یک استراتژی جدید برای غربالگری اجزای فعال در Cistanche Tubulosa بر اساس تجزیه و تحلیل رابطه طیف-اثر و فارماکولوژی شبکه Ⅱ

3. نتایج و بحث

3.1. اثر انگشت HPLC

3.1.1. اعتبار سنجی روش

اعتبارسنجی روش HPLC نشان داد که انحراف استاندارد نسبی (RSD) برای دقت روش، تکرارپذیری و پایداری کمتر از 2.85 درصد برای منطقه اوج نسبی (n = 11) و 0.77 درصد بود. برای زمان نگهداری نسبی (n = 11). دقت همان محلول نمونه در محدوده 0 ظاهر شد. 2.70 درصد برای مساحت نسبی قله های مشترک. تکرارپذیری آزمایش در محدوده 0 بود.03-0.20 درصد برای زمان نسبی و 0.23-2.59 درصد برای منطقه نسبی قله های مشترک. پایداری نمونه 0.09-0.24 درصد برای زمان ماند نسبی و 0.75-2.85 درصد برای منطقه نسبی قله های مشترک بود. این نتایج نشان داد که اثر انگشت ایجاد شده رضایت بخش است. روابط خطی برای ژنیپوزیدیک اسید،اکیناکوزید, اکتئوزید, توبولوزید A، وایزواکتئوزیددر جدول S4 نشان داده شده است. مقدار مربع R 1 بود.{2}} که نشان دهنده خطی بودن خوب است. نتایج بازیابی نمونه نشان داد که میانگین بازیافت های ژنیپوزیدیک اسید، اکیناکوزید،اکتئوزید, توبولوزید A، وایزواکتئوزید100.37 درصد، 103.59 درصد، 98.46 درصد، 100.81 درصد و 101.19 درصد بود و RSD برای بازیابی نمونه کمتر از 2.68 درصد بود.

برای دریافت جزئیات بیشتر در مورد Cistanche Active Components اینجا را کلیک کنید

3.1.2. منطقه اوج (PA) و زمان ماند نسبی (RRT)

اثر انگشت مرجع و اثر انگشت HMs، WEs، و HR از 11 دسته از C. tubulosa در شکل 2 ارائه شده است. یازده پیک، که جدایی و وضوح خوبی از خود نشان دادند، به عنوان پیک های رایج در بین HMs، WEs و HRs شناسایی شدند. پنج ترکیب استاندارد به عنوان اسید ژنیپوزیدیک (A2) شناسایی شدند.اکیناکوزید(A8),اکتئوزید (A9), توبولوزیدA (A10) وایزواکتئوزید(A11). ترکیب استاندارد،اکیناکوزیدکه در همه کروماتوگرام ها (متوسط ​​زمان ماند 12.86 دقیقه) با سطح پیک مناسب و پایداری خوب وجود داشت، به عنوان پیک مرجع انتخاب شد و برای محاسبه زمان ماند نسبی (RRTs) ده مورد دیگر استفاده شد. قله های مشترک RRT های این اشکال مختلف در محدوده 16.16-1.51 0 هستند. PA و ضریب واریانس (درصد CV) این پیک‌های رایج در جداول S5-S7 فهرست شده‌اند. از داده‌ها، مقادیر درصد CV برای PA در اشکال مختلف به ترتیب 25.78 درصد -142.02 درصد، 23.36 درصد -150.38 درصد و 28.91 درصد -112.78 درصد برای HMs، WEs و HRs است. این نتایج تفاوت های قابل توجهی را در غلظت هر یک نشان می دهدCistanche tubulosaترکیب در میان اشکال مختلف اثر انگشت HMs، WE و HR در شکل 3 نشان داده شده است.

