خلاصه.آربوتین یک ترکیب طبیعی است که از گیاهان مختلف از جمله برگهای خرس استخراج میشود که اثرات متعددی از جمله سفید کردن پوست، و خواص ضد التهابی و محافظت از استرس اکسیداتیو دارد. با این حال، اثرات آربوتین بر استئوبلاست ها ناشناخته باقی مانده است. مطالعه حاضر با هدف بررسی عملکرد و مکانیسمهای آربوتین بر تکثیر و تمایز سلولهای پیشساز استئوبلاست موش MC3T3-E1 در شرایط آزمایشگاهی انجام شد. تکثیر سلولهای MC3T3-E1 تیمار شده با آربوتین با استفاده از روش کیت شمارش سلولی-8 و روش برچسبگذاری 5-اتینیل{10}}'-دئوکسیاوریدین ارزیابی شد. علاوه بر این، چرخه سلولی و آپوپتوز با استفاده از آنالیز فلوسیتومتری مورد بررسی قرار گرفت. اثرات آربوتین بر تمایز استئوبلاست ها با استفاده از رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز (ALP) و با بررسی سطوح بیان mRNA زنجیره کلاژن نوع I 1 (COL1A1)، پروتئین کربوکسی گلوتامات استخوان (BGLAP) و فاکتور رونویسی Sp7 (SP7) مورد بررسی قرار گرفت. برای بررسی بیشتر مکانیسم مولکولی زیربنایی عملکرد آربوتین در ترویج استخوان زایی، سطح بیان mRNA و پروتئین فاکتور رونویسی 2 مربوط به runt (RUNX2) و -catenin با یک واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی رونویسی معکوس و وسترن بلات تجزیه و تحلیل شد. آربوتین به طور قابل توجهی تکثیر سلولی MC3T3-E1 را ارتقا داد و نسبت سلول ها را در فاز S افزایش داد. درمان با آربوتین باعث افزایش فعالیت ALP و سطوح بیان mRNA COL1A1، BGLAP و SP7 در سلولهای MC3T3-E1 شد. علاوه بر این، سطح بیان پروتئین و mRNA RUNX2 و -catenin پس از درمان با آربوتین به طور قابل توجهی افزایش یافت. در مجموع، یافتههای حاضر نشان میدهد که آربوتین میتواند تکثیر و تمایز سلولهای MC3T3-E1 را از طریق مسیر سیگنالینگ Wnt/-catenin ترویج کند.
طبق مطالعات مربوطه،سیستانچیک گیاه رایج است که به عنوان "علف معجزه آسا طولانی کننده عمر" شناخته می شود. جزء اصلی آن استسیستانوزید، که دارای اثرات مختلفی از جملهآنتی اکسیدان, ضد التهابو ارتقاء عملکرد سیستم ایمنی بدن مکانیسم بین سیستانچ وسفید شدن پوستدر اثر آنتی اکسیدانی گلیکوزیدهای سیستانش نهفته است. ملانین در پوست انسان از اکسیداسیون تیروزین که توسط آن کاتالیز می شود تولید می شودتیروزینازو واکنش اکسیداسیون نیاز به مشارکت اکسیژن دارد، بنابراین رادیکالهای آزاد اکسیژن در بدن به عامل مهمی بر تولید ملانین تبدیل میشوند. سیستانچ حاوی سیستانوزید است که یک آنتی اکسیدان است و می تواند تولید رادیکال های آزاد را در بدن کاهش دهد.مهار تولید ملانین.
برای اطلاعات بیشتر:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
معرفی
پوکی استخوان یک مشکل بهداشتی و اجتماعی-اقتصادی است که با توده استخوانی کم و ریزمعماری استخوانی ضعیف مشخص می شود که خطر شکستگی های شکنندگی را افزایش می دهد (1،2). در اتحادیه اروپا (EU)، میزان شیوع پوکی استخوان در افراد بالای یا مساوی 50 سال به ترتیب 6.6 و 22.1 درصد برای مردان و زنان در سال 2010 برآورد شد. از نظر اقتصادی، کل هزینه پوکی استخوان برای اتحادیه اروپا 37.4 میلیارد یورو در سال 2010 بود (3). با توجه به افزایش امید به زندگی و افزایش سن جمعیت، تعداد فزاینده ای از افراد ممکن است در آینده از شکستگی های ناشی از پوکی استخوان رنج ببرند (4). پوکی استخوان به دلیل عدم تعادل بین تشکیل استخوان به واسطه استئوبلاست ها و تحلیل به واسطه استئوکلاست ها ایجاد می شود (5). درمان های موجود برای پوکی استخوان شامل داروهای ضد تحلیل (مانند بیس فسفونات ها و دنوزوماب)، کلسی تونین و استروژن است. با این حال، این ترکیبات محدودیت های خاصی را نشان می دهند. به طور خاص، نرخ گردش استخوانی را کاهش داده و با کاهش فرآیند بازسازی استخوان، باعث کاهش استخوانسازی میشوند (6). استروژن درمانی برای درمان طولانی مدت پوکی استخوان ایده آل نیست، زیرا سطوح بالای استروژن ممکن است باعث خونریزی رحم، سرطان سینه و بیماری های قلبی عروقی شود (7). علاوه بر این، داروهای ضد تحلیل قادر به بازیابی ساختار استخوان از دست رفته نیستند. با این حال، عوامل آنابولیک ممکن است تشکیل استخوان را تحریک کرده و توده استخوانی را افزایش دهند (8). بنابراین، شناسایی داروهای جدید ایمن و موثر که می توانند استخوان سازی را تقویت کنند، مهم است.
