بتوان با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال ساده، یک ابزار استاندارد در اکثر امکانات تحقیقاتی و آزمایشگاه‌های آسیب‌شناسی، در مورد آسیب‌شناسی در سد فیلتراسیون نتیجه‌گیری کرد. قابلیت سه بعدی پروتکل هنگام انجام تصویربرداری از FP ها مهم است زیرا حجم تصویربرداری زیادی در دسترس است که امکان شناسایی و غربالگری مناطق مناسب نمونه را برای تجزیه و تحلیل کمی فراهم می کند.

یک یافته مهم مطالعه ما این است که پروتکل ما نه تنها مکمل و مفید در مقایسه با پروتکل‌های استانداردی است که در حال حاضر برای تجزیه و تحلیل استاندارد استفاده می‌شود.کلیهبافت. همچنین می‌تواند این جریان‌های کاری را در یک پروتکل ادغام کند، با صرفه‌جویی آشکار از نظر ساعات کاری و مواد/معرف‌ها/تجهیزات مورد نیاز. با این حال، از آنجایی که تجزیه و تحلیل تا حد زیادی بر اساس آنتی بادی ها انجام می شود، هزینه برچسب گذاری معرف ها به طور معقولی بالا است (حدود 20e در هر نمونه)، که برای سایر پروتکل های مبتنی بر فلورسانس ارائه شده در این مقاله (از جمله ایمونوفلورسانس معمولی) نیز صادق است.

در سریع‌ترین نسخه پروتکل، ما از آنتی‌بادی‌های اولیه کونژوگه‌شده با رنگ استفاده می‌کنیم که کیفیت رنگ‌آمیزی کافی برای حل کردن FP‌ها را به همراه دارد. با این حال، سیگنال حاصل در مقایسه با سیگنال حاصل از یک رویکرد اولیه/ثانویه مرحله ای همیشه کمتر است. علاوه بر این، آنتی بادی های کونژوگه اولیه مورد استفاده در این مطالعه به صورت تجاری در دسترس نیستند و باید در داخل کونژوگه شوند. بنابراین، برای برخی از برنامه‌ها، یک پروتکل رنگ‌آمیزی مرحله اولیه/ثانویه همچنان ترجیح داده می‌شود و 2 ساعت به پروتکل اضافه می‌کند. مطالعات اخیر میکروسکوپ Airyscan را روی آن اعمال کرده استکلیهبافت، که از تنظیمات سوراخ سوراخ متغیر روی یک آشکارساز آرایه دوربین کوچک در ترکیب با دکانولوشن و پردازش تصویر تغییر انتساب سیگنال استفاده می‌کند. در این مطالعه نشان می‌دهیم که با تورم خفیف و متعاقب آن شرایط رنگ‌آمیزی و تصویربرداری عالی، تصویربرداری کانفوکال معمولی با

سوراخ سوراخ بسته، وضوح کافی را بدون نیاز به پس پردازش ریاضی تصاویر فراهم می کند. در این کار، ما داده‌های مقایسه‌ای را برای پروتکل و روش‌های استاندارد خود برای ارزیابی آسیب‌شناسی در نمونه‌های بیمار ارائه می‌کنیم. با این حال، تجزیه و تحلیل بر روی تعداد کمی از بیماران انجام شد و مطالعات بیشتر برای بررسی اینکه آیا این پروتکل می‌تواند برای تشخیص انبوهی از پارامترهای پاتولوژیک موجود در انواع دیگر استفاده شود، حیاتی است.بیماری های کلیویهمچنین. برای دستیابی به این هدف، یک تلاش مشترک متمرکز شامل آسیب شناسان، کارشناسان آماده سازی نمونه و کارشناسان تصویربرداری باید آغاز شود. این اعتبار سنجی کامل در محدوده این مطالعه اثبات اصل نبود، که در آن هدف توسعه یک پروتکل نوری سریع و سریع برای تصویربرداری با وضوح بالا ازکلیههمچنین باید تاکید کرد که وضوح پروتکل ما با EM فاصله زیادی دارد و به عنوان مثال رسوبات فیبریلری را برطرف نمی کند و بنابراین برای برخی موارد، EM برای تشخیص دقیق همچنان مورد نیاز است.

در این مطالعه، ما از اندازه‌گیری طول خام بدون تصحیح برای برش مصنوعات ناشی از برش نوری یا فیزیکی غیرمتعامد ساختار اندازه‌گیری شده (GBM یا FP) استفاده کردیم. 2 دلیل اصلی برای نمایش داده ها در این فرم وجود دارد. اولاً، تصحیح قطعه‌بندی مصنوعات با حفظ اطلاعات مربوط به تغییرات نانومقیاس (مانند GBM نامنظم "برآمدگی") ساده نیست. دوم، در نمونه های شفاف خود، ما همیشه یک هواپیمای تصویربرداری را انتخاب می کردیم

که در آن ساختار مورد مطالعه تا حد امکان به صورت متعامد با صفحه تصویربرداری تراز شده است. بنابراین، برش تصادفی نیست، و تجزیه و تحلیل مصنوع برش را پیچیده تر می کند. در نتیجه، مقادیر میانگین ارائه شده در این مطالعه احتمالاً کمی بیش از حد برآورد شده است، و مصنوعات برش به گسترش داده ها در نمودارهای پراکنده کمک می کنند. برای اندازه‌گیری‌های تصحیح شده برش سازه‌ها در آینده بدون از دست دادن تغییرات واقعی داده‌ها، نسخه‌های اصلاح‌شده روش‌های تصحیح مصنوع برش موجود، مانند روش قطع متعامد، به طور بالقوه می‌تواند به کار رود.!920