شکل 2 اثر انگشت HPLC از نمونه های استاندارد

3.1.3. محتویات HMs، WEs، و HRs

پنج جزء استاندارد ازC. tubulosaاندازه گیری شدند. محتویات اجزای اصلی در جدول 1 نشان داده شده است. مقایسه بین HMs، WEs و HRs در جدول 2 و شکل 4 نشان داده شده است. PhGs در C. tubulosa از نظر بیولوژیکی فعال اما حساس به حرارت هستند. اجزای حساس به حرارت که در آب حل می شوند را می توان با استفاده از یک روش معقول به طور موثر استخراج کرد. به طور کلی، گیاه Cistanche با آب استخراج می شود و سپس برای تجزیه و تحلیل شیمیایی زیر به یک محلول غلیظ تبخیر می شود [26، 27، 30]. پس از استخراج و تغلیظ، از فناوری خشک کردن پاششی استفاده شد و این روش از مقاله قبلی اصلاح شد. آب به سرعت از بخار مایع خارج شد و سپس عصاره خشک مواد خام از گیاهان به دست آمد. در این مرحله، افزودن مالتودکسترین یک حامل رایج برای افزایش پراکندگی و افزایش زمان ذخیره سازی در نظر گرفته می شود. از طریق یک سری از فرآیندهای تولید، گیاهان گیاهی سپس به گرانول فرمول با مواد افزودنی فشرده شدند. این مرحله از افزودن مواد کمکی در آزمایش گنجانده نشد. به طور کلی، فرآیند تولید ما شامل استخراج، تغلیظ و خشک کردن اسپری است، همانطور که در بخش 2.2 توضیح داده شد، به موازات فرآیند تولید گرانول فرمول. برای تولید این محصولات نیمه تمام باید سه مرحله فوق را طی کرد. فرآیند تشکیل WE شامل غلظت و خشک کردن اسپری است که به راحتی باعث از بین رفتن اجزای حساس به حرارت می شود، اما HR ها پس از استخراج و خشک کردن HM ها به دست می آیند. ما نمی دانیم که آیا ممکن است اجزای فعال در منابع انسانی باقی بمانند؟ با توجه به نتایج ما، محتوای verbascoside به طور قابل توجهی از HMs به WE و HR کاهش یافت (و، به ترتیب). پایداری حرارتی ورباسکوزید با نظارت بر تغییرات در ناحیه پیک از طریق HPLC در طول فرآیند گرمایش بررسی می‌شود. پس از حرارت دادن به مدت 4 ساعت، 41.6 درصد ورباسکوزید باقی می ماند. این نشان می دهد که ورباسکوزید به حرارت حساس است [31]. ایزواکتئوزید، توبولوزید A، و اکیناکوزید در WES پس از فرآیندهای پردازش پیچیده پایدار باقی ماندند. در طول فرآیند خشک کردن طولانی مدت، تجمع PhG ها کاهش قابل توجهی را نشان داد که ممکن است به تخریب حرارتی این اجزای حساس به حرارت نسبت داده شود [32]. از نظر سایر اجزای هدف، HRs و WE به جز ورباسکوزید تفاوت معنی‌داری نداشتند. درک ما از این تفاوت ما را قادر می سازد در آینده استانداردهای کیفی بهتری برای ضایعات گیاهی ایجاد کرده و آنها را به محصولات ارتقا دهیم.

جدول 1 محتویات 11 دسته C. tubulosa

جدول 2 مقایسه محتویات اجزای اصلی (n = 11).

,

شکل 4 تعیین محتوای پنج جزء از اشکال مختلف (n = 11). ، ns: قابل توجه نیست.

3.1.4. تجزیه و تحلیل تشابه اثر انگشت

شباهت بین سه گروه C. tubulosa مورد بررسی قرار گرفت. مقادیر تشابه مواد گیاهی-عصاره آب، مواد گیاهی-بقایای گیاهی و عصاره آب-بقایای گیاهی در محدوده 0.943-0.994، 0.847-0 بود. {9}}.995، و 0.938–1.000، به ترتیب (جدول 3).

جدول 3 شباهت های HM-WE، HM-HR و WE-HR برای 11 دسته از C. tubulosa.

3.2. نتایج تست فعالیت آنتی اکسیدانی

فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی اشکال مختلف C. tubulosa با استفاده از سنجش‌های DPPH، , و ظرفیت مهار تعیین شد و نتایج مربوطه در شکل 5 ارائه شده است. در جدول S8، دامنه نتایج سنجش DPPH و ظرفیت مهار {{ {2}}.04-37.80، 0.98-843.90، و 0.32-27.65 mg/ml برای سه شکل مختلف در بین 11 دسته C. tubulosa. در سه آزمایش فعالیت آنتی اکسیدانی، HMs و WEs فعالیت مهاری نزدیک را نشان دادند، در حالی که HRs ضعیف‌ترین مهار را نشان دادند.