آربوتین (4-هیدروکسی فنیل---D-گلوکوپیرانوزید؛ شکل 1) یک مشتق طبیعی هیدروکینون (جرم مولکولی 272 Da) است که در انواع مختلف گیاهان وجود دارد. سطوح بالایی از آربوتین در گیاهانی از جمله مرزنجوش (Origanum majorana، Lamiaceae) و گلابی (Pyrus communis، Rosaceae) و بهویژه خانواده Ericaceae مانند برگهای خرس (Arctostaphylos uva-ursi) شناسایی شد (9). آربوتین فعالیت های بیولوژیکی مختلفی را نشان می دهد. به عنوان مثال، آربوتین ممکن است استفاده شود
به عنوان یک عامل سفید کننده پوست؛ با مهار فعالیت تیروزیناز در ملانوزوم ها، آربوتین برای ترویج رنگدانه شناسایی شد (10،11). مطالعه قبلی نشان داد که آربوتین ممکن است با کاهش سطوح درون سلولی رادیکالهای هیدروکسیل نقش محافظتی در برابر آپوپتوز ناشی از تابش X داشته باشد (12). علاوه بر این، آربوتین ممکن است تمایز استئوکلاست ها را با کاهش سطح سوپراکسید درون سلولی و با کاهش فاکتور هسته ای سلول های T فعال مهار کند (13). با این حال، اثرات آربوتین بر عملکرد استئوبلاست ناشناخته باقی مانده است. بنابراین، مطالعه حاضر با هدف بررسی اثرات و مکانیسمهای آربوتین بر تکثیر و تمایز سلولهای پیشساز استئوبلاست موش MC3T3-E1 انجام شد.
مسیر سیگنال دهی Wnt ممکن است به طور مستقیم و غیرمستقیم بر استئوبلاست و استئوکلاست تأثیر بگذارد و باعث افزایش تشکیل استخوان و کاهش تحلیل استخوان شود (14). سیگنال دهی متعارف Wnt ممکن است تکثیر، تمایز و عملکرد استئوبلاست را در سطوح مختلف تنظیم کند (15). در مدلهای حیوانی، کاهش فعالیت مهارکنندههای مسیر سیگنالدهی Wnt/-catenin با استفاده از آنتیبادیها علیه پروتئین 1 مرتبط با پروتئین موخورهدار ترشح شده، اسکلروستین و مهارکننده مسیر سیگنالدهی WNT 1 (DKK1) و مهارکنندههای مولکولی کوچک گلیکوژن سنتاز. کیناز 3 (GSK{9}}) ممکن است توده استخوانی را افزایش داده و خطر شکستگی را کاهش دهد (16). بنابراین، مسیر سیگنالینگ Wnt نشان دهنده یک هدف درمانی بالقوه برای توسعه داروهای جدید برای درمان پوکی استخوان است (17). در مطالعه حاضر، اثرات آربوتین بر تکثیر و تمایز سلولی MC3T3-E1 مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، مکانیسم مولکولی زیربنایی عملکرد آربوتین در القای تمایز سلولی MC3T3-E1 مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها
مواد شیمیایی. آربوتین (خلوص، بیشتر یا برابر با 98 درصد) از شرکت Dalian Meilun Biotech، Ltd. (Dalian، چین)، حل شده در دی متیل سولفوکسید (Sigma-Aldrich؛ Merck KGaA، دارمشتات، آلمان) خریداری شد و در غلظت 0.5 M. DKK1 نوترکیب انسانی از PeproTech، Inc. (راکی هیل، نیوجرسی، ایالات متحده؛ شماره گربه. 120-30) خریداری شد.
کشت سلولی پیش استئوبلاست های کالواری موش MC3T3-E1 از مرکز منابع سلولی مؤسسه علوم زیستی شانگهای آکادمی علوم چین (شانگهای، چین) خریداری شدند و در محیط حداقل ضروری (-MEM؛ HyClone؛ GE Healthcare) کشت شدند. Life Sciences، Logan، UT، USA) همراه با 10 درصد سرم جنین گاو (FBS؛ Biological Industries، Kibbutz Beit Haemek، اسرائیل)، 10 0 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین و 100 U/ml پنی سیلین (HyClone؛ GE Healthcare Life Sciences). سلول ها در انکوباتور کشت سلولی با 5 درصد CO2 در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. مدیوم یک روز در میان تعویض می شد. پس از تیمار با 25/0 درصد تریپسین (HyClone؛ GE Healthcare Life Sciences) به مدت 1 تا 2 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد، سلولهای 80 درصد تلاقی مجدد در فلاسکهای کشت بافت کاشته شدند. برای آزمایشهای تمایز استئوبلاستیک، سلولها با یک مکمل استئوژنیک حاوی 50 میکروگرم در میلیلیتر L-آسکوربیک اسید (Sigma-Aldrich؛ Merck KGaA) و 10 میلیمولار - گلیسروفسفات دی سدیم هیدرات نمک (Sigma-Aldrich؛ Merck KGaA3) به مدت 79 روز تحت درمان قرار گرفتند. ˚C. برای مطالعات مکانیکی، سلولهای MC3T3-E1 با DKK1 (0.5 میکروگرم در میلیلیتر) به مدت 6 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد پیش تیمار شدند و سپس با آربوتین (100 میکرومولار) به مدت 3 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد تیمار شدند.
تکثیر سلولی. یک سنجش کیت شمارش سلولی{{0}} (CCK-8؛ Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan) برای ارزیابی اثرات آربوتین بر تکثیر سلولی استفاده شد. سلول ها در صفحات چاهک با تراکم 5×103 سلول در چاه به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد کاشته شدند. سپس سلول ها با آربوتین در غلظت های مختلف (0، 10، 50 و 100 میکرومولار) تیمار شدند. پس از 24، 48 یا 72 ساعت، سلول ها با محلول 9.1 درصد CCK-8 حاوی 10 میکرولیتر CCK{18}} و 100 میکرولیتر -MEM به مدت 1 تا 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد تیمار شدند. مقدار چگالی نوری هر چاه با استفاده از یک میکروپلیت خوان (ELx808؛ BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) در طول موج 450 نانومتر اندازهگیری شد. زنده ماندن نسبی سلولی به عنوان نسبت بین میانگین جذب نمونه و شاهد محاسبه شد.
