هسته‌های تالاموس قدامی: بستری حیاتی برای حافظه غیرمکانی مرتبط با جفت در موش‌ها قسمت 2

2|مواد و روش ها

2.1|حیوانات و شرایط اسکان

موش‌های نر لانگ اوانز (12 ماهه؛ میانگین وزنی 630 گرم) در گروه‌های سه یا چهار نفره در قفس‌های ماکرولون (48 28 22 سانتی‌متر) با چرخه معکوس 12- ساعت نور تا تاریکی (چراغ‌ها در ساعت 8 شب روشن می‌شوند) نگهداری شدند. ).

آزمایش رفتاری در مرحله تاریکی چرخه نور، پنج جلسه در هفته انجام شد؛ مشاهدات تأیید کرد که موش‌ها در طول فاز تاریکی نسبتاً فعال‌تر بودند. موش‌ها در 85 درصد وزن بدن بدون تغذیه با آب به طور آزاد نگهداری شدند؛ غذا قبل و بعد از جراحی برای بهبودی پس از عمل به طور آزاد بود.

جراحی فرآیند درمان بیماری و بهبود سلامت جسمانی است. روند بهبودی پس از جراحی نیاز به توجه ویژه دارد. علاوه بر ریکاوری فیزیکی، احساس خوب نیاز به تمرکز بر بازیابی حافظه نیز دارد. ارتباط قوی بین بهبودی پس از عمل و حافظه وجود دارد.

در طول عمل، عواملی مانند واکنش نامطلوب بدن و اثرات داروهای بیهوشی اغلب بر عملکرد حافظه مغز تأثیر می گذارد. پس از بهبودی بدن، به رعایت رژیم غذایی مناسب، ورزش متوسط ​​و خواب کافی توجه کنید. در طول دوره نقاهت در خارج از بیمارستان، باید از انجام فعالیت های بیش از حد خودداری کنید و حالت راحت بدن را حفظ کنید.

علاوه بر عادات زندگی، تنظیمات روانی معقول نیز در بازیابی سلامت و حافظه مفید است. خودتان را آرام کنید، ذهنی آرام داشته باشید و به خودتان کمک کنید تا با بهبود حافظه سازگار شوید. در عین حال، باید فعالانه در فعالیت های تفریحی شرکت کنید و با اقوام و دوستان خود ارتباط برقرار کنید تا مغز خود را فعال نگه دارید و توانایی های شناختی و حافظه خود را بهبود بخشید. این فعالیت را می توان به تدریج افزایش داد و اساساً یک بار در هفته انجام می شود.

به طور خلاصه، روند بهبودی پس از جراحی نیاز به توجه همه جانبه دارد. حفظ عادات خوب زندگی و سازگاری های روانی نقش بسیار مهمی در ارتقای ریکاوری فیزیکی و بازیابی حافظه دارد. بیایید با اعتماد به نفس و امید کامل با آن روبرو شویم. ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانش دسرتیکولا می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد، زیرا سیستانش دسرتیکولا می تواند تعادل انتقال دهنده های عصبی مانند افزایش سطح استیل کولین و فاکتورهای رشد را نیز تنظیم کند. این مواد برای حافظه و یادگیری بسیار مهم هستند. علاوه بر این، گوشت همچنین می تواند جریان خون را بهبود بخشد و اکسیژن رسانی را تقویت کند، که می تواند اطمینان حاصل کند که مغز مواد مغذی و انرژی کافی را دریافت می کند و در نتیجه نشاط و استقامت مغز را بهبود می بخشد.

روی روش های بهبود عملکرد مغز کلیک کنید

همه رویه ها با دستورالعمل های تایید شده کمیته اخلاق حیوانات دانشگاه کانتربری مطابقت داشتند. چهار گروه از موش‌ها پس از آشنایی قبل از جراحی در ماز شعاعی بازو (RAM) و باند فرودگاه به‌صورت تصادفی ایجاد شدند. چهار گروه ضایعات دو طرفه ATN با یا بدون اثری بین بو و محرک های شی بودند که در کار زوجی و دو گروه مربوط به ضایعه شم آموزش دیدند.

