اسید آریستولوکیک باعث ایجاد فیبروز کلیه و پیری در موش می شود

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصه:کلیه یکی از حساس ترین اندام ها در برابر آسیب های مرتبط با افزایش سن است. به طور کلی، پیری کلیه با فیبروز کلیه همراه است که آخرین مسیر مشترک مزمن استبیماری های کلیوی. اسید آریستولوکیک (AA)، یک عامل نفروتوکسیک، باعث نفروپاتی AA (AAN) می شود که با فیبروز پیشرونده کلیه و کاهش عملکرد مشخص می شود. اگرچه فیبروز کلیه با پیری کلیه مرتبط است، اما اینکه آیا AA باعث پیری کلیه می شود نامشخص است. هدف از مطالعه حاضر بررسی استفاده بالقوه از AAN به عنوان یک مدل پیری کلیه است. در اینجا، ما عوامل مرتبط با پیری را در مدل‌های AAN با تجویز مزمن AA به موش‌های C57BL/6 بررسی کردیم. در مقایسه با گروه کنترل، گروه AA پیری را نشان دادکلیهفنوتیپ هایی مانند آتروفی کلیه، کاهش عملکرد کلیه و فیبروز توبولو بینابینی. علاوه بر این، AA پیری سلولی را به طور خاص درکلیه هاو افزایش بیان mRNA p16 کلیوی و فعالیت گالاکتوزیداز مرتبط با پیری. علاوه بر این، موش‌های تحت درمان با AA ناهنجاری‌های میتوکندری لوله‌ای پروگزیمال و همچنین تجمع گونه‌های اکسیژن فعال را نشان دادند. کلوتو، یک ژن ضد پیری، نیز به طور قابل توجهی کاهش یافتکلیه هاموش های تحت درمان با AA در مجموع، نتایج مطالعه حاضر نشان می‌دهد که AA عوامل مرتبط با پیری را تغییر می‌دهد و فیبروز کلیه ارتباط نزدیکی با پیری کلیه دارد.

کلید واژه ها:بیماری مزمن کلیوی؛ فیبروز کلیه؛ اسید آریستولوکیک؛ سالخورده؛ پیری سلولی

سیستانچ بیماری کلیوی/کلیوی را بهبود می بخشد

مقدمهبا افزایش مداوم طول عمر در انسان، افراد بیشتری از آسیب های مرتبط با افزایش سن رنج می برند.کلیه هامعمولاً تحت تأثیر آسیب بافتی مرتبط با سن و بروز مزمن هستندبیماری کلیویبا افزایش سن [1] افزایش می یابد. پیری کلیوی پیری کلی را تسریع می‌کند که در نتیجه طول عمر کوتاه‌تر می‌شود. بنابراین، تحقیقات در مورد پیری کلیه ضروری است، اگرچه مدل های حیوانی مناسب به طور کامل توسعه نیافته اند. پیری کلیه با تغییرات پاتولوژیک مختلفی از جمله آتروفی کلیه، گلومرولواسکلروز و فیبروز توبولو بینابینی همراه است [2]. فیبروز توبولوینترستیشیال کلیه آخرین مسیر مشترک در اکثر اشکال بیماری پیشرونده کلیه است که نشان می‌دهد فیبروز کلیه ارتباط نزدیکی با افراد مسن دارد.کلیه. در تحقیقات پیری، موش ها به دلیل نزدیکی ژنتیکی با انسان، توانایی دستکاری ژنتیکی ژنوم و این واقعیت که فنوتیپ های مرتبط با پیری مشابهی را در طول عمر خود به انسان ارائه می دهند، ابزار قابل اعتمادی هستند [3]. مشاهدات طولی با استفاده از موش های همخون به عنوان مدلی برای پیری ایده آل است، اگرچه پیگیری موش ها برای طول عمر کامل آنها زمان بر است. علاوه بر این، چندین مدل موش اصلاح شده ژنتیکی برای پیری وجود دارد. موش کمبود Klotho مدلی از پیری زودرس است که در تحقیقات پیری استفاده می شود. با این حال، در این مدل، عملکرد کلیه تحت تأثیر قرار نمی گیرد و چندین اندام به جز کلیه ها دچار اختلال می شوند [4]. بنابراین، این مدل موش ممکن است برای تحقیق در مورد پیری کلیه نامناسب باشد.تجویز آریستولوکیک اسید (AA) باعث ایجاد نوع خاصی از آسیب کلیوی به نام نفروپاتی AA (AAN) می شود که با فیبروز بینابینی گسترده مشخص می شود [5،6]. AA برای اپیتلیوم لوله‌ای کلیه سمی است زیرا باعث تشکیل ترکیب‌های اضافی DNA در بافت‌های کلیوی می‌شود [7]. بعید است که AA بر اندام های دیگری غیر از سیستم ادراری تأثیر بگذارد و ممکن است برای ارزیابی مفید باشدکلیه-تغییرات خاص بنابراین، AA معمولاً برای ایجاد مدل های فیفیبروز کلیه در موش استفاده می شود [8،9]. با این حال، مشخص نیست که آیا تغییرات ناشی از AA با پیری در بدن مرتبط است یا خیرکلیه ها. در این مطالعه، ما فنوتیپ‌های مرتبط با سن و عوامل مولکولی را در AAN در موش‌ها بررسی کردیم