سنجش برچسب زدن 5-اتینیل-2-دئوکسیاوریدین (EdU). اثر آربوتین بر تکثیر سلولی با استفاده از کیت EdU Apollo®567 In vitro Imaging (گوانگژو RiboBio Co., Ltd., Guangzhou, China) اندازه گیری شد. سلولها در یک 96-صفحه چاهک با چگالی 1×103 سلول در چاه تلقیح شدند و در -MEM حاوی 1{20}} درصد FBS با 0، 10، 50 یا 100 میکرومولار انکوبه شدند. آربوتین پس از یک 72- ساعت جوجه کشی، EdU قبل از انکوباسیون اضافی به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد به هر چاهک با غلظت 50 میکرومولار اضافه شد. سلول ها دو بار با PBS شسته و با PBS حاوی 4 درصد پارافورمالدئید به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق (RT) تثبیت شدند. پس از شستشو با گلیسین (2 میلی گرم در میلی لیتر) و PBS، سلول ها با Triton X-100 (0.5 درصد) به مدت 10 دقیقه در RT نفوذ پذیر شدند. سلول ها با مایع واکنش رنگ آمیزی آپولو 1X در RT به مدت 30 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. هسته های سلولی با 1X Hoechst 33342 به مدت 30 دقیقه در RT رنگ آمیزی شدند. سلولهای مثبت EdU با میکروسکوپ فلورسانس (بزرگنمایی، x200؛ Eclipse Ti؛ شرکت نیکون، توکیو، ژاپن) در پنج میدان بهطور تصادفی مشاهده شدند.
تجزیه و تحلیل چرخه سلولی و آپوپتوز سلولهای MC3T3-E1 در صفحات شش چاهی با تراکم 2×105 سلول در چاه کاشته شدند. پس از یک 24- ساعت انکوباسیون، سلولها با آربوتین در غلظتهای 0، 10، 50 و 100 میکرومولار تیمار شدند. سلول ها پس از 3 روز در RT برداشت و با اتانول 70 درصد به مدت 12 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد تثبیت شدند. سلول ها سه بار با PBS شسته و با محلول رنگ آمیزی یدید پروپیدیوم (PI) (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime، هایمن، چین) به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد در تاریکی رنگ آمیزی شدند. محتوای DNA با استفاده از فلوسایتومتر FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) با نرم افزار CellQuest Pro (نسخه 5.2؛ BD Biosciences) و نرم افزار ModFit LT (نسخه 3.0؛ Verity Software House, Inc., Topsham, ME,) اندازه گیری شد. ایالات متحده آمریکا). برای تجزیه و تحلیل آپوپتوز، سلولهای تیمار شده با آربوتین جمعآوری شدند و با Annexin-V و P I (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) با برچسب فلورسین ایزوتیوسیانات در تاریکی به مدت 15 دقیقه در RT رنگآمیزی شدند. سرعت آپوپتوز سلولی با استفاده از فلوسایتومتر FACSCalibur (BD Biosciences) با نرم افزار CellQuest Pro (نسخه 5.2؛ BD Biosciences) ارزیابی شد.
سنجش رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز (ALP). استئوبلاست ها در صفحات چاهک با تراکم 5×104 سلول در چاهک در -MEM حاوی مکمل استئوژنیک انکوبه شدند و با آربوتین 0 (شاهد)، 10، 50 یا 100 میکرومولار تیمار شدند. پس از 9 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد، سلولها سه بار با PBS شسته و در 4 درصد پارافرمالدئید در دمای RT به مدت 10 دقیقه تثبیت شدند. سلولها سه بار با آب مقطر شسته شدند و متعاقباً با استفاده از کیت توسعه رنگ ALP 5-بروم-4-کلرو{14}}ایندولیل فسفات/نیترو بلو تترازولیوم کلرید ALP (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) به مدت 2 ساعت رنگآمیزی شدند. در RT سلول های رنگ آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ نوری (بزرگنمایی، x40، Eclipse Ti، شرکت نیکون) تصویربرداری شدند.
واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی رونویسی معکوس (RT-qPCR). سلول ها در 6-صفحات چاهی با تراکم 2×105 سلول در چاه کاشته شدند. پس از درمان با آربوتین در غلظتهای مختلف به مدت 3 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد، RNA کل از سلولهای MC3T3-E1 با استفاده از معرف RNAiso Plus (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China) استخراج شد. در مجموع، 1 میکروگرم RNA با استفاده از کیت معرف PrimeScript RT با پاک کن gDNA (تاکارا بیوتکنولوژی شرکت، آموزشی ویبولیتین)، بر اساس دستورالعمل سازنده، به cDNA معکوس رونویسی شد. شرایط واکنش به شرح زیر بود: 42 درجه سانتی گراد برای 2 دقیقه، 37 درجه سانتی گراد برای 15 دقیقه و 85 درجه سانتی گراد برای 5 ثانیه. qPCR با استفاده از مقادیر مساوی از cDNA از هر نمونه در حجم کلی 20 میکرولیتر با سیستم PCR سریع و بلادرنگ ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) با استفاده از SYBR premix Ex Taq II (Takara) انجام شد. شرکت بیوتکنولوژی، آموزشی ویبولیتین). شرایط ترموسایکلینگ زیر مورد استفاده قرار گرفت: دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه، به دنبال آن 40 چرخه 95 درجه سانتیگراد برای 5 ثانیه و 60 درجه سانتیگراد برای 34 ثانیه. ویژگی تقویت با تجزیه و تحلیل منحنی ذوب ارزیابی شد، و -اکتین به عنوان یک کنترل داخلی خدمت کرد. سطوح بیان ژن نسبی با استفاده از روش 2-ΔΔCq (18) تجزیه و تحلیل شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده به شرح زیر بود: فاکتور رونویسی مربوط به Runt 2 (RUNX2)، جلو 5'‑CCAACCGAGTCATTTAAGGCT-3'، معکوس 5'-GCTCACGTCGCTCATCTTG-3'; زنجیره کلاژن نوع I 1 (COL1A1)، جلو 5'-GCCTCCCAGAACATC ACCTA‑3'، معکوس 5'-GCAGGGACTTCTTGAGGTTG-3';استخوان پروتئین کربوکسی گلوتامات (BGLAP)، جلو 5'-CGCTACCTTGGAGCCTCAGT-3'، معکوس 5'‑AGGCGGTCTTCAAGCCATAC-3'؛ فاکتور رونویسی Sp7 (SP7)، به جلو5'‑AAGGTGTACGGCAAGGCTTC‑3'، معکوس 5'‑CGTCAGAGCGAGTGAACCTC‑3'؛ -catenin، جلو 5'-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC‑3'، معکوس 5'‑CTTGCCACTCAGGGAAGGA-3'؛ -اکتین، فوروارد 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'، معکوس 5'‑CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