WE های خشک شده با اسپری فعالیت های قابل توجهی حتی در غلظت های پایین نشان می دهند. گزارش قبلی نشان داد که Vernonia amygdalina WE با اسپری خشک شده به 5{3}} درصد مهار مهار در 0.17 میلی گرم در میلی لیتر [33] دست یافت. استفاده از زمان استخراج طولانی و دمای بالا یک شمشیر دولبه است. از یک طرف، افزایش زمان استخراج و دمای ورودی خشک کردن اسپری باعث بهبود عملکرد و کارایی می شود. علاوه بر این، عصاره ها به فعالیت آنتی اکسیدانی قوی و غلظت بالاتری از اجزای بیولوژیکی نسبت به آن گیاهان دست می یابند [34]. از طرف دیگر، هوای ورودی بیش از حد گرم باعث تخریب ترکیبات زیست فعال می شود. چنین دمای ورودی هوای بالا منجر به از دست دادن فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره Bidens pilosa شد و به کاهش ترکیبات فنلی نسبت داده شد [35]. نتایج حاضر با گزارش فوق مطابقت دارد. به عنوان مثال، WE در S6 توانایی های مهاری رادیکال ضعیف تری نسبت به HM و HR نشان داد. علاوه بر این، HR در S5 توانایی‌های DPPH و مهار آنیون سوپراکسید قوی‌تری نسبت به HM و WE نشان داد. ساختار PhG ها شامل پیوندهای گلیکوزیدی و گروه های استیل است که به راحتی تحت عمل آنزیمی هیدرولیز می شوند یا در دماهای بالا تجزیه می شوند. این واکنش ها ممکن است باعث کاهش برخی از اجزای اصلی در طول تولید در مقیاس بزرگ شود. با این حال، هیدرولیز یا ایزومریزاسیون اجزای خاص ممکن است سنتز اجزای دیگر را تسریع کند. چنین دگرگونی هایی هنگام پردازش گیاهان Cistanches رایج است [36-38]. محلول بودن PhG ها در آب به این معنی است که بیشتر اجزای بیولوژیکی را می توان از طریق استخراج آب مورد استفاده قرار داد. این بحث که اکثر اجزای فعال در WE باقی می مانند برای دهه ها ادامه داشته است، بنابراین منطقی به نظر می رسد که فرض کنیم مواد باقیمانده مرطوب را می توان پس از استخراج دور انداخت. با این حال، در نظر گرفتن HRs از C. tubulosa به عنوان زباله نادرست است. محققان خاطرنشان می کنند که PhG ها ناپایدار هستند و مستعد تجزیه آنزیمی یا هیدرولیتیکی هستند [39]. واکنش‌های هیدرولیز یا ایزومریزاسیون که به کاهش مواد بیولوژیکی در داروهای گیاهی در طول فرآوری کمک می‌کنند، ممکن است در همان زمان فرصت‌های جدیدی را برای بهره‌برداری از منابع انسانی ارائه دهند. با تبدیل روش‌های سنتی استخراج، می‌توان بقایای دارویی را توسعه داد و به طور مؤثرتری مورد استفاده قرار داد. هیدرولیز آنزیمی برای تبدیل باقیمانده جینسنگ Panax به تک قندها انجام شد. بازده پلی ساکاریدها و جین سنوزیدها مانند قند، اسید سوکسینیک، پلی ساکاریدهای جینسنگ و جین سنوزیدها افزایش یافت [40]. باقی مانده های Sophora flavescens توسط امواج اولتراسونیک با اتیل استات دوباره استخراج می شوند [41]. فن آوری های به روز شده برای استفاده از بقایای گیاهی توسط هوانگ و همکاران خلاصه شده است. [42].

بر اساس نتایج PLSR و BCA، پنج پیک برتر از اشکال مختلف با استفاده از روش‌های DPPH، آنیون سوپراکسید و مهار رادیکال هیدروکسیل برای شناسایی مهم‌ترین پیک‌ها غربال‌گری شدند. نتایج در نمودار ون (شکل 7) نشان داده شده است. A2، A6، A8 و A10 پیک های مشترکی هستند که توسط HM، WE، و HR مشترک هستند (شکل 7(a) و 7(c)) در سنجش مهار رادیکال های آنیون سوپراکسید و هیدروکسیل، در حالی که HM، WE، و سهم HR بدون پیک سنجش DPPH. در همین حال، مدل‌های BCA نشان می‌دهند که A1، A2، A3، و A6 پیک‌های مشترک مشترک HM، WE و HR هستند (شکل 7(d)-7(f)). قابل توجه، همپوشانی‌ها در نمودار ون نشان می‌دهد که مدل BCA مناسب‌تر از مدل PLSR به نظر می‌رسد، اولی تکرار بیشتری را نشان می‌دهد. ضرایب مدل BCA و توانایی آنتی اکسیدانی مقادیر IC50 از طریق RDA آنالیز شد. همانطور که RDA در شکل 8 نشان داده شده است، A1، A3 و A6 از HM و HR به طور مثبت با شاخص های آنتی اکسیدانی مرتبط هستند، با این تفاوت که A3 با ظرفیت مهار رادیکال هیدروکسیل رابطه منفی دارد. A1 و A6 از WE همبستگی قوی با DPPH و آنیون سوپراکسید دارند. قله‌های A6 که از اشکال مختلف مشخص شده‌اند، قوی‌ترین ارتباط را با DPPH، آنیون سوپراکسید و رادیکال‌های هیدروکسیل نشان می‌دهند. A1 و A3 نیز اتصال مشابهی را نشان می دهند.