نتایج 2.1. تجویز AA باعث کاهش قابل توجه وزن، آتروفی کلیه و کاهش عملکرد کلیه شد.وزن پایه بدن (BW) و فشار خون سیستولیک (BP) بین گروه کنترل وسیله نقلیه و AA یکسان بود. وزن بدن در گروه کنترل وسیله نقلیه به طور مداوم طی 8 هفته افزایش یافت. با این حال، افزایش وزن با تجویز AA مهار شد و گروه AA در 4 و 8 هفته پس از شروع تجویز AA به طور قابل توجهی وزن بدن کمتری داشت (شکل 1A). تفاوت معنی داری در BP سیستولیک یا ضربان قلب بین گروه کنترل وسیله نقلیه و گروه AA وجود نداشت (شکل 1B,C). نسبت وزن قلب به وزن بدن در 8 هفته پس از شروع تجویز AA تفاوتی را بین گروه ها نشان نداد (شکل 1D)، در حالی کهکلیهنسبت وزن به وزن بدن در گروه AA در 8 هفته پس از شروع تجویز AA به طور قابل توجهی کمتر بود (شکل 1E). ما در مرحله بعد عملکرد کلیه را در گروه کنترل وسیله نقلیه و AA بررسی کردیم. غلظت کراتینین پلاسما و نیتروژن اوره (UN) در گروه AA به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل وسیله نقلیه در 8 هفته پس از شروع تجویز AA بود. علاوه بر این، درمان AA به طور قابل توجهی باعث کاهش کلیرانس کراتینین در مقایسه با گروه کنترل وسیله نقلیه در 8 هفته پس از شروع تجویز AA شد (شکل 1F-H).

2.2. فیبروز توبولو بینابینی آشکار ناشی از تجویز AA و افزایش قابل توجه بیان ژن مرتبط با فیبروز در کلیه هابررسی بافت شناسی با استفاده از رنگ آمیزی پریودیک اسید-شیف (PAS) نشان داد که ناحیه گلومرولی در گروه AA در مقایسه با گروه کنترل وسیله نقلیه به طور قابل توجهی کاهش یافته است (شکل 2A). فیبروز توبولو بینابینی گسترده، که با استفاده از رنگ‌آمیزی ماسون تری کروم (MT) ارزیابی شد، در گروه AA (شکل 2B) و همچنین با افزایش سطح mRNA ژن‌های مرتبط با فیبروز کلیه، کلاژن I و III و فاکتور رشد مشاهده شد. TGF)- (شکل 2C-E).