اندازه نمونه نهایی (1) Sham-No Trace=7 بود (یعنی یک گروه ضایعه شم بدون فاصله بین بو و محرک های شیء مورد استفاده در کار جفت-همبستگی). (2) Sham-Trace=7 (گروه Shamlesion یک رد 10- بین ارائه بو و محرک های جسم داده شده است). (3) ATN-No Trace=8;و (4) ATN-Trace=9. یک موش ATN-ضایعه اضافی به دلیل عدم رعایت معیارهای ضایعه حذف شد (زیر را ببینید).

2.2|عمل جراحی

موش ها با ایزوفلوران بیهوش شدند (القاء 4٪؛ نگهداری 2.5٪) و در یک دستگاه استریوتاکسیک با میله های گوش آتروماتیک (Kopf، Tujunga، CA) قرار گرفتند. میله انسیزور روی 7.5 میلی متر زیر خط بین شنوایی تنظیم شد تا آسیب فورنیکس را کاهش دهد.

در هر نیمکره، دو انفوزیون به سمت هسته قدامی شکمی (AV؛ بالا و پایین)، و یک انفوزیون به سمت هسته آنترومدیال (AM) هدایت شد. در هر جراحی از یک مختصات قدامی-خلفی (AP) نسبت به فاصله برگما-لامبدا هر موش صحرایی (همه مقادیر برحسب میلی متر) استفاده می شد. برای ضایعات AV، مختصات AP عبارت بودند از: 2.20 برای B-L 6.9-7.2. 2.25 برای B–L 7.3 تا 7.6؛ 2.30 برای B–L بزرگتر یا مساوی 7.7. انفوزیون های AV در 5.68 و 5.73 در زیر سخت شامه و 1.52 لترال به خط وسط انجام شد.

انفوزیون TheAM {{0}}.1 میلی‌متر جلوتر از مختصات AV، در 5.76 زیر سخت‌شکم و 1.16 جانبی قدامی‌تر ساخته شد؛ اولین ضایعه AM پس از تکمیل همه انفوزیون‌های AV ایجاد شد و در مقابل آخرین ضایعه AV شروع شد. 0.15 M N-methyl-d-aspartate (NMDA; Sigma, CastleHill, NSW) در 0.1 M بافر فسفات (pH 7.20) با سرعت 0.04 ul در دقیقه از طریق یک 2.{18}}سرنگ ulHamilton (Reno، NV، USA) با استفاده از پمپ تزریق میکرو (Stoelting، Wood Dale، IL).

نیمکره AV sitesper به ترتیب {{0}}.12 و 0.10 ul برای سایت‌های شکمی پشتی دریافت کرد. 0.06 ul برای هر سایت AM استفاده شد. سوزن سرنگ پس از انفوزیون به مدت 3 دقیقه در محل باقی ماند.
جراحی‌های ضایعه شم از همین روش استفاده کردند، اما سوزن به 1 میلی‌متر بالای AV فوقانی و محل‌های ضایعه AM با تزریق بدون تزریق کاهش یافت.

2.3|وظایف رفتاری

یک RAM هشت بازویی اختلال حافظه فضایی را در موش‌های ضایعه ATN پس از جراحی تأیید کرد. یک دستگاه باند فرودگاه برای آموزش موش‌ها در تمام کارهای غیرمکانی، یعنی بوی ساده و تمایز شی ساده و وظایف مرتبط با بو-شی و بو-ردیاب-شیء استفاده شد.

قبل از جراحی، موش‌های محدودشده با غذا به رم هشت بازویی که در زیر توضیح داده شده است عادت کردند تا 0.1 گرم تکه‌های شکلات (Foodfirst LTD Auckland، NZ) را بازیابی کنند و با باز و بسته شدن درهای بازو سازگار شوند. در یک باند پرسپکس قرمز رنگ (شکل 1)، موش‌ها به شکلی به شکل بینی بودند که یک کلاه پلاستیکی سفید دایره‌ای 2- سانتی‌متری که 10 سانتی‌متر بالاتر از سطح کف قرار داشت و در مرکز یک اسفنج نازک روی یک درج پرسپکس شفاف قرار داشت که به آن وصل شده بود. دیوار انتهایی

آنها همچنین به شکلی بودند که (با استفاده از دماغه یا پنجه) جسمی را که در پشت پایه آن به بالای چاه غذایی که در مرکز یک بلوک چوبی 3 سانتی‌متری 8.5 8.5 فرو رفته بود، لولا می‌کردند. غذا حاوی تکه‌های شکلات بود (و غذای غیرقابل دسترس در زیر شکاف نگه داشت). شی مورد استفاده برای پیش تمرین دوباره استفاده نشد. پس از عمل جراحی، موش‌های ریکاوری با RAM و باند فرودگاه آشنا شدند.

