تماس:jerry.he@wecistanche.com

Yuto Mitsuhata1، Takaya Abe2، Kazuyo Misaki3، Yuna Nakajima1، Keita Kiriya1،

Miwa Kawasaki4، Hiroshi Kiyonari2، Masatoshi Takeichi4*، Mika Toya1,4,5,6*&

ماسامیتسو ساتو1،6،7

سیستانچ می تواند عملکرد کلیه را بهبود بخشد

سلول های اپیتلیال یک آرایه منظم از میکروتوبول های غیر سانتروزومی را سازماندهی می کنند که انتهای منهای آن توسط CAMSAP3 تنظیم می شود. نقش این میکروتوبول ها در عملکرد اپیتلیال، با این حال، به خوبی درک نشده است. در اینجا، ما نشان می دهیم کهکلیه هاموش هایی که Camsap3 در آنها جهش یافته است، رشد می کنندکیست هادر لوله های پیچیده پروگزیمال (PCTs). PCT به شدت در جهش یافته گشاد شدکلیه هاو آنها همچنین افزایش تکثیر سلولی را نشان دادند. در این PCT ها، سلول های اپیتلیال همراه با اختلال در آرایه های میکروتوبول و همچنین ساختارهای درون سلولی خاصی مانند فرآیندهای پایه بین انگشتی، چاق شدند. علاوه بر این، YAP و PIEZO1 که به عنوان تنظیم‌کننده‌های حساس مکانیکی برای شکل‌دهی و تکثیر سلول شناخته می‌شوند، در این سلول‌های PCT جهش یافته فعال شدند. این مشاهدات نشان می‌دهد که شبکه‌های میکروتوبولی با واسطه CAMSAP3 برای حفظ خواص مکانیکی مناسب سلول‌های PCT مهم هستند و از دست دادن آن باعث تغییر شکل و تکثیر سلولی از طریق فعال‌سازی حسگرهای مکانیکی و در نتیجه اتساع PCT‌ها می‌شود.

سلول های اپیتلیال اجزای اصلی اندام های مختلف هستند. آنها قطبیت آپیکال به پایه را نشان می دهند که با عملکردهای آنها مانند جذب و ترشح مرتبط است. در سلول‌های اپیتلیال متمایز، اکثر میکروتوبول‌ها غیرسنتروزومی هستند و در امتداد محور اپیکال به پایه 1-3 قرار دارند. CAMSAP3 عضوی از خانواده پروتئین مرتبط با طیف‌های تنظیم‌شده با کالمودولین (CAMSAP)/Nezha/Patronin است و برای سازمان‌دهی میکروتوبول‌های اپیتلیال مهم است. CAMSAP3 انتهای منهای میکروتوبول ها را متصل می کند و تثبیت می کند 4،6،9. در سلول‌های روده کوچک در موش‌ها، CAMSAP3 در نواحی قشر آپیکال متمرکز می‌شود و انتهای منهای میکروتوبول‌های غیرسنتروزومی را به این مکان‌ها متصل می‌کند و در نتیجه آرایه‌های میکروتوبولی را به سمت جهت آپیکوبازال تشکیل می‌دهد که انتهای بعلاوه آن‌ها به صورت پایه اشاره شده است. . با این حال، این سازمان میکروتوبول مشخصه در موش‌های حامل یک ژن جهش‌یافته که یک Camsap3 کوتاه شده را کد می‌کند (موش‌های Camsap3dc/dc)، که در آن دامنه اتصال میکروتوبول C ترمینال حذف می‌شود، گم می‌شود. سلول‌های اپیتلیال روده در این موش‌ها دارای نقایص سیتولوژیکی مختلفی هستند، از جمله کاهش ارتفاع سلول و اندامک‌های نادرست مانند هسته و Golgi10. علیرغم چنین آشفتگی های بزرگی در معماری درون سلولی، سلول های اپیتلیال ورقه های دوبعدی با ظاهر طبیعی را حفظ می کنند10،12، و روده های جهش یافته هیچ نقص فیزیولوژیکی آشکاری نداشتند.

لوله ها (PCTs)، حلقه هنله، لوله های پیچیده دیستال و مجرای جمع کننده. زیرساختارهای نفرون Tese از یک لایه اپیتلیوم تشکیل شده است که برای فیلتراسیون، بازجذب و ترشح عمل می کند.

A کلیه کیستیک ضایعه پاتولوژیک شایع از استکلیه ها. ضایعه کیستیک متغیر است. کیست های کانونی یا چندگانه در یک طرف یا به صورت دوطرفه در کلیه ها تشکیل می شوند که درجه متفاوتی از علائم را نشان می دهند 13-15. چند کیستیک مادرزادیکلیهبیماری ها از جمله پلی کیستیککلیهبیماری ها (PKD)، بیماری کلیه گلومرولوسیستیک (GCKD) و کیستیک مدولاریکلیهبیماری (MCKD)، شناخته شده است که باعث ایجاد چندگانه می شودکلیهکیست در کلیه های دو طرفه در PKD، کیست ها به طور یکنواخت در کل اندام از جمله PCT توزیع می شوند، در حالی که GCKD و MCKD به ترتیب در کپسول های بومن و مجاری جمع کننده (عمدتاً در ناحیه مدولا) کیست ایجاد می کنند.

در مورد PKD، دو علت اصلی شناخته شده است: 1) جهش در ژن Pkd1 یا Pkd2، و 2) جهش در ژن های مورد نیاز برای بیوژنز اولیه مژک. Pkd1 و Pkd2 به ترتیب پلی سیستین 1 و پلی سیستین 2 را کد می کنند که کانال های کاتیونی غیرانتخابی هستند 20 که در چندین بخش سلولی از جمله مژک های اولیه 21،22 قرار می گیرند. در موش‌های حامل فرم جهش یافته PKD1 یا PKD2، پروتئین‌های پلی سیستین در مژه‌ها 23 موضعی نمی‌شوند. ژن های مورد نیاز برای بیوژنز مژک های اولیه عبارتند از If88 و Kif3a که در حمل و نقل درون فاژلی 24-26 نقش دارند. جهش در این ژن ها نیز منجر بهکلیهبیماری های کیستیک 24-27. اگرچه رابطه بین این دو مسیر علّی پیچیده است23، یکی از مسیرهایی که نشان داده شده است که PKD را القا می‌کند، عامل سیگنالینگ Hippo Yap28 است. در موش‌های جهش یافته Pkd1، فعال‌کننده رونویسی YAP/TAZ و عامل آن c-Myc فعال می‌شوند و سیستوژنز را ارتقا می‌دهند. با این وجود، مکانیسم های زیربنایی ایجاد پلی کیستیککلیه هاتا حد زیادی ناشناخته باقی می ماند.

در مطالعه حاضر، نقش CAMSAP3 را بررسی کردیمکلیهساختار و عملکرد مشاهدات ما نشان می‌دهد که CAMSAP3 موضعی آپیکال به جهت‌گیری مناسب میکروتوبول‌های غیرسنتروزومی و همچنین ایجاد معماری درون سلولی سلول‌های اپیتلیال در PCT‌ها، همانطور که در روده کوچک مشاهده می‌شود، کمک می‌کند. با این حال، برخلاف اپیتلیوم روده، CAMSAP3اختلال عملکردباعث ایجاد ناهنجاری های سطح اندام در کلیه های دو طرفه - یعنی تشکیل کیست در PCT ها می شود. از دست دادن عملکرد CAMSAP3 منجر به فعال شدن تنظیم کننده های حساس مکانیکی می شود که به طور معمول به حفظ یکپارچگی بافت کمک می کند. مطالعه ما نشان می‌دهد که سازمان‌دهی میکروتوبول‌های غیرسانتروزومی با واسطه CAMSAP برای حفظ خواص مکانیکی حساس PCT مهم است و از دست دادن این سیستم باعث تشکیل کیست منطقه‌ای در کلیه می‌شود.