شکل 7

نمودارهای ون مدل PLSR و BCA: (الف) سنجش DPPH. (ب) سنجش مهار. (ج) روش مهار با مدل PLSR تجزیه و تحلیل شد. (د) سنجش DPPH. (ه) سنجش مهار. (f) روش مهار با مدل BCA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. بخش همپوشانی، قله های مشترک توسط HM، WE و HR بود.

3.4. تجزیه و تحلیل مبتنی بر فارماکولوژی شبکه

3.4.1. ساخت شبکه سی تی

در مجموع 4359 هدف مربوط به فعالیت آنتی اکسیدانی از پایگاه داده GeneCards و پایگاه داده OMIM به دست آمد. در همان زمان، اجزای فعال از پایگاه داده TCMSP و پایگاه داده SwissTargetPrediction غربالگری شدند. سپس 198 هدف از طریق پایگاه داده UniPort جمع آوری و استانداردسازی شد. 159 ژن هدف مشترک توسط اجزای فعال و بیماری های مرتبط با آنتی اکسیدان وجود داشت (شکل S1 را ببینید). شبکه CT برای نشان دادن همبستگی بین ترکیبات و اهداف ژنی کلیدی ساخته شد (شکل 9).

شکل 9 شبکه CT. این شبکه ارتباط بین اجزای فعال و اهداف ژنی کلیدی را نشان داد.

3.4.2. ساخت شبکه PPI و غربالگری اهداف کلیدی

PPI با استفاده از پایگاه داده STRING تجسم شد (شکل 10). شبکه شامل 159 گره و 2528 لبه بود. در کل شبکه تعامل، اجزای اتصال یا گره هایی با نقاط هدف بیشتر ممکن است جزء کلیدی یا ژن هدف باشند که نقش آنتی اکسیدانی در C. tubulosa ایفا می کند. نتایج دانلود و برای تجسم به Cytoscape معرفی شدند. هرچه مقدار DC بیشتر باشد، رنگ تیره تر است و هر چه مقدار امتیاز ترکیبی بزرگتر باشد، لبه ضخیم تر است. ما دریافتیم که RAC-آلفا سرین/ترئونین-پروتئین کیناز (AKT1)، اینترلوکین{6}} (IL6)، فاکتور نکروز تومور (TNF) و فاکتور رشد اندوتلیال عروقی A (VEGFA) در مرکز قرار دارند (شکل 11). نشان می دهد که وقتی اجزای فعال اثر آنتی اکسیدانی داشتند، آنها اهداف کلیدی بودند. گزارش شده است که اکیناکوزید از طریق تنظیم پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن (MAPK) و AKT و اشکال فسفریله آنها، اختلال عملکرد میتوکندری را کاهش می دهد [43]. محققان حدس زدند که اثر ضد دیابتی گلیکوزیدهای C. tubulosa ممکن است به دلیل فعالیت آنتی اکسیدانی PhGs با کاهش سیتوکین های پیش التهابی مانند IL{11}} و TNF- [44] باشد. علاوه بر این، اکیناکوزید می‌تواند رشد سلول‌های سرطانی تخمدان را با کاهش بیان VEGFA برای مهار رگ‌زایی [45]، که ارتباط نزدیکی با سیستم ROS برای ROS ایجاد سیگنالینگ VEGF دارد، مختل کند [46].

شکل 10 شبکه PPI.