2.4|حافظه کاری فضایی در RAM

پس از جراحی، حافظه کاری فضایی با استفاده از RAM واقع در مرکز یک اتاق بدون پنجره (3 3 متر) آزمایش شد. پیچ و خم دارای یک توپی مرکزی چوبی با رنگ خاکستری به عرض 35 سانتی متر با هشت بازوی آلومینیومی (65 سانتی متر طول، 8.6 سانتی متر عرض، با حاشیه هایی به ارتفاع 4.5 سانتی متر) بود که 67.5 سانتی متر از کف اتاق بلند شده بود. دیوارهای شفاف Perspex (19 سانتی‌متر طول و 25 سانتی‌متر ارتفاع) در امتداد یک طرف هر بازو از توپی کشیده شده‌اند تا از پریدن موش‌ها بین بازوها جلوگیری کند.

در انتهای هر بازو یک چاه چوبی سیاه رنگ (5 8.5 3 سانتی متر) با مواد غذایی غیر قابل دسترس در زیر آن قرار داده شد. در طول آزمایش، 2 قطعه شکلات 0.1 گرم در هر غذا در ابتدای هر غذا وجود داشت. آزمایش. درهای Perspexguillotine شفاف که می‌توانستند از زیر توپی توسط یک سیستم قرقره بلند شوند، دسترسی به بازوهای هوبند را کنترل می‌کردند.

ده روز متوالی آموزش رسمی در RAM برای آزمایش حافظه کاری فضایی استفاده شد. موش در مرکز مرکزی قرار گرفت، و 10 ثانیه بعد، هر هشت بازو باز شدند، و موش مجاز به انتخابی بود که به عنوان هر دو پای عقبی بیش از یک آستانه بازو تعریف شده بود. هنگامی که موش وارد یک بازو شد، تمام درها بسته شد، و بدون توجه به اینکه آیا انتخاب درستی انجام داده باشد، به مدت 15 ثانیه در بازو محبوس شد.

سپس موش دوباره به هاب مرکزی بازگردانده شد و به مدت 10 ثانیه در آنجا نگه داشته شد تا همه درها دوباره باز شوند تا امکان انتخاب بازوی دیگری فراهم شود. کارآزمایی زمانی به پایان رسید که رتاد از هر هشت بازو بازدید کرد، 20 بازو انتخاب شده بود یا 10 دقیقه سپری شده بود.

2.5|وظایف غیر مکانی: تبعیض ساده و یادگیری زوجی

هم تبعیض ساده و هم تکالیف جفتی از یک باند پرسپکس قرمز رنگ (93 26 26 سانتی متر) که روی یک میز به ارتفاع 75- سانتی متر قرار گرفته بود استفاده می کردند (شکل 1). باند را می توان با سه درب عمودی قابل جابجایی (redPerspex، 26 26 سانتی متر) تقسیم کرد که بر اساس وظیفه رفتاری خاص انتخاب شدند. برای آشنایی، اسفنج نازک 6.5 6 8 میلی متری با کلاهک در مرکز آن جایزه غذای شکلاتی دارد (شکل 1).

اسفنج به یک در قابل جابجایی در باند فرودگاه (برای کارهای جفت شده) یا دیوار انتهایی باند (برای کار تشخیص ساده) وصل شده است. برای هر بو از یک اسفنج درب پلاس متفاوت استفاده شد که در مجاورت ظرف با 5 میلی لیتر روغن آفتابگردان مخلوط شده با 20 لیتر اسانس ماده نیوزیلندی تزریق شد.