نتایج

کیستتشکیل درکلیه هاموش های جهش یافته Camsap3. تجزیه و تحلیل فنوتیپی موش های جهش یافته Camsap3dc/dc نشان داد کهکلیه هادر موش های مسن (~ 2 ساله) Camsap3dc/dc هیپرتروفیک و تغییر رنگ داشتند (شکل 1a). برای تجزیه و تحلیل بیشتر ناهنجاری ها در Camsap3dc/dcکلیه ها، ما موش های جوان را بررسی کردیم. در روز 21 پس از تولد (P21)، کلیه های Camsap3dc/dc ظاهر طبیعی داشتند. با این حال، برش کلیه ساختارهای کیستیک را در نواحی قشر مغز نشان داد (شکل 1b و شکل تکمیلی S1a)، همانطور که با محاسبه شاخص کیستیک، که نسبت نواحی حاوی کیست به کل ناحیه کلیه است، تأیید شد (شکل. 1c). ما جنین‌های جهش یافته را بررسی کردیم تا مشخص کنیم کیست‌ها چه زمانی در طول رشد تشکیل می‌شوند، که نشانه‌ای از افزایش تشکیل کیست را در تقریباً روز 17.5 جنینی (E17.5) نشان داد (شکل تکمیلی S1a، فلش‌ها). در P{12}}، کیست های قشری به راحتی قابل تشخیص بودند (شکل تکمیلی S1a، فلش)، و اندازه و تعداد آنها تا P21 افزایش یافته بود (شکل 1b، شکل تکمیلی S1a، فلش). همانطور که موش ها بزرگتر شدند، فنوتیپ های کیستیک آشکارتر شدند، اگرچه درجه تشکیل کیست در بین افراد متفاوت بود (شکل 1c و شکل تکمیلی S1b). علاوه بر این، نسبت وزن کلیه به بدن برای موش‌های Camsap3dc/dc نسبت به موش‌های نوع وحشی (WT) در طول عمرشان بیشتر بود (شکل 1d و شکل تکمیلی S1c، d). بنابراین، کلیه‌های Camsap3dc/dc تشکیل کیست را نشان دادند که با گذشت زمان افزایش یافت و منجر به هیپرتروفی در کلیه‌های مسن شد.

موش Camsap3dc/dc یک CAMSAP3 (CAMSAP{3}}dc)10 کوتاه شده با دامنه C را بیان می‌کند، که می‌تواند در فنوتیپ کیستیک مشاهده‌شده کلیه‌های موش دخیل باشد. برای بررسی این امکان، ما یک موس Camsap3–/– (Camsap3-تهی) تولید کردیم (شکل تکمیلی S2a,b) (به روش‌ها نیز به تفصیل مراجعه کنید). این موش ها هم داشتندکلیه هابا کیست های متعدد، و فنوتیپ خود را از آن مشاهده شده در موش Camsap3dc/dc غیر قابل تشخیص بود. به ویژه، موش‌های هتروزیگوت (Camsap3 plus /-) هیچ نشانه‌ای از کلیه پلی کیستیک نشان ندادند (شکل تکمیلی S2c).

تشکیل کیست در PCT های Camsap3dc/dcکلیه ها. برای تعیین اینکه کدام ساختار در جهش یافته کیستیک شده استکلیه هاما رنگ آمیزی ایمنی سه بخش نفرون را برای سه پروتئین انجام دادیم، یعنی Megalin (محلی به PCTs)، یک انتقال دهنده Na + /Cl– (توبول های پیچیده دیستال)، و aquaporin-2 (مجرای جمع کننده). نتایج نشان داد که اتساع منحصراً در لوله‌های مگالین مثبت در P21 رخ می‌دهد (شکل 1e و شکل تکمیلی S1e)، که نشان می‌دهد سیستوژنز به PCTs محدود شده است. PCT ها به سه بخش تقسیم می شوند، یعنی S1، S2 و S3، و ما بین آنها با رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای انتقال دهنده های گلوکز SGLT1 و SGLT2، که به ترتیب در بخش های S3 و S1/S2 قرار دارند، تمایز قائل شدیم29،30. لوله های گشاد شده تنها با SGLT2 مشخص شدند (شکل 1f)، که نشان می دهد سیستوژنز در بخش های S1/S2 رخ می دهد. با این حال، در موش‌های جهش یافته مسن‌تر، تشکیل کیست تا کپسول بومن نیز گسترش یافت (شکل 1g).

ساختار سلولی نامرتب در PCT های کیستیک برای کشف نقایص سطح سلولی در PCT های کیستیک، ابتدا آنها را با میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی کردیم و دریافتیم که جمعیتی ازکلیهتوبول ها به طور قابل توجهی در کلیه های Camsap3dc/dc متورم شدند (شکل 2a)، اگرچه میزان تورم از موقعیتی به موقعیت دیگر لوله متفاوت بود. برش‌های عرضی نشان داد که در قسمت‌های متورم یک لوله، مجرای آن همراه با نازک شدن لایه اپیتلیال که لوله‌ها را تشکیل می‌دهد، منبسط شده است (شکل 2a). کمی‌سازی با استفاده از نمونه‌های رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین تأیید کرد که ارتفاع سلول در لوله‌های گشاد شده کاهش می‌یابد (شکل 2b)، در حالی که محیط آپیکال هر سلول افزایش یافته است (شکل 2c)، که نشان می‌دهد سلول‌های جهش یافته چاق‌تر از سلول‌های WT هستند.کلیه ها.

سپس بررسی کردیم که آیا معماری سلولی و/یا ساختارهای درون سلولی PCT تحت تأثیر جهش Camsap3 قرار گرفته است یا خیر. رنگ آمیزی ایمنی برای DPP IV، یک نشانگر غشایی آپیکال، و برای Na به علاوه / K به علاوه -ATPase، یک نشانگر غشای قاعده ای جانبی، نشان داد که قطبیت کلی سلول در هر یک نرمال است.کلیهسلول توبول Camsap3dc/dc

شکل 1. تشکیل کیست در لوله های پیچیده پروگزیمال Camsap3dc/dcکلیه ها. (الف) مورفولوژی کلیه موشهای WT (بعلاوه / پلاس) و جهش یافته Camsap3 (Camsap3dc/dc) در P666. (ب) رنگ آمیزی H&E کلیه های WT و Camsap3dc/dc در P21. کیست های متعدد در قشر کلیه Camsap3dc/dc تشکیل شده است. (ج) تغییر شاخص کیستیک موش های WT و Camsap3dc/dc در طول زمان. 9 موش برای WT یا Camsap3dc/dc مورد بررسی قرار گرفتند. برای تعریف شاخص کیستیک به مواد و روش ها مراجعه کنید. (د) نسبت کلیه به وزن بدن. 11 موش برای WT یا Camsap3dc/dc مورد بررسی قرار گرفتند. (ه) رنگ‌آمیزی ایمنی برای نشانگرهای لوله‌های پیچ‌خورده پروگزیمال (PCT) (مگالین)، لوله‌های پیچیده دیستال (DCT)، انتقال‌دهنده NaCl، و مجاری جمع‌آوری (CD) (aquaporin{12}}؛ AQP2) در WT و Camsap3dc/ دی سیکلیه هادر P21. تصاویر نمای بزرگ‌نمایی شده مگالین، مگالین غیر موضعی را در سلول‌های کیستیک در کلیه‌های Camsap3dc/dc نشان می‌دهند، همانطور که با نوک پیکان نشان داده شده است. خطوط شکسته و پیوسته به ترتیب حاشیۀ آپیکال و قاعده ای سلول را نشان می دهند. (f) رنگ آمیزی ایمنی برای نشانگرهای بخش S1/S2 (SGLT2، سبز) و بخش S3 (SGLT1، قرمز) در کلیه های WT و Camsap3dc/dc در P21. تصاویر نمای بزرگ شده SGLT2 کاهش شدت سیگنال SGLT2 را در سلول های کیستیک در کلیه های Camsap3dc/dc نشان می دهد، همانطور که با نوک پیکان نشان داده شده است. (ز) مورفولوژی گلومرول در P21 و P487. نوک پیکان نشان دهنده گلومرول گشاد شده است. شکل های S1 و S2 را نیز ببینید.