تجزیه و تحلیل وسترن بلات سلولهای MC3T3-E1 در 6-صفحههای چاهک با تراکم 2×1{26}}5 سلول در چاه کاشته شدند. سلول ها با آربوتین در غلظت های مختلف به مدت 3 روز تحت درمان قرار گرفتند و سه بار با PBS سرد شستشو داده شدند. کل پروتئین سلولی از سلولهای MC3T3-E1 با استفاده از بافر لیز سنجش رادیوایمونو رسوبگیری (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) حاوی 1 میلیمولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید استخراج شد. پروتئین ها پس از سانتریفیوژ در 13800 xg به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد جداسازی شدند. غلظت پروتئین با استفاده از کیت سنجش پروتئین اسید بیسینکونیک (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) تعیین شد. مقادیر مساوی پروتئین ({16}} میکروگرم) در هر نمونه توسط 10 درصد SDS-PAGE به مدت 2 ساعت با ولتاژ ثابت (110 ولت) جدا شد و روی غشای پلیوینیلیدین فلوراید (PVDF) (EMD Millipore، Billerica، MA، ایالات متحده). غشاها در TBS + Tween{20}} (TBST؛ 20 میلی مولار Tris-HCl، 150 میلی مولار NaCl pH 7.5 و 0.1 درصد Tween-20) حاوی 5 درصد شیر بدون چربی در RT به مدت 2 ساعت مسدود شدند و سپس در طول شب در انکوبه شدند. 4 درجه سانتی گراد با آنتی بادی های اولیه مناسب. آنتی بادی های مورد استفاده عبارتند از: خرگوش مونوکلونال ضد- -کاتنین (1:5،000؛ شماره گربه. ab32572؛ Abcam، کمبریج، MA، ایالات متحده)، خرگوش پلی کلونال ضد RUNX2 (1: 1،000؛ شماره گربه. ab23981؛ Abcam) و آنتی{42}}اکتین پلی کلونال موش (1:1،{45}}؛ گربه شماره. AF0003؛ Beyotime موسسه بیوتکنولوژی). پس از آن، غشاها سه بار با TBST شسته شدند و غشاهای PVDF با ایمونوگلوبولین G ضد خرگوش بز کونژوگه شده با پراکسیداز ترب کوهی (HRP) انکوبه شدند (IgG; 1:10،000؛ cat. no. ZB{{{{{ 52}}؛ OriGene Technologies, Inc., Beijing, China) یا IgG ضد موش بز کونژوگه با HRP (1:10,000؛ شماره گربه ZB-2305؛ OriGene Technologies, Inc.) در RT به مدت 2 ساعت . پروتئینها با استفاده از معرفهای شیمیلومینسانس پیشرفته (Thermo Fisher Scientific, Inc.) تجسم شدند و با یک سیستم تشخیص نورتابی شیمیایی (Amersham Imager 600؛ GE Healthcare Life) شناسایی شدند. پروتئین ها با استفاده از نرم افزار ImageJ (نسخه 1.52؛ مؤسسه ملی بهداشت، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) اندازه گیری شدند. پس از نرمال سازی، سطح بیان پروتئین نسبی با -اکتین به عنوان یک کنترل داخلی محاسبه شد.
تحلیل آماری. تمام آزمایش ها به طور مستقل حداقل سه بار تکرار شدند. تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از GraphPad Prism 5 انجام شد.{1}} (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه میشوند و تفاوتهای معنیدار با آنالیز واریانس یک طرفه همراه با آزمون تعقیبی دانت مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. پ<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
نتایج
آربوتین باعث افزایش تکثیر سلولی MC3T3-E1 می شود. اثرات آربوتین بر تکثیر سلولی MC3T3-E1 با استفاده از روش CCK{6}} مورد بررسی قرار گرفت. آربوتین در غلظت های مختلف ({7}}، 10، 50 و 100 میکرومولار) به مدت 24، 48 و 72 ساعت تجویز شد و یک سنجش CCK{14}} انجام شد (شکل 2A). پس از 24 ساعت، هیچ تفاوت آماری در تکثیر استئوبلاست در مقایسه با سلول های کنترل درمان نشده مشخص شد. با این حال، تکثیر سلولی MC3T3-E1 پس از درمان با آربوتین در 100 میکرومولار پس از 48 و 72 ساعت به طور قابل توجهی افزایش یافت. سنجش برچسبگذاری EdU بعد از 72 ساعت انجام شد و نتایج نشان داد که درصد سلولهای MC3T3-E1 مثبت EdU که با آربوتین در غلظتهای 50 و 100 میکرومولار تیمار شدهاند در مقایسه با شاهد درماننشده به طور قابلتوجهی افزایش یافته است (شکل 2B و C). .
آربوتین پیشرفت چرخه سلولی را تسریع می کند. اثرات آربوتین بر پیشرفت چرخه سلولی با استفاده از تجزیه و تحلیل چرخه سلولی ارزیابی شد (شکل 3). تیمار با آربوتین در 50 و 100 میکرومولار منجر به افزایش درصد سلولها در فاز S (شکل 3A و C) و 100 میکرومولار آربوتین منجر به کاهش درصد سلولها در فاز G شد. شکل 3D). هیچ تفاوت آماری معنی داری در گروه 10 میکرومولار در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد. اثرات آربوتین بر آپوپتوز MC3T3-E1 نیز با استفاده از فلوسیتومتری ارزیابی شد (شکل 3B و E). میزان آپوپتوز پس از تیمار با آربوتین در غلظتهای 10، 50 و 100 میکرومولار در مقایسه با گروه شاهد تغییر معنیداری نداشت.
اثرات آربوتین بر فعالیت ALP. اثرات آربوتین بر تمایز استئوبلاست ها با رنگ آمیزی ALP مورد بررسی قرار گرفت. پس از 9 روز، تیمار با غلظت های مختلف آربوتین ({1}}، 10، 50 یا 100 میکرومولار) به طور قابل توجهی فعالیت ALP را در مقایسه با گروه کنترل افزایش داد (شکل 4A). یافتههای حاضر نشان داد که آربوتین ممکن است فعالیت ALP را در سلولهای MC3T3-E1 افزایش دهد.