2.3. تجویز AA پیری سلولی، اختلال عملکرد میتوکندری و تجمع گونه‌های واکنش اکسیژن/ژن (ROS) در کلیه‌ها را تسریع کرد.برای ارزیابی پیری سلولی، ما بیان mRNA کلیوی p53، p21، p16 و گلوتامیناز (GLS) را بررسی کردیم، گروه AA سطوح mRNA به طور قابل توجهی بالاتری از این ژن‌های مرتبط با پیری را نشان داد.کلیه ها(شکل 3A-D). علاوه بر این، شدت رنگ‌آمیزی گالاکتوزیداز (SA{4}}gal) مرتبط با پیری درکلیه هادر گروه AA افزایش یافت و در گروه کنترل وسیله نقلیه تقریباً وجود نداشت (شکل 3E). در گروه AA، میکروسکوپ الکترونی ناپدید شدن کریستای میتوکندری، تکه تکه شدن میتوکندری، واکوئل شدن سیتوپلاسمی و اتولیزوزوم ها در سلول های لوله پروگزیمال را نشان داد. کاهش BCL2/آدنوویروس E1B 19-kDa پروتئین برهمکنش 3 (Bnip3)، یک ژن مرتبط با میتوکندری (شکل 3FG). بیان mRNA کلیوی Nox2. یکی از اجزای نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید فسفات اکسیداز (NADPH) در گروه AA در مقایسه با گروه کنترل وسیله نقلیه به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 3H). علاوه بر این، تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داد که سطح اسمی {{10}هیدروکسی{11}کلیه (4-HNE) به طور قابل توجهی در گروه AA افزایش یافته است (شکل 3I). این نتایج نشان داد که تجویز AA باعث پیری سلولی، اختلال عملکرد میتوکندری و تجمع ROS درکلیه ها.

2.4. AA کاهش بیان پروتئین کلوتو کلیویما بیان کلیوی پروتئین های ضد پیری را در گروه کنترل وسیله نقلیه و AA بررسی کردیم. بیان کلوتو در گروه AA در مقایسه با گروه کنترل وسیله نقلیه به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 4A)، در حالی که بیان کلیوی نیکوتین آمید فسفریبوزیل ترانسفراز (NAMPT) و sirtuin1 (SIRT1) بین گروه ها مشابه بود (شکل 4B,C).

3. بحثطبق دانش ما، مطالعه حاضر اولین مطالعه‌ای است که بر ارزیابی تغییرات مرتبط با پیری کلیوی در AAN با استفاده از نشانگرهای پیری، مانند فعالیت p16 و SA{2}} تمرکز دارد. درمان AA باعث آتروفی کلیه، فیبروز توبولو بینابینی و کاهش عملکرد کلیه شد که با تنظیم مثبت mRNA p16 کلیه و رنگ آمیزی SA{4}gal مثبت همراه بود. علاوه بر این، گروه AA ویژگی‌های مکانیسم‌های مرتبط با پیری کلیوی مانند ناهنجاری‌های میتوکندری، افزایش استرس اکسیداتیو، و کاهش ژن ضد پیری، Klotho را نشان دادند. روی هم رفته، مشاهدات ما نشان می دهد که تجویز مزمن AA تا حدی پیری کلیه را تقلید می کند.

پیری سلولی توقف دائمی تکثیر سلولی در پاسخ به عوامل استرس‌زای مختلف مانند آسیب DNA است و به پیری و بیماری‌های مرتبط با پیری کمک می‌کند. بیان p16، یک مهارکننده کیناز وابسته به سیکلین، با افزایش سن در اندام های مختلف از جمله کلیه ها مرتبط است. محدودیت کالری با مهار بیان pl6 طول عمر را افزایش می دهد [1{15}}]. علاوه بر این، حذف سلول‌های پیر بیان‌کننده p{5} در موش‌های INK-ATTAC از طریق تزریق AP20187، یک دیمرکننده پروتئین اتصال‌دهنده FK [11]، باعث تضعیف فنوتیپ‌های پیری کلیه، مانند اسکلروز گلومرولی و کلیه می‌شود. افت عملکردی بنابراین، p16 یکی از مهمترین عوامل مرتبط با پیری است. سلول‌های پیر را می‌توان با استفاده از رنگ‌آمیزی SA{12}gal شناسایی کرد، که افزایش فعالیت گالاکتوزیداز را در pH 6.0 نشان می‌دهد [12]، و یک نشانگر زیستی پرکاربرد سلول‌های پیر و پیر است. بیان mRNA کلیوی pl16 در موش های مسن افزایش می یابدکلیه هاو با افزایش فعالیت SA{0}}گال در اپیتلیوم کلیه همراه است [13I. در مطالعه حاضر، افزایش بیان mRNA p16 کلیه و رنگ آمیزی SA{3}}گال را نشان دادیم که نشان می دهد AA باعث پیری کلیه می شود. اخیرا گزارش شده است که GLS برای بقای سلول های پیر از طریق افزایش گلوتامینولیز و خنثی سازی pH داخل سلولی ضروری است [14]. نشان داده شد که مهار گلوتامینولیز وابسته به GLS در موش‌های مسن سلول‌های پیر را از بین می‌برد و اختلال عملکرد اندام مرتبط با سن را بهبود می‌بخشد. در مطالعه حاضر، تنظیم مثبت mRNA GLS کلیه نشان دهنده تجمع کلیوی سلول های پیر در گروه است. بنابراین، تجویز مزمن AA باعث پیری سلولی در کلیه ها می شود.