بوی لیمو و میخک برای کارهای همبسته و دارچین و آهک برای کارهای تشخیص ساده یا برعکس در گروه‌های متعادل بود. اجسام سبک و از نظر بصری متمایز (شکل 1) توسط یک لولا در پشت پایه آن به بالای چاه غذا متصل شده بودند تا موش بتواند به راحتی جسم را به عقب هل دهد (اعم از بینی یا پنجه) تا چاه را برای پاداش غذا جستجو کند.

یک قاب چوبی (ارتفاع 1.8 متر از کف به عرض 1.3 متر)، پوشانده شده در پرده های مشکی، همه طرف های منطقه آزمایش را برای کاهش نشانه های فضایی در طول آزمایش محصور کرده است.

تبعیض‌های ساده (فقط بو؛ فقط شی) و وظایف مرتبط با همبستگی از رویه «برو/بدون رفتن» استفاده می‌کردند.

اولین آزمایش برای هر جلسه با مهار کردن موش در ناحیه شروع به مدت 120 ثانیه برای سازگاری مجدد با ماز آغاز شد. آزمایشات بعدی 20 ثانیه در این منطقه شروع استفاده شد. Allrats 12 کارآزمایی انبوه را در هر جلسه روزانه، با شش کارآزمایی (پاداش) و شش کارآزمایی بدون پاداش (بدون پاداش) به ترتیب شبه تصادفی دریافت کرد. بیش از سه کارآزمایی بدون رفتن یا رفتن به طور متوالی در یک جلسه اجرا نشد.

هیچ یک از چهار جفت مختلف محرک بو - شی در آزمایشات متوالی تکرار نشد. آیتم‌های صحیح در این وظایف تمایز ساده و جفت‌های محرک صحیح در تکالیف همبسته-همبسته در سراسر رتیه‌ها متعادل شدند.

برای تشخیص بو ساده، پاسخی به صورت فشار دادن بینی به کلاهک در مرکز اسفنج تئودور شده تعریف شد. فقط بو کشیدن اسفنج یک پاسخ ممنوع تلقی می شد. غذا همیشه در کلاهک در مرکز اسفنج برای کارهای مرتبط با بو-اشیاء جفت شده وجود داشت. در اینجا جنبه go/no-go به این اشاره دارد که آیا جسم تحت فشار قرار گرفته است تا نشان دهد که آیا در انتهای باند زیر آن یک جایزه غذایی وجود دارد یا خیر.

برای اشیاء، پاسخ به عنوان هر فشاری با بینی یا پنجه ای که جسم را به سمت عقب متمایل می کند، تعریف می شود. تأخیر از زمانی که آخرین در برداشته شد و هنگامی که موش با بو (نفش بینی در کلاه، برای تشخیص بوی ساده) یا با جسم (به عقب رانده شده روی لولا، برای تشخیص اشیاء ساده و وظایف جفتی) تعامل داشت. با استفاده از کرونومتر بی صدا (دیک اسمیت، نیوزیلند) اندازه گیری شد.

ناظر در داخل پرده ها و در مجاورت باند فرود نشسته بود تا درها را کنترل کند و رفتار را ثبت کند. در صورتی که موش در کمتر از 8 ثانیه در حال حرکت پاسخ دهد یا قبل از 8 ثانیه در کارآزمایی بدون رفتن پاسخ ندهد، کارآزمایی به عنوان "صحیح" تعیین می شود.

2.6|تبعیض های ساده

نیمی از موش‌ها آموزش تشخیص بوی ساده را دریافت کردند و به دنبال آن تشخیص شیء ساده و بالعکس برای نیمی دیگر. تأخیر بین در X (شکل 1a) و تعامل با جسم بو در انتهای باند ثبت شد. موش‌ها تا زمانی که به معیار (80% درست در 2 روز متوالی) برسند، در مورد بوی ساده و کار تشخیص شیء ساده آموزش دیدند.

برای کار ساده تشخیص بو، در هر آزمایش یک بو ارائه شد. راتد برای تشخیص اینکه کدام یک از دو بو با پاداش غذایی ارائه شده در اسفنج در انتهای محفظه B جفت شده است (شکل 1a).