شکل 2. ساختار سلولی بهم ریخته در سلول های PCT کیستیک. (الف) تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی ▸

سیستانچ می تواند عملکرد کلیه را بهبود بخشد

WT و Camsap3dc/dcکلیه هادر P21. توبول کلیوی در Camsap3dc/dcکلیه هاتا حدی متورم است (ب) کمی سازی ارتفاع سلول در قشر [ plus / plus , n=121cell; dc/dc (گشاد شده)، n=128 سلول. dc/dc (غیر متسع)، n=66 سلول]. نوارهای خطا نشان دهنده SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">کلیه ها. (i) تعداد مژک های اولیه در PCTs. تعداد مژک های اولیه با استفاده از طول محیط آپیکال برش های PCT به همراه تعداد مژک ها و هسته های اولیه محاسبه شد. [ plus / plus , N=340 سلول، 63 مقطع PCT، تعداد مژک های اولیه=268; dc/dc، N=221 سلول، 29 مقطع PCT، تعداد مژک های اولیه=133].

موش ها (شکل 2d). در مقابل، اگرچه مگالین در نواحی آپیکال سلول‌های WT انباشته شد، اما در برخی از سلول‌های کیستیک Camsap3dc/dc در سیتوپلاسم منتشر شد (شکل 1e نمای بزرگ‌نمایی شده، و شکل 2d). رنگ‌آمیزی فلورسانس برای F-اکتین، که با چگالی بالا در میکروویل‌های آپیکال تجمع می‌یابد، نشان می‌دهد که ریزپرزها گهگاه در سلول‌های چاق شده جهش یافته به هم ریخته می‌شوند.کلیه ها(شکل 2e نوک پیکان)، همانطور که توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری تایید شده است (شکل 2f). ازرین، بخشی از مجتمع ERM که با غشای پلاسمایی آپیکال 31 مرتبط است، در سلول‌های کیستیک Camsap3dc/dc کاهش یافته یا گم شده است.کلیه ها(شکل 2e)، نشان می دهد که ساختار سلولی در سلول های جهش یافته غیر طبیعی است. علاوه بر این، در حالی که دستگاه گلژی مثبت Giantin به طور کلی به عنوان رشته های نازک در کنار هسته در سلول های WT توزیع می شود، گلژی گهگاه در سلول های Camsap3dc/dc متراکم می شود (شکل 2e). میکروسکوپ الکترونی عبوری نقایص درون سلولی اضافی را در PCT های متسع Camsap3dc/dc نشان داد.کلیه ها. در سلول‌های PCT WT، میتوکندری‌ها دراز بودند و جهت‌گیری منظمی را در امتداد محور اپیکو-پایه سلول نشان می‌دادند، در حالی که در سلول‌های PCT کیستیک، میتوکندری‌ها تمایل داشتند گرد باشند - دیگر هیچ جهت منظمی را نشان نمی‌دهند (شکل 2f). در این سلول‌ها، رگه‌های پایه نیز به هم ریخته بودند، و فرورفتگی‌های موازی و عمیق خود را که در سلول‌های WT رایج است از دست دادند (شکل 2f نوک پیکان و ترسیم ترسیم شده)، همانطور که با رنگ‌آمیزی ایمنی برای Na به علاوه /K به علاوه -ATPase نشان داده شد (شکل نوک پیکان 2 بعدی). علاوه بر این، هسته ها در سلول های کیستیک در مقایسه با شکل گرد آنها در سلول های WT چاق شدند (شکل 2f,g). مژک های اولیه در سمت مجرای سلول های PCT در کلیه های WT و جهش یافته قابل تشخیص بودند (شکل 2h,i)، بر خلاف مورد موش های جهش یافته که برای مژه زایی ناقص هستند، که باعث ایجاد کلیه های پلی کیستیک می شود. دلیل احتمالی برای

فنوتیپ های پلی کیستیک در موش Camsap3dc/dc مشاهده شد. در مجموع، این مشاهدات نشان داد کهاختلال عملکردCAMSAP3 معماری درون سلولی سلول های کیستیک PCT را مختل می کند.

موش های Camsap3dc/dc برخی از نقایص فیزیولوژیکی را نشان می دهند. سپس بررسی کردیم که آیا کلیه‌های Camsap3dc/dc نقص فیزیولوژیکی دارند یا خیر. مطالعات ایمونوسیتولوژیکی فوق الذکر نشان داد که Megalin که به عنوان یک گیرنده اندوسیتی چند لیگاندی عمل می کند 32،33، تمایل به انتشار در سیتوپلاسم سلول های PCT Camsap3dc/dc (شکل 1 e arrow، و شکل 2d) دارد، برخلاف محلی سازی اپیکال واضح آن در سلول های PCT WT. علاوه بر این، اگرچه ناقل گلوکز SGLT2، که مسئول 90 درصد بازجذب گلوکز است، عمدتاً در نواحی آپیکال سلول‌های Camsap3dc/dc (همانطور که در سلول‌های WT نیز دیده می‌شود) موضعی دارد، اما شدت سیگنال آن در مناطق خاصی از لوله‌های کیستیک کاهش می‌یابد. شکل 1f نوک پیکان)، نشان می‌دهد که فیزیولوژی لوله‌های جهش‌یافته ممکن است تحت تأثیر منفی قرار گرفته باشد. بنابراین، آزمایش‌های ادرار و خون را با استفاده از P{14}} به P{15}}موش‌های مسن انجام دادیم. آزمایشات ادرار تمایل به خروج بیش از حد K plus، Mg2 plus، و نیتروژن اوره را در موش Camsap3dc/dc نشان داد (شکل تکمیلی S3a). آزمایش‌های خون به طور متقاعدکننده‌تری نشان داد که موش‌های Camsap3dc/dc در مقایسه با موش‌های WT یا Camsap3 plus /dc به طور قابل‌توجهی سطوح پایین‌تری از K plus و Mg2 plus داشتند، اگرچه هیچ تغییری در سطوح نیتروژن اوره و گلوکز مشاهده نشد (شکل تکمیلی S3b). . سطح کراتینین خون و ادرار بین موش های WT و جهش یافته تفاوتی نداشت (شکل تکمیلی S3c). بنابراین، ما فقط نقص فیزیولوژیکی جزئی را در موش Cam-sap3dc/dc مشاهده کردیم.

سازمان میکروتوبول درکلیهسلول های اپیتلیال توبولی از آنجایی که جهش Camsap3 منجر به از هم گسیختگی میکروتوبول‌ها در سلول‌های اپیتلیال روده کوچک می‌شود، ما بررسی کردیم که آیا این اتفاق درکلیهسلول های اپیتلیال ما ابتدا توبولین را با مگالین رنگ آمیزی کردیم. قابل‌توجه، هم در کلیه‌های WT و Camsap3dc/dc، توبول‌های مگالین منفی، یعنی یا لوله‌های پیچ‌خورده دیستال یا مجاری جمع‌کننده، شدت رنگ‌آمیزی توبولین قوی‌تری نسبت به -توبولین در PCT‌های مثبت مگالین نشان دادند (شکل 3a، b). . همانطور که در روده کوچک یافت شد، CAMSAP3 به صورت آپیکال در تمام سلول های اپیتلیال WT موضعی شد.کلیه ها، همپوشانی انتهای آپیکال میکروتوبول هایی که در امتداد محور آپیکو-پایه قرار گرفته اند (شکل 3c سمت چپ). سلول‌های اپیتلیال کلیه Camsap3dc/dc نیز تا حدودی برای CAMSAP3 ایمونو مثبت بودند اما در موقعیت‌های نامنظم (شکل 3c سمت راست، نوک پیکان)، نشان می‌دهد که CAMSAP3 جهش‌یافته در سلول‌ها باقی می‌ماند و به برخی از ساختارهای ناشناس متصل است. در سلول‌های کیستیک کلیه‌های جهش‌یافته، آرایه‌ای از میکروتوبول‌ها در هم پیچیده و به هم ریخته بود (شکل 3c سمت راست)، همانطور که در سلول‌های روده موش Camsap3dc/dc مشاهده شد. با این حال، در سلول‌های غیر کیستیک، سازمان میکروتوبول تحت تأثیر قرار نگرفت