CISTANCHE عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

علاوه بر پیری سلولی، اختلال عملکرد میتوکندری یک مکانیسم اساسی در زمینه آسیب بافتی مرتبط با افزایش سن است و با تجمع ROS همراه است [15،16. اختلال عملکرد میتوکندری باعث پیری سلولی و حفظ آن می شود [17] در حالی که پیری سلولی به طور مستقیم به اختلال عملکرد میتوکندری کمک می کند [18]. Bnip3 که عمدتاً در غشای خارجی میتوکندری قرار دارد، ممکن است در تنظیم میتوفاژی در سلول‌های توبولار پروگزیمال کلیه در پاسخ به استرس اکسیداتیو و هیپوکسی نقش داشته باشد. در موش‌های مسن، محدودیت کالری، اتوفاژی را در سلول‌های لوله‌ای افزایش می‌دهد، از طریق تنظیم مثبت Bnip3، و انحطاط ناشی از سن عملکرد کلیه را بهبود می‌بخشد [19]. در مطالعه حاضر، میکروسکوپ الکترونی ویژگی‌های ناهنجاری‌های میتوکندری را نشان داد که ممکن است با کاهش بیان Bnip3 کلیوی یا پیری سلولی تحت‌تاثیر قرار گیرند. میتوکندری ها منبع اصلی درون سلولی ROS هستند. برای ارزیابی اثرات ناهنجاری‌های میتوکندری روی ROS کلیه، تجمع کلیوی 4-HINE را بررسی کردیم و تجمع ROS ناشی از AA را درکلیه ها.اکسیدازهای NADPH منبع اصلی ROS هستند. در طول فاز حاد AAN در موش، بیان mRNA کلیوی Nox2 افزایش یافت و در دسترس بودن اکسید نیتریک کاهش یافت که منجر به هیپوکسی و ایسکمی پایدار شد [20. در موش های مسنکلیه ها، تجمع ROS با افزایش بیان Nox2 همراه است [21]. این یافته‌ها نشان می‌دهد که AA ممکن است فنوتیپ‌های مرتبط با سن را از طریق تجمع ROS ناشی از اختلال عملکرد میتوکندری و تنظیم مثبت NADPH اکسیدازها، القا کند.

بیان ژن کلوتو کلیه در گروه AA کاهش یافت، در حالی که بیان NAMPT و SIRTl بین گروه ها مشابه بود. کلوتو یک ژن ضد پیری است که یک پروتئین غشایی تک گذری را کد می کند که به عنوان یک سرکوب کننده پیری عمل می کند. روند پیری در موش‌های دارای کمبود کلوتو شبیه به آن در انسان بود، از جمله طول عمر کوتاه‌تر، ناباروری، تصلب شرایین، آتروفی پوست، پوکی استخوان و آمفیزم [22]. موشهای جهش یافته هیپومورفیک کلوتو نیز فنوتیپ پیری تسریع شده را نشان دادند که با فرسایش p16 بازسازی شد [23]. از آنجایی که کلوتو یک عامل مهم در پیری است، موش های اصلاح شده با ژن Klotho به طور گسترده ای در تحقیقات در مورد پیری مورد استفاده قرار گرفته اند. با این حال، موش‌های اصلاح‌شده با ژن Klotho ممکن است برای تحقیق در مورد پیری کلیوی به دلیل اختلالات سیستمیک مرتبط با پیری در این موش‌ها و این واقعیت که عملکرد کلیوی تایید نشده است (یعنی سطح کراتینین) نامناسب باشد. در مقابل، مدل موش AAN ممکن است به عنوان یک مدل ناشی از دارو برای پیری کلیه برای اهداف تحقیقاتی مورد استفاده قرار گیرد، زیرا دارای چندین مزیت، مانند سهولت نسبی اجرا و توانایی تخمین اثرات مداخلات بر کاهش عملکرد کلیه است. .