در تکلیف ساده تشخیص اشیا، یک شیء واحد در هر آزمایش در انتهای بخش B ارائه شد (در شکل 1 نشان داده نشده است). Therat باید یاد می گرفت که کدام یک از دو شی با جایزه غذایی که در زیر شی ارائه می شود جفت شده است.

2.7|وظایف مرتبط با جفت (ردیابی و بدون ردیابی) این وظایف از طرح جدیدی از درهای قابل جابجایی عمودی استفاده می کردند (شکل 1). موش‌ها یاد گرفتند که کدام یک از دو جفت بو و شی پاداش داده می‌شود (مثلاً بو 1 + ObjectA و بو 2 + شی B) و به کدام جفت‌ها پاداش داده نمی‌شود (یعنی بو 1 + شی B و بو 2 + شی A).

صرف نظر از جفت شدن، موش‌ها همیشه برای ارائه بویی که به محفظه دوم باند فرودگاه اجازه داده می‌شد، جایزه دریافت می‌کردند. این محفظه C برای شرایط "بدون ردیابی" بود که در آن محفظه A استفاده نمی‌شد و محفظه B محفظه شروع بود. بو در انتهای محفظه B برای شرایط "ردیابی" بود، که برای آن از محفظه A به عنوان جعبه شروع استفاده شد.

موش‌هایی که در شرایط ردیابی قرار داشتند با نگهداری در محفظه C در معرض یک تاخیر 10- بین نمایش بو و محرک‌های شیء قرار گرفتند، در حالی که موش‌هایی که در شرایط بدون ردیابی بودند بلافاصله پس از تعامل با بو در معرض شی قرار گرفتند (بعد از در هر دو شرایط ردیابی و بدون ردیابی، ما تأخیر را برای عبور از محفظه D، از زمانی که DoorZ بلند شد تا زمانی که موش با جسم تعامل کرد یا به مدت 8 ثانیه از تعامل با آن خودداری کرد، ثبت کردیم.

دو گروه از موش‌ها (Sham-lesion و ATN-lesion) در مورد وظایف تئودور-شیء-همبسته (گروه‌های بدون ردیابی) و دو گروه متناظر در مورد تئودور-ردیابی-شیء زوج-همبسته (گروه‌های ردیابی) آموزش دیدند. به معیار (80٪ کارآزمایی صحیح در عرض 3 روز) یا حداکثر 50 روز رسید.

2.8|آزمون حفظ پس از کسب

حفظ تکلیف زوجی برای هر موش 5 روز پس از رسیدن به معیار یا پس از 50 روز آموزش انجام شد. در این جلسه از 12 آزمایش انبوه پاداش/بدون پاداش در یک روز به روشی مشابه که قبلاً برای آن موش استفاده می شد استفاده شد.

2.9|بافت شناسی

2.9.1|پرفیوژن و جمع آوری بافت

در 3 روز قبل از آزمون احتباس، موش های صحرایی مجرد با یک قفس خالی تمیز به مدت 90 دقیقه در یک اتاق تاریک آشنا شدند. بلافاصله پس از آخرین آزمایش در آزمایش نگهداری، موش 90 دقیقه قبل از پرفیوژن در قفس خود در اتاق ساکت تاریک آشنا قرار داده شد.

موش‌ها با پنتوباربیتال سدیم (125 میلی‌گرم/کیلوگرم) بیهوش شدند و به‌صورت ترانس‌کاردیال با سالین و به‌دنبال آن پارافورمالدئید [4% PFA در 0}.1 مولار بافر فسفات (PB)] برای تثبیت مغز پرفیوژن شدند. مغزها در 4% PFA تثبیت شدند و به دنبال آن حداقل 48 ساعت در یک محلول طولانی مدت (20% گلیسرول در 0.1 M PB) انجام شد. مقاطع 40-میکرومتر کرونر با استفاده از میکروتوم انجمادی (ترمو فیشر، انگلستان) جمع‌آوری شدند و در محلول محافظ سرما (30٪ گلیسرول، 30٪ اتیلن گلیکول در 0.1 مولار PB) در دمای 20 درجه سانتیگراد تا زمانی که برای ایمونوهیستوشیمی پردازش شوند، ذخیره شدند.