شکل 3. میکروتوبول ها در سلول های اپیتلیال توبول کلیوی. (الف) رنگ آمیزی ایمنی برای -توبولین، مگالین، و هسته در کلیه های WT و Camsap3dc/dc در P21. (ب) کمی سازی شدت توبولین در PCT و DCT/CD کلیه های WT (PCT، n=28 توبول؛ DCT/CD، n=18 توبول) و کلیه Camsap3dc/dc (PCT، n { {8}} لوله؛ DCT/ CD، n=9 لوله). نوارهای خطا نشان دهنده SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

حتی در غیاب CAMSAP3 عملکردی، که ممکن است توضیح دهد که چرا این سلول ها هیچ ناهنجاری سیتولوژیکی را نشان نمی دهند. علاوه بر این، سلول‌های اپیتلیال کلیه تهی Camsap نیز نقایص میکروتوبولی مشابهی را نشان دادند اما فقط در سلول‌های کیستیک (شکل تکمیلی S2d). در مجموع، این نتایج نشان داد که CAMSAP3 تنها برای یک زیرجمعیت از سلول‌های اپیتلیال کلیه در حفظ سازمان آپیکو-پایه میکروتوبول‌ها نقش دارد.

افزایش تکثیر سلولی در PCT های Camsap3dc/dc. تشکیل کیست در کلیه ها ارتباط نزدیکی با افزایش تکثیر سلول های کلیوی دارد. برای آزمایش اینکه آیا تکثیر سلولی در کلیه‌های Camsap3dc/dc تغییر کرده است، تکثیر سلول‌های PCT را بین WT و کلیه‌های جهش یافته با رنگ‌آمیزی همزمان برای Megalin و Ki{4}}، که نشانگر تکثیر سلولی است، مقایسه کردیم. سلول های Ki{5}-مثبت به ندرت در PCT کلیه WT مشاهده شد، در حالی که آنها به راحتی در سلول های PCT کلیه Camsap3dc/dc آشکار شدند. با این حال، Ki{7}} هم در لوله‌های گشاد نشده و هم در لوله‌های متسع (شکل 4a,b) شناسایی شد که هیچ ارتباطی بین تکثیر سلولی و تشکیل کیست نشان نمی‌دهد. توس، CAMSAP3اختلال عملکردتکثیر سلولی را تقویت کرد، اما این فرآیند همیشه با تشکیل کیست همراه نبود.

تغییرات در محلی سازی YAP و میوزین غیر عضلانی مرتبط با تغییر شکل سلولی. YAP یک فعال کننده رونویسی است که تکثیر سلولی35 و همچنین شکل دهی سلولی وابسته به کشش مکانیکی را تنظیم می کند. YAP همراه با مکان یابی هسته ای آن در کلیه موش های Pkd1-مشکلی، مدلی از PKD37، فعال می شود، و فعال سازی Yap باعث افزایش تکثیر سلولی و اتساع لوله ای در کلیه ها می شود. بنابراین ما آزمایش کردیم که آیا YAP در PCT کلیه های Camsap3dc/dc نیز فعال شده است یا خیر. رنگ آمیزی ایمنی برای YAP محل سیتوپلاسمی آن را در PCTs کلیه WT نشان داد. به طور قابل‌توجهی، YAP در هسته PCT‌های Camsap3dc/dc متمرکز شد، اما فقط در بخش‌های متسع آن‌ها (شکل 5a)، همانطور که توسط کمی‌سازی (شکل 5b) تأیید شد، نشان می‌دهد که توزیع مجدد YAP مشاهده‌شده در پاسخ به تغییر در سلول رخ داده است. مورفولوژی به جای CAMSAP3اختلال عملکردفی نفسه

YAP یک عامل پایین دست مسیر کرگدن است که توسط نشانه های مکانیکی تنظیم می شود. در واقع، سلول‌های کیستیک در کلیه Camsap3dc/dc کشیده به نظر می‌رسیدند، که نشان می‌دهد ممکن است در معرض افزایش تنش قرار داشته باشند.

شکل 4. تکثیر سلولی در PCT های Camsap3dc/dc. (الف) رنگ‌آمیزی ایمنی برای Ki-67، Megalin و DAPI در کلیه‌های WT و Camsap3dc/dc در P22. نوک پیکان سلول های Ki{5}}-مثبت در لوله های کیستیک را نشان می دهد. (ب) درصد سلولهای Ki-67-مثبت در سلولهای اپیتلیال PCT [ plus / plus , n=700 سلول. dc/dc (گشاد شده)، n=224 سلول. dc/dc (non-latated)، n=396 سلول]. نوارهای خطا نشان دهنده SD *p است<0.05,>

بنابراین ما بررسی کردیم که آیا تغییرات مکانیکی در هماهنگی با تشکیل کیست رخ داده است یا خیر. از آنجایی که فعال‌سازی غیر عضلانی میوزین II یک فرآیند حساس به تنش است، ما توزیع زنجیره سبک 2 میوزین (MLC2) را که در فعال‌سازی میوزین II نقش دارد، در کلیه‌ها ارزیابی کردیم. اگرچه MLC2 در سیتوپلاسم سلول‌های توبول WT منتشر شد، اما در نزدیکی بخش‌های آپیکال سلول‌های کیستیک در کلیه‌های Camsap3dc/dc متمرکز شد (شکل 5c نوک پیکان)، که نشان می‌دهد این سلول‌ها تحت نیروی کششی قرار گرفته‌اند. سلول های PCT های غیر متسع چنین غلظت MCL2 را نشان ندادند. این یافته ها مطابق با این ایده بود که YAP زمانی که سلول ها به طور مکانیکی کشیده می شوند وارد هسته می شود.

تغییرات در توزیع PIEZO1 در Camsap3dc/dc PCT. برای آزمایش بیشتر اینکه آیا سلول‌های کیستیک در معرض نیروی کششی قرار می‌گیرند، توزیع درون سلولی PIEZO1، یک کانال یونی حساس به مکانیسم42-45 را بررسی کردیم، زیرا این یک نشانگر معمولی برای کشش مکانیکی است. زمانی که سیگنال‌های کششی را حس می‌کند، محلی‌سازی PIEZO1 از غشای پلاسمایی/سیتوپلاسم به پوشش هسته‌ای تغییر می‌کند. رنگ آمیزی ایمنی برای PIEZO1 نشان داد که PIEZO1 بیشتر در سیتوپلاسم سلول های PCT WT موضعی می شود، در حالی که محل یابی آن با هسته سلول های کیستیک PCT های Camsap3dc/dc همپوشانی دارد (شکل 6a). رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای YAP و PIEZO1 در مقاطع متوالی همچنین نشان داد که محلی سازی هسته ای آنها در PCT های گشاد شده همزمان است (شکل تکمیلی S4، نوک پیکان). از سوی دیگر، در PCT های Camsap3dc/dc غیر متسع، توزیع PIEZO1 سیتوپلاسمی به نظر می رسید (شکل 6a). با این حال، مشاهدات دقیق تصاویر ایمونوفورسانس و همچنین کمی سازی نشان داد که محلی سازی هسته ای آن در مقایسه با سلول های WT تا حدی تمایل به افزایش دارد (شکل 6a,b). بنابراین، بر خلاف YAP، به نظر می رسد که PIEZO1 قبل از تغییر شکل قابل تشخیص سلول ها در PCT های Camsap3dc/dc شروع به فعال شدن می کند.