مطالعه حاضر دارای محدودیت هایی بود. ما پیری کلیه را مورد ارزیابی قرار دادیم و عمدتاً روی پیری سلولی، مورفولوژی میتوکندری و بیان ژن مرتبط با پیری تمرکز کردیم. با این حال، مکانیسم‌های پیری پیچیده هستند و هنوز درک نشده‌اند. علاوه بر این، اگرچه بیان ژن Klotho در پاسخ به AA کاهش یافت، ما نتوانستیم یک رابطه علی با تغییرات پاتولوژیک در AAN نشان دهیم. مطالعات بیشتری برای تعیین نقش مولکول های مختلف درگیر در توسعه AAN مورد نیاز است. با این وجود، مطالعه حاضر بینش جدیدی در مورد استفاده از آوان به عنوان مدل پیری کلیه ارائه می دهد. توجه به این نکته ضروری است که تغییرات فنوتیپی درکلیهبه شدت با طول عمر مرتبط هستند. اگر چهکلیهبه راحتی تحت تأثیر تغییرات مرتبط با افزایش سن قرار می گیرد، مهار پیری کلیه می تواند طول عمر کلی را افزایش دهد. بنابراین، تحقیقات بیشتر در مورد پیری کلیه با استفاده از مدل‌های AAN ممکن است منجر به افزایش طول عمر در آینده شود.

4. مواد و روش ها4.1. حیواناتاین مطالعه مطابق با دستورالعمل مؤسسه ملی بهداشت برای استفاده از حیوانات آزمایشی انجام شد. همه آزمایش‌های حیوانی توسط کمیته مطالعات حیوانی دانشگاه یوکوهاما سیتی (شماره تأیید: FA20-027) تأیید شد و مطابق با دستورالعمل‌های ARRIVE انجام شد. تلاش ها برای به حداقل رساندن تعداد حیوانات مورد استفاده و رنج آنها انجام شد. موش ها در یک محیط کنترل شده تحت یک چرخه 12- ساعت نور/{12- ساعت تاریکی در دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. موش ها به غذا و آب دسترسی آزاد داشتند.

سیستانچ عفونت کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

موش‌های نر هشت هفته‌ای C57BL/6 از آزمایشگاه‌های رودخانه چارلز (ویلمینگتون، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند و پس از 1 هفته سازگاری به گروه کنترل وسیله نقلیه یا AA اختصاص داده شدند، موش‌ها به صورت داخل صفاقی با وسیله نقلیه یا AA (سیگما) تجویز شدند. -Aldrich، St.Louis، MO، USA)، که در مقدار کمی دی متیل سولفوکسید حل شد. قبل از مطالعه حاضر، ما یک مطالعه مقدماتی را با استفاده از چندین پروتکل انجام دادیم. اولین پروتکل شامل تجویز AA (3 میلی گرم بر کیلوگرم) به موش های C57BL/6 به صورت داخل صفاقی دو بار در هفته به مدت 4 هفته بدون زمان بازسازی بود. در این پروتکل، AA باعث ضایعات کلیوی حاد آشکار، مانند لوله های پروگزیمال گشاد شده با از دست دادن مرز برس (شکل تکمیلی S1) می شود. در پروتکل دوم، موش‌های C57BL/6 با AA (2.5 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌صورت داخل صفاقی یک‌بار در هفته به‌مدت 4 هفته و پس از آن زمان بازسازی به‌مدت 4 هفته تجویز شدند. کراتینین پلاسما در این موش‌ها 0.19 ± {{20}} بود. میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM)، p=0.86، آزمون t-paired Student، n=4 در هر گروه) و UN پلاسما برابر با 5.95 ± 31.3 میلی‌گرم در دسی‌لیتر بود. 30.4 ± 3.87 میلی‌گرم در دسی‌لیتر (به‌ترتیب کنترل وسیله نقلیه در مقابل AA؛ میانگین ± SEM، p=0.90، آزمون t دانشجوی جفت نشده، n=4 در هر گروه). بنابراین، ما تشخیص دادیم که این پروتکل برای مدل آسیب کلیوی مناسب نیست زیرا AA باعث کاهش قابل توجه عملکرد کلیه نمی شود. در پروتکل سوم، موش‌های C57BL/6 با AA (3 میلی‌گرم/کیلوگرم) به‌صورت داخل صفاقی دو بار در هفته به‌مدت 10 هفته بدون زمان بازسازی تجویز شدند. در این موش‌ها، میزان مرگ و میر در گروه AA 83 درصد (n=6) بود، در حالی که هیچ یک از موش‌های گروه کنترل وسیله نقلیه نمردند (n=4). در این پروتکل، به دلیل مرگ و میر بالا، نمی‌توانیم فنوتیپ کلیه ناشی از AA را از نظر آماری ارزیابی کنیم. در پروتکل چهارم، موش‌های C57BL/6 با AA (3 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌صورت داخل صفاقی دو بار در هفته به‌مدت 4 هفته و پس از آن زمان بازسازی به‌مدت 4 هفته تجویز شدند. ضایعات مزمن کلیوی، مانند فیبروز توبولو بینابینی، و کاهش عملکرد کلیه در این موش ها مشاهده شد [9]. بنابراین، بر اساس نتایج این بررسی‌های اولیه، پروتکل چهارم را برای انجام آزمایش‌ها در مطالعه حاضر اتخاذ کردیم.