مقاطع تاج در دو سری مجزا جمع آوری شد. اولین سری بخش‌های متوالی را در پنج کرایوویال برای ایمونوهیستوشیمی (یعنی یک در پنج) ثبت کرد. این مجموعه شامل یک بلوک قدامی از مقاطع از قشر جلوی پیشانی تا ناحیه سپتوم (تقریباً {0}}.7 تا 0.6 میلی متر از برگما) و یک بلوک خلفی از تالاموس میانی (تقریباً 3.5 میلی متر از برگما) تا دمی بود. قشر رتروسپلنیال

سری دوم بخش‌های متوالی را برای تأیید ضایعه ثبت کرد. این بخشها در چهار کرایویال از بلافاصله قدامی به ATN تا تالاموس میانی خلفی (تقریباً 0.6 تا 3.5 میلی متر از برگما) جمع آوری شدند.

2.9.2|رنگ آمیزی Neu-N و تایید ضایعات ATN

بخش‌های شناور آزاد در سرتاسر منطقه ATN قبل از انکوباسیون در بافر مسدودکننده پراکسیداز درون‌زا به مدت 30 دقیقه (3 10 دقیقه) در 0}.1 مولار سالین بافر فسفات با Triton-X (0.2٪؛ PBSTx) شسته شدند. دقیقه [1٪ پراکسید هیدروژن (H2O2)، 50٪ متانول (CH3OH) در 2٪ PBSTx].

بخش ها یک شبه در آنتی بادی اولیه inanti-NeuN 4 درجه سانتیگراد (1:5000؛ مونوکلونال-MouseCat# MAB377؛ میلیپور، کالیفرنیا ایالات متحده آمریکا) در PBSTx با 1٪ سرم بز طبیعی (NGS؛ Life Technologies، NZ) انکوبه شدند.

بافر آنتی بادی اضافی با PBSTx برداشته شد و به دنبال آن در آنتی بادی ثانویه ضد موش بز بیوتینیله (1:1000 Cat# BP{3}}: VectorLaboratories، کالیفرنیا ایالات متحده آمریکا) یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد در PBSTx و 1% NGS انکوباسیون شد. بخش‌ها در ExtraAvidin (پراکسیداز کونژوگه؛ 1:1000؛ Sigma، NSW استرالیا)، PBSTx و 1٪ NGS به مدت 2 ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند.

برای حذف اضافی ExtraAvidin و Triton X{{0}}، مقاطع در PBS، PB و سپس بافر Tris (PH 7.4 در H2 مقطر0) شسته شدند تا بخش‌ها برای تجسم با دی آمینو بنزیدین تازه آماده شده آماده شوند. DAB 0.05٪؛ سیگما، در 0.01٪ H2O2 در بافر Tris).

واکنش DAB (تقریباً 5 دقیقه) با استفاده از بافر Tris (1 10 دقیقه شستشو) متوقف شد، و بخش‌ها قبل از نصب روی لام‌های ژلاتینه‌شده، یک شبه در PB در دمای 4 C قرار داده شدند و اجازه دادند خشک شوند. اسلایدها از طریق الکل درجه بندی شده (70٪ تا 100٪) قبل از پاکسازی اینکسیلن و نصب با DPX (06522؛ Sigma-Aldrich) و یک پوشش پوششی، آبگیری شدند.

تعداد سلول های Neu-N مثبت در ATN برای تعیین میزان ضایعه استفاده شد. این بخش از هر دو نیمکره چپ و راست برای هر بخش از چهار{2}} میکرومتر در سراسر ATN و ناحیه تعیین شده با استفاده از ImageJ (NIH، ایالات متحده آمریکا) استفاده کرد. رنگ‌آمیزی سلول‌های NeuN مثبت در 5 هدف روی میکروسکوپ عمودی LeicaDM6 B و دوربین DFC7000T (Leica Microsystems، آلمان) عکس‌برداری شد.