بحث

در این مطالعه متوجه شدیم که جهش CAMSAP3 یا از بین رفتن آن منجر به اتساع سلول‌های PCT می‌شود که باعث می‌شود سطح مقطع لوله‌ها ظاهری کیستیک به خود بگیرد. نشانه ای از سیستوژنز در اوایل E17.5 مشاهده شد، با افزایش تدریجی اتساع در طول پیری و گسترش نهایی آن به کپسول Bowman. سلول‌های اپیتلیال در نواحی گشاد شده نازک‌تر شدند و نقص‌های سیتولوژیکی مختلفی را نشان دادند، همانطور که در سلول‌های روده کوچک موش Camsap3dc/dc مشاهده شد. برخی از نقایص خاص کلیه نیز مشاهده شد، از جمله اختلال در تراز میتوکندری و الگوی غشای پلاسمایی پایه. این تغییرات با اغتشاش آرایش میکروتوبول‌ها همزمان شد و نشان می‌دهد که شبکه‌های میکروتوبولی با واسطه CAMSAP مسئول سازماندهی طبیعی این ساختارهای درون سلولی در سلول‌های PCT هستند، همانطور که در انواع سلولی دیگر یافت می‌شود. از سوی دیگر، اگرچه به نظر می‌رسد CAMSAP3 در تمام سلول‌های اپیتلیال توبول کلیوی بیان می‌شود، فنوتیپ‌های ساختاری ناهنجار تنها در PCT‌ها مشاهده شد، که نشان‌دهنده وجود مکانیسم(های) اضافی برای حفظ شبکه‌های میکروتوبولی در غیاب CAMSAP3 است. ممکن است مولکول هایی غیر از CAMSAP3، مانند سایر CAMSAP ها، در حفظ یکپارچگی شبکه های میکروتوبولی در این سلول ها شرکت کنند. سلول‌های PCT تراکم میکروتوبولی نسبتاً کمتری نسبت به سایر سلول‌های توبولی داشتند. احتمالاً این تغییر شکل سلولی را تسهیل می کند، زیرا شبکه های میکروتوبولی که پس از از دست دادن CAMSAP3 باقی می مانند ممکن است برای حفظ کافی نبوده باشند.

معماری سلولی مناسب با این حال، حتی در سلول‌های PCT، مکانیسم‌هایی وجود دارد که اتلاف CAMSAP3 را جبران می‌کند، زیرا اتساع PCT به طور یکنواخت رخ نمی‌دهد.

شکل 5. محلی سازی YAP و میوزین غیر عضلانی مرتبط با تغییر شکل سلولی. (الف) رنگ آمیزی ایمنی برای YAP، Megalin، و DAPI در کلیه های WT و Camsap3dc/dc در P22. سیگنال های فلورسانس DAPI و YAP در امتداد خط کشیده شده در تصاویر بزرگ شده اسکن شدند و تغییرات فضایی در شدت فوئورسانس به رنگ آبی برای DAPI و سبز برای YAP نشان داده شده است. خطوط چین نشان دهنده مساحت تقریبی هسته است. نوک پیکان موقعیت هسته را در سلول های نماینده نشان می دهد. (ب) نسبت شدت YAP هسته ای به شدت YAP سیتوپلاسمی [ plus / plus , n=81 سلول. dc/dc (گشاد شده)، n =43 سلول. dc/dc (غیر متسع)، n=53 سلول]. نمودارهای جعبه ای مقادیر چارک اول، میانه و چارک سوم را نشان می دهند. ***پ<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

شکل 6. تغییر در توزیع PIEZO1 در Camsap3dc/dc PCT. (الف) رنگ آمیزی ایمنی برای PIEZO1، Megalin، و DAPI در کلیه های WT و Camsap3dc/dc در P22. سیگنال های فلورسانس DAPI و PIEZO1 در امتداد خط ترسیم شده در تصاویر بزرگ شده اسکن شدند و تغییرات فضایی در شدت فوئورسانس به رنگ آبی برای DAPI و سبز برای PIEZO1 نشان داده شده است. خطوط چین نشان دهنده مساحت تقریبی هسته است. نوک پیکان موقعیت هسته را در سلول های نماینده نشان می دهد. (ب) نسبت شدت پیزو۱ هسته ای به شدت پیزو۱ سیتوپلاسمی [ plus / plus , n=66 سلول. dc/dc (dlatated), n =44 سلول; dc/dc (غیر متسع)، n=81 سلول]. نمودارهای جعبه ای مقادیر چارک اول، میانه و چارک سوم را نشان می دهند. ***پ<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

پس چگونه PCT ها به صورت منطقه ای، همراه با چاق شدن سلول های اپیتلیال گشاد شدند؟ قابل ذکر است که تشکیل کیست در E17.5 قابل تشخیص است و این زمان بندی با شروع تولید ادرار اولیه در موش ها ارتباط دارد. بنابراین، ما می‌توانیم فرض کنیم که "فور ادرار" یک عامل مکانیکی بالقوه است که باعث اتساع لوله‌های کلیوی می‌شود. این احتمال وجود دارد که سلول‌های PCT که اسکلت سلولی میکروتوبولی با واسطه CAMSAP{4}}را از دست داده بودند، در مقایسه با سلول‌های PCT WT، از نظر مکانیکی بیشتر مستعد نیروهای خارجی بودند، یعنی تغییر شکل‌پذیرتر. در نتیجه، نیروهای تولید شده توسط فور ادرار در لوله های کلیوی ممکن است باعث گشاد شدن لوله ها و چاق شدن آنها شود. چنین نیروهایی ممکن است یکنواخت نباشند، که منجر به درجات متغیر اتساع در طول PCT می شود. این ایده، نیازی به گفتن ندارد، مکانیسم های احتمالی دیگری را برای اتساع PCT رد نمی کند.

مشاهدات ما نشان داد که PIEZO1 از سیتوپلاسم به ناحیه هسته‌ای در سلول‌های PCT متسع کلیه‌های Camsap3dc/dc جابجا می‌شود، که نشان می‌دهد این مکانوسنسور در پاسخ به تغییر شکل سلولی فعال شده است، به احتمال زیاد «کشش» سلول‌ها همانطور که قبلا گزارش شده است. وضعیت کشیده سلول‌های PCT متسع با مشاهده افزایش MLC2 در نواحی قشر مغز تأیید شد. تجزیه و تحلیل ما بیشتر نشان داد که PIEZO1 قبلاً تا حدی در سلول‌های PCT غیر متسع فعال شده است، که نشان می‌دهد حتی این سلول‌ها با وجود ظاهر طبیعی‌شان دستخوش تغییرات مکانیکی شده‌اند. مکانوسنسور دیگری به نام YAP نیز در سلول‌های PCT فعال شد، اما به نظر می‌رسید فعال‌سازی آن فقط در سلول‌های کشیده اتفاق می‌افتد.

پس چگونه این تنظیم کننده های حساس مکانیکی به تغییر شکل سلولی و همچنین تکثیر سلولی که در غیاب CAMSAP3 ترویج می شود کمک می کنند؟ نشان داده شده است که فعال‌سازی PIEZO1 ناشی از کشش، تکثیر سلولی را در سلول‌های اپیتلیال افزایش می‌دهد، که نشان می‌دهد این مکانیسم در سلول‌های PCT کلیه‌های Camsap3dc/dc نیز کار می‌کند. این ایده با مشاهدات ما مطابقت دارد که تکثیر سلولی افزایش یافته و فعال سازی جزئی PIEZO1 با هم اتفاق افتاده است، حتی در سلول های غیر متسع PCT های Camsap3dc/dc. در مورد YAP، فعال‌سازی آن به تعویق افتاد و ارتباط واضحی با شروع افزایش تکثیر سلولی نشان نداد. YAP نه تنها به عنوان یک فاکتور رشد سلولی، بلکه به عنوان یک تنظیم کننده هموستاز مکانیکی شناخته می شود، همانطور که قبلاً نشان داده شد. بنابراین ممکن است YAP که همراه با تغییر شکل سلول‌های PCT به درون هسته منتقل شده است، برای تنظیم شکل آنها، یعنی بازیابی شکل آسیب‌دیده این سلول‌ها عمل کند. در غیر این صورت، YAP ممکن است با PIEZO1 در افزایش تکثیر سلول های گشاد شده همکاری کند، زیرا YAP شناخته شده است که از طریق افزایش تکثیر سلولی در تشکیل کلیه های پلی کیستیک نقش دارد.