4.2. اندازه گیری BPفشار خون سیستولیک و ضربان قلب با استفاده از روش دم کاف توصیف شده قبلی (BP-Monitor MK-2000؛ Muromachi Kikai Co.، توکیو، ژاپن) اندازه گیری شد[24،25]. همه اندازه‌گیری‌ها بین 9:00 و 14:00 انجام شد. حداقل 10 اندازه گیری در هر موش انجام شد و مقدار میانگین برای تجزیه و تحلیل استفاده شد.

4.3. آنالیز PCR با رونویسی معکوس کمی در زمان واقعی RNA کل از بافت کلیه با استفاده از ISOGEN (ژن نیپون، توکیو، ژاپن) استخراج شد و DNA مکمل (cDNA) با استفاده از سیستم SuperScript IⅢFirst-Strand (Invitrogen, Waltham, MA, USA) سنتز شد. تجزیه و تحلیل PCR با رونویسی معکوس کمی با استفاده از سیستم تشخیص PCR Real-Time CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) انجام شد و محصولات رونویسی معکوس با TaqMan PCR Master Mix و TaqMan سفارشی انکوبه شدند. کاوشگر (Applied Biosystems، Waltham، MA، USA)، همانطور که قبلاً توضیح داده شد [26]. پروب های TaqMan علیه ژن های زیر مورد استفاده قرار گرفت: کلاژن I(Mm00801666_g1)، کلاژن II (Mm01254476_m1)، TGF- (Mm01178819 m1)، p53 (Mm00441964 g1)، p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449m1)GLS (Mm01257297_m1)، Bnip3 (Mm01275600_g1)، و Nox2 (Mm00627011_m1). سطوح mRNA به سطح RNA ریبوزومی 18S.

4.4. تجزیه و تحلیل وسترن بلات بیان پروتئین با آنالیز وسترن بلات هموژنه های بافتی با استفاده از روشی که قبلاً توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل شد [27،28]. عصاره پروتئین کل از بافت ها با استفاده از بافر نمونه حاوی سدیم دودسیل سولفات تهیه شد. غلظت پروتئین هر نمونه با استفاده از کیت سنجش پروتئین سازگار با مواد شوینده (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) و NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) با آلبومین سرم گاوی اندازه گیری شد. استاندارد مقادیر مساوی از عصاره های پروتئینی از نمونه های بافت بر روی 5-20 درصد ژل پلی آکریل آمید (ATTO Corp.، توکیو، ژاپن) تکه تکه شدند. سپس پروتئین های جدا شده با استفاده از سیستم انتقال نیمه خشک (ATTO Corp.، توکیو، ژاپن) به غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید منتقل شدند. غشاها به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با سالین بافر فسفات حاوی 5 درصد پودر شیر بدون چربی مسدود شدند. غشاها با آنتی بادی های اولیه علیه کلتو (ab{11}}:1000؛ Abcam، کمبریج، انگلستان)، NAMPT(sc-67020 1:5000؛ Abcam)، SIRT1(07-131 1}:1000، MilliporeSigma انکوبه شدند. , Burlington, MA, USA), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA، Fukuroi، ژاپن)، و گلیسرآلدئید{3}}فسفات دهیدروژناز (GAPDH) (2118، 1:2000؛ فناوری سیگنالینگ سلولی، دانورز، MA، ایالات متحده). غشاها شسته و با آنتی بادی های ثانویه به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. مکان‌های واکنش آنتی‌بادی-آنتی‌ژن با استفاده از بستر لومینسانس شیمیایی تقویت‌شده (Merck، Kenilworth، NJ، USA) مشاهده شدند. GAPDH به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد. تصاویر به صورت کمی با استفاده از ChemiDoc Touch (آزمایشگاه‌های Bio-Rad، هرکول، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) تجزیه و تحلیل شدند.