شمارش خودکار سلول ها از طریق ImageJ (نرم افزار تجزیه و تحلیل تصویر، موسسه ملی بهداشت، NIH، ایالات متحده) به دست آمد. ناحیه اطراف نورون‌ها در ناحیه ATN به صورت دستی انتخاب شد و تصاویر به {{0}}مقیاس بیت خاکستری تبدیل شدند، پس‌زمینه کم شد (غلط=40)، به ماسک تبدیل شد و تابع آبخیز اعمال شد. و تمام سلول های عصبی بالاتر از آستانه (آستانه 'MaxEntropy'، دایره ای 0.5-1.0) شمارش شدند.

آستانه تشخیص برای همه بخش‌ها یکسان بود. هسته‌های سلول‌های رنگ‌آمیزی خودکار NeuN در نه موش صحرایی (پنج تا در گروه Sham-Trace و چهار در گروه Sham-No Trace) برای بیان تعداد سلول‌ها در ATN شمارش شدند.

شمارش خودکار هسته‌های رنگ‌آمیزی NeuN سلول‌های محافظت‌شده در تمام موش‌های ATN-ضایعات نسبت به میانگین تعداد سلول‌های NeuN مشاهده‌شده در موش‌های شم مقایسه شد. ضایعات قابل قبول به عنوان رسیدن به معیار 50٪ از دست دادن سلول در ATN، با حداقل 25٪ در هر نیمکره تعریف شد. این با معیارهای ضایعه ATN در مطالعات قبلی مطابقت دارد (Mitchell & Dalrymple-Alford، 2005، 2006؛ Perryet al.، 2018).

2.9.3|ایمونوهیستوشیمی Zif268

بخش‌های شناور آزاد به روشی مشابه NeuN پردازش شدند، اما در آنتی‌بادی اولیه پلی کلونال Zif268 خرگوش (Egr-1؛ 1:1000 Cat# sc-110؛ Santa CruzBiotechnology، USA) به مدت 72 ساعت در انکوبه شدند. 4 C در PBSTx با 1% NGS، و به دنبال آن انکوباسیون در آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش بز بیوتینیله (1:1000: Vector LaboratoriesBA-1000) یک شبه در PBSTx و 1% NGS.

پس از تجسم DAB (18 دقیقه)، رنگ‌آمیزی سلولی مثبت Zif در هر ناحیه مورد نظر با یک هدف 1{3}} با میکروسکوپ نوری (لایکا، آلمان) عکس‌برداری شد. شمارش خودکار سلول‌ها از طریق ImageJ بدست آمد. NIH، ایالات متحده) به همان شیوه سلول‌های NeuNpositive، به جز دایره‌ای در 0.65-1.0 تنظیم شد.

تعداد سلول‌های مثبت Zif268-برای همه مناطق از الگوریتم آستانه یکسانی استفاده می‌کردند که بین دو تا شش بخش در هر منطقه مورد نظر در هر موش اندازه‌گیری شد. میانگین تعداد سلول‌های مثبت Zif در هر میلی‌متر مربع در سراسر بخش‌ها (از هر دو نیمکره) در ناحیه مورد نظر استفاده شد.

2.10|تحلیل داده ها

ANOVA با استفاده از Statistica (v13; Dell Inc.) برای آزمایش تفاوت‌های میانگین در بین چهار گروه موش‌ها (Sham-No Trace، Sham-Trace، ATN-No Trace و ATNTrace) انجام شد. عوامل اندازه‌گیری مکرر برای روزها (رم و تبعیض ساده)، بلوک‌های آزمایشی (وظایف مرتبط-همبسته) و تعداد Zif268 در مناطق مرتبط یا زیرمنطقه‌های مورد علاقه اضافه شد.

ANOVA برای هر دو RAM و وظایف تشخیص ساده، چهار گروه را مقایسه کرد تا تأیید کند که دو گروه Sham-lesion و twoATN-lesion با یکدیگر سازگار هستند، اما توجه داشته باشید که هیچ جزء اثری در RAM یا وظایف تشخیص ساده وجود ندارد. هم برای تبعیض ساده و هم برای وظایف جفتی در باند فرودگاه، یک تبدیل متقابل داده‌های تأخیر در آزمایش‌های فردی برای اطمینان از همگنی واریانس استفاده شد.