ما متوجه شدیم که موش‌های Camsap3dc/dc به‌طور قابل‌توجهی سطوح پایین‌تری از K پلاس و Mg2 پلاس در خون داشتند، که نشان می‌دهد کلیه‌های آنها ممکن است از برخی عملکردهای غیرطبیعی رنج ببرند. نقص‌های سیتولوژیک شدیدی که در غشای پلاسمایی آپیکال و پایه سلول‌های PCT، جایی که ماشین‌های انتقال فعال در آن قرار دارند، مشاهده کردیم، ممکن است به این ناهنجاری مربوط باشد. با این حال، ما نمی‌توانیم این احتمال را رد کنیم که بخش‌های دیگر لوله‌های کلیوی یا سایر اندام‌ها نیز از نظر عملکردی معیوب باشند و این فنوتیپ را القا کنند. علاوه بر این، ما هیچ مدرکی مبنی بر آسیب دیدن عملکردهای گلومرول به دست نیاوردیم، زیرا سطوح خونی کراتینین و نیتروژن اوره که از طریق گلومرول دفع می شوند، طبیعی بود.

اختلال در بیوژنز اولیه مژه منجر به PKD24-27 می شود. در مورد جهش Camsap3، به نظر می‌رسید که تشکیل مژه‌های اولیه بی‌تأثیر باشد. مطالعه اخیر نشان داد که از دست دادن CAMSAP3 در سلول‌های اپیتلیال چندشاخه‌ای بینی بر تشکیل جفت‌های مرکزی میکروتوبول‌ها در آکسونم تأثیر گذاشته و باعث تحرک نابجا در مژک‌های متحرک می‌شود. اگرچه مژک‌های اولیه روی سلول‌های اپیتلیال غیر متحرک هستند و فاقد جفت‌های مرکزی میکروتوبول‌ها هستند، هنوز مشخص نیست که مژک اولیه در موش‌های جهش یافته Camsap3 هنوز عملکردی دارد یا خیر. با وجود این عدم قطعیت، ناهنجاری‌ها در جهش‌های PKD و Camsap3 کاملاً متفاوت هستند، زیرا تشکیل کیست به طور یکنواخت در کل کلیه در اولی رخ می‌دهد، در حالی که در دومی یک رویداد محلی است. این تفاوت به احتمال زیاد به زمینه های مولکولی متمایز تشکیل کیست بین آنها مربوط می شود.

به طور خلاصه، مطالعه ما نشان می‌دهد که CAMSAP3 برای حفظ ساختار و عملکرد لوله‌های کلیوی در نواحی پروگزیمال، احتمالاً از طریق تنظیم مجموعه میکروتوبول‌های غیرسنتروزومی، مهم است. با این حال، برای درک کامل اینکه چگونه از دست دادن این سیستم سازماندهی میکروتوبول با عملکردهای فیزیولوژیکی کلیه تداخل می کند، مطالعات بیشتری مورد نیاز خواهد بود.

مواد و روش ها

همه آزمایش‌ها مطابق با دستورالعمل‌ها، مقررات مربوطه و تأیید شده توسط مرکز تحقیقات دینامیک بیوسیستم RIKEN و/یا کمیته ایمنی زیستی نهادی دانشگاه Waseda انجام شد.

موش. موش‌های جهش یافته Camsap3 (Camsap3dc/dc) مورد استفاده در این مطالعه در مطالعه قبلی ما تولید شده‌اند (شماره دسترسی CDB0716K؛ http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant درصد 20mice درصد 20list.html). در آن موش‌ها، ناحیه C ترمینال Camsap3، یعنی اگزون‌های 14-17، برداشته شد، و ما قبلاً تأیید کردیم که سلول‌های موش یک CAMSAP3 (CAMSAP{15}}dc) غیر عملکردی C ترمینال کوتاه شده را بیان می‌کنند. در مطالعه حاضر از موش های نسل N4 و 5 در آزمایشات استفاده شد.

موش‌های حذفی Camsap3 (Camsap3–/–) (شماره دسترسی CDB0033E)، که فاقد کل 22-kb منطقه کدگذاری Camsap3 هستند، با ویرایش ژنوم CRISPR/Cas{6}از طریق الکتروپوراسیون زیگوت51 تولید شدند. به طور خلاصه، دو RNA راهنما و یک الیگودئوکسی نوکلئوتید تک رشته ای (ssODN) برای حذف ناحیه 22-kb طراحی شدند و یک سایت EcoRI به منظور شناسایی برای درج موفقیت آمیز در موش های جهش یافته اضافه شد. برای الکتروپوراسیون، cRNA ها، tracrRNA، ssODN و پروتئین Cas9 به زیگوت‌های C57BL/6 وارد شدند. پس از الکتروپوراسیون، زیگوت‌ها به موش‌های ماده ICR باردار کاذب منتقل شدند و موش‌های موسس توسط PCR و توالی‌یابی DNA غربالگری شدند. موش های ناک اوت درختی (#4، #10، #23) به دست آمدند، و یکی از آنها (#23) دارای آلل کوبشی EcoRI طراحی شده بود. توالی های راهنمای RNA توسط CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp) طراحی شدند. توالی‌های crRNA، tracrRNA و ssODN مورد استفاده برای ویرایش ژنوم به‌صورت زیر سنتز شدند: 5'-cRNA، 5'-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3'، 3'-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3′; tracrRNA، 5′-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3′; ssODN، 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCTCCCACCCCCACAT-3′ . حروف بزرگ و کوچک به ترتیب کدگذاری و دنباله های کمکی را نشان می دهند. خط شماره 23 موش با C57BL/6 سه بار تلاقی داده شد و موش‌های نسل N3 در آزمایش‌ها مورد استفاده قرار گرفتند.

آزمایش‌ها با استفاده از موش‌ها توسط کمیته مراقبت از حیوانات و استفاده از مرکز تحقیقات دینامیک بیوسیستم RIKEN یا دانشگاه Waseda تأیید شد و مطابق با پروتکل‌های ارائه شده توسط آن کمیته‌ها انجام شد. این مطالعه مطابق با دستورالعمل های ARRIVE انجام شد: https: //arriveguidelines.org.

ژنوتیپ کردن تعیین ژنوتیپ برای موش توسط PCR انجام شد. برای موش های Camsap3dc/dc، ما از پرایمرهای توصیف شده در Toya و همکاران استفاده کردیم. (2016). برای موش Camsap3–/–، ما از پرایمرهای زیر برای تشخیص آلل نوع وحشی (WT) (P1/P2، 411 جفت باز) یا Camsap3–/– (P1/P3، 614 جفت باز) استفاده کردیم (شکل تکمیلی S2a,b) : P1، 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2، 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3، 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . منطقه P1/P3 در WT تحت شرایط PCR مورد استفاده تقویت نشد.

بافت شناسی: تهیه مقاطع بافت منجمد. بافت کلیه جدا شده در 2 درصد پارافرم آلدئید (Termo Fisher) / 0.1 مولار سوربیتول (Nacalai Tesque) / بافر PEM به مدت 1 ساعت در دمای اتاق ثابت شد. دستور العمل برای PEM عبارت است از: لوله های 100 میلی مولار (Nacalai Tesque)، 5 میلی مولار EGTA (Nacalai Tesque) و 5 میلی مولار MgCl2 (Wako)، تنظیم شده با pH 6.9 با 2 M KOH. پس از فراکساسیون، بافت کلیه سه بار با PEM به مدت 10 دقیقه شستشو داده شد. 10، محافظت در برابر سرما با ساکارز / PEM انجام شد: 15 درصد ساکارز در محلول PEM به مدت 2 ساعت در 4 درجه، به دنبال آن 20 درصد ساکارز در محلول PEM در طول شب در دمای 4 درجه، و جایگزینی با 30 درصد ساکارز در محلول PEM برای ~ 2 ساعت. در 4 درجه بافت کلیه در ترکیب OCT در یک قالب جاسازی شده (Polysciences, Inc.) در نیتروژن مایع منجمد شد و در دمای 80- درجه نگهداری شد. نمونه های منجمد با ضخامت 5 میکرومتر با CM1850 Cryostat (Leica) برش داده شدند. مقاطع روی لام های شیشه ای تا زمان رنگ آمیزی در دمای 80- درجه نگهداری شدند.