4.5. تجزیه و تحلیل بافت شناسی همانطور که قبلا توضیح داده شد [29] انجام شد. بافت‌های کلیوی موش‌ها با 4 درصد پارافورمالدئید تثبیت و سپس در پارافین جاسازی شدند. مقاطع (ضخامت 4 میکرومتر) با رنگ‌های PAS و MT رنگ‌آمیزی شدند. برای ارزیابی ناحیه گلومرولی، 50 گلومرول در هر موش اندازه گیری و میانگین گیری شد. همه تصاویر با استفاده از میکروسکوپ BZ{4}} (Keyence Corp.، اوزاکا، ژاپن) به دست آمدند.

سیستانچ دیالیز کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

4.6. رنگ آمیزی SA- - بافت‌های کلیوی موش‌ها به سرعت منجمد شدند و در یک ترکیب دمای برش بهینه (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokyo, Japan) نصب شدند. بخش‌ها (ضخامت 4 میکرومتر) با استفاده از یک کرایوستات (HM{1}}VPD; Thermo Fisher Scientific) و بر روی اسلایدهای شیشه ای نصب شده است. فعالیت SA{2} gal با استفاده از کیت تشخیص پیری (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) طبق پروتکل‌های سازنده اندازه‌گیری شد. نمونه ها در زیر میدان روشن با بزرگنمایی 100 × با استفاده از میکروسکوپ BZ{4} (Keyence Corp.. 4.7. Microscopy Electronآنالیز میکروسکوپ الکترونی همانطور که قبلا توضیح داده شد [30] انجام شد. موش ها با ایزوفلوران بیهوش شدند و از طریق قوس آئورت راست با سالین فیزیولوژیکی هپارینه شده (5 واحد بر میلی لیتر) و گلوتارآلدئید 2.5 درصد در بافر فسفات 0.1 مول در لیتر در pH 7.4 پرفیوژن شدند. نمونه‌های میکروسکوپ الکترونی عبوری به مدت 2 ساعت در 1 درصد تتروکسید اسمیم غوطه‌ور شدند، به‌طور سریالی در اتانول آب‌گیری شدند و در یک مخلوط Epon جاسازی شدند. مقاطع UlItrathin با اورانیل استات و سیترات سرب رنگ‌آمیزی شدند و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری Hitachi H{10}} که در ۸۰ کیلوولت کار می‌کرد (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan) مورد بررسی قرار گرفت. بخش ها با بزرگنمایی 5000 × مشاهده شدند و با استفاده از دوربین دستگاه شارژ همراه عکسبرداری شدند.

4.8. تجزیه و تحلیل بیوشیمیایینمونه های خون در حالت تغذیه با سوراخ قلبی جمع آوری شد. نمونه های خون کامل در 3000 دور در دقیقه (MR-150؛ Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Japan) به مدت 10 دقیقه در درجه 4 سانتریفیوژ شدند تا پلاسما جدا شود. نمونه‌های پلاسمای حاصل در -80 درجه نگهداری شدند. سطوح کراتینین پلاسما، UN و کراتینین ادرار با استفاده از اتوآنالایزر هیتاچی 7180 (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan) اندازه گیری شد.

4.9. تحلیل آماری تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) انجام شد. داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. برای مقایسه تفاوت بین گروه کنترل وسیله نقلیه و گروه AA از آزمون F بدون جفت استفاده شد.<0.05 was="" considered="" statistically="">

5. نتیجه گیری هاتجویز AA باعث می شودکلیهپیری، همراه با فیبروز توبولو بینابینی و آتروفی کلیه. نتایج نشان می‌دهد که فیبروز کلیه ارتباط نزدیکی با پیری کلیه دارد و AAN ممکن است به عنوان یک بیماری مفید باشدکلیه-مدل پیری خاص