توانایی استخراج پارامترهای پاتولوژیک از پاک شدهکلیهبافت با استفاده از نمونه‌های بدون برچسب (اتوفلورسانس) و برچسب‌دار فلورسنت اخیراً نشان داده شده است.-علاوه بر این، یک مطالعه اخیر نشان داده است که "بافت شناسی مجازی" را می توان با استفاده از یادگیری عمیق al-برای موارد در تصاویر اتوفلورسانس و تقسیم بندی مبتنی بر شبکه عصبی و طبقه بندی آسیب شناسی کلیه نیز نشان داده شده است. ادغام روش‌های جدید آماده‌سازی نمونه (مانند گزارش‌شده در اینجا) با ابزارهای جدید تجزیه و تحلیل تصویر، احتمالات دیجیتالی جالبی را در آینده ایجاد می‌کند، و احتمالاً شاهد تغییراتی در نحوه تصور و تجزیه و تحلیل نمونه‌های کلیه در تحقیقات و کلینیک خواهیم بود.

مواد و روش ها بافت کلیه موش و انسانتمام آزمایشات موش توسط اداره ایالتی آلمان نوردراین-وستفالن، دپارتمان طبیعت، محیط زیست و حمایت از مصرف کننده تایید شد و مطابق با دستورالعمل های اروپایی، ملی و سازمانی انجام شد. موش هایی با پس زمینه 100 درصد C57BL/6N استفاده شدند. پس از القای بیهوشی با کتامین و زایلازین، موش‌ها با پرفیوژن قلبی با محلول نمک متعادل هنک کشته شدند و طبق شرح زیر فیکس شدند.

مواد بیمار از 2 کودک مبتلا به سندرم‌های نفروتیک مقاوم به استروئید به دلیل جهش‌های نقطه‌ای در NPHSI یا جهش‌های نقطه‌ای ترکیبی-هتروزیگوت در TRPC6 و NPHS2، و همچنین 3 بیمار مبتلا به گلومرولواسکلروزیس سگمنتال کانونی، بیماری حداقل تغییر و نفروپاتی IgA به دست آمد. ، به ترتیب. بافت انسانی کنترل از بیمارانی که به دلیل نفرکتومی شده بودند جمع آوری شدکلیهتومورها نمونه های بافتی از قطب غیر توموری جدا شدکلیهدر معاینه بافت شناسی معمول، یک تصویر هیستولوژیک طبیعی نشان داد. همه رویه ها توسط کمیسیون اخلاق کلن و کمیته اخلاق منطقه ای استکهلم تأیید شد و مطابق با اعلامیه هلسینکی انجام شد. در صورت لزوم، بیمار یا سرپرست بیمار رضایت آگاهانه را ارائه کرد.

مدل ماوس برای FSGSموش هایی با 2 جهش نقطه ترکیبی-هتروزیگوت، Pod8asicyAzv همانطور که قبلا توضیح داده شد، تولید شدند."تثبیتانسان و موشکلیه هادر پارافورمالدئید 4 درصد در سالین 1× بافر فسفات در دمای اتاق به مدت {3}} ساعت تثبیت شدند. انسان نفرکتومی شدهکلیهبه مدت 3 ساعت در محلول Dubosaq-Brasil ثابت شد.بخش بندینمونه ها در آگارز 3 درصد جاسازی و با استفاده از ویبراتوم به ضخامت 300 میکرومتر برش داده شدند.چربی زدایینمونه ها در محلول شفاف (200 میلی مولار اسید بوریک و 4 درصد SDS، pH 8.5) در دمای 70 درجه سانتی گراد به مدت 1 ساعت با تکان دادن در ساعت 500 بعد از ظهر انکوبه شدند.برچسب زدنپروتکل برچسب زدن و فهرستی از آنتی بادی ها/کاوشگرها در مواد تکمیلی ارائه شده است.نصبنمونه ها در 80 درصد فروکتوز (1 میلی لیتر dH 0 اضافه شده به 4 گرم فروکتوز) حاوی 4 مولار اوره در دمای 37 درجه با تکان دادن با دور 500 به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند و سپس در ظرف MatTek (MatTek) قرار داده شدند. , Ashland, MA) با یک پوشش در بالا (برای جلوگیری از تبخیر) قبل از تصویربرداری،تصویربرداریتصاویر با استفاده از یک سیستم کانفوکال لایکا SP8 (اهداف بیان شده در افسانه های شکل) (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) به دست آمد. تصویربرداری با هدف 100× همیشه مستلزم تنظیم سوراخ سوزنی 03 AU (همانطور که برای نور 594-nm محاسبه می‌شود) در صورتی که خلاف آن ذکر نشده باشد. تصویربرداری استاندارد بافت شناسی با استفاده از سیستم Leica DM3000 (شکل 5) یا سیستم Olympus BX45 (Olympus، توکیو، ژاپن) (شکل 6) انجام شد. ایمونوفلورسانس استاندارد با استفاده از Nikon Microphot-FXA (Nikon، توکیو، ژاپن) و EM با میکروسکوپ الکترونی عبوری Zeiss 912 (شکل 5) یا Hitachi 7700 (Hitachi، توکیو، ژاپن) (شکل 6) انجام شد.پردازش و تحلیل تصویرمگر اینکه خلاف این گفته شود، تصاویر با جایگزینی هر پیکسل با میانگین همسایگی 3×3 با استفاده از Fiji/ImageJ (موسسه ملی بهداشت، Bethesda، MD) صاف می‌شوند. آنالیزهای مورفومتریک در روشهای تکمیلی توضیح داده شده و در شکل تکمیلی S4 نشان داده شده است.