بافت شناسی: تهیه مقاطع بافتی تعبیه شده با پارافن. بافت کلیه جدا شده در محلول سوپر فیکس (Kurabo) به مدت 2 ساعت در دمای اتاق fxed شد، سپس یک شبه به دمای 4 درجه منتقل شد. هر نمونه در معرض سه محلول آبی اتانول با غلظت فزاینده در دمای اتاق قرار گرفت: 30 درصد اتانول به مدت 3{{20}} دقیقه دو بار، 50 درصد اتانول برای 3{ {35}} دقیقه، و در نهایت 70 درصد اتانول برای 30 دقیقه. هر نمونه با یک پردازشگر بافت ASP300 (Leica) پردازش شد. 10 نمونه بافت کلیه در موم پارافن (Sakura Fine-tek) با EG1160 (Leica) جاسازی و در دمای 4 درجه نگهداری شد. نمونه‌های تعبیه‌شده با پارافن با ضخامت 6 میکرومتر با میکروتوم روتاری RV24{61}} (یاماتو کوهکی) برش داده شدند. مقاطع روی اسلایدهای شیشه ای تا زمان رنگ آمیزی در دمای 4 درجه نگهداری شدند. رنگ آمیزی ایمونوفورسنت. مقاطع کلیه منجمد در 0.1 درصد Triton X{18}} (Nacalai Tesque) / PEM به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق غوطه ور شدند. ده نمونه با اعمال 0.2 درصد Triton X{22}} / PEM به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نفوذپذیر شدند. یک بار دیگر، نمونه ها در 0.1 درصد Triton X{26}} / PEM به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق غوطه ور شدند. سپس نمونه‌ها با 3 درصد آلبومین سرم گاوی (BSA؛ Roche) / 0.1 درصد Triton X{31}} / PEM به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق مسدود شدند و سپس واکنش آنتی‌بادی اولیه برای یک شب در دمای 4 درجه انجام شد. آنتی بادی های اولیه در 3 درصد BSA / 0.1 درصد Triton X{37}} / PEM رقیق شدند. برای آنتی‌بادی‌های اولیه پرورش‌یافته در موش، مسدودسازی اضافی با معرف مسدودکننده MOM (Vector Laboratories) قبل از مسدود کردن در 3 درصد BSA / 0.1 درصد Triton X{41}} / PEM انجام شد. معرف MOM Blocking در 0.1 درصد Triton X{44}} / PEM رقیق شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق روی نمونه ها اعمال شد. پس از تیمار MOM، نمونه ها با 0.1 درصد Triton X{48}} / PEM سه بار به مدت 5، 10 و 15 دقیقه در دمای اتاق شستشو شدند. پس از واکنش آنتی بادی اولیه، نمونه ها به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق با 0.1 درصد Triton X{55}} / PEM سه بار شستشو شدند. واکنش آنتی بادی ثانویه به مدت 2 ساعت در دمای اتاق در تاریکی انجام شد. آنتی بادی های ثانویه در 3 درصد BSA / 0.1 درصد Triton X{60}} / PEM رقیق شدند. پس از واکنش، نمونه ها با 0.1 درصد Triton X{63}} / PEM سه بار به مدت 5، 10 و 15 دقیقه در دمای اتاق شسته و با محیط نصب VECTASHIELD (آزمایشگاه های وکتور) مهر و موم شدند. آنتی بادی ها و معرف ها. DNA با محلول DAPI رنگ آمیزی شد (Dojindo, D523, 1:1000). F-اکتین با الکسا فلوئور 594 فالویدین رنگ آمیزی شد (Termo Fisher, A12381, 1:400). میکروتوبول ها با ضد{76}توبولین-FITC موش رنگ آمیزی شدند (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). آنتی‌بادی‌های اولیه زیر مورد استفاده قرار گرفت: ضد مگالین بز (P{83}}؛ بیوتکنولوژی سانتا کروز، sc{84}}، 1:200)، حامل ضد نمک خرگوش (MERCK، AB3533، 1:500) ), خرگوش ضد آکواپورین-2 (abcam, AB3274, 1:400), goat anti-SGLT1 (M-19; Santa Cruz Biotech-nology, sc-20582, 1:200) , rabbit anti-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP{106}}, 1:200), mouse anti-ezrin (3C12; abcam, ab4069, 1:500), rabbit anti-giantin (Covance, PRB{116} C, 1:700), rabbit anti-aPKC (Santa Cruz Biotechnology, sc{121}}, 1:400), goat anti-DPP IV (R&D Systems, AF954, 1:100), mouse anti-Na پلاس /K پلاس -ATPase (abcam، ab7671، 1:100)، توبولین ضد استیله موش (Sigma Aldrich، T6793، 1:200)، خرگوش ضد CAMSAP3 (Tanaka و همکاران، 2012، 1:400)، موش توبولین ضد تیروزین (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), rabbit anti-Ki{147}} (SP6; abcam, ab16667, 1:250), rabbit anti-YAP (Cell Signaling, #4912, 1:100 )، زنجیر سبک 2 ضد میوزین خرگوش (سیگنالینگ سلولی، #8505، 1:100)، خرگوش آنتی پیزو1 (Novus Biologicals، N BP{163}}، 1:100)، موش ضد E-cadherin (52، 1:400) و خرگوش ضد مرلین (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). آنتی بادی های ثانویه زیر مورد استفاده قرار گرفتند: Don-key Dylight 594–conjugated anti-goat IgG (Jackson, 1:500), goat Alexa Fluor 488/594–conjugated anti-rabbit IgG (Termo Fisher, A{183}}, A -11037، 1:500)، آلکسا فلور بز 488/594–کنژوگه ضد موش IgG (Termo Fisher, A{190}}, A{191}}, 1:500) و Alexa Fluor بز 488-کنژوگه ضد موش IgG (ترمو فیشر، A{196}}،