3.4.3. تجزیه و تحلیل غنی سازی و ایجاد شبکه CTP

ترکیبات آنتی اکسیدانی بالقوه بر روی عملکردهای بیولوژیکی متعددی از جمله BP، CC و MF عمل می کنند. در شکل 12(a)، 10 مسیر برتر نشان داده شده است. اهداف پیش‌بینی‌شده از شبکه PPI عمدتاً به بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی مانند ترکیبات حلقوی آلی، محرک‌های بیگانه‌بیوتیک، مواد معدنی، سطوح اکسیژن و تنظیم مثبت حرکت اجزای سلولی پاسخ دادند. تجزیه و تحلیل اجزای سلولی نشان داد که ژن‌ها عمدتاً به رافت غشایی، ماتریکس خارج سلولی، لومن گرانول ترشحی، مجموعه تنظیم‌کننده رونویسی و قسمت آپیکال سلول مربوط می‌شوند. این اهداف همچنین در بسیاری از عملکردهای مولکولی، از جمله اتصال به فاکتور رونویسی متصل به DNA، فعالیت همودایمریزاسیون پروتئین، اتصال اختصاصی دامنه پروتئین، و اتصال گیرنده سیتوکین نقش دارند.

شکل 12 تجزیه و تحلیل غنی سازی: (الف) تجزیه و تحلیل غنی سازی GO. (ب) تجزیه و تحلیل غنی سازی KEGG.

برای بررسی عملکردهای بیولوژیکی این مراکز اصلی، یک تحلیل غنی‌سازی مسیر انجام شد. از نتایج غنی‌سازی KEGG، یک نمودار حباب برای نشان دادن 20 مسیر برتر ترسیم شد. هر چه لکه بزرگتر باشد، ژن های بیشتری در مسیر گنجانده شده است. همانطور که در شکل 12 (ب) نشان داده شده است، مسیرهای کلیدی C. tubulosa مربوط به مسیرهای سرطان، چربی و آترواسکلروز، مسیر سیگنالینگ AGE-RAGE در عوارض دیابت، سرطانزایی شیمیایی - فعال شدن گیرنده و مسیر سیگنالینگ MAPK بود. اثرات C. tubulosa بر آپوپتوز و هموستاز ردوکس سلولی مورد بررسی قرار گرفت. داده ها نشان می دهد که C. tubulosa می تواند یک نامزد امیدوارکننده برای درمان ضد سرطان روده بزرگ باشد [47]. عصاره C. deserticola در افراد مسن یافت می شود [48].

شکل 13 همبستگی بین مسیرها و اهداف مرتبط با آنها و رابطه بین ژن های هدف همپوشانی و اجزای فعال بیولوژیکی C. tubulosa را نشان می دهد. یک نمای جهانی از شبکه CTP ایجاد شد که شامل 12 ماده، 159 هدف و 20 مسیر بود. بیشتر اهداف توسط ترکیبات فعال کاندید مشترک بود. این مواد فعال کاندید با درجات اتصال بالا مسئول اتصال بالای شبکه CTP، به ویژه کوئرستین (درجه = 131) ​​بودند. اکثر اهداف، مانند AKT1، IL6، TNF، و VEGFA، به مسیرهای KEGG مرتبط با مسیرهای سرطان نگاشت شدند.

شکل 13 شبکه CTP.

4. نتیجه گیری

در این مطالعه، ما در درجه اول موقعیت‌های پیچیده را هنگام در نظر گرفتن روابط طیف اثر بین HM، WE و HR بررسی کردیم.C. tubulosa. اثر انگشت HPLC وسنجش آنتی اکسیدانیبرای شناسایی تفاوت‌های بین Hs، WE و HR استفاده شدC. tubulosa. با توجه به اثر انگشت HPLC، 11 پیک در بین 11 دسته Hs، WEs و HR رایج بود. اسید جنیپوزیدیک،اکیناکوزید, ورباسکوزید, توبولوزید A، وایزواکتئوزیددر میان این قله ها شناسایی شدند. محتوای این پنج جزء مشخص شد. علاوه بر این، اثرات آنتی اکسیدانی ازC. tubulosaHs، WEs، و HRs به دلیل تغییرات در ترکیبات شیمیایی ناشی از شرایط پیچیده ساخت متفاوت بودند. بر اساس مدل های آماری متنوع، مطالعه رابطه طیف-اثر نشان داد که قله A6 ممکن است تعیین کننده ترین مؤلفه در بین سه شکل باشد.C. tubulosa. این مطالعه بر اساس فارماکولوژی شبکه ای برای کشف مکانیسم های بالقوه انجام شدC. tubulosaبرآنتی اکسیداسیوناز طریق غربالگری ترکیبات، پیش‌بینی اهداف کلیدی، ساخت شبکه‌ها و انجام تجزیه و تحلیل غنی‌سازی. نتایج ما یک مبنای نظری برای بازیافت بقایای گیاهی و پتانسیل آن فراهم می کندC. tubulosaدر درمانبیماری های مرتبط با آنتی اکسیدان.