اثرات آربوتین بر سطوح بیان mRNA COL1A1، -catenin، RUNX2، BGLAP و SP7. سطوح بیان mRNA COL1A1، -catenin، RUNX2، BGLAP، و SP7 در سلولهای MC3T3-E1 با استفاده از RT-qPCR پس از درمان با آربوتین در غلظتهای مختلف ({13}}، 10، 50، یا 100 میکرومولار) ارزیابی شد. 3 روز. سطح بیان COL1A1 و -کاتنین در استئوبلاست های تیمار شده با آربوتین 10، 50 و 100 میکرومولار در مقایسه با سلول های تیمار نشده افزایش یافت (شکل 4B و C). سطوح بیان RUNX2، BGLAP، و SP7 پس از درمان با آربوتین در 50 و 100 میکرومولار به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 4D-F).
اثرات آربوتین بر سطوح بیان پروتئین -کاتنین و RUNX2. برای بررسی مکانیسمهای اساسی تمایز استئوبلاستهای ناشی از آربوتین، سطوح بیان پروتئین RUNX2 و -catenin در سلولهای MC3T3-E1 توسط وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت (شکل 5A و B). درمان با آربوتین در 1{18}}0 میکرومولار به طور قابل توجهی سطوح بیان پروتئین -catenin و RUNX2 را در استئوبلاست ها در مقایسه با گروه شاهد افزایش داد (به ترتیب شکل 5C و D). نتایج حاضر نشان داد که آربوتین ممکن است با تنظیم سطوح بیان پروتئین -catenin و RUNX2 بر تمایز استئوبلاست تأثیر بگذارد. برای بررسی اینکه آیا آربوتین تمایز استئوبلاستی را از طریق مسیر سیگنالینگ Wnt/-catenin تحریک میکند، سلولهای MC3T3-E1 با 0.5 میکروگرم بر میلیلیتر DKK1 به مدت 6 ساعت قبل از درمان با 100 میکرومولار آربوتین تحت درمان قرار گرفتند.
DKK1 به طور قابل توجهی بیان پروتئین RUNX2 ناشی از آربوتین را مهار کرد (شکل 5E). نتایج حاضر نشان داد که آربوتین ممکن است بر تمایز استئوبلاست از طریق مسیر سیگنالینگ Wnt/ -catenin تأثیر بگذارد.
بحث
پوکی استخوان ممکن است منجر به شکستگی ها و ناتوانی های جدی شود و نشان دهنده یک مشکل مرتبط با سن در سراسر جهان است (19). شواهد انباشته نشان داد که عدم تعادل بین استئوکلاست ها و استئوبلاست ها در تشکیل و تحلیل استخوان ممکن است منجر به پوکی استخوان شود (20). قابل ذکر است، تشکیل استخوان به تکثیر و تمایز استئوبلاست بستگی دارد (21،22).
چندین داروی موجود که برای درمان پوکی استخوان استفاده می شوند، داروهای ضد جذب هستند (23). با این حال، این درمان ها قادر به معکوس کردن از دست دادن استخوان نیستند (24). عوامل آنابولیک که تشکیل استخوان را تحریک می کنند ممکن است ریزساختار اسکلتی آسیب دیده و از دست دادن توده استخوانی را بازسازی کنند (24). تری پاراتید یکی از عوامل آنابولیک است که نشان داده شده است که استخوان سازی را تحریک می کند، و آزمایشات بالینی نشان داد که درمان با تری پاراتید خطر شکستگی های مهره های جدید و افزایش تراکم استخوان در لگن، ستون فقرات کمری و گردن فمور را کاهش می دهد (25). قابل ذکر است که تری پاراتید یک درمان گران قیمت است. بنابراین، توسعه داروهای جدیدی که می توانند به طور موثری تشکیل استخوان را تقویت کنند، مهم است.
آربوتین یک عامل محافظ سلولی است و در غلظت های بالا اثرات سیتوتوکسیک قابل توجهی از خود نشان نمی دهد (26). اگرچه غلظت خونی آربوتین نامشخص است (13)، آربوتین به عنوان یک داروی ضد میکروبی ادراری استفاده می شود و یک عامل خوراکی بی خطر در نظر گرفته می شود (27،28). مطالعات قبلی نشان داد که آربوتین ممکن است فعالیت های متعددی از خود نشان دهد، از جمله سفید کردن پوست (10،11)، ضد التهابی (29)، ضد سرطانی (30)، و سرکوب تمایز استئوکلاست ها (13). با این حال، مطالعات بیشتری برای بررسی اثرات آربوتین بر استئوبلاست ها و پتانسیل آن برای استفاده به عنوان یک ترکیب جدید برای درمان پوکی استخوان مورد نیاز است. بنابراین، مطالعه حاضر اثرات آربوتین را بر تکثیر و تمایز سلولهای MCET3-E1 و مکانیسمهای زیربنایی عملکرد آربوتین در شرایط آزمایشگاهی بررسی کرد.
تشکیل استخوان با تعداد استئوبلاست ها و فعالیت تک تک استئوبلاست ها مرتبط است (31). تعداد استئوبلاست ها را می توان با ترویج تکثیر یا تمایز قبل از استئوبلاست یا با کاهش مرگ سلولی استئوبلاست های بالغ افزایش داد (32). در مطالعه حاضر، آربوتین تکثیر سلولهای MC3T3-E1 را بدون تأثیر بر سرعت آپوپتوز افزایش داد. علاوه بر این، آربوتین با انتقال سلولها از فاز G به فاز S، پیشرفت چرخه سلولی را افزایش داد. این نتایج نشان داد که آربوتین ممکن است تکثیر استئوبلاستی را القا کند.
ALP یک نشانگر اولیه تمایز استخوانی است (33). ALP با کلسیفیکاسیون اسکلت در طول تشکیل استخوان همراه است (34). در مطالعه حاضر، نتایج رنگآمیزی ALP نشان داد که استئوبلاستهایی که با آربوتین در غلظتهای 10، 50 و 100 میکرومولار و با مکملهای استخوانساز به مدت 9 روز درمان شدهاند، افزایش فعالیت ALP را نشان میدهند، که نشان میدهد که آربوتین ممکن است تمایز اولیه استئوبلاستها را تقویت کند.