در هر روز آزمون، تأخیرهای تغییر یافته، تاخیر متوسطی را برای هر یک از شش آزمایش بدون پاداش و شش آزمایش با پاداش ایجاد کردند. برای وظایف ساده تبعیض، میانگین امتیاز تفاوت تأخیر (میانگین آزمایش‌های با پاداش منهای میانگین کارآزمایی‌های بدون پاداش) را تجزیه و تحلیل کردیم، اما آزمایش‌های با پاداش و بدون پاداش را به‌دلیل شکست در ذخیره‌سازی داده‌ها به طور جداگانه تجزیه و تحلیل نکردیم.

هر سه معیار تأخیر برای وظایف حافظه زوجی (آزمایش‌های بدون پاداش، آزمایش‌های پاداش و تفاوت تأخیر) در دسترس بودند. برای در نظر گرفتن مقایسه‌های چندگانه و متعادل کردن خطاهای نوع I و نوع II، از سطح معنی‌داری p < 0.02 برای تحلیل‌های رفتاری استفاده کردیم، زیرا سه معیار مرتبط در کار مرتبط-همبسته (آزمایش‌های بدون پاداش، کارآزمایی‌های پاداش‌دار) وجود داشت. و میانگین تفاوت تاخیر).

شش تجزیه و تحلیل اولیه برای مناطق مورد علاقه برای بیان Zif268 وجود داشت، بنابراین اهمیت در این تحلیل‌ها در p < 0.01 تنظیم شد. آزمون‌های نیومن-کولز (NK) تفاوت‌های گروهی را به صورت زوجی ارزیابی کردند. تجزیه و تحلیل اثرات اصلی ساده زمانی مورد استفاده قرار گرفت که برهمکنش های قابل توجهی شامل عوامل اندازه گیری های مکرر وجود داشت.

3|نتایج

3.1|تایید ضایعه

همه به جز یکی از 18 موش با ضایعات ATN معیار قبلی 50٪ آسیب دو طرفه به ATN و حداقل 25٪ در هر نیمکره را برآورده کردند. میانگین آسیب دوطرفه در هر دو گروه ضایعه ATN 76٪ بود (محدوده: ATN-No Trace، 61٪-93٪؛ ATN-Trace، 63٪-93٪؛ شکل 2). موش‌های خارج‌شده تنها در یک نیمکره ضایعه رضایت‌بخش داشتند (48% کل، 75% چپ و 20% راست).

شکل 2d نشان می‌دهد که تعداد NeuN برای نورونسین ATN موش‌های ضایعه ATN (M=3388، SD=2024) بسیار پایین‌تر از مقادیر موجود در موش‌های ضایعه ساختگی بود (M=15، 339، SD=1065؛ این شمارش مشابه آن چیزی بود که توسط فراست و همکاران، 2020 گزارش شده بود). هشت موش از 17 موش ضایعه (چهار در گروه Trace و چهار موش در گروه بدون ردیابی) هیچ آسیبی به تالاموس میانی (MD) یا هسته‌های پیوند مجدد/رومبوئید (Re/Rh) نداشتند و آسیب نسبتا کمی به آن وارد شد. این ساختارها در 9 موش صحرایی با ضایعات باقی مانده است.

هنگامی که آسیب MD رخ داد، این در جنبه های قدامی بود که در مجاورت ATN قرار داشت. بنابراین، آسیب MD از حدود {{0}}.72 تا +2.10 میلی‌متر از Bregma، که در آن از ۰٪ تا ۴۱٪ از بین رفتن سلول‌ها در کل متغیر بود، ارزیابی شد. گروه (میانگین=21%). هنگامی که آسیب Re/Rh رخ داد، همچنین در مجاورت ناحیه ATN بود، بنابراین تقریباً 1.08 تا 2.04 میلی‌متر از Bregma ارزیابی شد، جایی که از 0٪ تا 33٪ (میانگین=6%) متغیر بود. توجه داشته باشید که این مقادیر درصد صدمات نشان دهنده کل MD و Re/Rhregions نیستند، زیرا نواحی خلفی هر دو هسته در تمام موش های ATN-ضایعه دست نخورده بودند.

For more information:1950477648nn@gmail.com