1:400). ویژگی اتصال آنتی‌بادی‌های anti-YAP (Sell Signaling, #4912) و anti-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) مورد استفاده در مطالعه توسط کار قبلی تأیید شد. رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E). لام‌های شیشه‌ای با برش‌های کلیوی روی صفحه 55 درجه به مدت 30 دقیقه قرار داده شد تا پارافن کشیده شود. سپس نمونه‌ها دو بار به مدت 15 دقیقه در زایلن غوطه‌ور شدند و سپس در یک سری اتانول 70 تا 100 درصد غوطه‌ور شدند: اتانول 100 درصد به مدت 5 دقیقه دو بار، اتانول 90 درصد به مدت 5 دقیقه، اتانول 80 درصد به مدت 5 دقیقه و 70 درصد اتانول به مدت 5 دقیقه پس از شستشو در آب به مدت 20 دقیقه و در H2O مقطر/دیونیزه (ddH2O) به مدت 1 دقیقه، نمونه ها در محلول هماتوکسیلین مایر (Wako) به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شدند. نمونه ها دو بار در ddH2O غوطه ور شدند، سپس با ddH2O به مدت 10 دقیقه شستشو داده شدند. نمونه ها دوباره در ddH2O غوطه ور شدند و سپس به مدت 2 دقیقه در محلول ائوزین (Merck) رنگ آمیزی شدند. برای شستشو، نمونه ها به مدت 30 ثانیه در ddH2O غوطه ور شدند، سپس به صورت سری 70 تا 100 درصد اتانول و زایلن غوطه ور شدند: اتانول 70 درصد برای 5 ثانیه، اتانول 80 درصد برای 5 ثانیه، اتانول 90 درصد برای 5 ثانیه، 100 درصد اتانول. به مدت 5 ثانیه دو بار و زایلن به مدت 10 دقیقه. در نهایت نمونه ها در گلیسرول مهر و موم شدند. میکروسکوپ. تصاویر با میکروسکوپ فلورسانس یکپارچه BZ-X710 (Keyence) یا میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری LSM880 (Zeiss) به دست آمد. برای BZ-X710، لنزهای شیئی مورد استفاده Nikon CFI Plan Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × و Nikon CFI Plan Fluor 4 × بودند. تصاویر به دست آمده با نرم افزار BZ-X Analyzer پردازش شدند. Te LSM880 مجهز به یک میکروسکوپ معکوس Axio Observer Z1 با لنز شیئی غوطه‌وری روغنی Plan-Apochromat 63 × 1.40 NA (Zeiss) بود. تصاویر با استفاده از ImageJ و Adobe Photoshop CC2019 پردازش و تجزیه و تحلیل شدند. تجزیه و تحلیل شاخص کیستیک شاخص کیستیک توسط ImageJ با استفاده از تصاویر رنگ آمیزی H&E از بخش افقی کلیه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. به عنوان اندازه‌گیری ناحیه حاوی کیست، محیط لومن لوله‌ای گشاد شده با استفاده از تابع "انتخابات دست آزاد" و مساحت آن با تابع "Measure" اندازه‌گیری شد. این کار برای همه کیست‌های داخل بخش کلیه انجام شد و نواحی همه کیست‌ها با هم اضافه شدند تا ناحیه حاوی کیست مشخص شود. مساحت کل کلیه نیز به همین روش اندازه گیری شد. محیط بیرونی کلیه با استفاده از عملکرد "انتخابات دست آزاد" ردیابی شد و ناحیه آن ارزیابی شد. در نهایت، با تقسیم ناحیه حاوی کیست بر مساحت کل کلیه، شاخص کیستیک را محاسبه کردیم.

تعریف لوله های گشاد شده و لوله های غیر گشاد شده. در این تحقیق، لوله‌هایی با مساحت لومن بزرگتر یا مساوی 500 میکرومتر مربع به عنوان "گشاد" تعریف شده‌اند، در حالی که لوله‌هایی با سطح لومن<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

میکروسکوپ الکترونی. برای میکروسکوپ الکترونی، موش‌های نر P21 مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه هایی برای میکروسکوپ الکترونی روبشی بر اساس Takahashi-Iwanaga54 با تغییرات خاصی به شرح زیر تهیه شد. موش ها با ایزوفوران بیهوش شدند و با فرمالدئید 2 درصد (وزنی/حجمی) و گلوتارآلدئید 5/2 درصد (حجم/حجمی) در بافر کاکودیلات 1 مولار 0 پرفیوژن شدند، pH 7.4. هر کلیه جدا شد و به مکعب هایی برش داده شد که یک شبه در همان fxative غوطه ور شدند و سپس با 0.1 M بافر کاکودیلات شستشو داده شدند. نمونه های آماده شده از طریق محلول آبی 3{17}} درصدی دی متیل سولفوکسید به دی متیل سولفوکسید 60 درصد منتقل شدند و سپس در N2 مایع شکسته شدند. نمونه‌های شکسته شده با بافر کاکودیلات 1 مولار شستشو داده شدند و در 6 N NaOH به مدت 1{{3{41}}}}-20 دقیقه در دمای ۶۰ درجه قرار گرفتند. پس از خیساندن در محلول NaOH، هر نمونه با بافر کاکودیلات 0.1 مولار حاوی 0.05 درصد Tween 20 شسته شد و با 1 درصد OsO4 در بافر 0.1 مولار کاکودیلات روی یخ به مدت 2 ساعت پس‌افکس شد. نمونه‌های پس‌افکس شده عبارت بودند از: (1) با ddH2O شسته شده و به مدت 20 دقیقه در تیوکربوهیدرازید آبی 1 درصد در دمای اتاق قرار داده شد و (2) با ddH2O شستشو داده شد و مجدداً در 1 درصد OsO4 در بافر کاکودیلات 0.1 مولار به مدت 1 ساعت در دمای اتاق شستشو داده شد. . پس از تکرار مراحل (1) و (2)، نمونه ها با ddH2O شستشو داده شدند و با محلول 0.5 درصد اورانیل استات در طول شب در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند. بلوک‌های بافت با ddH2O شسته شدند و از طریق یک سری اتانول درجه‌بندی شده، آبگیری شدند، به ایزوپنتیل استات منتقل شدند و با استفاده از CO2 مایع در نقطه بحرانی خشک شدند. نمونه های خشک شده با تبخیر با اسمیم پوشانده شدند و با میکروسکوپ الکترونی روبشی LV با ولتاژ شتاب ده کیلو ولت بررسی شدند. تصاویر با Adobe Photoshop پردازش شدند.

برای میکروسکوپ الکترونی عبوری، مکعب‌های کلیه‌های جداشده حداقل به مدت 2 ساعت در فرمالدئید 2 درصد (وزنی/حجمی) و گلوتارآلدئید 5/2 درصد (حجم/حجمی) در بافر کاکودیلات 0.1 مولار در دمای اتاق ثابت شدند. نمونه ها با بافر کاکودیلات 0.1 مولار شسته و با 1 درصد OsO4 در {{10}}.1 مولار بافر کاکودیلات روی یخ به مدت 2 ساعت پس از اکستنشن قرار گرفتند. سپس نمونه ها با ddH2O شسته و در طول شب با 0.5 درصد اورانیل استات آبی در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند. نمونه های رنگ آمیزی شده با یک سری اتانول درجه بندی شده آبگیری شدند، به اکسید پروپیلن منتقل شدند و در Polybed 812 (Polysciences) جاسازی شدند. مقاطع بسیار نازک با یک چاقوی الماسی برش داده شدند، با اورانیل استات و سیترات سرب دو رنگ آمیزی شدند و با ولتاژ شتاب دهنده 100 کیلو ولت با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (JEM{20}}؛ JEOL) مجهز به دوربین دستگاه شارژی مشاهده شدند. BioScan مدل 792؛ Gatan). تصاویر با Adobe Photoshop پردازش شدند.

آزمایش ادرار و آزمایش خون. برای مقایسه با موش Camsap3dc/dc، موش‌های WT (بعلاوه / پلاس) و هتروزیگوت (بعلاوه / dc) به‌عنوان کنترل در این سنجش‌ها استفاده شدند. موش های هتروزیگوت هیچ نشانه ای از Camsap3 را نشان نمی دهنداختلال در عملکرد 10و آرایه های آپیکو-پایه ای از میکروتوبول ها را سازماندهی کرده اند. موش ها 56 تا 60 هفته سن داشتند.

موش ها در یک قفس متابولیک (TECNIPLAST) قرار گرفتند. نمونه های ادرار هر روز به مدت پنج روز متوالی جمع آوری شد و نمونه های جمع آوری شده در دمای 80- درجه نگهداری شدند. در نهایت، تمام پنج نمونه برای هر موش مخلوط شدند به طوری که مخلوط نهایی وضعیت میانگین هر موش را در آن دوره تغییر داد.

برای جمع‌آوری خون، موش‌ها {{0}}.۰۲ میلی‌لیتر بیهوشی به ازای هر گرم وزن بدن مصرف کرده‌اند. ترکیب بیهوشی Domitor (ZENOAQ) 30 µL، میدازولام (Sandoz) 80 µL، Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL و 0.9 درصد NaCl آبی تا 1 میلی‌لیتر بود. خون با پونکسیون قلبی جمع آوری شد. برای جلوگیری از همولیز، سرنگ به آرامی وارد و بیرون کشیده شد. هر نمونه خون به مدت 1 ساعت در دمای اتاق نگهداری شد تا منعقد شود. سپس هر نمونه سانتریفیوژ شد (10،{10}}×g، 25 درجه، 15 دقیقه)، و سرم جمع‌آوری و در دمای 80- درجه نگهداری شد. کلیه نمونه های ادرار و خون توسط شرکت مخمر شرقی آنالیز شد.