ثابت شده است که استخوان زایی توسط فاکتورهای رونویسی مختلف، از جمله RUNX2 و SP7، و چندین پروتئین ماتریکس اختصاصی استخوان، از جمله ALP، تنظیم می شود.BGLAP و COL1A1 (35). RUNX2 و SP7 مهم هستندعوامل رونویسی دخیل در تمایز استئوبلاستدر طول تشکیل استخوان (36). COL1A1 خارج سلولی استپروتئین ماتریکس که باعث ترمیم استخوان و پوکی استخوان می شودتمایز انفجار (37). BGLAP غیر کلاژنی استپروتئین ماتریکس استخوان که گردش استخوان و استخوان را تنظیم می کندکانی سازی (38). مطالعه حاضر آن آربوتین را شناسایی کردممکن است سطح بیان mRNA مهم را القا کندتنظیم کننده های استخوان سازی، از جمله RUNX2، BGLAP، SP7، وCOL1A1. علاوه بر این، سطح بیان از -کاتنین بودافزایش یافت. این نتایج نشان میدهد که آربوتین ممکن است باعث تقویت شودتمایز استئوبلاستیک از طریق مکانیسمی که شاملWnt/ سیگنالینگ کاتنین
مسیر سیگنالینگ Wnt بر تشکیل استخوان در طول رشد و بازسازی استخوان در طول نوسازی بافت تأثیر می گذارد (39). مسیر سیگنالینگ Wnt متعارف بودشناسایی شده است که با سیگنالینگ لیگاند Wnt در سلول آغاز می شودسطح از طریق لیپوپروتئین کم چگالی مربوط به گیرندهپروتئین 5 یا 6 (Lrp5/6) و گذرنده هفت پاسگیرنده فرفری (40). تعامل بین لیگاندهای Wntو گیرنده آنها ممکن است GSK را مهار کند3- در سیتوپلاسم،منجر به آزادی -کاتنین، رسانه رونویسیator سیگنالینگ Wnt متعارف. پس از انتشار، -کاتنینمی تواند وارد هسته شود، بنابراین بیان را کنترل می کندسطوح ژن های هدف آن (41). RUNX2 متعلق به Runt استخانواده ژن دامنه و یک فاکتور رونویسی است که درتمایز استئوبلاستیک (42). RUNX2 در خدمت یک نکته مهم استنقش در هماهنگی مسیرهای سیگنالینگ متعدد در طولتمایز استئوبلاست (43). یک شیطان مطالعه قبلیساختاری که سیگنالینگ Wnt متعارف ممکن است مستقیماً تنظیم کندRUNX2. به طور خاص، - catenin/HNF1 homeobox Aپیچیده ممکن است سطح بیان RUNX2 را فعال کند،بنابراین تشکیل استخوان را تقویت می کند (44). DKK1 قدرتمند استبازدارنده Wnt/ مسیر متعارف کاتنین، با اتصالبه Lrp5/6 (45،46). نتایج مطالعه حاضر پیشنهاد کردکه درمان با آربوتین به طور قابل توجهی پروتئین را افزایش دادسطوح بیان RUNX2 و -کاتنین در MC3T3-E1سلولها و DKK1 به طور قابلتوجهی میزان پروتئین را کاهش دادسطح sion RUNX2. نتایج حاضر نشان می دهد کهآربوتین ممکن است تمایز سلولی MC3T3-E1 را از طریق Wnt/ متعارف ترویج کند.-مسیر کاتنین
در مجموع، با بهترین دانش نویسندگان، مطالعه حاضر اولین مطالعه ای است که نشان می دهد آربوتین ممکن است تکثیر و تمایز سلول های MC3T3-E1 را از طریق مسیر سیگنالینگ Wnt/ -catenin تحریک کند. بنابراین، آربوتین ممکن است یک کاندید بالقوه جدید برای درمان پوکی استخوان باشد. با این حال، مطالعات بیشتری برای شناسایی نقش خاص مسیر سیگنالینگ Wnt/-catenin در استخوان سازی ناشی از آربوتین، از جمله فسفوریلاسیون -catenin در Ser675 مورد نیاز است (47). اطلاعات بیشتر در مورد نقش سیگنال دهی Wnt/ -catenin را می توان با استفاده از آگونیست های Wnt به دست آورد. در آینده، مطالعات بیشتر ممکن است توانایی آربوتین را برای تقویت تشکیل استخوان در داخل بدن بررسی کند.
قدردانی
قابل اجرا نیست.
منابع مالی
کار حاضر توسط برنامه اصلی بنیاد ملی علوم طبیعت چین (با شماره کمک مالی 81370981) و صندوق علمی برجسته بیمارستان Shengjing پشتیبانی شد.
در دسترس بودن داده ها و مواد
مجموعه دادههای مورد استفاده و/یا تجزیهوتحلیلشده در طول مطالعه جاری در صورت درخواست معقول از نویسنده مربوطه در دسترس است.
مشارکت نویسندگان
QF، XM، و LiY این آزمایش ها را تصور و طراحی کردند. XM آزمایش ها را انجام داد و دستنوشته را نوشت. SL، LiY، LeY، و ML داده ها را تجزیه و تحلیل کردند و نسخه خطی را به طور انتقادی بازبینی کردند. QF بر تمام تحقیقات نظارت کرد و نسخه خطی را اصلاح کرد. همه نویسندگان نسخه نهایی را خوانده و تایید کردند.
تایید اخلاق و رضایت برای شرکت
قابل اجرا نیست.
رضایت بیمار برای انتشار
قابل اجرا نیست.
منافع رقابتی
نویسندگان اعلام می کنند که هیچ منافع رقابتی ندارند.
منابع
1. Das S و Crockett JC: پوکی استخوان - دیدگاه فعلی از پیشگیری و درمان دارویی. Drug Des Devel Ther 7435-448.2013.
2. Rachner TD، Khosla S و Hofbauer LC: Osteoporosis: Now and the future. Lancet 377: 1276-1287. 2011.
3. Hernlund E، Svedbom A، Ivergard M، Compston J، Cooper CStenmark JMcCloskey EVJOnsson B andKanis JA: پوکی استخوان در اتحادیه اروپا: مدیریت پزشکی، اپیدمیولوژی و بار اقتصادی. گزارشی که با همکاری بنیاد بین المللی پوکی استخوان (IOF) و فدراسیون اتحادیه های صنعت داروسازی اروپا (EFPIA) تهیه شده است. Arch Osteoporos 8: 136.2013.
4. Cauley JA: تأثیر پوکی استخوان بر سلامت عمومی. J Gerontol ABiol Sci Med Sci 68: 1243-1251.2013.
5. Manolagas SC و Jilka RL: مغز استخوان، سیتوکین ها و بازسازی استخوان. بینش های نوظهور در مورد پاتوفیزیولوژی پوکی استخوان N Engl J Med 332: 305-311. 1995.
6. بارون R و Hesse E: به روز رسانی در مورد آنابولیک های استخوان در درمان پوکی استخوان: منطق، وضعیت فعلی، و دیدگاه ها. J ClinEndocrinol Metab 97: 311-325.2012.
7.TangDZ، Hou WZhou Q، ZhangM، HolzJ، SheuTJ، LiTF ChengSDShi O. Harris SE.et al: Osthole تمایز استئوبلاست و تشکیل استخوان را با فعال سازی سیگنالینگ بتا-کاتنین-BMP تحریک می کند Bone Miner Res 25: {{4} . 2010.
8. Canalis E: به روز رسانی در درمان های آنابولیک جدید برای پوکی استخوان. J Clin Endocrinol Metab 95: 1496-1504.2010.
9. Lamien-Meda A, Lukas B, Schmiderer C, Franz C, and Novak J: Validation of a quantitative assay of arbutin using gas chromatography in Origanum majorana and Arctostaphylos uva-ursiextracts.Phytochem Anal 20: {092}. .
10.Lim YJ، Lee EH، Kang TH، Ha SK، Oh MS، Kim SM، Yoon TJ.Kang C، Park JH و Kim SY: اثرات مهاری آربوتین بر بیوسنتز ملانین هیپرپیگمانتاسیون ناشی از هورمون تحریک کننده آلفا ملانوسیت در بافت های پوست خوکچه هندی قهوه ای مایل به قهوه ای کشت شده. Arch Pharm Res 32: 367-373.2009.
11. Maeda K و Fukuda M: Arbutin: مکانیسم اثر رنگدانه آن در کشت ملانوسیت انسانی. J Pharmacol ExpTher 276: 765-769.1996.
12. Wu LH Li P Zhao OL. Piao JL Jiao YF Kadowaki M and Kondo T: Arbutin. یک جاذب رادیکال هیدروکسیل درون سلولی از آپوپتوز ناشی از تشعشع در سلول های لنفوم U937 انسانی محافظت می کند. آپوپتوز 19: 1654-1663.2014
13. Omori A Yoshimura Y. Deyama Y and Suzuki K: Rosmarinicacid و arbutin تمایز استئوکلاست ها را با مهار کاهش تنظیم سوپراکسید و NFATel در سلول های RAW 264.7 سرکوب می کنند Biomed Rep 3: 483-490.2015
14. بارون R و Kneissel M: سیگنال دهی WNT در هموستاز استخوان و بیماری: از جهش های انسانی تا درمان. Nat Med l9.179-197.2013
15. Baron R and Rawadi G: Targeting the Wnt/beta-catenin pathway to regulate bone formation in the adult skeleton.Endocrinology 148: 2635-2643.2007.
16. Hoeppner LH Secreto FJ و Westendorf JJ: سیگنال دهی Wnt به عنوان یک هدف درمانی برای بیماری های استخوانی. Expert Opin TherTargets 13: 485-496.2009.
17. Williams BO و Insogna KL: Wnts کجا رفت: میدان انفجاری Lrp5 و Lrp6 که در استخوان سیگنال میدهند. J Bone Miner Res 24:171-178.2009
18. Livak KJ و Schmittgen TD: تجزیه و تحلیل داده های بیان ژن نسبی با استفاده از PCR کمی زمان واقعی و روش 2(-DeltaDeltaC(T) Methods 25:402-408.2001.
19.Lin X. Xiong D. Peng YO. شنگ ز اف. Wu XY Wu XP Wu FYuan LO و Liao EY: اپیدمیولوژی و مدیریت استئو. Poros در جمهوری خلق چین: دیدگاه های فعلی. Clin Interv Aging 10: 1017-1033.2015.
20. Manolagas SC: تولد و مرگ سلول های استخوانی: مکانیسم های تنظیمی و پیامدهای اساسی برای پاتوژنز و درمان پوکی استخوان. Endocr Rev 21: 115-137.2000.
21. Liu S. Fang T. Yang L. Chen Z. Mu S and Fu O: Gastrodin از MC3T محافظت میکند{2}}El استئوبلاستها را در برابر اختلال عملکرد سلولی ناشی از دگزامتازون و تقویت تشکیل استخوان از طریق القای مسیر سیگنالینگ NRF2. Int J Mol Med 41: 2059-2069.2018.
22. یون اچ ام پارک KR. کوانگ TH اوه اچ هونگ JT. Kim YC و Kim EC: 2.4.5-Trimethox yldalbergiquinol تمایز و کانیسازی استئوبلاستیک را از طریق مسیر BMP و Wnt/B-catenin ترویج میکند. Cell Death Dis 6: el819. 2015.
23. Cosman F Nieves JW and Dempster DW: Treatment sequence1718.22.matters: درمان آنابولیک و ضد جذب برای پوکی استخوان Bone Miner Res 32: 198-202.2017
24.Uihlein AV and Leder BZ: Anabolic therapies for osteoporosis.Endocrinol Metab Clin North Am 41: 507-525.2012
25. Nakamura T Sugimoto T. Nakano T. Kishimoto H. Ito MFukunaga MHaginoH Sone T. Yoshikawa Nishizawa Y.eral تری پاراتید تصادفی شده (هورمون پاراتیروئید انسانی (PTH{1}} یک بار در هفته تحقیق اثربخشی (TOWER) کاهش کارآزمایی برای نمونه شکستگی های جدید مهره در افراد مبتلا به پوکی استخوان اولیه و خطر شکستگی بالا. J Clin Endocrinoetab 97: 3097-3106.2012
26. Jurica K BrCic Karabonji l، Mikolic A، Milcjkowic-Opsenica DBenkovic V و Kopjar N: ارزیابی ایمنی در شرایط آزمایشگاهی عصاره برگ آب درخت توت فرنگی (Arbrrfus redo L) و لنفوسیت های خون محیطی انسان آربوتین. Cytotechnology 70: 1261-1278.2018
27. Schindler G. Patzak U Brinkhaus B. won Niecieck A. Wittig JKrihmer N Glockl land Veit M: Urinary excretion and Metabo. فهرست آربوتین پس از تجویز خوراکی عصاره Arctosfaphylos reversi به عنوان قرص های پوشش داده شده با فیلم و محلول آبی در انسان سالم. J Clin Pharmacol 42: 920-927.2002.
28. Genowese C Davinelli S. Mangano K, Tempera G, Nicolosi D.Corsello S.Vergalito F Tartaglia E. Scapagnini G andDi Marco R: اثرات ترکیب جدیدی از عصاره های گیاهی به اضافه d-مانوز برای مدیریت دستگاه ادراری عود کننده بدون عارضه عفونت ها J Chemother 30: 107-114. 2018
29. Lee HJ و Kim KW: اثرات ضد التهابی آربوتین در سلول های میکروگلیال BV2 تحریک شده با لیپوپلی ساکارید. InfiammRes 61: 817-825.2012.
30. Jiang L. Wang D Zhang Y. Li J. Wu Z. Wang Z و Wang Dبررسی اثرات پیش آپوپتوتیک آربوتین و مشتقات استیله آن بر سلول های ملانوما موش. Int J Mol Med 41:1048-1054.2018
31. Marie PJ و Kassem M: Osteoblasts در پوکی استخوان: Pastemerging و اهداف آنابولیک آینده. Eur J Endocrinol 165:1-10.2017
32. Canalis E: مدیریت بیماری غدد درون ریز: درمان های آنابولیک جدید برای پوکی استخوان. Eur J Endocrinol 178: R33-R44. 2018
33. Weinreb M Shinar D و Rodan GA: الگوهای مختلف بیان آلکالین فسفاتاز، استئوپونتین و استئوکلسین در رشد استخوان موش صحرایی که با هیبریداسیون درجا تجسم شده است. J BoneMiner Res 5: 831-842.1990.
34. کیم وای جی. Lee MH Wozney JM Cho JY و Ryoo HM: بیان آلکالین فسفاتاز ناشی از پروتئین مورفوژنتیک استخوان-2- توسط Dlxs تحریک و توسط Msx2 سرکوب میشود. J BioChemm 279: 50773-50780.2004
35. An JYang H Zhang O. Liu C. Zhao J. Zhang L and Chen BNatural products for the treatment of osteoporosis: The Effects and Mechanisms on promoting Bone formation life-mediated osteoblast life Sci 147: 46-58.2016
36. Kobavashi T and K ronenbere H: Minireview: Transcriptionalregulation in development of bone.Endocrinoloey 146: 1012-1017.2005.
37. Cathev و Reddy ABaltordal.oiczThrombospondin-2 مونتاژ یک ماتریکس غنی از کلاژن نوع-I را در سلولهای استرومایی مغز که تحت ایستگاههای مختلف استئوبلاستیک قرار دارند، تسهیل میکنند. Connect Tissue Res 54: 275-782.2013
38. Neve A. Corrado A and Cantatore FP: Osteocalcin: Skeletal and extra-Skeletal effect J Cell Physiol 228: 1149-1153.2013
39. Wang Y.Li YP Paulson C، Shao Jz، Zhang X Wu M، و Chen مسیر سیگنالینگ Wnt را در توسعه استخوان و بیماری دنبال کردند. Front Biosci (Landmark Ed) 19: 379-407.2014
40. مک دونالد بی تی. Tamai K و He X: اجزای سیگنالینگ Wnt/بتا-کاتنین. مکانیسم ها و بیماری ها Dev Cel1 17: 9-26. 2009
41. Kramer l.Halleux C، Keller H، Pegurri M، Gooi JHWeber PB. فنگ جو. Bonewald LF و Kneissel M: سیگنالینگ OsteocytWnt/بتا-کاتنین برای هموستاز طبیعی استخوان مورد نیاز است. Mo Cel1 Biol 30: 3071-3085.2010
42. Ducy P Schinke T و Karsenty G: استئوبلاست: یک فیبروبلاست پیچیده تحت نظارت مرکزی. علم 289:1501-1504.2000
43. Franceschi RI و Xiao G: تنظیم فاکتور رونویسی اختصاصی استئوبلاست. RUNX2: پاسخگویی به چندین مسیر انتقال سیگنال. J Cell Biochem 88: 446-454.2003
44. Gaur T، Lengner Cl، Howhannisyan H، Bhat RA، Bodine PVKomm BS. جاوید آ. ون وینن ای جی. استین جی ال. Stein GS Lian JB: سیگنال دهی متعارف WNT باعث تقویت استخوان سازی می شود که مستقیماً بیان ژن Runx2 را تحریک می کند. J Biol Chem 280:33132-33140.2005
45. Kawano Y و Kypta R: آنتاگونیست های ترشح شده مسیر سیگنالینگ Wnt. J Cel1 Sci 116: 2627-2634.2003
46. Daoussis D و Andonopoulos AP: نقش نوظهور otDickkopf-l در زیست شناسی استخوان: آیا این کلید اصلی برای بازسازی استخوان و مفصل است؟ Semin Arthritis Rheum 41: 170-177.2011
47. Taurin S.Sandbo N. Qin Y. Browning D و Dulin NO: فسفوریلاسیون بتا کاتنین توسط پروتئین کیناز حلقوی وابسته به AMP. J Biol Chem 281: 9971-9976.2006
برای اطلاعات بیشتر: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
